CA2261094C - Gene chimere a plusieurs genes de tolerance herbicide, cellule vegetale et plante tolerantes a plusieurs herbicides - Google Patents

Gene chimere a plusieurs genes de tolerance herbicide, cellule vegetale et plante tolerantes a plusieurs herbicides Download PDF

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Abstract

1. Gène chimère à plusieurs gènes de tolérance herbicide, cellule végétale e t plante tolérantes à plusieurs herbicides. 2. La plante est tolérante à la fois à plusieurs herbicides, notamment aux inhibiteurs de l'HPD et à ceux de l'EPSPS et/ou aux dihalogénohydroxybenzonitriles. 3. Utilisation pour le désherbage de plantes avec plusieurs herbicides.

Description

G~NE CHIM~RE Ä PLUSIEURS G~NES DE TOLÉRANCE
HERBICIDE, CELLULE VÉGÉTALE ET PLANTE
TOLÉRANTES Ä PLUSIEURS HERBICIDES
La présente invention a pour objet un gène chimère à plusieurs gènes de tolérance herbicide, une cellule végétale et une plante tolérantes à plusieurs herbicides.
Dans la suite de la description, les herbicides seront désignés selon le nom commun en particulier référencé dans "The Pesticide Manual" 10 th edition par British Crop Protection Council.
On connaît des plantes qui ont été transformées pour être tolérantes à
certains herbicides comme notamment les dihalogénohydroxybenzonitriles, en particulier le bromoxynil et l' ioxynil, grâce au gène codant pour la nitrilase dégradant ces herbicides ou encore celles tolérantes aux herbicides inhibiteurs de l'EPSPS notamment le glyphosate, le sulfosate ou la fosametine ou encore aux inhibiteurs de l' acétolactatesynthase (ALS) du type des sulfonylurées ou encore aux inhibiteurs de la dihydro-pteroate synthase tel que l'asulam ou encore aux inhibiteurs de la glutamine synthase tels que le glufosinate.
On connaît certains herbicides tels que les isoxazoles décrites notammeiît dans les demandes de brevets français no. 2,734,840 et 2,734,841 et notamment l'isoxaflutole, herbicide sélectif du maïs, les dicétonitriles tels que ceux décrits dans les demandes européennes 0 496 630, 0 496 631, en particulier 1a ?-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-S02 CH3-4-CF3 phényl) propane-1, 3-dione et la ~'.-cyano-3-cyclo-propyl-1-(2-S02CH3-4-2,3 C12 phényl) propane-1,3-dione, les tricétones décrites àans les demandes européennes 0 625 505 et ~~ 62 . 508, en p.~a!~:' ~rul.~er_ la sulcotr Zone ou emcore celles décrites ~~lans l'U.~P 5 506 195, ou enwore les pyrazo-linates. De plus le gPne codant pour l'HPPD conférant une tolérance à ces derniers herbicides a étF~ isolé et des plantes transgéniques 1e contenant c~bt~~nues montrant une _~~¿ c-:.1_e'~~i':~e ~ 1~~'.lf 1 '=tf . 'l c' e t: '-OT t ~ ' O~~~e~: c'(~~'~
Ciemcl;îdeS
françaises P~1° 2, 734, 8~_'_ rit 2, î34, 841.

la Cependant Ia pratique agricole montre que les agriculteurs aiment disposer pour le traitement des plantes, et notamment des cultures, d'associations d'herbicides en particulier pour répondre à différents problèmes de désherbage dûs aux limites du spectre des herbicides pris isolément. II peut être en outre intéressant de disposer d' un gëne de marquage de sélection associé à un gène de tolérance herbicide. II y a donc un besoin de plantes et notamment de cultures présentant une tolérance à plusieurs herbicides, de préférence au moins deux ou trois .
2 PCT/FR97/01256 I1 a maintenant été découvert qu'on pouvait conférer à une cellule végétale et à une plante un tolérance herbicide multiple.
La présente invention a d'abord pour objet un gène chimère comprenant au moins deux ~~ènes chimères élémentaires contenant chacun, dans le sens de la transcription. des éléments de régulation nécessaires à sa transcription dans les plantes c'est à dire au moins une séquence de régulation promotrice, au moins une partie codante hétérologue comprenant une séquence codante codant pour une enzyme conférant aux plantes la tolérance à un herbicide et au moins une séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation.
Comme séquence codante, on peut notamment utiliser toutes celles connues pour conférer la tolérance de plantes à certains inhibiteurs telles que:
- celle de l'EPSPS pour ia tolérance au glyphosate, au sulfosate ou à la fosamétine, notamment celles de la protéine mutée ou non, on peut citer notamment les brevets;
- USP 4 535 060, EP 115 673, USP 4 769 061, USP 5 094 945; USP 4 971 908, USP

l45 783. EP 293 358; EP 378 985 , WO 91/04323; WO 92 044 449; WO 92 06201.
Dans ia suite ce type de gène sera désigné par séquence ou gène "EPSPS".
On peut également citer la glyphosate oxydoréductase (cf WO 92/ 000 377) enzyme de détoxification du glyphosate.
- celle du gène de la nitrilase de Klebsiella sp. pour la tolérance aux dihalogénobenzonitriles décrite dans l'L'SP 4 810 648 et en particulier celui issu de Klebsiella ozaenae, qui sera désigné dans la suite par gène ou séquence "OXY".
celle de l'HPPD telle décrite dans les demandes françaises non publiées N°95/06800, 95/i3570 et 96/05944 citées ci-dessus. Cette HPPD peut être de toute nature.
Plus particulièrement cette séquence peut être d'origine bactérienne, telle que notamment le genre Pseudomonas ou encore d'origine végétale, telle que notamment de plante monocotylédone ou dicotylédone, notamment d'Arabidopsis ou d'ombellifères comme par exemple la carotte (Daucus carota). Elle peut être native ou sauvage ou éventuellement mutée tout en gardant fondamentalement une propriété de tolérance herbicide contre les inhibiteurs de l'HPPD, tels que les herbicides de la famille des isoxazoles ou de celle des tricétones ou des pyrazolinates.
D'autres séquences peuvent être utilisées:
- celle de la phosphinotrycine acëtyl transférase ou celle de la glutamine synthase pour la tolérance au glufosinate (cf EP 0 242 236) - celle de la dihydroptéroate synthase pour la tolérance à fasulam (cf EP 0 367) - celle de PALS pour la tolérance aux sulfonylurées
3 - celle de la Protoporphyrogen oxydase ("protox") pour la tolérance aux herbicides de la famille des diphényléthers tels que l'acifluorfen ou l'oxyfluorfen ou celle des oxadiazoles tels que l'oxadiazon ou l'oxadiargyl ou celle des imides cycliques tels que le chlorophthalim ou celle des phénylpyrrazoles tel que le TNP ou celles des pyridines et les phénopylates et analogues carbamates (cf WO 95/34659).
De préférence l'un des gènes chimères contient une séquence codante de l'HPPD.
Dans ce cas l'autre ou les autres séquences peuvent être quelconques et notamment choisies dans le groupe mentionné ci-dessus. De préférence les autres séquences sont choisies dans le groupe comprenant le gène de la nitrilase de tolérance aux dihalogénohydroxybenzonitriles l0 et un gène EPSPS.
Les gènes chimères selon l'invention peuvent en outre contenir des gènes codant pour des propriétés autres que de tolérance herbicides tels que par exemple des gènes de résistance aux insectes, tels que ceux de type Bacillus thurigensis conférant une résistance à
divers représentants de la famille des coléoptères, des lépidoptères, ou encore des gènes de résistance aux nématodes, des gènes de résistance aux maladies fongiques ou microbiennes, ou encore des gènes conférant des propriétés agronomiques telles que les gènes des diverses desaturases intervenant dans la production des acides gras. On peut citer en particulier celui de la delta -6 desaturase décrit dans la demande internationale WO 93/06712.
Comme séquence de régulation promotrice on peut utiliser toute séquence promotrice d'un gène s'exprimant naturellement dans les plantes en particulier un promoteur d'origine bactérienne, virale ou végétale tel que, par exemple, celui d'un gène de la petite sous-unité
de ribulose-biscarboxylase (RuBisCO) ou de celui d'un gène de l'ot tubuline (Demande européennne EP n° 0 652 286), ou encore d'un gène de virus de plante tel que, par exemple, celui de la mosaïque du choux fleur (CaMV 19S ou 35S), mais tout promoteur convenable connu peut être utilisé. De préférence on a recours à une séquence de régulation promotrice qtti favorise la surexpression de la séquence codante, tel que par exemple, celle comprenant au moins un promoteur d'histone tel que décrit dans la demande européenne EP
0507698.
Selon l'invention, on peut également utiliser, en association avec la séquence de régulation promotrice, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de trancription "enhancer", comme par exemple l'activateur de translation du virus etch du tabac (TEV) décrit dans la demande W087/07644, ou des peptides de transit, soit simples, soit doubles, et dans ce cas éventuellement séparés par une séquence intermédiaire, c'est à dire comprenant, dans le sens de la transcription, une séquence codant pour un peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, une partie de séquence de la partie mature N
terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, puis une séquence codant pour un second peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, constituée d'une partie de séquence de la partie mature N
4 terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, tels que décrit dans la demande européenne n' 0 508 909.
Comme séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation, on peut utiliser toute séquence correspondante d'origine bactérienne, comme par exemple le ternùnateur nos d'Agrobacterium tumefaciens, ou encore d'origine végétale, comme par exemple un terminateur d'histone tel que décrit dans la demande européenne EP n° 0 633 317.
L'invention a encore pour objet une cellule végétale, de plantes monocotylédones ou dicotylédones, notamment des cultures, tolérante à aux moins deux herbicides dont au moins - un est un inhibiteur de l'HPPD. Cette cellule peut contenir au moins deux gènes chimères comprenant chacun une séquence codant pour la tolérance à un herbicide et dont l'un comprend une séquence codant pour l'HPPD. Les deux gènes chimères peuvent être soit portés par un même vecteur, soit chacun sur un vecteur différent, soit encore apportés tels quels par introduction dans la cellule par des moyens physiques ou physico-chimiques, par exemple par microinjection, électroporation ou bombardement, selon des méthodes en soi ï 5 connues.
L'invention a encore pour objet une plante transformée tolérante à au moins deux herbicides dont un est inhibiteur de fHPPD. Cette plante peut être obtenue soit par croisement d'au moins deux plantes contenant chacune un gène codant pour la tolérance à un herbicide, soit par régénération d'une cellule selon l'invention, telle que décrite ci-dessus.
Les plantes peuvent être des monocotylédones ou dicotylédones, notamment des cultures, grandes cultures telles que par exemple mais de manière non limitative pour les dicotyledones le tabac, le coton, le colza, le soja, la betterave, et pour les monocotyledones le maïs et les céréales à paille, ou en tore des cultures maraichères ou florales.
L'invention a encore pour objet un procédé d'obtention de plantes à tolérance herbicide multiple par trangénèse végtale, caractérisé en ce que:
- dans une première étape, on insère dans plusieurs cellules respectivement un des gènes élémentaires contenant chacun des éléments de régulation nécessaires à sa transcription dans les plantes et une séquence codante codant pour une enzyme conférant aux plantes la tolérance à un herbicide, et que - ensuite les plantes sont croisées pour obtenir des plantes à tolérance multiple.
L'invention a encore pour objet un autre procédé d'obtention de plantes à
tolérance herbicide multiple par trangénèse végétale, une première étape comportant l' intégration dans des cellules végétales d'au moins deux gènes de tolérances à un herbicide dont au moins un est un inhibiteur de l'HPPD, la seconde étape compremant la régénération de la plante à
partir des cellules transformées selon l'invention.
La transformation peut être obtenue par tout moyen connu approprié, amplement décrit dans la littérature spécialisée et notamment les demandes et brevets cités dans la présente demande.

