CA2190883A1 - Adenovirus comprenant un gene codant pour une superoxyde dismutase - Google Patents
Adenovirus comprenant un gene codant pour une superoxyde dismutaseInfo
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Abstract
La présente invention se rapporte à un adénovirus recombinant défectif comprenant au moins une séquence d'ADN codant pour tout ou une partie active d'une superoxyde dismutase ou un de ses dérivés. Elle vise également leur utilisation en thérapie et des compositions pharmaceutiques correspondantes.
Description
~1 90883 wo 9610~790 ~l/r~ A~ 5 ADENOVIRUS COMPRENANT UN GENE CODANT POUR UNE
SUPERO7~YDE DISMUTASE
La présente invention concerne des adénovirus ' ~u~ une séquence d'ADN codant pour une ~upe.uAyd~ dismutase et ses utilisations en thérapie 5, génique. .' L'ox,Ygene occupe une place essentielle dsns de nomb~ r processus g-, ou ~ ,, La réduction de l'ox~Ygène " proYOque la formation d'espèces chimiques hautement réactives comme le radical ~u~)Aydd~ le perox,Yde d'~ug~ e et le radical hydroAyle. Ce dernier, formé à par~r du SU~A,~
10 et du peroAyde d'lly~u~ ~ selon la réaction de Haber-Weiss, est le radical libre le plus réactif. De part la présence d'un électton libre dans leur couche externe, ccs radicauA sont hdutement réactifs. Cette réactiYité peut être ~ à réga~d de molécules biologiques , telles que rADN, des protéines cellulaires essentielles et les lipides ' En outre, ces radicauA libres peuvent initier 15 des réactions en châîne telle qu'une ~uAyudLull lipidique qui peut altérer l'intégrité
des cellules et causer leur ~ l`X~
Une série de ~ S-'A ~- .. ~.. ` de défense ~ ' existe ~.A1.. 11.. ~ pour réguler cette production de radicsuA libres et préYenir des dommages de tissus et/ou cellules.
C'est ainsi que la formation de ces entités hautement réactives est régulée ou irlhibée par une ~ de l'ion , y~l" par renzyme ~.A~UAr~
dismutase, en peroxyde d'll~uc~_,,c, ce dernier étant ensuite converti en eau etoxygène pat soit la glutathion peroxidase soit la catalase.
r ~ ' t, sous cer~aines conditions, ces de régulation ne sont pas totalement efficaces. Il s'en suit un excès en radicauA libres q~u enttaîne des pa~lOl~w de type; 1 . - ;~ ou ,~ x. .~, 1 11 est ainsi aujourd'hui reconnu que ces radicauA libres ~- au niveau de les maladies ~diu~ ' la cirrhose du foie, le diabète, Ia formation de cataracte, dsns un certain nombre de maladies r-- ---.,ln~.l. ~ incluant la rnaladie de Parbnson et l'ischémie cérébrale, au niveau de la trisomie 21, ainsi que dans le processus de vir~ ccpm~f Enfin, l'anion I y le semble également être impliqué dans la l~ de rl-.~lb,.~ll I ' ~ induite par TNF ~umor Necrosis Factor).
La présente invention a l"~ pour objet de proposer un moyen pour suppléer à ce type de déficience des .~ de regulation naturels et ceci en interver~ant plus l~ au niveau de l'activité de la su~Arde dismutase.
FEUILLE ~E REMPLACEMENT (REGLE 26) ~ _ _ _ _ _ . . . .. . .. . _ 21 908~3 W096/00790 r~l,r~,r~
Comme explicité ~ f ~ la fonction principale de cette enzyme, chez les ~ est de détruire les radicaux ,u~.~yd~s qui sont générés lors des diverses réactions ' ~L 1 d'u~ . l;". Cette enzyme est par conséquent - --` importante puisqu'erie procure une défense contre les toxicités à
5 l'oxygène et tout dommage pouvant être causé aux oellules par des ll~
"c,....
La su~u~ dismutase est en fait une variété de différentes enzymes présentes chez la plupart des êtres vivants. ~ existe trois fonnes de SOD, avec des , T~ . distinctes et . ,.. ~ chacune par la nature de leur composant métal:
la CuZnSOD - - - spécifique des euca~otes, la MnSOD dépendante du manganèse et produite au niveau des - - chez les eucaryotes et IJIU~ l.yULe~:~ (Creagan R et al. TT ~ 20 203-209 1973) et la FeSOD, dépendante du fer, cytosolique et présente: -' chez lec lJlU~Lyu~l (T~ . L~ D et ~ ~r,mirc 8, 736-738 1990). Il ex~ste également une SOD à
cuivre et zinc; -La CuZn . yd~ dismutase - , dite SOD1, constitue 85 à 90~7c de la totaTité de ractivité SOD cellulajn~ ~ s'agit d'une protéine dimère, composée a~ de deux sous-unités identiques, liées de manière non covalente, chacune d'entre-elles ayant un poids de l'ordre de 16~000 à 19~000 Lieman-Hur~vitz J. et al; Biochem ~t. 3:107-115, 1981). Le locuspour la ;~u~u,~ dismutase ~l , humaine se trouve sur le . l " , ""~
21. (Tan Y.H. et al. J. Exp. Med. 137: 317-330, 1973).
r~. ~ t, la CuZn . ~ y~ dismutase endogène est présente dans les tissus dans des quantités limitées et lorsque des quantités . en anions su~u~d~ sont produites, sa I s'avère nettement '' Par ailleurs, il a récemment été démontré que des mutations ponctuelles au niveau du gène CuZnSOD huTnain etaient associees au ~1;. . l. .l.l ~ . . d'une pathologie, la sclérose latérale ~..~ ui l - I (AI Ci). Cette maladie grave se traduit par une fTf~ léthale des neurones moteurs dans le cerveau et la moelle 30 épinière. Ces mutations affectent ractivité de l'enzyme f ~ ' ' CuZn~iOD
(Deng H. X. et al, Science, 261,10471993).
y a donc aujourd'hui un besoin en CuZnSOD exogene pour des .1 - l .-1;. . - diniques afn de suppléer à de telles carenres ou anomalies.
Iu.. t, sous cer~aines conditions, une - trop élevee en SOD
35 peut être toxique à régard des oeriules ia produisant. La SOD est une enzyme de
SUPERO7~YDE DISMUTASE
La présente invention concerne des adénovirus ' ~u~ une séquence d'ADN codant pour une ~upe.uAyd~ dismutase et ses utilisations en thérapie 5, génique. .' L'ox,Ygene occupe une place essentielle dsns de nomb~ r processus g-, ou ~ ,, La réduction de l'ox~Ygène " proYOque la formation d'espèces chimiques hautement réactives comme le radical ~u~)Aydd~ le perox,Yde d'~ug~ e et le radical hydroAyle. Ce dernier, formé à par~r du SU~A,~
10 et du peroAyde d'lly~u~ ~ selon la réaction de Haber-Weiss, est le radical libre le plus réactif. De part la présence d'un électton libre dans leur couche externe, ccs radicauA sont hdutement réactifs. Cette réactiYité peut être ~ à réga~d de molécules biologiques , telles que rADN, des protéines cellulaires essentielles et les lipides ' En outre, ces radicauA libres peuvent initier 15 des réactions en châîne telle qu'une ~uAyudLull lipidique qui peut altérer l'intégrité
des cellules et causer leur ~ l`X~
Une série de ~ S-'A ~- .. ~.. ` de défense ~ ' existe ~.A1.. 11.. ~ pour réguler cette production de radicsuA libres et préYenir des dommages de tissus et/ou cellules.
C'est ainsi que la formation de ces entités hautement réactives est régulée ou irlhibée par une ~ de l'ion , y~l" par renzyme ~.A~UAr~
dismutase, en peroxyde d'll~uc~_,,c, ce dernier étant ensuite converti en eau etoxygène pat soit la glutathion peroxidase soit la catalase.
r ~ ' t, sous cer~aines conditions, ces de régulation ne sont pas totalement efficaces. Il s'en suit un excès en radicauA libres q~u enttaîne des pa~lOl~w de type; 1 . - ;~ ou ,~ x. .~, 1 11 est ainsi aujourd'hui reconnu que ces radicauA libres ~- au niveau de les maladies ~diu~ ' la cirrhose du foie, le diabète, Ia formation de cataracte, dsns un certain nombre de maladies r-- ---.,ln~.l. ~ incluant la rnaladie de Parbnson et l'ischémie cérébrale, au niveau de la trisomie 21, ainsi que dans le processus de vir~ ccpm~f Enfin, l'anion I y le semble également être impliqué dans la l~ de rl-.~lb,.~ll I ' ~ induite par TNF ~umor Necrosis Factor).
La présente invention a l"~ pour objet de proposer un moyen pour suppléer à ce type de déficience des .~ de regulation naturels et ceci en interver~ant plus l~ au niveau de l'activité de la su~Arde dismutase.
FEUILLE ~E REMPLACEMENT (REGLE 26) ~ _ _ _ _ _ . . . .. . .. . _ 21 908~3 W096/00790 r~l,r~,r~
Comme explicité ~ f ~ la fonction principale de cette enzyme, chez les ~ est de détruire les radicaux ,u~.~yd~s qui sont générés lors des diverses réactions ' ~L 1 d'u~ . l;". Cette enzyme est par conséquent - --` importante puisqu'erie procure une défense contre les toxicités à
5 l'oxygène et tout dommage pouvant être causé aux oellules par des ll~
"c,....
