CA2247179C - Utilisation de l'il-7 dans le traitement des maladies auto-immunes, en particulier le diabete mellitus insulinodependant - Google Patents

Abstract

L'invention concerne une utilisation de l'interleukine-7 ou de lymphocytes T préalablement incubés en présence d'IL-7 pour la préparation d'un médicament ou d'une composition pharmaceutique pour le traitement d'une maladie auto-immune, en particulier une maladie auto-immune générée par un défaut dans l'immunorégulation par les cellules T CD4+.

Description

WO 97!31648 PCT/FR97/00343 -Utilisation de !'I1-7 dans le traitement des maladies auto-immunes, en particulier le diabte mellitus insulinodpendant".

La prsente invention concerne une nouvelle utilisation de finterieukine-7 (IL-7) dans le traitement des maladies auto-immunes, en particulier le diabte mellitus insulinodpendant.

' Le diabte de type 1 ou diabte mellitus insulinodpendant (DMID) est considr aujourd'hui comme une maladie auto-immune {Endocr.
Rev. 1994, 75 (4), 516-542), caractrise par fa prsence d'anticorps anti-cellules bta et par sa sensibilit une thrapie immunosuppressive. Le DMID
rsulte la fois chez l'homme et chez la souris "nonobese diabetic" {NOD), d'une rponse immunitaire de type cellulaire prdominante, la rponse humorale tant caractrise par fa scrtion d'anticorps anti-membrane et anti-produits scrtoires de cellules bta {N. Engl. J. Med. 1981, 304, 1454.1465, N. Engl. J.

Med., 1992, 327, 302). La rponse immunitaire de type cellulaire est caractri-se par des lsions histologiques ou "insulitis" provoques par des infiltrations de cellules inflammatoires et immunitaires de types macrophages, lymphocytes B et T (intrieur des flots de Langefians du pancras (Diabetoiogia, 1989, 32, 282-289 ; lnsulitis and type 1 diabetes, Academic Press Tokyo, 1986, 35-50).

La souris NOD est un modle spontan du diabte auto-immun ou diabte de type 1. Des arguments convergents indiquent que la survenue de la maladie est sous le contrle de cellules T immunorgulatrices CD4+. Celle-ci est en effet acclre par fa thymectomie ralise (ge de 3 semaines (Eur.
J. Immuno, 1989, 99, 889-895) et peut tre prvenue, dans un systme de transfert, par la coinjecon de thymocytes ou de cellules splniques CD4+ de jeunes souris NOD non encore diabtiques (J. Exp. Med., 1989, 769, 1669-1680).

II a t suggr et montr de manire indirecte que les cellules lymphocytes T

helper 2 (Th2) de par leur capacit produire de finterleukine-4 (IL-4) sont les cellules T immunorgulairices CD4+ dont il est question (Autoimmunity, 1993, 95, 113-122). !l a en effet t montr que l'administration d'IL-4 (J. Exp. Med.

1993, 178 (1}, 87-99) ou d'anticorps monoclonal anti-interfron-y (IFNJy) prvient le dclenchement du diabte et que l'administration d'interieukine-12 (IL-12), inducteur de lymphocytes T helper 1 (Th1}, acclre le dclenchement du diabte (J. Exp. Med., 1995, 181 (2), 817-821).
,, Nanmoins, une autre tude a montr que si des cellules 'Th2-ke"

diabtologiques retrouves infiltres dans les flots ne provoquaient pas fappari-tion de la maladie, elles n'offraient pas pour autant de protection significative (Science, 1995, 268 (5214), 1185-1188). Ainsi, s'il a t suggr et montr de