~~ne série de méthodes consiste à bombarder des cellules ou des protoplastes avec des particules auxquelles sont accrochées les séquences d'ADN. Selon l'invention ces ADN
peuvent être portés par les mêmes particules ou par des bombardements différents. Une autre série de méthodes consiste à utiliser comme moyen de transfert dans la plante un gène
5 chimère inséré dans un plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens ou Ri d Agrobacterium rhi~ogenes.
D'autres méthodes peuvent être utilisées telles que la micro-injection ou l'électroporation.
L'homme de métier fera le choix de la méthode appropriée en fonction de la nature de la plante, notamment de son caractère monocotylédone ou dicotylédone.
On a observé que des plantes transformées selon l'invention présentent une tolérance significative aux inhibiteurs de l'hydroxy phényl pyruvate dioxygénase tels que certains herbicides récents tels que les isoxazoles décrites notamment dans les demandes de brevets IS français 9506800 and 95 13570 et notamment du 4-[4-CF3-2-(méthylsulfonyl) benzoylJ-5-cyclopropyl isoxazole.ou "isoxaflutole", herbicide sélectif du maïs, les dicétonitriles tels que ceux décrits dans les demandes européennes 0 496 630, 0 496 63 I , en particulier la 2-cyano-3-cyclopropyl-I-(2-S02 CH3-4-CF3 phényl) propane-1,3-dione et la 2-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-S02 CH3-4-2,3 CI2 phényl) propane-1, 3-dione, les tricétones décrites dans les demandes européennes 0 625 505 et 0 625 508, en particulier la sulcotrione et les pyrazinolates. Ces mêmes plantes selon l'invention présentent une tolérance significative à
d'autres herbicides tels que par exemple les dihalogéno benzonitriles, notamment le bromoxynil et l'ioxynil, le glyphosate et ses analogues, le glufosinate La présente invention a encore pour objet les plantes régénérées à partir des cellules transformées. La régénération est obtenue par tout procédé approprié qui dépende de la nature de l'espèce, comme par exemple décrit dans les demandes ci-dessus. Les plantes selon l'invention peuvent encore être obtenues par croisement de parents, chacun d'eux portant l'un des gènes de tolérance herbicide décrites.
L'invention a enfin pour objet un procédé de désherbage de plantes, notamment de cultures, à l'aide d'un herbicide de ce type, caractérisé en ce qu'on applique cet herbicide sur des plantes transformées selon l'invention, tant en présen~is, en prélevée qu'en postlevée de la culture. Par herbicide au sens de la présente invention on entend une matière active herbicide seule ou associée à un additif qui modifie son efficacité comme par exemple un agent augmentant l'activité (synergiste) ou limitant l'activité (en anglais safener).
Bien entendu, pour leur application pratique, les herbicides ci-dessus sont associée de manière en soi connue aux adjuvants de formulations utilisés habituellement en agrochimie Selon l'invention l'un des gènes de tolérance herbicides présents dans les plantes peut être utilisé comme marqueur de sélection, soit in vitro, soit in vivo .
6 w Les différents aspects de l'invention seront mieux compris à l'aide des exemples expérimentaux ci-dessous.
Exemple l: Isolement du gène de l'HPPD de P.,fli~orescens A32 A partir de la séquence en acides aminés de l'HPPD de Pseudomonas sp. P.J. 874 publié par Rüetschi U. et al. 1992. Eur. J. Biochem. 205: 459-466), on déduit la séquence de différents oligonucléotides pour amplifier par PCR une partie de la séquence codante de l'HPPD de P. fluorescens A32 (isolée par McKellar, R.C. 1982. J. Appl Bacteriol. 53:305-316). Un fragment d'amplification du gène de cette HPPD a été utilisé pour cribler une banque génomique partielle de P. fluorescens A32 et ainsi isoler le gène codant pour cette enzyme.
A) Préparation de l'ADN génomique de P. fluorescens A32.
La bactérie a été cultivée dans 40 ml de milieu minimum M63 (KH2P04 13,6g/1, (NH4)2504 2g/l, MgS04 0,2g/1, FeS04 0,005 g/I pH7 plus L-tyrosine IOmM comme seule source de carbone) à 28°C pendant 48 heures.
Après lavage, les cellules sont reprises dans 1 ml de tampon de lyse (tris HCl 100 mM
pH 8,3, NaCI 1,4 M et EDTA 10 mM) et incubées 10 minutes à 65°C. Après un traitement au phénol/chloroforme (24/1) et un traitement au chloroforme, les acides nucléiques sont précipités par addition d'un volume d'isopropanol puis repris dans 300 ltl d'eau stérile et traités à la RNAse 10 lrg/ml final. L'ADN est de nouveau traité au phénol/chloroforme, chloroforme et reprécipité par addition de 1/10 de volume d'acétate de sodium 3M pH5 et 2 volumes d'éthanol. L'ADN est ensuite repris dans de l'eau stérile et dosé.
B) Choix dcs oligonucléotides et synthèses.
A partir de la séquence en acides aminés de I'HPPD de Pseudomonas sp. P.J. 874 on choisit cinq oügonucléotides, deux dirigés dans le sens NH2 terminal de la protéine vers le COOH terminal de la protéine et trois dirigés dans le sens inverse (voir figure 1). Le choix a été dicté par les deux règles suivantes:
-une extrémité 3' de l'oligonucléotide stable, c'est à dire au moins deux bases sans ambiguité.
-une dégénérescence la plus faible possible.
Les oligonucléotides choisis ont les séquences suivantes:
P1: S'TA(C!T)GA(G/A}AA(C/T)CCIATGGG3' P2: 5'GA(G/A)ACIGGICCIATGGA3' P3: 5'AA(CIT)TGCATIA(G/A)(G/A)AA(C/T)TC(C/T)TC3' P4:5'AAIGCIAC(G/A)TG(C/T)TG(T/G/A)ATICC3' P5: 5'GC(C/T)TT(A/G)AA(A/G)TTICC(CfT)TCICC3' Ils ont été synthétisés sur le synthétiseur "Cyclone plus DNA Synthesizer" de marque MILLPORE.
7 Avec ces cinq oligonucléotides par PCR les fragments d'amplification que l'on doit obtenir théoriquement d'après la séquence SEQ ID N° 1 ont les tailles suivantes:
avec les amorces P 1 et P3 --------> environ 690 bp avec les amorces P 1 et P4 --------> environ 720 bp avec les amorces P 1 et P5 --------> environ 1000 bp avec ies amorces P2 et P3 --------> environ 390 bp avec les amorces P2 et P4 --------> environ 420 bp avec les amorces P2 et PS --------> environ 700 bp C) Amplification d'une partie codante de I'HPPD de P. fluorescens A32.
Les amplifications ont été faites sur un appareil PCR PERKIN ELMER 9600 et avec la Taq polymérise PERKIN ELMER avec son tampon dans les conditions standards, c'est à
dire pour SOItI de réaction il y a les dNTP à 200~tNi, les primers à 20E.tM, la Taq polymérise 2,5 unités et l' ADN de P. fluorescens A32 2,5 pg.
Le programme d'amplification utilisé est, 5 min à 95°C puis 35 cycles <45 sec 95°C, 45 sec 49°C, 1 min 72°C> suivis de 5 min à 72°C.
Dans ces conditions, tous les fragments d'amplification obtenus ont une taille compatible avec les tailles théoriques données au-dessus, ce qui est une bonne indication de la spécificité des amplifications.
Les fragments d'amplifications obtenus avec les jeux d'amorces P1/P4, P1/PS et sont ligués dans pBSII SK(-) après digestion de ce plasmide par Eco RV et traitement à la terminal transférase en présence de ddTTP comme décrit dans HOLTON T.A. and GRAHAM M.W. 1991. N.A.R. vol 19, n°5 p1156.
Un clone de chacun des trois types est séquencé partiellement; ceci permet de confirmer qu'on a bien amplifié dans les trois cas une partie de la région codante de l'HPPD de P.
f luorescens A32. Le fragment P 1/P4 est retenu comme sonde pour cribler une banque génomique partielle de P. fluorescens A32 et isoler le gène complet de l'HPPD.
D) Isolement du gëne.
Par Southern on montre qu'un fragment de 7 Kbp après digestion de l'ADN de P.
fluorescens A32 par l'enzyme de restriction BamHI s'hybride avec la sonde HPPD
Pl/P4. On a donc fait digérer 400~tg d'ADN de P..fluorescens A32 par l'enzyme de restriction BamHI et purifier sur gel d'agarose les fragments d'ADN faisant environ 7Kbp.
Ces fragments sont ligués dans pBSII SK(-), lui-même digéré par Bam HI et déphosphorylé par traitement à la phosphatase alcaline. Après transformation dans E. coli DHIOb, la banque génomique partielle est criblée avec la sonde HPPD Pl/P4.
Un clone positif a été isolé et appelé pRP A. Sa carte simplifiée est donnée figure 2. Sur cette carte est indiqué la position de la partie codante du gène HPPD. Elle est composée de 1077 nucléotides qui codent pour 358 acides aminés (voir SEQ ID N° 1 ).
L'HPPD de P.
8 tluorescen,r A32 présente une bonne homologie en acides aminés avec celle de Pseudomonas sp. strain P.1. 874, il y a en effet 92~1o d'identité entre ces deux protéines ( voir figure 3 ).
Exemple 2 : Construction de deux gènes chimères avec une séquence HPPD
Pour conférer la tolérance de plantes aux herbicides inhibant I'HPPD, on construit deux gènes chimères:
Le premier consiste à mettre la partie codante du gène de l'HPPD de P.
fluorescens A32 sous Ie contrôle du promoteur double histone (Demande de Brevet européen N° 0 507 698) suivi du Tobacco etch virus translational enhancer (TEV) (pRTL-GUS (Carrington and Freed, 1990; J. Virol. 64: 1590-1597)) avec le terminateur du gène de la nopaline synthase.
L'HPPD sera alors localisée dans le cytoplasme.
Le deuxième sera identique au premier, à ceci près qu'entre l'activateur de translation TEV et la partie codante de I'HPPD, on intercale Ie peptide de transit optimisé (OTP) (Demande européenne EP n° 0 508 909). L'HPPD sera alors localisée dans le chloroplaste.
A) Construction du vecteur pRPA-RD-153:
- pRPA-RD-11 Un dérivé de pBS-II SK(-) (Stratagene catalog #212206) contenant le site de polyadenylation de la nopaline synthase (NOS polyA) (Demande européennne n° 0 652 286) est cloné entre les sites Kpnl et Sall. Le site Kpnl est transformé
en un site NotI
par traitement avec la T4 ADN polymerase I en présence de 150 NM de deoxynucleotide triphoshates puis ligation avec un linker NotI (Stratagene catalog #1029).
Ainsi on obtient une cû~sette de clonage NOS polyA .
- pRPA-RD-127: Un dérivé de pRPA-BL-466 (Demande européenne EP n° 0 337 899) cloné dans pRPA-RD-11 créant une cassette d'expression du gène oxy et contenant le promoteur de la petite sous unité de la ribulose-biscarboxylase:
" promoter (SSU) - oxy gene - NOS polyA"
Pour créer ce plasmide, pRPA-BL-488 a été digéré avec Xbal et HindIII pour isoler un fragment de 1.9 kpb contenant le promoteur SSU et le gène oxy, qui a été ligué
dans le plasmide pRPA-RD-11 digéré avec des enzymes compatibles.
- pRPA-RD-132: C'est un dérivé de pRPA-BL-488 (Demande européenne EP n°