La su~u~ dismutase est en fait une variété de différentes enzymes présentes chez la plupart des êtres vivants. ~ existe trois fonnes de SOD, avec des , T~ . distinctes et . ,.. ~ chacune par la nature de leur composant métal:
la CuZnSOD - - - spécifique des euca~otes, la MnSOD dépendante du manganèse et produite au niveau des - - chez les eucaryotes et IJIU~ l.yULe~:~ (Creagan R et al. TT ~ 20 203-209 1973) et la FeSOD, dépendante du fer, cytosolique et présente: -' chez lec lJlU~Lyu~l (T~ . L~ D et ~ ~r,mirc 8, 736-738 1990). Il ex~ste également une SOD à
cuivre et zinc; -La CuZn . yd~ dismutase - , dite SOD1, constitue 85 à 90~7c de la totaTité de ractivité SOD cellulajn~ ~ s'agit d'une protéine dimère, composée a~ de deux sous-unités identiques, liées de manière non covalente, chacune d'entre-elles ayant un poids de l'ordre de 16~000 à 19~000 Lieman-Hur~vitz J. et al; Biochem ~t. 3:107-115, 1981). Le locuspour la ;~u~u,~ dismutase ~l , humaine se trouve sur le . l " , ""~
21. (Tan Y.H. et al. J. Exp. Med. 137: 317-330, 1973).
r~. ~ t, la CuZn . ~ y~ dismutase endogène est présente dans les tissus dans des quantités limitées et lorsque des quantités . en anions su~u~d~ sont produites, sa I s'avère nettement '' Par ailleurs, il a récemment été démontré que des mutations ponctuelles au niveau du gène CuZnSOD huTnain etaient associees au ~1;. . l. .l.l ~ . . d'une pathologie, la sclérose latérale ~..~ ui l - I (AI Ci). Cette maladie grave se traduit par une fTf~ léthale des neurones moteurs dans le cerveau et la moelle 30 épinière. Ces mutations affectent ractivité de l'enzyme f ~ ' ' CuZn~iOD
(Deng H. X. et al, Science, 261,10471993).
y a donc aujourd'hui un besoin en CuZnSOD exogene pour des .1 - l .-1;. . - diniques afn de suppléer à de telles carenres ou anomalies.
Iu.. t, sous cer~aines conditions, une - trop élevee en SOD
35 peut être toxique à régard des oeriules ia produisant. La SOD est une enzyme de
2 1 908~3 wo 96100790 r~llr r 4 protection assurant I un niveau mir~mal en radicaux . u~y~ au sein de Ia oerule. Pou~ ce faire, erle cataly-se 1~ de radicaux Libres en vu d'en oxyderun et de réduire l'autre, soit une réaction de ~" ~, qui conduit à la fotmation d'eau oxygénée. En soit, le radical su~u~y~ n'est pas I "` toxique. Le danger vient de sa capacité à interagir avec l'eau oxygénée pou~ générer de l'a~ygène singulet et des radicaux hydroxyle, deux formes hautement réactives et ~ `
toxiques de l'oxygène. Une quantite accrue en SU~V~YU~ dismutase peut donc conduite à une prvduction accrue en eau r~xygénée avec les ,.-- t, explicitées Ce ~ ` " æ traduit notamment ~~ pa~ une _ " de la L~ v~v -~ ' avec diminution de la teneur en acide gras insaturés des lll~,.,~ oerlulaites et pout ~ , - principale une p- .
des fonctions Dans ce dernier cas, il ærait donc c.~ ,, de pouvoir réguler l'activité de la Su~u~ydd dismutase soit par exemple à l'aide d'ar,tisens ou de mutants dominants négatifs.
Le potentiel clinique de renzyme Su~v.~ydd dismutaæ est par ~ 1 I~J ~ . et il serait I "` important de pouvoir crJntrôler .-~r;. . ~n.
son activité soit en la stirnulant, la téprimant ou en y suppléant.
Plus ~ t, la présente invention réside dans la mise au point de vecteurs I ' ` efficaces pour délivrer in vivo et de maniè~re localiséd, des quantités i , , actives du gène spécifique codant pout une , yJe dismutase ou l'un de ses dérivés.
Dans la demande ~-r ' ' n PCT/EP93/02519, il a été mr~ntre que les adénovitus pouvaient êtte utilisés comme vecteur pour le transfert d'un gène étranger in vivo dans le système ner~eux et 1'~ de la protéine I ' -La ptésente invention concetne plus I "` des cu~U.,Liu nouverles, ~ "` adaptées et efficaces pour controler r~JII de la su~u~yde dismutase.
Plus 1~ t, er~e se tapporte à un adénovirus . I, 30 une æquence d'ADN propre à controler l'expression de la ~u~u~y~ dismutase, sa prépatation et son utilisation pour des traitements Ih' ~ et/ou la prévenùr)n de divetses ~
La ~' ' a ains~ mis en évidence qu'il est possible de cons~lruire des adénovirus ' - contenant une æquenoe cûdant pour une su~.u. yde .
21 9a883 wo 96/00790 dismutase, d' ' ces adénovi~us ' in vivo, et que cette ' permet une expression stable et lo~alisée de quantités i' ~ , actives de la superoxyde dismutase in vivo.
Un premier objet de l'invention réside donc dans un adénovi~us ' 5 défecLif ~ , ~ au moins une sequence d'ADN codant pour tout ou une partie active d'une DU~W~y~ dismutase ou l'un de ses dérivés.
La DU~Ay~ dismutase prcduite dans le cadre de la présente invention peut être une su~.,.y~c dismutase humaine ou animale. Selorl un mode de réalisation privilégié de rinvention, il s'agit de l'une des trois formes de la , yd~ dismutase 10 hurnaine ~ ' décrites, CuZnSOD (SODl), MnSOD (SOD2) et SOD
" ~, (SOD3). Plus ~ ' " ~ la séquence d'ADN intégrée dans r~l~.~,~uuD selon rinvention code pour tout ou ure partie active de la CuZn superoxyde dismutase humaine jn~rPII ' ' ~" hSOD1, ou run de ses dériv~s.
La séquence d'ADN codant pour la !, y~, dismutase, utilisée dans le cadre de la présente invention peut être un ADNc, un ADN génomique (ADNg), ou une ~ . ~t. 1-- ~ hybride consistant par exemple en un ADNc dans lequel se,raient ir~s un ou plusieurs ir~rons. Il peut également s'agir de séquences _, ' ' , ou .. ...
De manière ~uui' "` ' u~ _ , on utilise un ADNc ou un ADNg.
Selon un mode préferé de rirlvention, il s'agit une sequence d'ADN
génomique (ADNg) codant pour une , y~ dismutase. Son utilisation peut permetrre une meilleure expression dans les cellules Irumaines.
Bien entendu, ~ ' ' à son :. ~ ... dans un vecteur adéna~irus 25 selon l'invention, la séquence d'ADN peut être ~ ~ modifiée, par exemple par ~ ` dirigée, en particulier pour rinsertion de sites de res~riction appropriés.
Les séquerlces décrites dans rart antérieur ne sont en effet pas construites pour une utilisation selon rinvention, et des adaptations préalables peuvent s~avérer npru~e~
pour obtenir des e~ JIID 11~
Au sens de la présente invention, on entend par dérivé de la Du~Ayde dismutase, toute séquence obtenue par . ~ ~ .... et codant pour un produit conservant Ibne au moins des propriétés hir~ e de la , , ~, dismutase. Par ,,..~1 r;. ~-:.... on doit entendre toute mutation, ! ' '-' '- , délétion, addition ou 21 ~1~883 w0 s6/007so r~llr~ 4 ,.-,~lif;~ - de nature génétique et/ou chimique. Ces ~ '' peuvent être réal~ées pa~ les techniques connues de Illornme du métier (voir techniques générales de biologie ~ ci-après). Les dé~ivés au sens de l'invention peuvent également être obtenus pa~ hybridation à partir de banques d'acides nucléiques, en utilisant 5 comme sonde la séquence native ou un fragment de celle-ci.
Ces dérivés sont des molécules ayant une plus grande affinité
pour leurs sites de f~xation, des sequences pe~mettant une expression amélio~ée in vivo, des molécules présentant une plus g~ande résistance aux protéases, des lé~ules ayant une efficacité i~ plus grande ou des effets ~ . moindres, ou 10 ~ . 1 de nouvelles propriétés ~ -' 7"
Parmi les dérivés préférés, on peut citer plus 1 "` Ies va~iants natu~els, les molécules dans lesquelles un ou plu~iieurs residus ont été substitués, les dérivés obtenus par délétion de régions ~1'il.~ . . pas ou peu dans r.l.~Liu.~ avec les sites de liaison conr~dérés ou expnmant une activité ' ''~, et les dérivés 15 , . par rapport à la séquence native des résidus ~1 ' tels que par exemple un signal de sécrétion et/ou un pep~tide de jonctiorL
Par dérivé de la , ~u., dismutase on entend également couvrir dans le cadre de la présente invention, les mutants dits dominants négatifs de la ~U~U~r~
20 dismutase. Plus ~ t, dans ce cas, le gene cloné est alteré de manière a ce qu'il code pour un produit mutant capable d'inhiber ractivité cellulaire de la ,u~u~rd., dismutase sauvage. Ce type de dérivé est I ` intéressant lorsque l'on cherche par exemple à réprimer une ~ naturelle de la ~upL~u~rU~, dismutase.