2 manière indirecte que le déclenchement du diabète chez la souris NOD est sous le contrôle des cellules Th2, aucune explication n'est donnés ou suggérée sur le caractère de (anomalie présente chez les souris NOD, du processus physiologique qui en découla et qui est à (origine de l'émergence d'uns auto-immunité anti-flots de Langherans à l'origine du diabète chez ces animaux.
II a égaiement été suggéré récemment que fa différenciation des cellules Th2 pouvait ëtre contrôlée par un sous-type de cellules T caractérisé par le phénotype TCR-aj3, CD4'CD8'(doubie négative, DN) ou CD4+CD8-(positive simple), porteurs d'un phénotype mature (non expression du "Heat Stable Antigen", HSA), exprimant sélectivement le marqueur d'activation CD44. Cette sous-population, qui est caractérisée égaiement dans d'autres souches par le marqueur NK1.1, a la capacité de produire en grande quantité de (1L-4 après stimulaüon par un anticorps polyclonal anti-TCR-aj3 (TCR-a.j3 : récepteur ap des cellules T) (J. Immunoi.1995, 155 (10), 4544-4550).
D'autre part, il a été montré que ce sous-type a la particularité d'être restreint 15 par des molécules de classe I du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH}
et d'utiliser préférentiellement te gène V(38 du récepteur T (J. Frxp. Med., 1993, 178, 901-908), sous type dont la proliféraüon est induite de manière spécifique par finterieukine-7 (J. Exp. Med. 1994, 18Q (2), 653-661).
Les protéines interleukine-7 de mammifères (cytokine IL-7s), en particulier chez 2~ l'homme et la souris, les ADNs con-espondants, les vecteurs d'expression codant pour les IL-7s, Peurs procédés de production, incluant les systèmes recombinants ont été décrits (US 4 965 195).
Les protéines interleukine-7 de mammifères sont désignées ci-après "IL-7".
L'lL
7 est un facteur de croissance lymphopoiéüque qui a la capacité de stimuler le 25 développement et la prolifération de cellules de la moelle osseuse (W0 89/03884). La stimulation de la producüon de plaquettes (VllO 90/09194) par induction de la prolifération de mégacaryocytes a été une des premières applications de l'administration de (1L-7. D'autres applications de (1L-7 ont ëgalement été décrites comme celle pour le traitement du cancer ou de

3~ l'infection virale par immunothérapie à partir de cellules modifiées produisant de a (1L-7, soit par une injection directe de cellules modifiées in vivo, soit par une phase préalable de traitement in vitro avant injection (V1/0 92/01459). A
également été décrite l'utilisation de (!L-7 pour la prolifération de lymphocytes T
humains spécifiques anti-HIV comme thérapie potentielle du SIDA (J. af Leucocyte 8iology, 1995, 58 (6), 623-633), pour le traitement du mélanome malin dans le domaine de fa dermatologie (Hautarzt, 1995, 46 (10), 676-682) ainsi que comme potentialisateur d'un vaccin pour fa prévention d'une infection (microbienne et virale) et de l'établissement d'une tumeur (W0 94/22473). A
également été décrite (utilisation d'anticorps anti-IL-7 pour ~I'étude et la recherche de processus physiologiques et pathologiques, en particulier conce~
nant ta différenciation et la prolifération des lymphocytes (WO 94!28160).
D'autres applications associant (utilisation de (IL 7 avec d'autres cytokines ont été décrites comme (association avec (1L-4 pour (induction in vitm de la différenciation des ceNules pré-B (W0 94104658) ou avec (1L-3 pour le traitement de la leucopénie (VIIO 92104455) et pour fa prevention de désordre de fa moelle osseuse après thérapie cancéreuse ou greffe de moelle (W0 93/03061 ).
Les auteurs de la présente invention ont à présent montré _sur la base d'une étude phénotypique en cytométrie de flux utilisant les marqueurs HSA, CD4, CDB, CD44. et VpB, qu'une sous population de thymocy~es de phénotype CD4.4'TCR-ap HSA' et utilisant préféren~etfement te gène V~8 du récepteur T
est numériquement réduite chez la souris NOD âgée de 3 semaines (à la fois pour les populations CD4'CD8'DN (double négative CD4'C08~ et CD4' (simple positive)) et âgée de 8 semaines (pour la populatjon DN). Il a été égaiement 2p trouvé qu'aux deux àges, cette sous-population produit peu ou pas d'1L-4.
Enfin, les auteurs de 1a presente invention ont montré que cette double anomalie numérique et fonctionnelle est corrigée in vitro et in vivo par f IL-7, facteur de croissance de cette sous-poputaüon cellulaire et qu'ainsi fI~ 7 est en mesure de protéger des mammifères du diabète, notamment du diabète mellitus in-sutinodépendant, cette propriété pouvant s'étendre également à toutes maladies auto-immunes, générées par un défaut de production d'!L-4 par les cellules Th2 et notamment par ladite sous population cellulaire décrite ci-dessus et de manière générale à toutes maladies auto-immunes, notamment celles générées par un défaut dans fimmunorégulation par les cellules CD4;.
Ainsi, selon (un de ses aspects, la présente invention a pour objet (utilisation de (!L-7 ou de lymphocytes T préalablement incubés en présence d'IL-7 ou modifés produisant (1L-7, pour la preparation de médicaments ou composiüons pharmaceutiques pour le traitement des maladies auto-immunes générées