698) cloné dans pRPA-RD-127 avec création d'une cassette d'expression du gène oxy avec le promoteur double histone:
" promoteur double histone - oxy gène - NOS polyA "
Pour fabriquer ce plasmide, pRPA-BL-466 est digéré par HindIII, traité par la Klenow puis redigéré avec NcoI. Le fragment de 1.35 kbp purifié contenant le promoteur double histone H3A748 est ligué avec le plasmide pRPA-RD-127 qui avait été digéré par XbaI, traité Klenow et redigéré par NcoI.

- pRPA-RD-153: C'est un derivé de pRPA-RD-132 contenant l'activateur de translation du virus etch du tabac (TEV). pRTL-GUS (Carrington and Freed, 1990: J. Virol.
64: 1590-f~97~ est digéré avec Ncnl et EcoRl et le fragment de 1~0 bp est ligué dans pRPA-RD-132 digéré avec les mêmes enzymes. Donc on a créé une cassette d'expression contenant le promoteur:
"double histone promoteur - TEV -oxy u - NOS polyA"
B) Construction du vecteur pRPA-RD-185:
pUCl9/GECA: Un dérivé de pUC-19 (Gibco catalog #15364-011) contenant de nombreux sites de clonage. pUC-19 est digéré avec EcoRl et ligué avec l'oligonucleotide linker l:
Linker l: AATTGGGCCA GTCAGGCCGT TTAAACCCTA GGGGGCCCG
CCCGGT CAGTCCGGCA AATTTGGGAT CCCCCGGGC TTAA
Le clone sélectionné contient un site EcoRl suivi du polylinker qui contient les sites suivants: EcoRl. Apal, Avrll. Pmel, Sfil, Sacl. Kpnl, Srnal, BamHl, Xbal, Sall, Pstl. Sphl et 1 ~ Hindlll.
pRPA-RD-18~: c'est un dérivé de pUCl9/GECA contenant un polylinker modifié.
pUCl9/GECA est digéré par HindIII et ligué avec l'oligonucleotide linker 2:
Linker 2: AGCTTTTAAT TAAGGCGCGC CCTCGAGCCT GGTTCAGGG
AAATTA ATTCCGCGCG GGAGCTCGGA CCAAGTCCC TCGA
Le clone sélectionné contient un site Hindlll site au milieu du polylinker qui contient maintenant Ies sites suivants: EcoRl, Apal, Avrll, Pmel, Sfil, Sacl, Kpnl, Smal, BamHl, Xbal. Sall. Pstl, Sphl, Hindlll. Pacl. Ascl Xhol et EcoNl.
C) Construction du vecteur pRP T:
- pRP O: un dérivé de pRPA-RD-153 contenant une cassette d'expression de l'HPPD, promoteur double histone - TEV - gène HPPD - terminateur Nos. Pour fabriquer pRP O, pRPA-RD 153 est digéré par Hind III, traité par la Klenow puis redigéré par NcoI pour enlever le gène oxy et le remplacer par Ie gène HPPD sorti du plasmide pRP A
par digestion BstEII, traitement par Ia Klenow et redigestion par NcoI.
- pRP R: pour l'obtenir le plasmide pRP O a été digéré par PvuII et SacI, le gène chimère a été purifié puis ligué dans pRPA-RD-185 lui-même digéré par PvuII et SacI.
- pRP T: il a été obtenu par ügation du gène chimère sorti de pRP R après digestion par SacI et HindIII dans le plasmide pRPA-BL 150 alpha2 digéré par les mêmes enzymes (Demande européenne EP n° 0 508 909).

Le Gène chimère du vecteur pRP T a donc la structure suivante:
Promoteur double histone ~ TEV ~ Réaion codante de l'HPPD I Terminateur nos D) Construction du vecteur pRP V
5 - pRP P: c'est un dérivé de pRPA-RD-7 (Demande européennne EP n° 0 652 286) contenant le peptide de transit optimisé suivi du gène de l'HPPD. Il a été
obtenu par ligation de la partie codante de l'HPPD sorti de pRP A par digestion BstEII et NcoI, traitement à la Klenow et du plasmide pRPA-RD-7 lui-même digéré SphI et AccI et traité à la DNAse polymérase T4.
10 - pRP Q: un dérivé de pRPA-RD-153 contenant une cassette d'expression de l'HPPD, promoteur double histone - TEV - OTP - gène HPPD - terminateur Nos. Pour le construire le plasmide pRPA-RD-153 est digéré par Sal I, traité par la Klenow puis redigëré
par NcoI
pour enlever le gène oxy et le remplacer par le gène HPPD sorti du plasmide.pRP P par digestion BstEII, traitement par la Klenow et redigestion par NcoI.
- pRP S: pour l'obtenir, le plasmide pRP Q a été digéré par PvuII et SacI pour sortir le gène chimère qui a été ligué dans pRPA-RD-185 lui-même digéré par PvuII et Sacl.
- pRP V: il a été obtenu par ligation du gène chimère sorti de pRP S après digestion par SacI et HindIII dans le plasmide pRPA-BL 150 alpha2 (Demande européennne EP
n° 0 508 909).
Le gène chimère du vecteur pRP Q a donc la structure suivante:
Promoteur doubleTEV OTP Rgion codante de Terminateur fHPPD nos histone Exemple 3 : Transformation du tabac industriel PBD6.
Afin de déterminer l'efficacité de ces deux gènes chimériques, ceux-ci ont été
transférés dans du tabac industriel PBD6 selon les procédures de transformation et de régénération déjà
décrites dans la demande européenne EP n° 0 508 909.
1 ) Transformation:
Le vecteur est introduit dans la souche non oncogène d'Agrobacterium EHA 101 (flood et al,1987) porteuse du cosmide pTVK 291 (Komari et al,1986). La technique de transformation est basée sur la procédure de Horsh R. et al. (1985) Science, 227, 1229-1231.
2) Régénération:

WO 98!02562 PCT/FR97/Oi256 La ré;énérution du tabac PBD6 (provenance SEITA France) à partir d'expiants tuiiaire, est réalisée sur un milieu de base Murashige et Skoog (MS) comprenant 30g/1 de saccharose ainsi que 100 ~tg/ml de kanamycine. Les expiants foliaires sont prélevés sur des plants en serre ou in vitro et transformés selon la technique des disques foliaires(Science t985,Vo1 227, p.1229-1231) en trois étapes successives:la première comprend l'induction des pousses sur un milieu MS additionné de 30g/1 de saccharose contenant O.OSmg/1 d'acide naphtylacétique (ANA) et 2 mg/1 de benzylaminopurine (BAP) pendant 15 jours.
Les pousses formées au cours de cette étape sont ensuite développées par culture sur un milieu MS âdditionné de 30 g/1 de saccharose mais ne contenant pas d'hormone, pendant 10 jours.
Puis on prélève des pousses développées et on les cultive sur un milieu d'enracinement MS à
teneur moitié en sels, vitamines et sucres et ne contenant pas d'hormone. Au bout d'environ jours, les pousses enracinées sont passées en terre. Les plantes obtenues sont appellées Co 17.
Au sortir de l'in-vitro, les plantules de tabac transformées ont été
acclimatées à la serre 15 (60% d'humidité relative; température: 20°C la nuit et 23°C
la jour) pendant cinq semaines puis traitées au 4-[4-CF3-2-(méthylsulfonyl) benzoyl]-5-cyclopropyl isoxazole.
Le tabac témoin, non transformé et traité au 4-[4-CF3-2-(méthylsulfonyl)benzoyl]-5-cyclopropyl isoxazole à des doses allant de 50 à 400 g/ha, développe en environ 72 heures des chloroses, qui s'intensifient pour évoluer vers des nécroses très prononcées en une semaine (couvrant environ 80% des feuilles terminales).
Après transformation ce même tabac, qui surexprime l'HPPD de P. fluorescens, est très bien protégé contre un traitement au 4-[4-CF3-2-(méthylsulfonyl) benzoyl]-5-cyclopropyl isoxazole à la dose de 400 g/ha.
Si l'enzyme surexprimée est dans le chloroplaste, c'est à dire si la transformation a été
faite avec le gène porté par le vecteur pRP V, alors la plante est parfaitement protégée, ne présente aucun symptôme.
Exemple 4: Transformation du tabac industriel PBD6. avec gène EPSPS pour ~
construction 173 Isolement d'un ADNc codant pour une EPSPS de maïs:
Les différentes étapes, qui ont conduit à l'obtention de fADNc d'EPSPS de maïs, qui a servi de substrat à l'introduction des deux mutations, sont décrites ci-dessous. Toutes les opérations décrites ci-dessous sont données à titre d'exemples et correspondent à un choix, effectué parmi les différentes méthodes disponibles pour parvenir au même résultat. Ce choix n'a aucune incidence sur la qualité du résultat et par conséquent, toute méthode adaptée peut être utilisée par l'homme de l'art pour parvenir au même résultat. La plupart des méthodes d'ingénierie des fragments d'ADN sont décrites dans "Current Protocole in Molecular Bioloay" Volumes I et 2, Ausubel F.M. et al , publiés par Greene Publishing Associates et Wiley -Interscience ( 1989)(Par la suite, les références à des protocoles décrits dans cet ouvrage seront notées "réf. CPMB"). Les opérations concernant l'ADN, qui ont été
effectuées selon les protocoles décrits dans cet ouvrage sont, en particulier les suivantes:
~ libation de fragments d'ADN, traitements par l'ADN polymérase de Klénow et la T4 ADN
polymérase, préparation d'ADN de plasmides et de bactériophages ~, soit en minipréparation soit en maxi préparation, analyses d'ADN et d'ARN respectivement selon les techniques de Southern et Northern. D'autres méthodes décrites dans cet ouvrage ont été
suivies, et seules les modifications ou ajouts significatifs à ces protocoles ont été décrits ci-dessous.
A I . Obtention d'un fragment d'EPSPS d' Arabidopsis thaliana a) deux oligonucleotides 20-mers de séquences respectives:
~'- GCTCTGCTCATGTCTGCTCC -3' 5'- GCCCGCCCTTGACAAAGAAA- 3' ont été synthétisés à partir de la séquence d'un gène d'EPSPS d'Arabidopsis thaliana 1~ (Klee H.J. et al. (1987) Mol. Gen. Genet., 210, 437-442). Ces deux oligonucleotides sont respectivement en position 1523 à 1543 et 1737 à 1717 de la séquence publiée et en onentauon convergente.
b) L'ADN total d'Arabidopsis thaliana (var. Columbia) a été obtenu chez Clontech (référence catalogue: 6970-1 ) c) On mélange 50 nanogrammes(ng) d'ADN avec 300ng de chacun des oligonucleotides et soumis à 3~ cycles d'amplification avec un appareil Perkin-Elmer 9600, dans les conditions de milieu standard pour l'amplification préconisées par le fournisseur. Le fragment de 204 pb résultant constitue le fragment d'EPSPS d' Arabidopsis thaliana.
2. Construction d'une bibliothèque d'un ADNc à partir d'une ligne cellulaire de maïs BMS .
a) On broye 5 g de cellules filtrées dans l'azote liquide et les acides nucléiques totaux extraits selon la méthode décrite par Shure et al. avec les modifications suivantes:
- le pH du tampon de lyse est ajusté à PH = 9,0;
-après la précipitation par l'isopropanol, le culot est repris dans l'eau et après dissolution, ajusté à 2,5 M LiCI. Après incubation pendant 12 h à °C, le culot de la centrifugation d 15 min. à 30000g à 4°C est resolubilisé. L'étape de précipitation par LiCI est alors répétée. Le culot resolubilisé constitue la fraction ARN
des acides nucléiques totaux.
b) La fraction ARN-polyA+ de la fraction ARN est obtenue par chromatographie sur colonne oligo-dT cellulose telle que décrite dans "Current Protocols in Molecular Biology" .
c) Synthèse d'ADNc double brin à extrémité synthétique EcoRI: elle est réalisée en suivant le protocole du fournisseur des différents réactifs nécessaires à
cette synthèse sou forme d'un kit: le "copy kit" de la société In Vitrogen.