La séquence d'~DN, codant pour tout ou partie de la su~u~r.le dismutase ou run de ses dérivés, peut également être une séquence antisens, dont rL, dans la cellule cible permet de contr;71er 1'~ 1 ~ de la , y.l~ dismutase.
r -~ -'I t, la séquence d'ADN I uI~g~ comporte un gène codant pour un ARN antisens capable de cont~ôler la traduction de l'ARNm ~ J~ La séquence antisens peut être tout ou seulement une partie de la séquence d'ADN, codant pour la su~u~r~ dismutase, insérée dans r~ inverse dans le vecteur selon rinvention.
i~elon un mode de realisation particulier de l'invention, la séquence d'ADN, codant pour la 1 rde dismutase ou run de ses derivés, intègre également un _ _ _ . _ _ _ _ . . , w0 96/00790 2 1 9 0 8 8 3 A ._I/r~
signal de sécrétion permettant de diriger la superoxyde dismutase synthétisée dans les voies de sécrétiorl des cerlules infectées. De cette manière, la su~yd. dismutase synthétisée est ~,.. _ libérée dans les, , P~rrll' Toutefois, il peut également s'agi~ d'un signal de sé~rétion h~ S, OU même 5 artificiel. Dans le cas particulier de la forme SOD3, le signal de sécrétion peut être _ le propre sig~nal de SOD3.
A~ ~ t, la séquence codant pour la su~ dismutase est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans les cerlules cibles.
pl~r -'1 t, il s'agit de signaux d'w~ t~ulGgvw~ c'est-à-dire de 10 signaux différents de ceux r~ r ' ' de rexE~ression de la L
dismutase. Il peut s'agir en particulier de sé~uences r ~ de r~ ~
d'autres protéines, ou de sequences ~ ~ N t, il peut s'agir de séquences l- ~. .- A- ;- ~ ~ de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de sé~uences 1~ issues du g~nome de la cellule que rOr~ désire infecter. De 15 même, il peut s'agir de séquences ~ issues du génome d'un virus, y compris r~ ,vu~utilis~Acetégard,onpeutciterparexemplelesl.. ~t~ ElA,MLP, CMV, LTR-RSV, etc. En outre, ces séquences LL'~, peuverlt être modifiées par addition de séquences d'activation, de rég~lation, ou permettant une expressiorl tissu-spécifique. Il peut en effet être I ' ` intéressant d'utiliser des signaux20 d~JII actifs, -, ou ; dans les ceriules cibles, de manière à ce que la séquence d'ADN ne soit exprimée et ne produise son effet quelorsque le VilUs a ~ . infecté une cellule cible.
Dans un prerluer mode de réalisation particulier, rinvention concerne un adénovilus I ' défectif ~ une séquence d'ADNc codant pour la 25 CuZn i~u~u~d~, dismutase hun aine ~ sous le contrôle du promoteur LTR-RSV.
Dans un autre mode de réalisation particulier, I'invention concerne un adénovirus ' défectif . , une séquence d'ADNg codant pour la CuZn , y~ dismutase hun3aine " ' sous le contrôle du promoteur 30LTR-RSV.
Un mo~e r préféré de mise en oeuvre de la présente invention réside dans un adénovirus ' défectif ~ , les séquences lTR, une séquence permettant r~ , une séquence d'ADN codant pour la CuZn u~d~. dismutase hurnaine " ' ou un dérivé de oelle-ci sous le contrôle .
q ~3 6100790 2 1, 08 r~llr~
d'un promotcur permettant une expression majoritaire dans les tissus cibles et dans lequel le gène E1 et au moins un des gènes E2, E4, L1-L5 est non ,r ~
Les adénovirus défectifs selon l'invention sont des adénovirus incapables de se répliquer de facon autonome dans la cellule cible. G. ' ~ le génome des 5 adénovirus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépour u au moins des séquences nccessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée.
Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en pa~tie), soit rendues non-- t~ , soit substituées par d'autres sequences et nflt~mtnPnt par la séquence d'ADN codant pour la ~U~IU~ y~ dismutase.
I~ t> le virus défecbf de rinvention conscrve Ics séquenccs de son génome qui sont néccssaircs à r ~ ,.. dcs particulcs viralcs. Encorc plus ~r~ .. 1l t, comme indiqué ci-avant, le gcnome du virus ' dcfcctif selon l'invcntion comprend Ics scqucnccs ITR, une séqucnce pcrmcttant le gcne E1 non fonctionnel et au moins un dcs gèncs E2, E4, L1-L5 nonr Il c~stc diffcrcnts sérotypes ~ d~uvilu.'~ dont la structure et Ics proprictcs varicnt quelquc peu. Parmi ccs sérotypcs, on prcfcrc utiliser dans le cadrc dc la prcsente invcntion Ics adcnovirus hurnains de t,vpe 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou lesadénovirus d'ar~g~ne anirnale (voir dcmande FR 93 05954). Parmi Ics adcnovirus d'aig~ne animale utilisables dans le cadre dc la présentc invention on peut citer Ics adénovirus d'~xig~ne canine, bovine, murine, (exemple: Mavl, ~3eard et al., V~logy 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviairc ou encore simienne (exemple: SAV). De préfcrence, rad~.uv~ d'ang~ne animale est un adénovirus carlin, plus un adénovilus CAV2 [souche manhattan ou A26161 (ATCC VR-800) par exemple]. De préférence, on utilisc dans le cadre de rinvention dcs adénovirus d'origine hurnaine ou canine ou mixte.
Les adénovicus ' défcctifs selon rinvcntion peuvent êtrc préparcs par toute techniquc cormue de l'hornme du mctier (Levrero et al., Gcne 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulicr, ils peuvcnt ctrc prcparés par ' homologuc entre un adénovi~us et un plasmidc portant entre autre la séquence d'ADN codant pour la su~.u~y~ dismutasc. La ' homologue se produit aprcs co-i r ' desdits adcnovi~us et pla~nide dans unc lignéc oellulairc ~rr~r~i~e La ligncc oerlulaire utilisée doit de 35 préference (i) êtrc j r ~~ ~ par lesdits éléments, et lu). comportcr Ics séquenoes 21 908~3 wo 96/00790 P~l/r~
capables de I , Ia partie du génome de r~d~ v.~ défectif, de préférence sous forme ~ntégrée pour éviter les risques de A titre d'exemple de lignée, on peut menti = la lignée de rein ~..~ , hurnain 293 (Graham et al., J. Gen. Vuol. 36 (1977) 59) qui contient t, intégrée darls son génome, la 5 pa~tie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 ~6). Des stratégies de ., " ,~de vecteurs dérivés des adénovirus ont également été décrites dans les demarldes n FR93 05954 et FR9308596 qui sont ;~ à la présente demande par référence.
Ensuite, les adénovims qui se sont multipliés sont récupe~s et purifiés selon 10 les techniques classiques de biologie Les propriétés I "` Il.~ ~ des vecteurs de l'invention découlent notamment de la c~ .. utilisée (ad~.v~..,.., défectif, délété de cert~unes régions vir les), du promoteur utilisé pour r~ , de la séquence codantpour la . yde dismutase (promoteur viral ou tissu-spécifique de préférence), et 15 des méthcdes d' dudit vecteur, permettant rexpression efficace et dans les tissus appropriés de la ~u~u~.yd~ dismutase.
La présente invention concerne également toute utilisation d'un adénovirus tel que décrit ci-dessus pour la I 1 d'une 1~ destinée au traitement et/ou à la prévential des I ~ ' citées. Plus 20 ~u i ` t, elle concerne toute utilisation de ces adénovirus pour la préparation d'une . lJ --.. - - l~ des~n~e au traitement et/ou à la préverltion dw maladies l..,~, ' ~ ' .w comme par exemple la maladie de Parkinson, la maladie d'AlzbeimOE, la scléroæ latérale ~..rv.~,lJh;q~ (~Ci), et la trisomie 21. Ils peuvent être également ~ utiliæs dans le traitement de 1' ' v~;, des maladies ~u.liv~ . de la ci~rhoæ du foie, du diabète, de la formation de cataracte ainsi que du processus de ~ "
On peut en outre, I ' envisager de procéder à une conjointe d'un adénovirus selon rinvention avec au moins un second adénovirus un gène codant pour la catalaæ (P. Amstad et al. ~ y 1991, 30, 9305-9313), autre enzyme importante dans la régulation de la production en radicaux libres.
La presente invention concerne également une ll ~i'`'~
w~l au moins un ou plusieurs adénovirus défectifs tels que 21 qO8~3 wo 96/00790 r~,rA7~
décrits In~ - associé, le cas échéant, à un adén^virus un gène codant pour la catalase..
Cw ~ "- peuvent et~e fotmulées en vue d' ' -par voie topique, orale, ~ '~, intranasale, i.~ e~, ' ~, sous-5 cutanée, ' . i ' . etc. De préférence, les de rinvention ~ un véhicule 1 , acceptable pour une ~ ' injectable, notamment pour une injection ditecte chez le patient. Il peut s'agir en patticulier de solutians stétilw, ;~ , ou de - . . æches, ~ Iy~,' ' ' qui, par addition ælon le cas d'eau 10 stérilisée ou de ærum ~ . . permettent la . ~ de solutow in~ectablw.