4 par un défaut de production d'IL-4 par les cellules Th2.
Tout particuliérement préférées parmi lesdites maladies auto-imrüunes sont les maladies auto-immunes générées par un défaut de production d'IL-4 lié à un déficit quantitatif et fonctionnel de sous-type de cellules T de phénotype HSA', CD4'CD8' ou CD4~'CD8', CD4.4', TCR-a~i~, V~38', NK 1.1' Parmi lesdites maladies auto-immunes, outre ~ 1e diabète mellitus insulinodépendant, fencéphato-myélite auto-immune, (arthrite rhumatoïde auto-immune, la polyarthrite, les hépatites auto-immunes de type 2, la gastrite auto-immune, la sclérose auto-immmune, la sialadénite, fadrénalite, foophorite, les 9tomérulonéphrites, la thyroïdïte auto-immune peuvent préférentiellement âtre traitées par lesdits médicaments,ou compositions, comme tout mécanisme pathogénique de type auto-immun dans une thérapie associée au traitement du SIDA. ' Préférentiellement, la maladie auto-immune est le diabète mellitus insulinodépendant.
Avantageusement, les lymphocytes T préalablement incubés en présence d'IL-7, utilisés selon la présente invention, sont des cellules autotogues ou syngéni-ques des cellules des patients auxquels les compositions les comprenant sont destinées.
L'invention comprend également des compositions pharmaceutiques offrant une nouvelle approche pour traiter les maladies auto-immunes générées par un défaut dans fimmunorégulation par les cellules T CD4'.
En partiarfier Pinvention comprénd des compositions pharmaceutiques offrant une nouvelle approche pour traiter les maladies auto-immunesvgénérées par un défaut de production d'IL-4 par les cellules Th2, tout particulièrement les maladies auto-immunes générées par un défaut de production d'IL-4 lié à un déficit quantitatif et fonctionnel de sous-type de cellules T de phénotype HSA', CD4'C08' ou CD4'CD8', CD4.4', TCR-agi', Vp8', NK 1.1' comme notamment le diabète meltitus insutinodépendant.
Ds telles compositions comprennent comme principe actif de (1L-7, préférentiel-lement sous forme soluble, et/ou des lymphocytes T autologues ou syngéni-ques des cellules du patient auquel la composition pharmaceutique est desti-n ne, lesdits lymphocytes T ayant t pralablement incubs en prsence d'IL-7.

Elles peuvent galement se prsenter sous forme d'associations avec d'autres principes acfs, par exemple d'autres agents immunomodulateurs.

Ces diffrentes compositions peuvent tre administres selon plusieurs modes S
d'administration, que !'homme du mtier poun-a dterminer en fonction du type de composition concerne.

Les compositions comprenant de fIL-7 comme principe actif peuvent par exemple tre administres par voie systmique, d prfrence par voie intraveineuse, par voie intramusculaire, intradermique ou par voie orale.

Les compositions comprenant des lymphocytes T comme principe actif sont prfrentiellement administres par voie intraveineuse ou intrapritonale.

Les modes d'administration prfrs ainsi que les posologies et formes galniques optimales peuvent tre dtermins seian les critres gnralement pris en compte dans l'tablissement d'un traitement thrapeutique adapt un 1 S paient comme par exemple (ge ou le poids corporel du patient, la gravit de son tat gnral, la tolrance au traitement et les effets secondaires constats.