Deux uli~onucleotides simples brins et partiellement complémentaires de séquences re5pecuves:
~'- AATTCCCGGG -3' ~'- CCCGGG- 3' (ce dernier étant phosphorylé) sont ligués avec les ADNc double brin à extrémités franches.
Cette libation des adaptateurs résulte en la création de sites Sma I accolés aux ADNc double brin et EcoRI sous forme cohésive à chaque extrémité des ADNc double brin.
d) Création de la bibliothèque:
Les ADNc préséntant à leurs extrémités les sites artificiels cohésifs EcoRI
sont t0 ligués avec le ADNc du bactériophage ~.gtl0 coupé par EcoRI et déphosphorylé
selon le protocole du fournisseur New England Biolabs.
Une aliquote de la réaction de ligation a été encapsidée in vitro avec des extraits d'encapsidation: Gigapack Gold selon les instructions du fournisseur, cette librairie a été titrée en utilisant la bactérie E.coli C600hf1. la librairie ainsi obtenue est I5 amplifiée et stockée selon les instructions du même fournisseur et constitue la librairie de ADNc de suspension cellulaire de maïs BMS.
3. Criblage de la bibliothèque de ADNc de suspension cellulaire de maïs BMS
avec la sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana:
Le protocole suivi est celui de "Cucrent Protocole in Molecular Biology"
Volumes I et 20 ?, Ausubel F.M. et al , publiés par Greene Publishing Associates et S ( 1989)(CPMB). En bref, environ 106 phages recombinants sont étalés sur boîte LB à une densité
moyenne de 100 phages /cm2~ Les plages de lyses sont répliqués en doubles sur membrane Hybond N
d'Amersham.
h) L'ADN a été fixé sur les filtres par traitement UV 1600kJ (Stratalinkei de 25 Stratagene). Les filtres iont été préhydridés dans: 6xSSC/0,1%SDS/0,25 lait écrémé pendant 2h à 65°C. La sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana a été marquée au 32P-dCTP par "random-priming" selon les instructions du fournisseur (Kit Ready to Go de Pharmacia).
L'activité spécifique obtenue est de l'ordre de 108 cpm par ug de fragment.
Après dénaturation pendant 5 min à 100°C, la sonde est ajoutée dans le milieu de préhybridation et 30 l'hybridation est poursuivie pendant 14 heures à 55°C. Les filtres sont fluorographiés 48h à
80°C avec un film Kodak XARS et des écrans renforçateurs Hyperscreen RPN d'Amersham.
L'alignement des spots positifs sur le filtre avec les boîtes d'où ils sont issus permet de prélever, sur la boîte, des zones correspondant aux phages présentant une réponse d'hybridation positive avec la sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana. Cette étape d'étalement, 35 transfert, hybridation, récupération est répétée jusqu'à ce que tous les spots de la boîte des phages successivement purifiés se révèlent positifs à 100% en hybridation. Une plage de lyse par phage indépendant est alors prélevée dans du milieu ~, diluant (Tris-Cl pH= 7,5; MgS04 * ( marques de commerce ) IOmM; NaCI 0, I M; gélatine 0. l X70 ), ces pliages en solution constituant les clones positifs de l' EPSP de la suspension cellulaire de maïs BMS.
:~. Préparation et analyse de l'ADN des clones d'EPSPS de la suspension cellulaire de maïs BMS.
On ajoute environ ~.10g pliages à 20 ml de bactéries C600hfl à 2 OD 600nm/ml et incubés 15 minutes à 37°C. Cette suspension est alors diluée dans 200m1 de milieu de croissance des bactéries dans un Erlen de 11 et agitée dans un agitateur rotatif à 250 rpm. La lyse est constatée par clarification du milieu, correspondant à 1 lyse des bactéries turbides et se produit après environ 4 h d'agitation. Ce surnageant est alors traité comme décrit dans "Carrent Protocole in Molecular Biology". L'ADN obtenu correspond aux clones d'EPSP de la suspension cellulaire de maïs BMS.
Un à deux. pg de cet ADN sont coupés par EcoRI et séparés sur gel d'agarose LGTAlTBE (réf. CPMB) à 0,8%. Une dernière vérification consiste à s'assurer que l' ADN
purifié présente bien un signal d'hybridation avec la sonde EPSPS
d'Arabidopsis thaliana.
Après fëlectrophorèse, les fragments d'ADN sont transférés sur mennbrane Hybond N
d'Amersham selon le protocole de Southern décrit dans "Carrent Protocols in Molecular BioioQy". Le filtre est hybridé avec la sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana selon les conditions décrites au paragraphe 3 ci-dessus. Le clone présentant un signal d'hybridation avec la sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana et contenant le plus long fragment EcoRI a une taille estimée sur gel à environ l,7kpb.
5. Obtention du clone pRPA-ML-711:
Dix ug de l'ADN du clone phagique contenant l'insert de l,7kpb sont digérés par EcoRI
et séparés sur gel d'agarose LGTAltBE (réf. CPMB) à 0,8%. Le fragment de gel contenant l'insert de l,7kpb est excisé du gel par coloration BET et le fragment est traité à la (3-agarase selon le protocole du fournisseur New a Biolabs. L'ADN purifié du fragment de l,7kpb est ligué à 12°C pendant 14h avec l'ADN du plasmide pUC 19 (New England Biolabs) coupé
par EcoRI selon le protocole de ligation décrit dans "Carrent Protocole in Molecular Biology". Deux pl du mélange de ligation ci-dessus sont utilisés pour la transformation d'une aliquote d'E.coli DH l OB électro compétentes; la transformation se fait par électroporation en utilisant les conditions suivantes: le mélange de bactéries compétentes et de milieu de ligation est introduit dans une cuvette d'électroporation d'épaisseur 0,2 cm (Biorad) prélablement refroidie à 0°C. Les conditions physiques de félectroporation utilisant un électroporateur de marque Biorad sont 2500 Volts, 25 pFarad et 200 S2. Dans ces conditions, le temps de décharge moyen de condensateur est de l'ordre de 4,2 millisecondes. Les bactéries sont alors reprises dans 1 ml de milieu SOC (réf, CPMB) et agitées pendant 1 heure à 200 rpm sur un agitateur rotatif dans des tubes Cotning de 15 ml.
Après étalement sur milieu LBIagar supplémenté à 100 ~tg/ml de carbéniciline, les mini-grêparations des clones bactériens ayant poussé après une nuit à 37 °C est réalisée selon le protocole décrit * ( marque de commerce ) dons "Current Protocole in Molecular Biology". Après digestion par 1~coRI de I'ADN et séparation en électrophorèse sur gel d'agarose LGTA~TBE (réf. CPMB) à 0.8%.
les clones présentant un insert de l.7kpb sont conservés. Une dernière vérification consiste à s'assurer que l' ADN purifié présente bien un signal d'hybridation avec la sonde EPSPS
d'Arabidopsis thaliana. Après l'électrophorèse. les fragments d'ADN sont transférés sur membrane Hybond*
N d'Amersham selon le protocole de Southern décrit dans "Cuitent Protocole in Molecular Biology". Le filtre est hybridé avec la sonde EPSPS d'Arabidopsis thaliana selon les conditions décrites au paragraphe 3 ci-dessus. Le clone plasmidique présentant un insert de l,7kpb et hybridant avec la sonde EPSPS d'Arabidopsis rhaliana a été préparé à
plus grande IO échelle et l'ADN résultant de la Lyse des bactëries purifié sur gradient de CsCI ainsi que décrit dans "Current Protocole in Molecular Biology". L'ADN purifié a été
partiellement séquencé avec -un kit Pharmacia en suivant les instructions du fournisseur 'et en utilisant comme amorces, les amorces universelles de M13 directes et inverses commandées chez le même fournisseur. La séquence partielle réalisée couvre environ 0,5 kpb. La séquence 15 dérivée en acides aminés dans la région de la protéine mature (environ 50 résidus acides aminës) présente une identité de 100% avec la séquence aminée correspondante de l'EPSPS
mature de maïs décrite dans le brevet américain USP 4 971 908}. Ce clone correspondant à
un fragment EcoRl de l,7kpb de l'ADN de l' EPSP de la suspension cellulaire de màis BMS
a été nommé pRPA-ML-711. La séquence complète de ce clone a ëté réalisée sur les deux brins en utilisant le protocole du kit Pharmacie et en synthétisant des oligonucléotides complémentaires et de direction opposée tous les 250 pb environ. La séquence complète de ce clone de 1713 pb obtenue est présentée par SEQ ID N° 2.
6. Obtention du clone pRPA-ML-715:
L'analyse de Ia séquence du clone pRPA-ML-711 et en particulier la comparaison de la séquence d' acides aminés dérivés avec celle de maïs montre une extension de séquence de 92 pb en amont du codon GCG codant pour l'Alanine NH2-terminale de la partie mature de l'EPSPS de maïs (brevet amêricain USP 4 971 908}. De même une extension de 288 pb en aval du codon AAT codant pour l'asparagine COOH-terminale de la partie mature de l'EPSPS de maïs (brevet américain USP 4 971 908) est observée. Ces deux parties pourraient correspondre, pour l'extension NH2-terminale à une portion de la séquence d'un peptide de transit pour la localisation plastidiale et pour l'extension COOH-terminale à
la rëgion 3' non traduite de I'ADNc.
Afin d'obtenir un ADNc codant pour la partie mature de fADNc de fEPSPS de maïs, telle que décrite dans l' USP 4 971 908, les opérations suivantes ont été
réalisées:
a) Elimination de la région 3' non traduite: construction de pRPA-ML-712:
Le clone pRPA-ML-711 a été coupé par l'enzyme de restriction AseI et les extrëmités résultant de cette coupure rendues franches par traitement avec le fragment de Klenow de I'ADN polymérase I selon le protocole décrit dans CPMB. Une coupure par l'enzyme de * (marque de commerce) restriction SacII a ensuite été effectuée. L'ADN résultant de ces opérations a été séparé par électrophorèse sur bel d'agarose LGTA/TBE (réf. CPMB) 1 %.
Le fragment de gel contenant l'insert "AseI-extrémités franches/SacII" de 0.4 kpb a été excisé du bel et purifié selon le protocole décrit au paragraphe S ci-dessus. L'ADN du ~ clone pRPA-ML-71 1 a été coupé par l'enzyme de restriction HindIII située dans le polylinker du vecteur de clonage pUC 19 et les extrémités résultant de cette coupure ont été rendues franches par traitement avec le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I. Une coupure par l'enzyme de restriction SacII a ensuite été effectuée. L'ADN résultant de ces manipulations a été séparé par électrophorèse sur gel d'agarose LGTA/TBE (réf.
CPMB) 0,7%.
Le fragment de gel contenant l'insert HindIII-extrémités franches/SacII de environ 3,7kpb a été excisé du gel et purifié selon le protocole décrit au paragraphe 5 ci-dessus.
Les deux inserts ont été ligués, et 2 Itl du mélange de ligation ont servi à
transformer E. coli DH10B ainsi que décrit plus haut au paragraphe 5.
On analyse le contenu en ADN plasmidique de différents clones selon la procédure décrite pour pRPA-ML-711. Un des clones plasmidique retenu contient un insert EcoRI-HindllI de 1,45 kpb environ. La séquence des extrémités terminales de ce clone révèle que l'extrémité 5' de l'insert correspond exactement à l'extrémité correspondante de pRPA-ML-711 et que l'extrémité 3' terminale présente la séquence suivante:
" 5'-...AATTAAGCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT-3' ".
La séquence soulignée correspond au codon de l'acide aminé COOH-terminal asparagine, le codon suivant correspondant au codon stop de la traduction. Les nucléotides en aval correspondent à des éléments de séquence du polylinker de pUCI9. Ce clone comprenant la séquence de pRPAML-711 jusqu'au site de terminaison de la traduction de fEPSPS mature de maïs et suivie de séquences du polylinker de pUC 19 jusqu'au site HindIII a été nommé pRPA-ML-712.
b) Modification de l'extrémité 5' de pRPA-ML-712: construction de pRPA-ML-715 Le clone pRPA-ML-712 a été coupé par les enzymes de restrictions PstI et HindIll.
L'ADN résultant de ces manipulations a été séparé par électrophorèse sur gel d'agarose LGTAlTBE (réf. CPMB) 0,8%. Le fragment de gel contenant l'insert PstI/EcoRI de 1,3 kpb a été excisé du gel et purifié selon le protocole décrit au paragraphe S ci-dessus. Cet insert a été mis en ligation en présence de quantité équimoléculaire de chacun des deux oligonucléotides partiellement complémentaires, de séquence:
Oligo 1: 5'-GAGCCGAGCTCCATGGCCGGCGCCGAGGAGATCGTGCTGCA-3' Oligo 2: 5'-GCACGATCTCCTCGGCGCCGGCCATGGAGCTCGGCTC-3' ainsi qu'en présence d'ADN du plasmide pUCl9 digéré par les enzymes de restrictions BamHI et HindIII.