A cet égatd, rinvention concetne également une méthode de t~aitement dw maladiw ~ w Cv l.~l r, 8 un patient d'un adénovitus æ ' tel que défini ci-avant. Plus, "` t, I'invention concetne une méthade de ttaitement des maladies ~ - r~
15 ~ ' . d'un adénovirus ' tel que défini ci-avant.
Les doses ~I'~rvvil~ ~~ ' défectif utilisées pour rinjection peuvent etre adaptées en fonction de différents ~ ` et en fonction du mode " ' utilisé, de la pathologie concetnée ou encore de la durée du traitement . ' D'une tnanière génétale, les adénovilus ' selon rinvention sont 20 fotmulés et ~ sous fotme de doses cotnprises entte 104 et 1014 pfulml, et de ptéfetence 106 a 101 pfu/ml. Le terme pfu (nplaque fa~ming unit") carrespond aupouvoir infectieux d'une solutian de virus, et est détvtminé par infection d'une culture cellulaire apptapriée, puis mesure, v' ' après 48 heures, du nombre de plages de oellules infectées. Les techniques de ,' du titre pfu d'une salutian vitale25 sant bien ~' - dans la littérature.
Un autre objet de l'inventian concerne toute cellule de ' infectee par un ou plusieurs adénovitus ' défectifs tels que décrits ci-dessus. Plus t, I'inventivn conoetne toute populatian de cellules humaines infectée par ces adénavitus. Il peut s'agir en particulier de r.~ . myoblastes, 30 h~ lh~ ~, cerlules i ' ' ' cellules Gliales, etc.
Les cellules selan rinventian peuvent être issues de cultures primaires. Celles-ci peuvent êtte prélevées par toute technique coMue de l'hamme du métier, puis mises en culture dans des conditi~s permettant leur ~ '~ S'agissant plus ' ` de -' '' ceux-ci peuvent etre aisément obtenus à partir de .
2 l ~088J
w096/00790 biopsies, p r exemple selon la technique décrite par Ham [Methods Cell.BioL 21a (1980) 255]. Ces oeliules peuvent être utiLisées ~ pour rinfe~tion par les sdénovirus, ou conservées, par exemple par ~ ,, ' pour ri ~ de banques o ~ guP~ en vue dbne utilisation ultérieure. Les oerlules selon rinvention 5 peuvent égaiement être des cuitures ' ~, obtenues par exemple à partir de banques préétablies.
Les oeLIules en culture sont ensuite infectées par des adénovims pour leur conférer la capacité de pmduire de la s..~yL~L~ dismutase.
L'i~fection est réalisée in vitro selon des techniques connues de l~nune du métier. En particulier, selon le type de oerluies utilisé et le nombre de copies de virus par cPllule désiré, l~nme du métier peut adapter la multipL;cité d'infectioQ Il est bier, entendu que ces étapes doivent être effectuées d ns des conditions de stérilité
lorsque les cerlules sont destinées à une ' in vivo. Les doses d'aL~.~)viLL~
utilisées pour l'infection des cerlules peuvent être adaptées par l'homme du métier selon le but recherché. Les conditions décrites ci-avant pour 1' in vivo peuvent être appliquées à l'infectionin vitro.
Un autre objet de rinverltion conoerne un implant I I des oeLIules mammifè~e infectéPs par un ou plusieurs adénovirus défectifs terles que décrites ci-dessus, et une matrioe ~ " prPfPrPn~lPIIPmPnt les implants selon I'invention ~ . 105 à 101 oellules. Plus 1 ' -' t, ils en Wl~ l- 106 à 108 Plus ~ ~.., dans les implants de rinvention, la matrice - c~ comprend un composé gélifiant et ~.. - un support permettant l'ancrage des celluies.
Pour la ~.~aLali~ll des implants selon l'invention, différents types de géLifiants peuvent être employés. LPS gélifiants sont utiLisés pour l'inclusion des oerlules dans une matrioe ayant la ~ d'un gel, et pour favoriser rancrage des oerlules sur le support, le cas échéant. Différents agents d'adhésion oerluiaire peuvent donc être utilisés comme gélifiants, teis que notamment le collagène, la gélatine, les ~, ~1~" ia [iln. les lectines, I'agarose etc.
Comme indiqué ci-avant, les ~ . selon rinvention ~ r a~ ' ~ ' un support permettant l'ancrage des oerluies. 1~ terme ancrage désigne toute fo~me, " biologique et/ou chimique et/ou physique entr~ûnant l'adhésion et/ou la fixation des oellules sur le support. Par airieurs, les oellules peuvent 2 1 9088~
WO 96/00790 P~~ 4 soit recouvrir le support utilisé, soit pénét~er à rin~rieur de ce support, soit les deux.
On préfère utiliser daDs le cadre de rinvention un support solide, non toxique et/ou bio-. , En particulier, on peut 1Itiliser des fibres de ~ 'ti.il ~ h.
S) ou un support d'origine biologique.
Les implants selon rinvention peuvent être implantés en diffé~ents sites de rl ~ En particulier, 1' ~,- peut être effectuée au niveau de la cavité
piSrit~ 1.o dans le tissu sous-cutané (région sus-pubier~De, fosses iliaques ou inguinales, etc), dans un organe, un muscle, une tumeur, le système nerveux central, ou encore sous une muqueuse. Les implants selon rinvention sont IJuliclAI;~
10 avantageux en oe sens qu'ils permettent de contrôler la Libération du produitih_~_r ', dans l'organisme: CeLle-ci est tout d'abord déterminée par la multiplicité
d'infection et par le nombre de oeLlules implantées. Ensuite, la libération peut être contrôlée soit par le retrait de rimplant, ce qui arrête !.c ,. Ie traitement, soit par rutilisation de systèmes d'~ r régulable, perrnettant d'induire ou de réprimer 15 r~lJl~Jll des genes , , La présente invention fournit ainsi des vecteurs viraux utilisables ~' en thérapie g&ique, I -^ adaptés et efficaces pour diriger rexpression de la sup~ ~ dismutase in vivo. La présente invention offre ainsi une nouveLle approche I -` a~ ' ~ pour le traitement etlou la prévention de 20 11~ ....1.... _ ~ 1.o1~. - cornme oelles citées I ' Les vecteurs ~.~.~ selon l'invention présentent en outre des avantages importants, Liés à leur très haute efficacité d'infection des oellules cibles, permethnt de réaliser des infections à par~ir de faibles volumes de suspension virale.
De plus, I'infection par les adénovirus de rinvention est très locaLisée au site d'injection, 25 ce qui évite les risques de di~fusion âUX structures oerébrales voisines. Ce traitement peut concerner aussi bien l'homme que tout animal tel que les ovins, les bovins, les rnurins, les animaux .' , (chiens, chats, etc), les chevaux, les poissons, etc.
Les exempL~s et la figure sont présentés ci-après à titre illustratif et non limitatif du dornaine de rinvention.
30 F~gu}e 1: Activité ~ , de la CuZnSOD humaine (hSOD-1) sur cellules NS20Y infectées par un ad&ovirus codant pour la hSOD-1 (O â 500 2~ ~0883 w096100790 I_l/r~
T~l~n;q -~ eén~l~ de hi.-lr~pie ~ -Les méthodes ~ - utilisées en biologie '' ' terles que les extractions ~ ~ d'ADN ~ . Ia ' _ d'ADN ~ r en gradient de chlorure de césiiim, r;~: r~ ~ sur geis d'agai~se ou .1'~.~ , la 5 purification de fragmeiits d'ADN par Cl~h. '' les extraction de protéines au phénol ou au phénol- '' ' la l~ d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de r~ , la ~ dalis ~ - ' coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont _' ' décrites dans la littératuie [Maiiiatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 10 Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et aL (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont d'origine ~ ' (Bethesda Research T ' `.
Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille 15 par ~ U~IW~ en gels d'agarose ou ~ ' ' extraits au phénol ou par un mélange l ' '/~ ' ' ' . précipités à l'éthanol puis incubés en présence de rA~N
ligase du phage T4 (BioLabs) selon les 1, ' du ~
Le ." ~ des extrémités 5' ~. peut être effectué par le fragment de Klenow de rADN Polymérase I d'E. coli (Bwolabs) selon les ~
20 du ~ La destruction des extrémités 3' ~, est effectuée en présence de l'ADN Polymér~ise du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les, ~ . . . -- : - ;. . - - du fabricant. La destruction des extrémités 5' l est effec~uée par un traitement ménagé par la nuclé~ise S1.
La ~ ` dirigée in viti~o par olil;~.~ ' ~ - ' I peut 25 être effectuée selon la méthode developpée par Taylor et aL rNucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit dist~ibué parAmersham.
L'~ de ilagments d'ADN par La technique dite de PCR
r~olymérase-catalyzed ~un ~eaction, Saiki R.K. et al., &ienoe ~Q (1985) 1350-1354; Mullis KB. et Faloona F.~, Meth. ED~ym. ~ (1987) 335-350] peut être 30 effectuée en utilisant un "DNA thermal cyclerr (Perkin Elmer Cetus) selon lesr;--:.. -dufabricant.
La vérification des séquences -' - ', peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. &i. USA, 74 (1977) 5463-5467] enu~isant le kit distribué par Amersham.