La prsente invention concerne galement un procd de fabrication d'un mdicament ou composition pharmaceutique pour le traitement des maladies auto-immunes, en particulier les maladies auto-immunes gnres par un 20 dfaut dans fimmunorgulation par les cellules T CD4+ caractris en ce que l'on mlange de fIL-7 etlou des lymphocytes T autologues ou syngniques des cellules du patient auquel la composition est destine, lesdits lymphocytes T

ayant t pralablement incubs en prsence d'IL-7, avec un vhicule ou diluant phartnaceutiquement acceptable, ventuellement en association avec d'autres principes actifs.

En particulier (invention concerne un procd de fabrication d'un mdicament ou composion pharmaceutique pour le traitement de maladies auto-immunes gnres par un dfaut de production d'IL-4 par les cellules Th2, tout particulirement les maladies auto-immunes gnres par un dfaut de producon d'IL-4 li un dfrcit quantitatif et fonctionnel de sous-type de cellules T de phnotype HSA-, CD4-CD8' ou CD4+CD8-, CD44+, TCR-a.~', V(38+, NK1.1+ comme notamment le diabte mellitus insunodpendant.

La prsente invention concerne une mthode de traitement thrapeutique caractrise en ce que l'on administre une dose thrapeutiquement efficace d'interieukine-7 ou de lymphocytes T préalablement incubés en présence d'iL-7 à un patient atteint d'une maladie auto-immune, en particulier une maladie auto-immune générée par un défaut dans l'immunorégulation par les cellules T
CD4+.
De manière avantageuse, la méthode selon l'invention s'applique au traitement du diabète mellitus insulinodépendant.
La présente invention est illustrée par les figures 1 et 2 ci-après.
La figure 1 montre (effet correcteur in vitro de fIL-7 sur la production d'1L-4 par des cellules thymocytes matures HSA- CD8- chez la souris NOD et C57BU6 jeune (fiacre la) et adulte (figure 1 b) .
Dans l'expérience présentée, les thymocytes HSA' CD8- fraïchement recueillis de souris NOD ou C57BU6 jeunes (âgées de 3 semaines) ou adultes {âgées de 8 semaines) sont cultivés à 1,0 x 10$ cellules/puits avec un anticorps monoclonal anti-TCR-«(3 en présence {colonne hachurée) ou en absence {colonne vide) d'IL-7 à 1000 U/ml. Le surnageant est recueilli après 48 heures d'incubation et dosé en lL-4 par ELISA (moyenne sur 3 à 4 expériences indépendantes).
D'autres caractéristiques et avantages de (invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples et les tableaux regroupant les résultats des essais expérimentaux.
La figure 2 montre (effet du traitement des souris par L'IL-7 sur la production primaire d'IL-4 par les spfénocytes.
Dans l'expérience présentée les souris de différentes souches àgées de 8 à
12 semaines reçoivent des injections sous-cutanées quotidiennes de 2pg d'IL-7 ou d'albumine sérique bovine (excipient) pendant 7 jours consécutifs.
Le huitième jour, les souris sont traitées par l'anticorps anti-CD3 puis les splénocytes cultivés (5.108 cellules par puits) et la production d'1L-4 mesurée par le test CT.4S. Le pourcentage d'augmentation de fa production d'IL-4 est calculé de la manière suivante : ((quantité d'IL-4 produite après traitement par (!L-7) / (quantité d'!L-4 produite après traitement par (excipient)-1)x100. Les résultats correspondent à une expérience type. Les productions d'IL-4 (U/ml) par les splénocytes des souris traitées par l'excipient sont respectivement de 94,3 ; 53,5 ; 11,0 et 11,4 pour les souris BALB/c, C57BU6, NOD et C57BU6[32m-~-.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) Etude de l'ontooénie des thvmocytes CD44' TCR-a.Q~ chez la souris NOD