Deux pl du mélange de ligation ont servi à transformer E. coli DHIOB ainsi que décrit plus haut au paragraphe ~. Après analyse du contenu en ADN plasmidique de différents clones selon la procédure décrite ci-dessus au paragraphe ~, un des clones présentant un insert d'environ 1,3 kpb a été conservé pour analyses ultérieures. La séquence de l'extrémité 5' terminale du clone retenu révèle que la séquence ADN dans cette région est la suivante: séquence du polylinker de pUCl9 des sites EcoRI à BamHI, suivi de la séquence des oligonucléotides utilisés lors du clonage, suivi du reste de la séquence présente dans pRPAML-712. Ce clone a été nommé pRPA-ML-713. Ce clone présente un codon methionine ATG inclus dans un site NcoI' en amont du codon Alanine N-terminal de l'EPSPSynthase mature. De plus, les codons alanine et glycine de l'extrémité N-terminale ont été conservées, mais modifiées sur la troisième base variable : GCGGGT initial donne GCÇGGÇ modifié.
Le clone pRPA-ML-713 a été coupé par l'enzyme de restriction HindIjZ et les extrémités de cette coupure rendues franches par traitement avec le fragment de Klenow de la ADN polymérase I. Une coupure par l'enzyme de restriction SacI a ensuite été effectuée.
L'ADN résultant de ces manipulations a été séparé par électrophorèse sur gel d'agarose LGTA/FBE (réf. CPMB) 0,8%. Le fragment de gel contenant l'insert "HindIII-extrémités franches/SacI" de 1,3 kpb a été excisé du gel et purifié selon le protocole décrit au paragraphe 5 ci-dessus. Cet insert a été mis en ligation en présence d'ADN du plasmide pUCl9 digéré par l'enzyme de restriction XbaI et les extrémités de cette coupure rendues franches par traitement avec le fragment de Klenow de I'ADN polymérase I. Une coupure par l'enzyme de restriction SacI a ensuite été effectuée. Deux pl du mélange de ligation ont servi à transformer E. coli DHiOB ainsi que décrit plus haut au paragraphe 5.
Après analyse du contenu en ADN plasmidique de différents clones selon la procédure décrite ci-dessus au paragraphe 5, un des clones présentant un insert d'environ 1,3 kpb a été
conservé pour analyses ultérieures. La séquence des extrémités terminales du clone retenu révèle que la séquence ADN est la suivante: séquence du polylinker de pUCl9 des sites EcoRI
à SacI, suivie de la séquence des oligonucléotides utilisés lors du clonage délétée des 4 pb GATCC
de l'oligonucléotide 1 décrit ci-dessus, suivi du reste de la séquence présente dans pRPA-ML-712 jusqu'au site HindllI et séquence du polylinker de pUCl9 de XbaI à
HindIII. Ce clone a été nommé pRPA-ML-715.
7) Obtention d'un ADNc codant pour une EPSPS de maïs mutée Toutes les étapes de mutagénèse ont été réalisées avec le U.S.E. mutagenesis kit de Pharmacia en suivant les instructions du fournisseur. Le principe de ce système de mutagénèse est le suivant: l'ADN plasmidique est dénaturé par la chaleur et réassocié en présence d'un excès molaire d'une part de l'oligonucléotide de mutagénèse, et d'autre part d'un oligonucléotide permettant d'éliminer un site d'enzyme de restriction unique présent dans le polylinker. Après l'étape de réassociation, la synthèse du brin complémentaire est réalisée par l'action de la T4 ADN polvmérase en présence de T4 ADN ligase et de protéine du gène 32 dans un tampon approprié fourni. Le produit de synthèse est incubé
en présence de l'enzyme de restriction, dont le site est supposé avoir disparu par mutagénèse. La souche d'E. soli présentant, en particulier, la mutation mutS est utilisée comme hôte pour la transformation de cet ADN. Après croissance en milieu liquide, l'ADN
plasmidique total est préparé, incubé en présence de l'enzyme de restriction utilisée précédemment.
Après ces traitements, la souche d'E. coli DH10B est utilisée comme hôte pour la transformation.
L'ADN plasmidique des clones isolés est préparé et la présence de la mutation-introduite vérifiée par séquençage.
A)- modifications de sites ou de séquence sans incidence a priori sur le caractère de résistance de l'EPSPS de maïs aux produits inhibiteurs compétitifs de l'activité EPSP
synthase: élimination d'un site NcoI interne de pRPA-ML-71~.
La séquence de pRPA-ML-715 est numérotée arbitrairement en plaçant la première base 1 ~ du codon Alanine N-terminal GCC en position 1. Cette séquence présente un site NcoI en position 1217. L'oligonucléotide de modification du site présente la séquence 5'-CCACAGGATGGCGATGGCCTTCTCC-3'.
Après séquençage selon les références données ci-dessus, la séquence lue après mutagénèse correspond à celle de I'oligonuciéotide utilisé. Le site NcoI a bien été éliminé et ?0 la traduction en acides aminés dans cette région conserve la séquence initiale présente sur pRPA-ML-715.
Ce clone a été nommé pRPA-ML-716.
La séquence de 1340 bp de ce clone est présentée SEQ ID N° 3 et SEQ
ID N° 4.
B) modifications de séquence permettant l'augmentation du caractère de résistance de ?~ l'EPSPS de mass aux produits inhibiteurs compétitifs de l'activité EPSP
synthase.
Les oligonucléotides suivants ont été utilisés a) mutation Thr 102 ~~~ Ile.
5'-GAATGCTGGAATCGCAATGCGGCCATTGACAGC-3' b) mutation Pro 106 ~~~ Ser.
30 5'-GAATGCTGGAACTGCAATGCGGTCCTTGACAGC-3' c) mutations Gly i01 ~~~ Ala et Thr 102 ~~~ Ile.
5'-CTTGGGGAATGCTGCCATCGCAATGCGGCCATTG-3' d) mutations Thr 102 ~~~ Ile et Pro 106 ~~~ Ser.
5'-GGGGAATGCTGGAATCGCAATGCGGTCCTTGACAGC-3' Après séquençage, la séquence lue après mutagénèse sur les trois fragments mutés est identique à la séquence de l'ADN parental pRPA-ML-716 à l'exception de la région mutagénéisée qui correspond à celle des oligonucléotides de mutagénèse utilisés. Ces clones WO 98/02562 PCT/FIt97/01256 ont été nommés : pRPA-ML-717 pour la mutation Thr 102 ~~ Ile, pRPA-ML-718 pour la mutation Pro 106 v~~ Ser, pRPA-ML-719 pour tes mutations Gly 101 "'~ Ala et Thr 102 "'~ Ile et pRP.A-ML-720 pour les mutations Thr 102 ~~~~ Ile et Pro 106 ~~~ Ser.
La séquence de 1340 bp de pRPA-ML-720 est présentée SEQ ID N° ~ et SEQ
ID N° 6.
L'insert Ncol-Hindlll de 1395 pb est à la base de toutes les constructions utilisées pour la transformation des plantes pour l'introduction de la résistance aux herbicides inhibiteurs compétitifs de l'EPSPS et en particulier la résistance au glyphosate. Cet insert sera nommé
dans la suite des descriptions "le double mutant de fEPSPSJde maïs".
B Tolérance au glyphosate des différents mutants in vitro.
2.a: Extraction de fEPSP synthase.
Les différents gènes d'EPSP synthases sont introduits sous forme d'une cassette NcoI-HindIII
dans le vecteur plasmidique pTrc99a (Pharmacia, ref : 27-5007-Ol) coupé par NcoI et HindIII. Les E. coli DH lOB recombinantes surexprimant les différents EPSP
synthases sont soniquées dans 40 ml de tampon par 10 g de cellules culottées et lavées avec ce même tampon (tris HC1200 mM pH 7,8, mercaptoethanol 50 mM, EDTA 5 mM et PMSF 1 mM), auxquels on ajoute 1 g de polyvinylpyrrolidone. La suspension est agitée pendant 15 minutes à 4°C, puis centrifugée 20 minutes à 27000g et 4°C.
Le surnageant est additionné de sulfate d'ammonium pour amener la solution à
40% de la saturation en sulfate d'ammonium. Le mêlange est centrifugé 20 minutes à
27000g et 4°C.
Le nouveau surnageant est additionné de sulfate d'ammonium pour amener la solution à 70%
de la saturation en sulfate d'ammonium. Le mélange est centrifugé 30 minutes à
27000g et 4°C. L'EPSP synthase, présente dans ce culot protéique, est reprise dans 1 ml de tampon (tris HCl 20 mM pH 7.8 et mercaptoethanol 50 mM). Cette solution est dialysée une nuit contre deux litres de ce même tampon à 4°C.
2.b: Activité enzymatique.
L'activité de chaque enzyme ainsi que sa résistance au glyphosate est mesurée in vitro sur 10 minutes à 37°C dans le mélange réactionnel suivant: acide maléfique 100 mM pH 5,6, phosphoénol pyruvate 1 mM, shikimate-3-phosphate 3 mM (préparé selon Knowles P.F. et Sprinson D.B. 1970. Methods in Enzymol 17A, 351-352 à partir de Aerobacter aerogenes strain ATCC 25597) et fluorure de potassium 10 mM. L'extrait enzymatique est ajouté au dernier moment après l'addition de glyphosate dont la concentration finale varie de 0 à 20 mM.