2 i 90883 wo s6/007so ~l/r~5~ ~4 EAemple 1: Protocole de des vecteurs pLTRlX-hSODl, pLTRIX-hSODl Gly37,etpLA~RlX-hSODlAsnl39 Ces vecteurs les séquences ccdant pour la SOD1 humaine type 5 sauvage ou mutée sous contrôle du LTR du virus RSV, ainsi que des séquences der~ ~ pe~mettant la ~ in vivo.
Les ADNc codant pour les différents types de SOD mis en oeuvre sont décrits dans Rosen et ~l., Nature, vol. ~, 52-62, et Deng et al., Science, vol. ~, 1047-1051.
Chaque ADNc est inséré dans un plasrnide Bluesc~ipt (~t~A~t~gPnP) entre les sites PstI et Hindm. Une séquence de ~l~a~.~ vl~ provenant de SV40 a auparavant été introduite dans le site Xhol du même plasmide. Ces plasmides ont pour nom SK-hSOD-PolyA, SK-hSODgly-PolyA et SK-hSODasn-PolyA.
LGS vecteurs pLTRIX-hSOD1, pLTRIX-hSOD1gly et pLTRIX-hSOD1 sont 15 obtenus en ' dans le site EcoRV du plasmide pLTRIX un insert obtGAnu par coupure de SK-hSOD-PolyA, SK-hSODgly-PolyA et SK-hSODasn-PolyA par KpnI et SacI (GAtrémités KpnI et Sacl rendues franches).
EAemple 2: C d'-' ...~ .. ' contenant une séquence codant pour la CuZn . ~.. A.~ &mutase i~ G humaine.
Le vecteur pLTR IX-hSOD1 est lin~risé et ~Y~L~ avec un vecteur adénovi~l déficient, dans les a~llules helpPr (lignée 293) apportant en trans les fonctions codées par les régions E1 (ElA et ElB) Plus ~ ' t, r~c..~,~h~ Ad-hSOD1 a Géte obtenu par . ~
homologue in vivo entre rad~r~...~ mutant Ad-dll324 ~ a et al., Cell 31 (1982) 543) et le vecteur pLTR IX-hSOD1, selon le proto~ole suivant: le pla~nidepLTR IX-hSOD1 et l'~l;.~vh~ Ad dl1324, linearisé par l'enzyme ClaI, ont été co-transfer,tés daiA,s la lignGe 293 en présence de phosphate de calcium, pour permettre la - h~ m~ gA,~P Lr,s adénovirus ' ainsi générés ont été
par I ' sur plaque. Après isolement, rADN de r~;a~uS
~- a été amplifié dans la ]ignée ~erlulaire 293, ce qui conduit à un surnageAnt de culture contenant r~.v. ~ défectif ' non pur~lé ayant un titre d'environ 101 pfu/ml.
Les par~icules virales sont ensuite purifiées par ~ ~ sur gradient.
0 ~3 W096rO0790 2 ~ 9 8 p~"~s, Exemple 3: Conh~le de l'expression in vitro de la hSOD-I.
Pour ce faire, on utilise le protocole de~it par 1~ et Fridovitch, 1971, Ann-Biochem, Vol.44, pp.276-278. Dans chaque cas, un extrait NP-40 est réalisé à partir de 500.000 oellules NS20Y
.",. . de souris), chargé sur gel d'~ ' non dénaturant, et une .~" , ' c x est réaJisée pendant 3 heures à 100 V.
La ~u~u~r~l~ dismutase est localisée en t~empant le gel da~s une solutiQn de nitrobleu de tétrazolium (NBT) et de ribrflavine puis dans une solution de 10 ~ho~ CI~MED~. Le gel est erlsuite iUurniné, et devient ainsi . r~ ..,...; bleu exoepté aux positions contenant la ;~U~u~!r~ dismutase, (la rib~flavine réduite en pr~sence de TEMED génère des radicaux :~U~.UAr~ après ~iU~ r~iUII à rair. Les radicaux superoxyde produits vont réduire le NBT incolore en Url composé bleu (formazan~. La SOD, en ~ les radicaux s,l~U~r~
15 produits, inhibera la réaction colorée, et apparaitra comme un spot incolore).
toxiques de l'oxygène. Une quantite accrue en SU~V~YU~ dismutase peut donc conduite à une prvduction accrue en eau r~xygénée avec les ,.-- t, explicitées Ce ~ ` " æ traduit notamment ~~ pa~ une _ " de la L~ v~v -~ ' avec diminution de la teneur en acide gras insaturés des lll~,.,~ oerlulaites et pout ~ , - principale une p- .
des fonctions Dans ce dernier cas, il ærait donc c.~ ,, de pouvoir réguler l'activité de la Su~u~ydd dismutase soit par exemple à l'aide d'ar,tisens ou de mutants dominants négatifs.
Le potentiel clinique de renzyme Su~v.~ydd dismutaæ est par ~ 1 I~J ~ . et il serait I "` important de pouvoir crJntrôler .-~r;. . ~n.
son activité soit en la stirnulant, la téprimant ou en y suppléant.
Plus ~ t, la présente invention réside dans la mise au point de vecteurs I ' ` efficaces pour délivrer in vivo et de maniè~re localiséd, des quantités i , , actives du gène spécifique codant pout une , yJe dismutase ou l'un de ses dérivés.
Dans la demande ~-r ' ' n PCT/EP93/02519, il a été mr~ntre que les adénovitus pouvaient êtte utilisés comme vecteur pour le transfert d'un gène étranger in vivo dans le système ner~eux et 1'~ de la protéine I ' -La ptésente invention concetne plus I "` des cu~U.,Liu nouverles, ~ "` adaptées et efficaces pour controler r~JII de la su~u~yde dismutase.
Plus 1~ t, er~e se tapporte à un adénovirus . I, 30 une æquence d'ADN propre à controler l'expression de la ~u~u~y~ dismutase, sa prépatation et son utilisation pour des traitements Ih' ~ et/ou la prévenùr)n de divetses ~
La ~' ' a ains~ mis en évidence qu'il est possible de cons~lruire des adénovirus ' - contenant une æquenoe cûdant pour une su~.u. yde .
21 9a883 wo 96/00790 dismutase, d' ' ces adénovi~us ' in vivo, et que cette ' permet une expression stable et lo~alisée de quantités i' ~ , actives de la superoxyde dismutase in vivo.
Un premier objet de l'invention réside donc dans un adénovi~us ' 5 défecLif ~ , ~ au moins une sequence d'ADN codant pour tout ou une partie active d'une DU~W~y~ dismutase ou l'un de ses dérivés.
La DU~Ay~ dismutase prcduite dans le cadre de la présente invention peut être une su~.,.y~c dismutase humaine ou animale. Selorl un mode de réalisation privilégié de rinvention, il s'agit de l'une des trois formes de la , yd~ dismutase 10 hurnaine ~ ' décrites, CuZnSOD (SODl), MnSOD (SOD2) et SOD
" ~, (SOD3). Plus ~ ' " ~ la séquence d'ADN intégrée dans r~l~.~,~uuD selon rinvention code pour tout ou ure partie active de la CuZn superoxyde dismutase humaine jn~rPII ' ' ~" hSOD1, ou run de ses dériv~s.
La séquence d'ADN codant pour la !, y~, dismutase, utilisée dans le cadre de la présente invention peut être un ADNc, un ADN génomique (ADNg), ou une ~ . ~t. 1-- ~ hybride consistant par exemple en un ADNc dans lequel se,raient ir~s un ou plusieurs ir~rons. Il peut également s'agir de séquences _, ' ' , ou .. ...
De manière ~uui' "` ' u~ _ , on utilise un ADNc ou un ADNg.
Selon un mode préferé de rirlvention, il s'agit une sequence d'ADN
génomique (ADNg) codant pour une , y~ dismutase. Son utilisation peut permetrre une meilleure expression dans les cellules Irumaines.
Bien entendu, ~ ' ' à son :. ~ ... dans un vecteur adéna~irus 25 selon l'invention, la séquence d'ADN peut être ~ ~ modifiée, par exemple par ~ ` dirigée, en particulier pour rinsertion de sites de res~riction appropriés.
Les séquerlces décrites dans rart antérieur ne sont en effet pas construites pour une utilisation selon rinvention, et des adaptations préalables peuvent s~avérer npru~e~
pour obtenir des e~ JIID 11~
Au sens de la présente invention, on entend par dérivé de la Du~Ayde dismutase, toute séquence obtenue par . ~ ~ .... et codant pour un produit conservant Ibne au moins des propriétés hir~ e de la , , ~, dismutase. Par ,,..~1 r;. ~-:.... on doit entendre toute mutation, ! ' '-' '- , délétion, addition ou 21 ~1~883 w0 s6/007so r~llr~ 4 ,.-,~lif;~ - de nature génétique et/ou chimique. Ces ~ '' peuvent être réal~ées pa~ les techniques connues de Illornme du métier (voir techniques générales de biologie ~ ci-après). Les dé~ivés au sens de l'invention peuvent également être obtenus pa~ hybridation à partir de banques d'acides nucléiques, en utilisant 5 comme sonde la séquence native ou un fragment de celle-ci.