comparée à la souris C57BU6 non diabétique.
Des souris d'élevage et C57BU6 femelles sont maintenues dans des conditions d'environnement spécifiques de non pathogénicité. Toutes les souris NOD sont vérifiées comme ne manifestant aucun signe évident de diabète (pas de glycosurie ou d'hyperglycémie). Les thymus d'environ 5 à 15 souris exsangues sont prélevés avec soin puis sont mélangés. Les thymocytes matures double t 0 négatifs (DN) et CD4' simples positifs sont ensuite enrichis par incubation à
37°C pendant 40 minutes avec des anticorps anti-CD8 (3-155 ; IgM de rat décrit dans J. immunol., 1980, 125, 2665-2672), anti-HSA (J11d; IgM de rat, Phamli-gen} et anti-complément (complément de lapin Low Tox Cederiane, Ontario, Canada). Les cellules mortes sont ensuite éliminées par centrifugation en gradient de densité (J. Prep., Techgen, Les Ulis, France). Une cytoméirie de flux des anticorps spécifiques différents de ceux utilisés pour la lyse cellulaire montrent que plus de 95 % des cellules récupérées sont de phénotype HSA-CD8'.
Le marquage est effectué comme décrit dans J. Exp. Med. 1994, 180, 653-661.
20 Les anticorps utilisés sont produits par des hybridomes commercialisés. Les anticorps anti-TCR-agi (clone H57-597, Pharmigen) ou antiV~B (clone F23.1 décrit dans J. Immunol. 143, 3994-4000) biotinylés ou marqués à la ffuores-céine (F1TC) sont utilisés combinés avec des anticorps anti-CD4 (clone RM 4.5, Pharmigen) marqués à la Phycoérytnne (PE) ebou avec des anticorps anti-CD44 (clone IM 7.8, Pharmigen) marqués à la FITC.
Pour le marquage à 3 couleurs, les cellules, après incubation en présence des anticorps biotinylés, sont ensuite incubées avec les anticorps monoclonaux appropriés marqués à la FITC et La PE et conjugués à la streptavidine-Tricolor (SAv-Tri, Caltag).
Le contra" le de témoin de marquage non spécifique est effectué en parallèle.
L'appareil utilisé est un cytomètre de flux FACScan* (Bedon Dickinson, Mountain View, CA). La prise minimum d'échantillon est environ égaie à 1 x 10~
cellules viables.
* (marques de commerce) WO 97/31648 PCT/FR97/~0343 Le dosage de la production de cytokine est effectué à partir de cellules en culture sur milieu tel que décrit dans J. of lmmunol., 1995, 755 (10), 4544-et J. Exp. Med. 1994, 180, 653-661. Environ 105 cellules sont déposées par puits dans des cupules fond rond de microplaque 96 puits (Nunc, Roskilde, Danemark), chaque essai éiant reproduit trois fois. Les cupules sont recouvertes de 10 ~g/ml d'anticorps anti TCR-aø (clone H57-597) et les cellules sont incubées 48 heures en présence ou en absence d'IL-7 à 1 000 U/mi (Sanofi, Toulouse, France} pour 200 ~I de volume final par puits, le surnageant est ensuite recueilli et stocké à -70°C avant dosage d'IL-4.
Le dosage d'IL-4 est effectué par la méihode ELISA type sandwich, comme décrit dans J. of Immunol. 1995, 155 (10) 4544-4550.
Les résultats obtenus et illustrés par le tableau 1 ci-dessous, montrent que !apparition de la sous-population de thymocytes de phénotype TCR-a~3+
CD44+, quantifiée parmi les cellules T HSA'CD8', est retardée chez la souris NOD comparée à la souris C57BU6 avec une diminution très significative observée à !âge de 3 semaines.