L'activité est mesurée par dosage du phosphate libéré selon fia technique de Tauslcy H.A. et Shorr E. 1953. J. Biol. Chem. 202, 675-685.
Dans ces conditions, l'enzyme sauvage (WT) est inhibée à 85% dès la concentration de 0,12 mM de glyphosate. A cette concentration, l'enzyme mutante connue Ser106 n'est inhibée qu'à 50% et les trois autres mutants Ile 102. Ile 102/Ser 106, Ala 101/Ile 102 ne sont pas ou peu inhibées.
II faut multiplier la concentration de glyphosate par dix, soit 1,2 mM, pour inhiber l'enzyme mutante Ile 102 à 50%, les mutants Ile 102/Ser 106. Ala/Ile et Ala n'étant toujours pas inhibés.
Il faut noter que l'activité des mutants Ala/Ile et AIa n'est pas inhibée jusqu'à des concentrations de 10 mM de glyphosate, et que celle du mutant I1e102/Ser106 n'est pas réduite même si la concentration en glyphosate est multipliée par 2, soit 20 mM.
C
Résistance des plantes de tabac transformés.
10 0-I Constructions des plasmides:
pRPA-RD-124: Addition d'un signal de polyadénylation "nos" à pRPA-ML-720, obtenu précédemment, avec création d'une cassette de clonage contenant le gène d'EPSPS
double mutant de mâis (Thr 102 --~ Ile et Pro 106 -~ Ser). pRPA-ML-720 est digéré avec Hind III, traité avec le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I d'E. coli pour produire 15 une extrémité franche. On effectue une seconde digestion avec Nco I et le fragment EPSPS
est purifié. Le gène EPSPS est ensuite ligué avec pRPA-RD-12 purifié (une cassette de clonage contenant le signal de polyadénylation de la nopaline synthase) pour donner pRPA
RD-124. Pour obtenir le vecteur pRPA-RD-12 purifié utile, il a fallu que celui-ci soit préalablement digéré par SaII, traité avec l'ADN polymérase de Klenow, puis digéré une 20 seconde fois avec NcoI.
pRPA-RD-125: Addition d'un peptide de transit optimisé (OTP) à pRPA-RD-124 avec création d'une cassette de clonage contenant le gène d'EPSPS ciblé sur les plasmides.
pRPA-RD-7 (demande de brevet européen EP 652 286) est digéré avec Sph I, traité avec la T4 ADN polymérase, puis digéré avec Spe I et le fragment OTP est purifié. Ce fragment OTP est cloné dans pRPA-RD-124 qui a été préalablement digérée par NcoI, traité avec l'ADN polymérase de Klenow pour enlever la partie protubérante 3', puis digérée par Spe I.
Ce clone est alors séquencé pour assurer la fusion traductionnelle correcte entre le OTP et le gène d'EPSPS. On obtient alors pRPA-RD-125.
pRPA-RD-159: Addition du promoteur double d'histone d'arabidopsis H4A748 (demande de brevet EP 507 698 ) à pRPA-RD-125 avec création d'une cassette pour expression dans les plantes pour l'expression du gène "OTP- gène d'EPSPS
double mutant"
dans les tissus de dicotylédones. pRPA-RD-132 (une cassette contenant le promoteur double H4A748 (demande de brevet EP 507 698)) est digérée avec Nco I et Sac I.
Le fragment purifié du promoteur est ensuite cloné dans qui a été digéré avec Eco I et Sac I.
pRPA-RD-173: Addition du gène "promoteur H4A748-OTP-gène d'EPSPS double mutant" de pRPA-RD-159 dans plasmide pRPA-BL-150A (demande de brevet européen 508 909) avec création d'un vecteur de transformation Agrobacterium tumefaciens. pRPA-RD-t~9 est digéré avec Not I et traité avec la polymérase de Klenow. Ce fragment est ensuite cloné dans pRPA-BL-150A avec Sma I.
1-1- Transformation.
Le vecteur pRPA-RD-173 est introduit dans la souche dAgrobacterium ta~mefaciens EHA101 (Hood et al.,1987) porteuse du cosmide pTVK291 (Komari et al.,1986). La technique de transformation est basée sur la procédure de Horsh et al.( 1985).
1-2- Régénération.
La régénération du tabac PBD6 (provenance SEITA France) à partir d'expiants foliaires est réalisée sur un milieu de base Murashige et Skoog (MS) comprenant 30g/1 de saccharose ainsi que 200 Irg/ml de kanamycine. Les expiants foliaires sont prélevés sur des plantes cultivées en serre ou in,vitro et transformées selon la technique des disques foliaires (Science,1985,Vo1 227,p.1229-1231) en trois étapes successives: la première comprend l'induction des pousses sur un milieu additionné de 30g/1 de saccharose contenant 0,05 mg/1 d'acide naphtylacétique (ANA) et 2mg/1 de benzylaminopurine (BAP) pendant 15 jours. Les pousses formées au cours de cette étape sont ensuite développées pendant 10 jours par culture sur un milieu MS additionné de 30g/1 de saccharose mais ne conténant pas d'hormone. Puis on prélève des pousses développées et on les cultive sur un milieu d'enracinement MS à teneur moitié en sels, vitamines et sucre et ne contenant pas d'hormone. Au bout d'environ 15 jours, les pousses enracinées sont passées en terre.
1-3- Résistance au glyphosate.
Vingt plantes transformées ont été régénérées et passées en serre pour la construction pRPA-RD-173. Ces plantes ont étë traitées en serre au stade 5 feuilles avec une susFension acqueuse de RoundUp correspondant à O,8kg de matière active glyphosate par hectare.
'25 Les résultats correspondent à l'observation d'indices de phytotoxicité
relevés 3 semaine après traitement. Dans ces conditions, on constate que les plantes transformées par la construction pRPA-RD-173 présentent une très bonne tolérance alors que les plantes témoins non transformées sont complètement détruites.
Ces résultats montrent clairement l'amélioration apportée par l'utilisation d'un gène chimère selon l'invention pour un même gène codant pour la tolérance au glyphosate.
t~ u t t ' . av c ène e 1 'tr~ e o r ~
construction 238:
Ce tabac est obtenu selon l'enseignement de la demande européenne n° 0 337 899 page 6 ligne 50 et suivantes à partir de la construction 238, qui est celle décrite sous le norn de pRPA-BL 238.
* ( marque de commerce ) Eremple 6~ Croisement par pollinisation On procède par pollinisation en serre au croisement respectivement des lignées Co 17, 173 et X38 Co 17 avec 238 pour obtenir des plantes de tabac PBD6 à tester sur la double tolérance à
l'isoxaflutole et au bromoxynil (" plantes HPPD + OXY") et Co 17 avec 173 pour obtenir des plantes de tabac PBD6 à tester sur la double tolérance à
l'isoxaflutole et au glyphosate ( "plantes HPPD + EPSPS").
Les trois lignées sont homozygotes vis à vis du gène concerné: en conséquence la descendance est hemizygote pour chacun des deux gènes introduits par croisement.
Les plantes croisées sont obtenues au bout de six semaines.
Exemple 7' Mesure de la tolérance du tabac en traitement de postlevée avec l'isoxaflutole et de postlevée avec le bromoxvnil ou le glyphosate.
Dans cet essai, chaque test est effectué sur un échantillon de 10 plantes, 10 plantes étant 1~ gardées non traitées.
Tous les traitements sont effectués par pulvérisation à raison de 5001 de bouillie par hectare.
Pour le traitement en postlevée, on fait un semis puis on repique les plantes en godets de 9cm x 9cm.
Les traitements de post levée sont faits à un stade bien développé (3-4 feuilles)Des lots de plantes respectivement sauvage et génétiquement transformées obtenues ci-dessus sont répartis en plusieurs pans, avec:
a) un lot non traité, b) d'autres lots qui sont traités respectivement avec un herbicide seul, - de fisoxaflutole en post levée, à deux doses (respectivement 200 et 400 g/ha) , - du bromoxynil en post levée à deux doses (respectivement 400 et 800 g/ha)"
- du glyphosate en post levée à deux doses (respectivement 800 et 1200 glha), c) d'autres lots qui sont traités respectivement avec deux herbicides, en post Levée, en mélange extemporané:
- de l'isoxaflutole et du bromoxynil à deux doses (respectivement 200/400 et g/ha) - de I'isoxaflutole et du glyphosate à deux doses (respectivement 200/800 et 400/1200 g/ha).