Ces dérivés sont des molécules ayant une plus grande affinité
pour leurs sites de f~xation, des sequences pe~mettant une expression amélio~ée in vivo, des molécules présentant une plus g~ande résistance aux protéases, des lé~ules ayant une efficacité i~ plus grande ou des effets ~ . moindres, ou 10 ~ . 1 de nouvelles propriétés ~ -' 7"
Parmi les dérivés préférés, on peut citer plus 1 "` Ies va~iants natu~els, les molécules dans lesquelles un ou plu~iieurs residus ont été substitués, les dérivés obtenus par délétion de régions ~1'il.~ . . pas ou peu dans r.l.~Liu.~ avec les sites de liaison conr~dérés ou expnmant une activité ' ''~, et les dérivés 15 , . par rapport à la séquence native des résidus ~1 ' tels que par exemple un signal de sécrétion et/ou un pep~tide de jonctiorL
Par dérivé de la , ~u., dismutase on entend également couvrir dans le cadre de la présente invention, les mutants dits dominants négatifs de la ~U~U~r~
20 dismutase. Plus ~ t, dans ce cas, le gene cloné est alteré de manière a ce qu'il code pour un produit mutant capable d'inhiber ractivité cellulaire de la ,u~u~rd., dismutase sauvage. Ce type de dérivé est I ` intéressant lorsque l'on cherche par exemple à réprimer une ~ naturelle de la ~upL~u~rU~, dismutase.
La séquence d'~DN, codant pour tout ou partie de la su~u~r.le dismutase ou run de ses dérivés, peut également être une séquence antisens, dont rL, dans la cellule cible permet de contr;71er 1'~ 1 ~ de la , y.l~ dismutase.
r -~ -'I t, la séquence d'ADN I uI~g~ comporte un gène codant pour un ARN antisens capable de cont~ôler la traduction de l'ARNm ~ J~ La séquence antisens peut être tout ou seulement une partie de la séquence d'ADN, codant pour la su~u~r~ dismutase, insérée dans r~ inverse dans le vecteur selon rinvention.
i~elon un mode de realisation particulier de l'invention, la séquence d'ADN, codant pour la 1 rde dismutase ou run de ses derivés, intègre également un _ _ _ . _ _ _ _ . . , w0 96/00790 2 1 9 0 8 8 3 A ._I/r~
signal de sécrétion permettant de diriger la superoxyde dismutase synthétisée dans les voies de sécrétiorl des cerlules infectées. De cette manière, la su~yd. dismutase synthétisée est ~,.. _ libérée dans les, , P~rrll' Toutefois, il peut également s'agi~ d'un signal de sé~rétion h~ S, OU même 5 artificiel. Dans le cas particulier de la forme SOD3, le signal de sécrétion peut être _ le propre sig~nal de SOD3.
A~ ~ t, la séquence codant pour la su~ dismutase est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans les cerlules cibles.
pl~r -'1 t, il s'agit de signaux d'w~ t~ulGgvw~ c'est-à-dire de 10 signaux différents de ceux r~ r ' ' de rexE~ression de la L
dismutase. Il peut s'agir en particulier de sé~uences r ~ de r~ ~
d'autres protéines, ou de sequences ~ ~ N t, il peut s'agir de séquences l- ~. .- A- ;- ~ ~ de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de sé~uences 1~ issues du g~nome de la cellule que rOr~ désire infecter. De 15 même, il peut s'agir de séquences ~ issues du génome d'un virus, y compris r~ ,vu~utilis~Acetégard,onpeutciterparexemplelesl.. ~t~ ElA,MLP, CMV, LTR-RSV, etc. En outre, ces séquences LL'~, peuverlt être modifiées par addition de séquences d'activation, de rég~lation, ou permettant une expressiorl tissu-spécifique. Il peut en effet être I ' ` intéressant d'utiliser des signaux20 d~JII actifs, -, ou ; dans les ceriules cibles, de manière à ce que la séquence d'ADN ne soit exprimée et ne produise son effet quelorsque le VilUs a ~ . infecté une cellule cible.
Dans un prerluer mode de réalisation particulier, rinvention concerne un adénovilus I ' défectif ~ une séquence d'ADNc codant pour la 25 CuZn i~u~u~d~, dismutase hun aine ~ sous le contrôle du promoteur LTR-RSV.
Dans un autre mode de réalisation particulier, I'invention concerne un adénovirus ' défectif . , une séquence d'ADNg codant pour la CuZn , y~ dismutase hun3aine " ' sous le contrôle du promoteur 30LTR-RSV.
Un mo~e r préféré de mise en oeuvre de la présente invention réside dans un adénovirus ' défectif ~ , les séquences lTR, une séquence permettant r~ , une séquence d'ADN codant pour la CuZn u~d~. dismutase hurnaine " ' ou un dérivé de oelle-ci sous le contrôle .
q ~3 6100790 2 1, 08 r~llr~
d'un promotcur permettant une expression majoritaire dans les tissus cibles et dans lequel le gène E1 et au moins un des gènes E2, E4, L1-L5 est non ,r ~
Les adénovirus défectifs selon l'invention sont des adénovirus incapables de se répliquer de facon autonome dans la cellule cible. G. ' ~ le génome des 5 adénovirus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépour u au moins des séquences nccessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée.
Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en pa~tie), soit rendues non-- t~ , soit substituées par d'autres sequences et nflt~mtnPnt par la séquence d'ADN codant pour la ~U~IU~ y~ dismutase.
I~ t> le virus défecbf de rinvention conscrve Ics séquenccs de son génome qui sont néccssaircs à r ~ ,.. dcs particulcs viralcs. Encorc plus ~r~ .. 1l t, comme indiqué ci-avant, le gcnome du virus ' dcfcctif selon l'invcntion comprend Ics scqucnccs ITR, une séqucnce pcrmcttant le gcne E1 non fonctionnel et au moins un dcs gèncs E2, E4, L1-L5 nonr Il c~stc diffcrcnts sérotypes ~ d~uvilu.'~ dont la structure et Ics proprictcs varicnt quelquc peu. Parmi ccs sérotypcs, on prcfcrc utiliser dans le cadrc dc la prcsente invcntion Ics adcnovirus hurnains de t,vpe 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou lesadénovirus d'ar~g~ne anirnale (voir dcmande FR 93 05954). Parmi Ics adcnovirus d'aig~ne animale utilisables dans le cadre dc la présentc invention on peut citer Ics adénovirus d'~xig~ne canine, bovine, murine, (exemple: Mavl, ~3eard et al., V~logy 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviairc ou encore simienne (exemple: SAV). De préfcrence, rad~.uv~ d'ang~ne animale est un adénovirus carlin, plus un adénovilus CAV2 [souche manhattan ou A26161 (ATCC VR-800) par exemple]. De préférence, on utilisc dans le cadre de rinvention dcs adénovirus d'origine hurnaine ou canine ou mixte.
Les adénovicus ' défcctifs selon rinvcntion peuvent êtrc préparcs par toute techniquc cormue de l'hornme du mctier (Levrero et al., Gcne 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulicr, ils peuvcnt ctrc prcparés par ' homologuc entre un adénovi~us et un plasmidc portant entre autre la séquence d'ADN codant pour la su~.u~y~ dismutasc. La ' homologue se produit aprcs co-i r ' desdits adcnovi~us et pla~nide dans unc lignéc oellulairc ~rr~r~i~e La ligncc oerlulaire utilisée doit de 35 préference (i) êtrc j r ~~ ~ par lesdits éléments, et lu). comportcr Ics séquenoes 21 908~3 wo 96/00790 P~l/r~
capables de I , Ia partie du génome de r~d~ v.~ défectif, de préférence sous forme ~ntégrée pour éviter les risques de A titre d'exemple de lignée, on peut menti = la lignée de rein ~..~ , hurnain 293 (Graham et al., J. Gen. Vuol. 36 (1977) 59) qui contient t, intégrée darls son génome, la 5 pa~tie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 ~6). Des stratégies de ., " ,~de vecteurs dérivés des adénovirus ont également été décrites dans les demarldes n FR93 05954 et FR9308596 qui sont ;~ à la présente demande par référence.
Ensuite, les adénovims qui se sont multipliés sont récupe~s et purifiés selon 10 les techniques classiques de biologie Les propriétés I "` Il.~ ~ des vecteurs de l'invention découlent notamment de la c~ .. utilisée (ad~.v~..,.., défectif, délété de cert~unes régions vir les), du promoteur utilisé pour r~ , de la séquence codantpour la . yde dismutase (promoteur viral ou tissu-spécifique de préférence), et 15 des méthcdes d' dudit vecteur, permettant rexpression efficace et dans les tissus appropriés de la ~u~u~.yd~ dismutase.
La présente invention concerne également toute utilisation d'un adénovirus tel que décrit ci-dessus pour la I 1 d'une 1~ destinée au traitement et/ou à la prévential des I ~ ' citées. Plus 20 ~u i ` t, elle concerne toute utilisation de ces adénovirus pour la préparation d'une . lJ --.. - - l~ des~n~e au traitement et/ou à la préverltion dw maladies l..,~, ' ~ ' .w comme par exemple la maladie de Parkinson, la maladie d'AlzbeimOE, la scléroæ latérale ~..rv.~,lJh;q~ (~Ci), et la trisomie 21. Ils peuvent être également ~ utiliæs dans le traitement de 1' ' v~;, des maladies ~u.liv~ . de la ci~rhoæ du foie, du diabète, de la formation de cataracte ainsi que du processus de ~ "
On peut en outre, I ' envisager de procéder à une conjointe d'un adénovirus selon rinvention avec au moins un second adénovirus un gène codant pour la catalaæ (P. Amstad et al. ~ y 1991, 30, 9305-9313), autre enzyme importante dans la régulation de la production en radicaux libres.