de CD44'TCR-a' SOUCHE AGE (SEMAINES) dans la population de thvmocWes HSA-CD8-i C57BU6 3 *2~.1 t 0,8 8 27.9 t 10.1 2~ NOD 3 12.~ t 0,3 8 2~.3 t 7.0 Les résultats représentent la moyenne et (écart type obtenu sur 4 à 5 expérimentations indépendantes.
* p ~ 0,001 versus la souris NOD âgés de 3 semaines (test de Student).

Le tableau 2 ci-dessous représente les résultats obtenus sur des populations de thymocytes double négatives (CD4' CD8~ et CD4+ chez les souris NOD et C57BLl6 âgées de 8 à 10 semaines. Le niveau de la sous-population CD44' TCR-a.~i' chez la souris NOD reste encore diminué à 8 semaines comparé à la souris non aiteinte de maladie auto-immune.
TABLEAU Z
SOUCHE *% de CD44'TCR-a,(3T
dans CD4~ CD4- CD8' NOD 23 ~ 8 34 t 1 C57BL/6 26 ~ 10 *59 t 7 Moyenne et écart-type obtenus sur 3 à 4 expérimentations différentes * p < 0,001 versus de la souche NOD (test de Student) II a été également vérifié que les cellules de thymocytes caractérisées par le phénotype HSA' CD8- CD44+ présentent bien la restriction du gène V(38 mentionné plus haut.
De même, il a été vérifié (voir figure 1 ) que les cellules thymocytes HSA' CD8' CD44+ chez la souris témoin produisaient en quantité importante de fIL-4 lorsque stimulées par un anticorps monoclonal anti-TCR-a(3 alors que chez !a souris NOD, cette production chute de manière dramatique à 3 et 8 semaines, même en tenant compte du nombre réduit de cellules HSA' CD8' CD44+ (tableau 1 ).

WO 97/3164$ PCT/FR97/00343 Correction in vitro par 1'1L-7 du déficit fonctionnel de la sous population de thvmocvtes chez la souris NOD.

5 S'il a déjà été montré que l'IL-7 induit de manière spécifique la prolifération de la sous-population de thymocytes HSA' CD8' CD44+DN (J. Exp. Med., 1994, ?S0, 653-661), les résultats obtenus représentés par la figure numéro 1 montrent en particulier que, de façon surprenante, la production d'IL-4, dosée sur les thymocytes après 48 heures d'incubation en présence 10 d'IL-7 et d'un anticorps anti-TCRa(i redevient normale chez la souris NOD
adulte (âgée de 8 semaines), comparée à la souris C57BU6 d'âge équivalent.

Expériences in vivo montrant l'effet protecteur de 1'1L-7 sur la survenue du diabète chez la souris NOD.
Les deux expériences décrites ci-après montrent que les cellules lymphoï
des provenant de la glande thymique de souris NOD âgées de 3 semaines peuvent protéger contre fa survenus du diabète dans un modèle de ca transfert. Précisément, 50 millions de thymocytes totaux de souris de 3 semaines injectés simultanément avec 5 à 10 millions de cellules spléniques de souris NOD diabétiques à des receveurs NOD irradiés de 10 semaines, empêchent la survenue du diabète normalement observé lorsque les cellules spléniques sont injectées seules. L'injection de moins de 10 millions de thymocytes n'a pas cet effet protecteur. Cependant, lorsque les thymocytes ont été préalablement incubés in vitro en présence d'IL-7 pendant 60 heures à 37°C, un million de thymocytes assure la protection dans le modèle de co-transfert décrit ci-dessus.
En outre, il est connu qu'une injection de cyciophosphamide (200 mg/kg) , provoquait l'apparition d'un diabète chez des souris NOD mâles âgées de 8 semaines dans un délai très inférieur (10 à 20 jours) à ceiui de l'apparition spontanée du diabète (2 à 4 mois). Un traitement in vivo par 1'1L-7 consistant en 2 injections d'IL-7, administrées la veille et le lendemain de !'injection de cyclophosphamide protège contre la survenue du diabète . induit par la cyclophosphamide.
Ces deux séries d'expériences indiquen# que 1'1L-7 a un rôle protecteur contre la survenue d'un diabète chez les souris génétiquement prédisposées.
3.1 Protection du diabète par des thymocytes incubés en présence d'interleukine-7 dans un modèle de co-transfert.
Des #hymocytes sont préparés à partir d'un thymus de souris NOD
femelles âgées de 3 semaines. Ces thymocytes sont incubés in vitro pendant 60 à 72 heures à 37°C dans du milieu RPMi contenant 10 % de sérum de veau foetai et additionné d'IL-7 (500-1000 U/ml). Au terme de cette incubation, on injecte simultanément 4, 2 ou 1 million(s) de ces thymocytes et 5 ou 10 millions de ceflules spléniques de souris NOD
récemmen# devenues diabétiques à des souris NOD mâles âgées de 10 semaines irradiées par une dose de 700 rad. La survenue d'un diabète est suivie trôis fois par semaine par la recherche d'une glycosurie et confirmée lors u'une I cosurie est observée q g y par la mise en évidence d'une hyperglycémie.
Les résultats indiqués dans te tableau 3 ci-joint montrent que les thymocytes incubés en présence d'IL-7 protègent contre le diabète à des doses qui ne sont pas protectrices lorsque des #hymocytes non incubés en présence d'IL-7 sont utilisés.
A