Les traitements sont effectués avec les formulations suivantes: isoxaflutole à
75%, le bromoxynil ( produit commercial PARDNER) sous forme octanoate en concentré
émulsionnable à ''25a /1 et le ~lyphosate (Round-UP) Dans ces conditions, on observe 17 jours après le traitement les phytotoxicités suivantes, exprimées en pourcentage de destruction indiquées dans le tableau suivant, ainsi que le nombre de plantes par lot et les doses d'herbicide(s) exprimées en gramme de matière active par hectare:
Traitement de ~,ostlevée avec l'isoxaflutole et de postlevée avec le bromoxynil ou le glyphosate Herbicide Plantes avec gne de tolrance en /1 * HPPD * HPPD * SANS =
+

+ OXY EPSPS Sauvage Contrles 10 10 10 isoxaflutoie200 20 4% 20 2% 10 75%

seul 400 20 5% 20 3% 85%

bromoxynil400 10 3% 10 0%

seul 800 10 0% ,: ., 10 0%

Glyphosate800 20 0% 10 100%

seul 1200 20 0% 10 100%

Isoxaflutole200 20 20% 10 100%

+ bromoxvnil400 Isoxaflutole400 20 30% 10 100%

+ bromox 800 nil Isoxaflutole200 40 5% 10 100%

+ 1 hosate800 Isoxaflutole400 40 10% 10 100%

I + glyphosate1200 * nombre de plants Exem lie 8 Dans le but d'étudier si le gène de fHPPD de Pseudomonas fluorescens peut être utilisé
comme gène marqueur au cours du cycle "transformation - régénération" d'une espèce végétale, le tabac a été transformé avec le gène chimère composé du gène de 1'HPPD et du gène EPSPS doublement muté de résistance au glyphosate et des plantes transformées résistantes à la fois à l'isoxaflutole et au glyphosate ont été obtenues après sélection sur isoxatlutole.
Matériel et méthodes et résultats ~ Le gène chimérique pRP 2012 décrit ci-dessous est transféré dans du tabac industriel PBD6 selon les procédures de transformation et de régénération déjà décrites dans la demande européenne EP n° 0 508 909.
Le gène chimère du vecteur pRP 2012 a la structure A-B suivante, dans laquelle:
A est:

Promoteur doubleTEV OTP Rgion codante de Terminateur l'HPPD nos histone st B est Promoteur doubleTEV OTP Rgion codante de Terminateur l'EPSPS nos histone comme celui utilisé dans le vecteur pRPA-RD-173 Le gène chimère pRP 2012 est introduit dans le tabac.
1 )Transformation:
Le vecteur est introduit dans la souche non oncogène d'AgroBacterium EHA
101 (flood et al,1987) porteuse du cosmide pTVK 291 (Komari et al,1986). La technique de transformation est basée sur la procédure de Horsh et al(1985).
2) Régénération:
La régénération du tabac PBD6 (provenance SEITA France) à partir d'expiants foliaires est réalisée sur un milieu de base Murashige et Skoog (MS) comprenant 30g/1 de saccharose ainsi que 350 mg/1 de cefotaxime et 1 mg/I d'isoxaflutole. Les expiants foliaires sont prélevés sur des plants en serre ou in vitro et transformés selon la technique des disques foliaires (Science 1985,Vo1 227,p.1229-1231) en trois étapes successives: la première comprend l'induction des pousses sur un milieu MS additionné de 30g/1 de saccharose contenant O.OSmg/1 d'acide naphtylacétique (ANA) et 2 mg/1 de benzylaminopurine (BAP) pendant 15 jours et 1 mg/1 d'isoxaflutole. Les pousses vertes formées au cours de cette étape sont ensuite développées par culture sur un milieu MS additionné de 30 g/1 de saccharose et 1 mg/i d'isoxaflutole mais ne contenant pas d'hormone, pendant 10 jours. Puis on prélève des pousses développées et on les cultive sur un milieu d'enracinement NIS à
teneur moitié en sels, vitamines et sucres et 1 mg/1 d'isoxaflutole et ne contenant pas d'hormone. Au bout d'environ 15 jours. les pousses enracinées sont passées en terre.
Toutes les plantules obtenues selon ce protocole sont analysées par PCR avec des amorces spécifiques de l'HPPD de P.fluorescens. Cette analyse PCR a permis de confirmer que toutes les plantules ainsi obtenues ont bien intégré le gène de l'HPPD et qu'elles sont tolérantes à la fois à l'isoxaflutole et au glyphosate, dans les conditions décrites à i'exemple7.
10 En conclusion, cet essai confirme que le gène de l'HPPD peut être utilisé
comme gène marqueur et que, associé à ce gène, fisoxaflutole peut être un bon agent de sélection.
Exemple9:Plante avec un Qène HPPD et un gène bar. résistant à la fois à
l'isoxaflutole et à
la phosphinothrvcine.
15 1. Construction d'un gène chimère avec une séquence HPPD:
Le plasmide pRPA-RD-1004 représenté à la figure 4 est obtenu par insertion du gène chimère de résistance aux isoxazoles dans le plasmide pUC 19 de 2686 pb, commercialisé
par New Englamd Biolabs (Yannish-Perron, C.Viera, J. and Massing, J. (1985) Gene 33, 103-119 et contenant la résistance à l'ampicilline.
20 Les différents éléments du gène chimère sont, dans le sens de la traduction:
le promoteur histone H3C4 de maïs de 1020pb décrit dans la demande EP 0 507 698;
- l'intron du gène de l'alcool déshydrogénase 1 de maïs décrit par Sachs M et al.
Genetics 113: 449-467 ( 1986) et constitué de 536pb - le peptide de tansit optimisé (OTP) décrit dans la demande de brevet EP 0 508 909; cet 25 OTP est constitué des 171 pb du peptide de transit de la petite sous unité
de la Ribulose 1,5 bisphosphate carboxylase /oxygénase d'Helianthus annuus (Waksman G. et al 1987.
Nucleics acids Res. 15: 7181 ) suivies des 66 pb de la partie mature de la petite sous unité de la Ribulose 1,5 bisphosphate carboxylase /oxygénase de Zea mays (Lebrun et al 1987.
Nucleics acids Res. 15: 4360) elles mêmes suivies des 150 pb du peptide de transit de la petite sous unité de la Ribulose 1,5 bisphosphate carboxylase/ oxygénase de Zea mays (Lebrun et al 1987. Nucleics acids Res. 15: 4360); L'ensemble fait donc 387 pb;
- la région codante de l'HPPD de Pseudomonas fluorescens décrite ci-dessus;
- le terminateur du gène de la nopaline synthase (nos) (zone de polyadenylation du gène nos isolé de pTi 37, 250 pb (Bevan M. et al. Nucleics Acids Res. 11: 369-385);
2. construction d'un gène chimère de tolérance à la phosphinothricine (gène bar):
La phosphinathricine acetyl tranferase (PAT) codée par le gène bar est une enzyme qui inactive un herbicide, la phosphinothricine (PPT). La PPT inhibe la synthèse de ~lutamine et provoqie une accumulation rapide d'ammoniaque dans les cellus conduisant à leur mort (Tachibana et al. 1986) .
Le plasmide utilisé pour introduire la tolérance à la phosphinothricine comme agent de sélection est obtenu par insertion du gène chimère pDM 302 dans le vecteur pSP72 de ?462 pb, commercialisé par Promega Corp. (Genbank/ DDBJ database accession number X65332) et contenant le gène de résistance à l'amplicilline.
Le plasmide pDM 302 de 4700pb a été décrit par Cao, J., et al. Plant Cell Report 11:
X86-591 (1992).
Les différents élêments de ce plasmide sont:
- le promoteur du gène active de riz décrit par Mc filroy D. et al. Plant Molecular Biology 15: 257-268 (1990) constitué de 840 pb;
- le premier exon du gène active de riz constitué de 80 pb;
- le premier intron du gène active de riz constitué de 450 pb;- la région codante du gène bar de 600 pb excisée du plasmide pIJ41404 décrit par White J. et al. Nuc. Acids res. 18:
1862 ( 1990):
- le terminateur du gène de la nopaline synthase (nos) (zone de polyadenylation du gène nos isolé de pTi 37, 250 pb (Bevan M. et al. Nucleics Acids Res. 11: 369-385).
3. transformation:
La technique du bombardement est utilisée pour introduire la construction génétique. Les palsmides sont purifiés sur colonne Qiagen et coprécipités sur particules de tungstène M10 selonle procédé Klein (Nature 327: 70-73, 1987).
Une mixture de particules métalliques et des deux plasmides décrits ci-dessus est ensuite bombardée sur des cellules embryogènes de maïs selon 1e protocole décrit par Finer et al. dans Plant Cell Reports 12: 84-88 (1993).
9. Régénération et utilisation du gène bar comme agent de sélection:
Les cals bombardés sont sélectionnés sur glufosinate jusqu'à l'apparit~'_on de secteurs verts. Les cals positifs sont alors convertis en embryons somatiques puis mis dans les conditions favorisant la germination.
IJes jeunes p.~_ant J.ont transférées en serre pour la production de gra-~nes.