La presente invention concerne également une ll ~i'`'~
w~l au moins un ou plusieurs adénovirus défectifs tels que 21 qO8~3 wo 96/00790 r~,rA7~
décrits In~ - associé, le cas échéant, à un adén^virus un gène codant pour la catalase..
Cw ~ "- peuvent et~e fotmulées en vue d' ' -par voie topique, orale, ~ '~, intranasale, i.~ e~, ' ~, sous-5 cutanée, ' . i ' . etc. De préférence, les de rinvention ~ un véhicule 1 , acceptable pour une ~ ' injectable, notamment pour une injection ditecte chez le patient. Il peut s'agir en patticulier de solutians stétilw, ;~ , ou de - . . æches, ~ Iy~,' ' ' qui, par addition ælon le cas d'eau 10 stérilisée ou de ærum ~ . . permettent la . ~ de solutow in~ectablw.
A cet égatd, rinvention concetne également une méthode de t~aitement dw maladiw ~ w Cv l.~l r, 8 un patient d'un adénovitus æ ' tel que défini ci-avant. Plus, "` t, I'invention concetne une méthade de ttaitement des maladies ~ - r~
15 ~ ' . d'un adénovirus ' tel que défini ci-avant.
Les doses ~I'~rvvil~ ~~ ' défectif utilisées pour rinjection peuvent etre adaptées en fonction de différents ~ ` et en fonction du mode " ' utilisé, de la pathologie concetnée ou encore de la durée du traitement . ' D'une tnanière génétale, les adénovilus ' selon rinvention sont 20 fotmulés et ~ sous fotme de doses cotnprises entte 104 et 1014 pfulml, et de ptéfetence 106 a 101 pfu/ml. Le terme pfu (nplaque fa~ming unit") carrespond aupouvoir infectieux d'une solutian de virus, et est détvtminé par infection d'une culture cellulaire apptapriée, puis mesure, v' ' après 48 heures, du nombre de plages de oellules infectées. Les techniques de ,' du titre pfu d'une salutian vitale25 sant bien ~' - dans la littérature.
Un autre objet de l'inventian concerne toute cellule de ' infectee par un ou plusieurs adénovitus ' défectifs tels que décrits ci-dessus. Plus t, I'inventivn conoetne toute populatian de cellules humaines infectée par ces adénavitus. Il peut s'agir en particulier de r.~ . myoblastes, 30 h~ lh~ ~, cerlules i ' ' ' cellules Gliales, etc.
Les cellules selan rinventian peuvent être issues de cultures primaires. Celles-ci peuvent êtte prélevées par toute technique coMue de l'hamme du métier, puis mises en culture dans des conditi~s permettant leur ~ '~ S'agissant plus ' ` de -' '' ceux-ci peuvent etre aisément obtenus à partir de .
2 l ~088J
w096/00790 biopsies, p r exemple selon la technique décrite par Ham [Methods Cell.BioL 21a (1980) 255]. Ces oeliules peuvent être utiLisées ~ pour rinfe~tion par les sdénovirus, ou conservées, par exemple par ~ ,, ' pour ri ~ de banques o ~ guP~ en vue dbne utilisation ultérieure. Les oerlules selon rinvention 5 peuvent égaiement être des cuitures ' ~, obtenues par exemple à partir de banques préétablies.
Les oeLIules en culture sont ensuite infectées par des adénovims pour leur conférer la capacité de pmduire de la s..~yL~L~ dismutase.
L'i~fection est réalisée in vitro selon des techniques connues de l~nune du métier. En particulier, selon le type de oerluies utilisé et le nombre de copies de virus par cPllule désiré, l~nme du métier peut adapter la multipL;cité d'infectioQ Il est bier, entendu que ces étapes doivent être effectuées d ns des conditions de stérilité
lorsque les cerlules sont destinées à une ' in vivo. Les doses d'aL~.~)viLL~
utilisées pour l'infection des cerlules peuvent être adaptées par l'homme du métier selon le but recherché. Les conditions décrites ci-avant pour 1' in vivo peuvent être appliquées à l'infectionin vitro.
Un autre objet de rinverltion conoerne un implant I I des oeLIules mammifè~e infectéPs par un ou plusieurs adénovirus défectifs terles que décrites ci-dessus, et une matrioe ~ " prPfPrPn~lPIIPmPnt les implants selon I'invention ~ . 105 à 101 oellules. Plus 1 ' -' t, ils en Wl~ l- 106 à 108 Plus ~ ~.., dans les implants de rinvention, la matrice - c~ comprend un composé gélifiant et ~.. - un support permettant l'ancrage des celluies.
Pour la ~.~aLali~ll des implants selon l'invention, différents types de géLifiants peuvent être employés. LPS gélifiants sont utiLisés pour l'inclusion des oerlules dans une matrioe ayant la ~ d'un gel, et pour favoriser rancrage des oerlules sur le support, le cas échéant. Différents agents d'adhésion oerluiaire peuvent donc être utilisés comme gélifiants, teis que notamment le collagène, la gélatine, les ~, ~1~" ia [iln. les lectines, I'agarose etc.
Comme indiqué ci-avant, les ~ . selon rinvention ~ r a~ ' ~ ' un support permettant l'ancrage des oerluies. 1~ terme ancrage désigne toute fo~me, " biologique et/ou chimique et/ou physique entr~ûnant l'adhésion et/ou la fixation des oellules sur le support. Par airieurs, les oellules peuvent 2 1 9088~
WO 96/00790 P~~ 4 soit recouvrir le support utilisé, soit pénét~er à rin~rieur de ce support, soit les deux.
On préfère utiliser daDs le cadre de rinvention un support solide, non toxique et/ou bio-. , En particulier, on peut 1Itiliser des fibres de ~ 'ti.il ~ h.
S) ou un support d'origine biologique.
Les implants selon rinvention peuvent être implantés en diffé~ents sites de rl ~ En particulier, 1' ~,- peut être effectuée au niveau de la cavité
piSrit~ 1.o dans le tissu sous-cutané (région sus-pubier~De, fosses iliaques ou inguinales, etc), dans un organe, un muscle, une tumeur, le système nerveux central, ou encore sous une muqueuse. Les implants selon rinvention sont IJuliclAI;~
10 avantageux en oe sens qu'ils permettent de contrôler la Libération du produitih_~_r ', dans l'organisme: CeLle-ci est tout d'abord déterminée par la multiplicité
d'infection et par le nombre de oeLlules implantées. Ensuite, la libération peut être contrôlée soit par le retrait de rimplant, ce qui arrête !.c ,. Ie traitement, soit par rutilisation de systèmes d'~ r régulable, perrnettant d'induire ou de réprimer 15 r~lJl~Jll des genes , , La présente invention fournit ainsi des vecteurs viraux utilisables ~' en thérapie g&ique, I -^ adaptés et efficaces pour diriger rexpression de la sup~ ~ dismutase in vivo. La présente invention offre ainsi une nouveLle approche I -` a~ ' ~ pour le traitement etlou la prévention de 20 11~ ....1.... _ ~ 1.o1~. - cornme oelles citées I ' Les vecteurs ~.~.~ selon l'invention présentent en outre des avantages importants, Liés à leur très haute efficacité d'infection des oellules cibles, permethnt de réaliser des infections à par~ir de faibles volumes de suspension virale.
De plus, I'infection par les adénovirus de rinvention est très locaLisée au site d'injection, 25 ce qui évite les risques de di~fusion âUX structures oerébrales voisines. Ce traitement peut concerner aussi bien l'homme que tout animal tel que les ovins, les bovins, les rnurins, les animaux .' , (chiens, chats, etc), les chevaux, les poissons, etc.
Les exempL~s et la figure sont présentés ci-après à titre illustratif et non limitatif du dornaine de rinvention.
30 F~gu}e 1: Activité ~ , de la CuZnSOD humaine (hSOD-1) sur cellules NS20Y infectées par un ad&ovirus codant pour la hSOD-1 (O â 500 2~ ~0883 w096100790 I_l/r~
T~l~n;q -~ eén~l~ de hi.-lr~pie ~ -Les méthodes ~ - utilisées en biologie '' ' terles que les extractions ~ ~ d'ADN ~ . Ia ' _ d'ADN ~ r en gradient de chlorure de césiiim, r;~: r~ ~ sur geis d'agai~se ou .1'~.~ , la 5 purification de fragmeiits d'ADN par Cl~h. '' les extraction de protéines au phénol ou au phénol- '' ' la l~ d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de r~ , la ~ dalis ~ - ' coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont _' ' décrites dans la littératuie [Maiiiatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 10 Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et aL (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont d'origine ~ ' (Bethesda Research T ' `.
Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille 15 par ~ U~IW~ en gels d'agarose ou ~ ' ' extraits au phénol ou par un mélange l ' '/~ ' ' ' . précipités à l'éthanol puis incubés en présence de rA~N
ligase du phage T4 (BioLabs) selon les 1, ' du ~
Le ." ~ des extrémités 5' ~. peut être effectué par le fragment de Klenow de rADN Polymérase I d'E. coli (Bwolabs) selon les ~
20 du ~ La destruction des extrémités 3' ~, est effectuée en présence de l'ADN Polymér~ise du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les, ~ . . . -- : - ;. . - - du fabricant. La destruction des extrémités 5' l est effec~uée par un traitement ménagé par la nuclé~ise S1.