WO 97/31648 PCT/F'R97/00343 Effet protecteur de thymocytes totaux traités par 1'/L-7 dans un modèle de diabète induit par transfert passif de cellules provenant de souris diabétiques.
Exp- ThvmocytesNbre Nbre de souris diabtiques en I

rience transfrs d'ani- fonction du nombre de semaines aprs I

maux le transfert 1 sem 4 sem 8 sem

6 sem . . .
.

No 1 - 6 0 4 5 5 non traits6 0 3 4 6 traits 6 0 0 0 1 par l'IL-7 ~5 No2 - 5 0 0 4 4 traits 8 0 0 0 0 par 1'IL-7 No 3 - 8 0 6 6 NT

traits 6 0 0 0 NT
par l'IL-7 NT : non testé
3.2. Protection contre le diabète induit par une infection de ~rclophosphamide par des infections d'interleukine-7 Des souris NOD femelles âgées de 6 à 7 semaines ont reçu une injection de 200 mg/kg de cyclophosphamide, encadrée aux jours -1 et +1 par une injection intraveineuse de 1 p.g d'IL-7. La survenue d'un diabète est dëtectée par la recherche d'une glycosurie et d'une hyperglycémie selon les modalités indio~.;ées dans l'exemple 1.
Les résultats montrés dans le tableau 4 indiquent que le traitement par 1/L-7 prévient significativement la survenue du diabète par rapport aux souris ayant reçu du cyclophosphamide sans IL-7.

WO 97/31648 ï'CT/FR97/00343 Effet protecteur de fIL-7 dans le modèle de diabète induit par le cyclophosphamide Nombre de souris diabtiques aprs Traitement Nombre de 2 semaines suivant l'injection souris de cwclophosphamide L'ensemble de ces résultats montre que les souris NOD présentent de manière précoce un déficit d'une sous-population de cellules thymocytaires HSA'CDBTCR-aø+, exprimant le marqueur CD44, avec ia restriction Vø8 et ayant la capacité de produire fIL-4 (appelées cellules T NK'l', récemment identifiée dans les souches non-autoimmunes). Ce déficit numérique est associé de manière surprenante à un déficit fonctionnel exprimé par une réduction importante de la production d'IL-4.
2o Les résultats indiquent que l'anomalie de ce déficit chez les souris NOD, touchant à la fois les sous-populations de thymocytes CD4-CD8- (DN) et CD4+ (simple positive) est corrigée in vitro par l'utilisation de 1'1L-7.
D'autre part, les expériences menées in vivo, que ce soit par injection de cellules préalablement incubées en présence d'IL-7 ou par injection directe d'une quantité efficace d'IL-7 chez la souris montrent que l'utilisation d'lL-

7 a un effet protecteur contre le déclenchement de maladie auto-immune comme en particulier le diabète.

8 PCT/FR97/00343 Traitement in vivo par 1'1L-7 Le traitement in vivo par fIL-7 potentialise la production d'IL-4 par les cellules T spléniques (figure 2). Cet effet de 1'1L-7 est obtenu dans l'ensemble des souches de souris testées (C57BL/6, BALB/c, NOD) et il est maximal chez la souris auto-immune NOD qui présente un déficit de production d'IL-4 en périphérie (légende de la figure 2). L'absence d'augmentation de la production d'lL-4 chez les souris C57BU6 dépourvues du gène de la X32-microgiobuline et donc déficientes en cellules T NK1+, suggère que l'action de de l'IL-7 est ciblée sur les celuies T NK1+.
Le protocole d'injection d'IL-7 par voie sous cutanée comprend deux doses de 2~.g par jour pendant une durée de 4 à 7 jours consécutifs. Des souris contrôles sont traitées par un volume identique de solution d'excipient (albumine sérique bovine). La production d'lL-4 est relevée après une unique ,injection (1,33p.g) par voie intraveineuse d'un anticorps dirigé
spécifiquement contre ia molécule CD3 marine (anti-CD3, clone 145-2C11, IgG de hamster). Les animaux sont sacrifiés 90 minutes suivant l'injection de l'anticorps anti-CD3 ; les rates sont immédiatement prélevées et les cellules spléniques mises en culture pendant 90 minutes en l'absence de toute stimulation (Yoshimoto et al., J. Exp. Med, 979, 1285-1295). Le milieu RPMI contenant du sérum de veau foetal décompiémenté (10%), du (3-mercaptoéthanof (0,05 mM) et des antibiotiques (pénicilline 100 UI/ml et streptomycine 100~,g/ml) est utilisé pour l'ensemble des expériences de culture cellulaire. Les surnageants sont prélevés et leur contenu en IL-4 déterminé par ie test biologique CT.4S, une lignée dépendant de fIL-4 (Hu Li et al., J. Immunol., 142, 800-807). La concentration d'1L-4 est exprimée en U/ml (une unité correspond approximativement à 1 pg) d'après une courbe standard é#ablie avec des dilutions sériées d'IL-4 recombinante mucine. La limite de sensibilité du test est d'environ 10 U/ml.
L'absence de production d'!L-4 en périphérie par des cellules T NK1' chez la souris NOD pourrait expliquer le déficit de ia fonction Th2 qui WO 97!31648 PCT/FR97l00343 -s'accompagne de l'émergence de cellules diabétogènes de type Th1 responsables de la maladie auto-immune dans cette souche.
Ces résultats qui constituent la démonstration princeps d'un effet in vivo pharmacologique de !'1L-7 sur la production d'IL-4 par les cellules T NK1+

ouvrent des perspectives sur !e rôle protecteur de 11L-7 vis à vis de l'apparition du diabète auto-immun. Plus généralement, ces données expérimentales permettent de proposer l'utilisation de !'1L-7 comme arme thérapeutique de déviation de la réponse immune en faveur d'un profil de type Th2.

Claims (8)

REVENDICATIONS

1. Utilisation de l'interleukine-7 ou de lymphocytes T préalablement incubés en présence d'IL-7, pour la préparation d'un médicament ou d'une composition pharmaceutique pour le traitement d'une maladie auto-immune générée par un défaut de production d'IL-4 par tes cellules Th2.

2. Utilisation selon la revendication 1, ladite maladie auto-immune étant générée par un défaut de production d'IL-4 lié à un déficit quantitatif et fonctionnel de cellules T de sous type HSA-, CD4-CD8- ou CD4+CD8-, CD44+, TCR-.alpha..beta.+, V.beta.8+, NK1.1+.

3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, ladite maladie auto-immune étant choisie parmi le diabète mellitus insulinodépendant, l'encéphalo-myélite auto-immune, l'arthrite rhumatoïde auto-immune, la polyarthrite, les hépatites auto-immunes de type 2, la gastrite auto-immune, la sclérose auto-immune, la sialadénite, l'adrénalite, l'oophorite, les glomérulonéphrites, la thyroïdite auto-immune, et les mécanismes pathogéniques de type auto-immun dans une thérapie associée au traitement du SIDA.

4. Utilisation selon la revendication 1, 2, ou 3, ladite maladie auto-immune étant 1e diabète mellitus insulinodépendant.

5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, lesdits lymphocytes T étant des cellules autologues ou syngéniques des cellules du patient auquel la composition pharmaceutique est destinée.

6. Composition pharmaceutique pour le traitement des maladies auto-immunes générée par un défaut de production d'IL-4 par les cellules Th2, comprenant à
titre de principe actif des lymphocytes T autologues ou syngéniques des cellules du patient auquel la composition pharmaceutique est destinée, lesdits lymphocytes T ayant été préalablement incubés en présence d'IL-7.

7. Composition pharmaceutique selon fa revendication 6 pour le traitement d'une maladie auto-immune générée par un défaut de production d'IL-4 lié à un déficit quantitatif et fonctionnel de cellules de sous-type HSA-, CD4-CD8- ou CD4+CD8-, CD44+, TCR-.alpha..beta.+, V.beta.8+, NK1.1+

8. Composition pharmaceutique selon la revendication 6 ou 7, pour le traitement du diabète mellitus insulinodépendant.