La ~ ` dirigée in viti~o par olil;~.~ ' ~ - ' I peut 25 être effectuée selon la méthode developpée par Taylor et aL rNucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit dist~ibué parAmersham.
L'~ de ilagments d'ADN par La technique dite de PCR
r~olymérase-catalyzed ~un ~eaction, Saiki R.K. et al., &ienoe ~Q (1985) 1350-1354; Mullis KB. et Faloona F.~, Meth. ED~ym. ~ (1987) 335-350] peut être 30 effectuée en utilisant un "DNA thermal cyclerr (Perkin Elmer Cetus) selon lesr;--:.. -dufabricant.
La vérification des séquences -' - ', peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. &i. USA, 74 (1977) 5463-5467] enu~isant le kit distribué par Amersham.
2 i 90883 wo s6/007so ~l/r~5~ ~4 EAemple 1: Protocole de des vecteurs pLTRlX-hSODl, pLTRIX-hSODl Gly37,etpLA~RlX-hSODlAsnl39 Ces vecteurs les séquences ccdant pour la SOD1 humaine type 5 sauvage ou mutée sous contrôle du LTR du virus RSV, ainsi que des séquences der~ ~ pe~mettant la ~ in vivo.
Les ADNc codant pour les différents types de SOD mis en oeuvre sont décrits dans Rosen et ~l., Nature, vol. ~, 52-62, et Deng et al., Science, vol. ~, 1047-1051.
Chaque ADNc est inséré dans un plasrnide Bluesc~ipt (~t~A~t~gPnP) entre les sites PstI et Hindm. Une séquence de ~l~a~.~ vl~ provenant de SV40 a auparavant été introduite dans le site Xhol du même plasmide. Ces plasmides ont pour nom SK-hSOD-PolyA, SK-hSODgly-PolyA et SK-hSODasn-PolyA.
LGS vecteurs pLTRIX-hSOD1, pLTRIX-hSOD1gly et pLTRIX-hSOD1 sont 15 obtenus en ' dans le site EcoRV du plasmide pLTRIX un insert obtGAnu par coupure de SK-hSOD-PolyA, SK-hSODgly-PolyA et SK-hSODasn-PolyA par KpnI et SacI (GAtrémités KpnI et Sacl rendues franches).
EAemple 2: C d'-' ...~ .. ' contenant une séquence codant pour la CuZn . ~.. A.~ &mutase i~ G humaine.
Le vecteur pLTR IX-hSOD1 est lin~risé et ~Y~L~ avec un vecteur adénovi~l déficient, dans les a~llules helpPr (lignée 293) apportant en trans les fonctions codées par les régions E1 (ElA et ElB) Plus ~ ' t, r~c..~,~h~ Ad-hSOD1 a Géte obtenu par . ~
homologue in vivo entre rad~r~...~ mutant Ad-dll324 ~ a et al., Cell 31 (1982) 543) et le vecteur pLTR IX-hSOD1, selon le proto~ole suivant: le pla~nidepLTR IX-hSOD1 et l'~l;.~vh~ Ad dl1324, linearisé par l'enzyme ClaI, ont été co-transfer,tés daiA,s la lignGe 293 en présence de phosphate de calcium, pour permettre la - h~ m~ gA,~P Lr,s adénovirus ' ainsi générés ont été
par I ' sur plaque. Après isolement, rADN de r~;a~uS
~- a été amplifié dans la ]ignée ~erlulaire 293, ce qui conduit à un surnageAnt de culture contenant r~.v. ~ défectif ' non pur~lé ayant un titre d'environ 101 pfu/ml.
Les par~icules virales sont ensuite purifiées par ~ ~ sur gradient.
0 ~3 W096rO0790 2 ~ 9 8 p~"~s, Exemple 3: Conh~le de l'expression in vitro de la hSOD-I.
Pour ce faire, on utilise le protocole de~it par 1~ et Fridovitch, 1971, Ann-Biochem, Vol.44, pp.276-278. Dans chaque cas, un extrait NP-40 est réalisé à partir de 500.000 oellules NS20Y
.",. . de souris), chargé sur gel d'~ ' non dénaturant, et une .~" , ' c x est réaJisée pendant 3 heures à 100 V.
La ~u~u~r~l~ dismutase est localisée en t~empant le gel da~s une solutiQn de nitrobleu de tétrazolium (NBT) et de ribrflavine puis dans une solution de 10 ~ho~ CI~MED~. Le gel est erlsuite iUurniné, et devient ainsi . r~ ..,...; bleu exoepté aux positions contenant la ;~U~u~!r~ dismutase, (la rib~flavine réduite en pr~sence de TEMED génère des radicaux :~U~.UAr~ après ~iU~ r~iUII à rair. Les radicaux superoxyde produits vont réduire le NBT incolore en Url composé bleu (formazan~. La SOD, en ~ les radicaux s,l~U~r~
15 produits, inhibera la réaction colorée, et apparaitra comme un spot incolore).
Claims (28)
1. Adénovirus recombinant défectif comprenant au moins une séquence d'ADN codant pour tout ou une partie active d'une superoxyde dismutase ou l'un de ses dérivés.
2. Adénonrus selon la revendication 1 caractérisé en ce que la séquence d'ADN est une séquence d'ADNc.
3. Adénovirus selon la revendication 1 caractérisé en ce que la séquence d'ADN est une sequence d'ADNg.
4. Adénovirus selon la revendication 1, 2 ou 3 caractérisé en ce que la séquence d'ADN code pour une superoxyde dismutase humaine.
5. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que la séquence d'ADN code pour la CuZn superoxyde dismutase humaine intracellulaire, SOD1 ou l'un de ses dérivés.
6. Adénovirus selon l'une des revendication 1 à 3 caractérisé en ce que la séquence d'ADN code pour un mutant dominant négatif d'une superoxyde dismutase humaine.
7. Adénovirus selon la revendication 1 caractérisé en ce que la séquence d'ADN est une séquence antisens dont l'expression permet de contrôler l'expression du gène codant pour la superoxyde dismutase.
8. Adénovirus selon la revendication 7 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un gènecodant pour un ARN antisens capable de contrôler la traduction de l'ARNm de la superoxyde dismutase.
9. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisé en ce que la séquence d'ADN est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans les cellules cibles.
10. Adénovirus selon la revendication 9 caractérisé en ce que les signaux d'expression sont choisis parmi les promoteurs viraux, de préférence parmi les promoteurs E1A, MLP, CMV et LTR-RSV.
11. Adénovirus selon la revendication 10 comprenant une séquence d'ADNg codant pour la CuZn superoxyde dismutase intracellulaire humaine sous le contrôle d'un promoteur LTR-RSV.
12. Adénovirus selon la revendication 10 comprenant une séquence d'ADNc codant pour la CuZn superoxyde dismutase intracellulaire humaine sous le contrôle d'un promoteur LTR-RSV.
13. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisé en ce qu'il estdépourvu des regions de son génome qui sont nécessaires à sa réplication dans lacellule cible.
14. Adénovirus selon la revendication 13 caractérisé en ce qu'il comprend les ITR et une séquence permettant l'encapsidation, et dans lequel le gène E1 et au moins un des gènes E2, E4, L1-L5 sont non fonctionnels.
15. Adénovirus selon la revendication 13 ou 14 caractérisé en ce qu'il sagit d'un adénovirus humain de type Ad 2 ou Ad 5 ou canin de type CAV-2.
16. Utilisation d'un adénovirus selon l'une des revendications 1 à 15 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention des maladies neurodégénératives.
17. Utilisation selon la revendication 16 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention de la maladie de Parkinson, d'Alzheimer, de Huntington, de l'ALS, de la trisomie 21.
18. Composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs adénavirus recombinants défectifs selon l'une des revendications 1 à 15.
19. Composition pharmaceutique selon la revendication 18 caractérisée en ce qu'elle contient en outre un adénovirus comportant un gène codant pour la catalase.
20. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 18 à 19 caractérisée en ce qu'elle est sous forme injectable.
21. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 18 à 20 caractérisée en ce qu'elle comprend entre 104 et 1014 pfu/ml, et de préférence 106 à
1010 pfu/ml adénovirus recombinants défectifs.
1010 pfu/ml adénovirus recombinants défectifs.
22. Cellule de mammifère infectée par un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs selon l'une des revendications 1 à 15.
23. Cellule selon la revendication 22 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule humaine.
24. Cellule selon la revendication 23 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule humaine de type rétinienne, fibroblaste, myoblaste, hépatocyte, cellule endothéliale, cellule Gliales ou kératynocyte.
25. Implant comprenant des cellules infectées selon les revendications 22 à 24 et une matrice extracellulaire.
26. Implant selon la revendication 25 caractérisé en ce que la matrice extracellulaire comprend un composé gélifiant choisi de préférence parmi le collagène, la gélatine, les glucosaminoglycans, la fibronectine et les lectines.
27. Implant selon les revendications 25 ou 26 caractérisé en ce que la matriceextracellulaire comprend également un support permettant l'ancrage des cellules infectées.
28. Implant selon la revendication 27 caractérisé en ce que le support est constitué préférentiellement par des fibres de polytétrafluoroéthylène.
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