26a Les analyses moléculaires réalisées sur ces plantes montrent que:
- au moins 4 cals sélectionnés sur phosphinothricine ont engendré des plantes révélant la présence du gène de l'HPPD par PCR;

- au moins ~ cals sélectionnés sur phosphinothricine ont engendré des plantes révélant ia présence du gène de l'HPPD par Southern blot;
au moins 5 cals sélectionnés sur phosphinothricine ont engendré des plantes révélant la présence de la protéine recombinante par Western blot;
- le gène chimère de l'HPPD et la protéine hétérologue sont absents des cals non transformés.
Ces résultats montrent l'efficacité du gène chimère bar pour la sélection des cals transformés contenant un autre gène d'intérêt agronomique.
5. Analyse de la descendance des plantes transformées:
Les plantes transformées obtenues ci-dessus ont émis du pollen supposé en partie transgénique, qui a fécondé des ovules d'un maïs sauvage non transgénique. Les graines obtenues sont sélectionnées sur sable après traitement à l'isoxaflutole.
Le protocole de sélection est le suivant:
1 ~ 800m1 de sable de Fontainebleau sont placés dans une barquette de 15 x 20 cm de côtés.
Ces barquettes sont alors arrosées oar de l'eau ei maintenant hydratées par apport d'une solution nutritive constituée de Sml de Quinoligo (La Quinoléine) par litre d'éau. Vingt graines de maïs sont placées sur les barquettes, qui sont alors traitées à
l'isoxaflutole par pulvérisation à raison de 100 à 200g de matière active par hectare (300 ou 600 pg de matière active par barquette). Les barquettes sont ensuite placées en culture en serre.
Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau suivant:
Gnotypes Isoxaflutolenombre nombre nombre nombre (g/ha) de de de de graines plantes plantes plantes semes germes mortes survivantes non 0 20 20 0 20 transgnique 200 10 7 7 p Ces résultats montrent l'efficacité du gène de l'HPPD pour la sélection des plantes résistantes de maïs. Ils montrent aussi que la surexpression de l'HPPD de Pseudomonas dans les IlSSIIS de maîs leur confère la tolérance à fisoxallutole.
Les séquences illustrées sont les suivantes:
SEQ ID N° 1 Séquence du gène de fHPPD de Pseudomonas fluorescens A32.
SEQ ID N° 2 Séquence d' ADNc d'EPSPS d'Arabidopsis thaliana SEQ ID N° 3 et 4 séquences respectivement du gène et de la protéine de fEPSPS de mâis mutée, partie 1340 pb du clone pRPA-ML-716 SEQ ID n° ~ et SEQ ID n° 6 séquences respectivement du gène et de la protéine de fEPSPS de mâis mutée, partie 1340 pb du clone pRPA-ML-720 Les figures ci-après sont données à titre indicatif pour illustrer l'invention.
La Figure 1 représente la séquence protéique de fHPPD de Pseudomonas sp.
strain P.J. 874 et la séquence nucléotidique théorique de la partie codante correspondante;
les cinq oligonucléotides choisis pour faire l'amplification d'une partie de cette région codante sont symbolisés par les cinq flèches.
La Figure 2 représente la cartographie du plasmide avec le fragment d'ADN
génomique de 7 kb contenant le gène de fHPPD de P. fluorescens A32.
La Figure 3 donne la comparaison des séquences en acides aminés de l' HPPD de P.
f luorescens A32 et de l'HPPD de Pseudomonas sp strain P.J. 874 (seuls les acides aminés divergents entre les deux séquences sont indiqués) ainsi que la séquence consensus.

~

.. 2261094 . seq t (1) INFORMATIONS GENERALES:
LISTE DE SEQUENCES
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE POULENC AGROCHIMIE
(B) RUE: 14/20 rue Pierre Baizet (C) VILLE: LYON
(E) PAYS: France (F) CODE POSTAL: F-69009 (ii) TITRE DE L' INVENTION: GENE CHIMERE A PLUSIEURS GENES DE
TOLERANCE HERBICIDE, CELLULE VEGETALE
ET PLANTE TOLERANTES A PLUSIEURS HERBICIDES
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 6 (iv) ADRESSE DE CORRESPONDANCE:
(A) DESTINATAIRE: Robic (B) RUE: 55 St-Jacques (C) VILE: Montréal (D) PROVINCE: QC
(E) PAYS: CANADA
(F) CODE POSTAL: H2Y 3X2 (G) TELEPHONE: 514-987-6242 (H) TELECOPIE: 514-845-7874 (v) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Disquette 3.5" / 1.44 MO
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D'EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Texte ASCII
(vi) DONNÉES RELATIVES Ä.LA DEMANDE ACTUELLE:
(A) NUMÉRO DE LA DEMANDE: 2,261,094 (B) DATE DE DÉPÖT: 10 Juillet 1997 (vii) DONNÉES RELATIVES Ä LA DEMANDE ANTÉRIEURE:
(A) NUMERO DE LA DEMANDE: PCT/FR97/01256 (B) DATE DE DÉPÖT: 10 Juillet 1997 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1077 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple 2261094.seq (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:

AACGAGCCCA ACAGCATCGC CTCC'rACTTT GCGGCCGAAC ACGGCCCGTC GGTGTGCGGC 240 GGCGGCGCGC CGTTGTACCT GATCc~ACCGT TTCGGCGAAG GCAGCTCGAT CTACGACATC 420 GACTTCGTGT ACCTCGAAGG TGTGc;AGCGC AATCCGGTCG GTGCAGGTCT CAAAGTCATC 480 ACTTCCAAGG CCATGAGTGC GCCG(iACGGC ATGATCCGCA TCCCGCTGAA CGAAGAGTCG 660 TTCTTCGAAT TCATCCAGCG CAAGC~GCGAC GATGGGTTTG GCGAGGGCAA CTTCAAGGCG 1020 CTGTTCGAGT CCATCGAACG TGAC(:AGGTG CGTCGTGGTG TATTGACCGC CGATTAA 1077 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
( i ) CARACTERISTIQUES I)E LA SEQUENCE
(A) LONGUEUR: 171.3 paires de bases (B) TYPE: nucléot:ide 2261094.seq (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
AATCAATTTC ACACAGGAAA CAGC'rATGAC CATGATTACG AATTCGGGCC CGGGCGCGTG 60 CCATCAAGGA GATCTCCGGC ACCG'rCAAGC TGCCGGGGTC CAAGTCGCTT TCCAACCGGA 180 AAGCTGCCAA AAGAGCTGTA GTTG'.rTGGCT GTGGTGGAAA GTTCCCAGTT GAGGATGCTA 360 AGAGACCCAT TGGCGACTTG GTTG'.CCGGAT TGAAGCAGCT TGGTGCAGAT GTTGATTGTT 540 AGGTCAAGCT GTCTGGCTCC ATCA(iCAGTC AGTACTTGAG TGCCTTGCTG ATGGCTGCTC 660 CTTTGGCTCT TGGGGATGTG GAGA'.CTGAAA TCATTGATAA ATTAATCTCC ATTCCGTACG 720 GGGACAGATT CTACATTAAG GGAGCzTCAAA AATACAAGTC CCCTP.AP.AAT GCCTATGTTG 840 2261094.seq CCTTCCCCGA CTACTTCGAT GTGC':CGAGCA CTTTCGTCAA GAATTAATAA AGCGTGCGAT 1440 ACTACCACGC AGCTTGATTG AAGTC~ATAGG CTTGTGCTGA GGAAATACAT TTCTTTTGTT 1500 TTTCTATTTC GGATCTTAAG TTTG'L'GCACT GTAAGCCAAA TTTCATTTCA AGAGTGGTTC 1620 GTTGGAATAA TAAGAATAAT AAAT'rACGTT TCAGTGAAAA 1680 (2) INFORMATIONS POUR LA SIEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1340 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATIO:L~: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE : CDS
(B) EMPLACEMENT:6..1337 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:

Ala Gly Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Lys Glu Ile
10 Ser Gly Thr Val Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile CTC CTA CTC GCC GCC CTG TC'.C GAG GGG ACA ACA GTG GTT GAT AAC CTG 143 Leu Leu Leu Ala Ala Leu Se:r Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu CTG AAC AGT GAG GAT GTC CF,C TAC ATG CTC GGG GCC TTG AGG ACT CTT 191 Leu Asn Ser Glu Asp Val Hi.s Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu 2261094.seq Gly Leu Ser Val Glu Ala As~g Lys Ala Ala Lys Arg Ala Val Val Val GGC TGT GGT GGA AAG TTC CC:~ GTT GAG GAT GCT AAA GAG GAA GTG CAG 287 Gly Cys Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln 80 8.5 90 CTC TTC TTG GGG AAT GCT GG:~. ACT GCA ATG CGG CCA TTG ACA GCA GCT 335 Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met Arg Pro Leu Thr Ala Ala GTT ACT GCT GCT GGT GGA AA'T GCA ACT TAC GTG CTT GAT GGA GTA CCA 383 Val Thr Ala Ala Gly Gly As:n Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro AGA ATG AGG GAG AGA CCC AT'T GGC GAC TTG GTT GTC GGA TTG AAG CAG 431 Arg Met Arg Glu Arg Pro Il~~ Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys Gln CTT GGT GCA GAT GTT GAT TG'T TTC CTT GGC ACT GAC TGC CCA CCT GTT 479 Leu Gly Ala Asp Val Asp Cy~s Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Val Arg Val Asn Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser 160 16.5 170 GGC TCC ATC AGC AGT CAG TA~~ TTG AGT GCC TTG CTG ATG GCT GCT CCT 575 Gly Ser Ile Ser Ser Gln Ty:r Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Asp Lys Leu Ile Ser ATT CCG TAC GTC GAA ATG AC.A TTG AGA TTG ATG GAG CGT TTT GGT GTG 671 Ile Pro Tyr Val Glu Met Th:r Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Gly Val AAA GCA GAG CAT TCT GAT AG~C TGG GAC AGA TTC TAC ATT AAG GGA GGT 719 Lys Ala Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly Gln Lys Tyr Lys Ser Pro Lys Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser 2261094.seq 240 24:5 250 AGC GCA AGC TAT TTC TTG GC'T GGT GCT GCA ATT ACT GGA GGG ACT GTG 815 Ser Ala Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val ACT GTG GAA GGT TGT GGC AC~~ ACC AGT TTG CAG GGT GAT GTG AAG TTT 863 Thr Val Glu Gly Cys Gly Th:r Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe GCT GAG GTA CTG GAG ATG AT~~ GGA GCG AAG GTT ACA TGG ACC GAG ACT 911 Ala Glu Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr AGC GTA ACT GTT ACT GGC CC.A CCG CGG GAG CCA TTT GGG AGG AAA CAC 959 Ser Val Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Phe G1~ Arg Lys His Leu Lys Ala Ile Asp Val As:n Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met Thr Leu Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg GAC GTG GCT TCC TGG AGA GT.A AAG GAG ACC GAG AGG ATG GTT GCG ATC 1103 Asp Val Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile Arg Thr Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp Tyr Cys Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp Thr Tyr Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala Glu Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe Pro Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn 2261094.seq (2) INFORMATIONS POUR LA S:EQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUE~S DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 444 acides aminés (B) TYPE: acide .aminé
(D) CONFIGURATIOI~T: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
Ala Gly Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Lys Glu Ile Ser Gly Thr Val Lys Leu Pro Gly Se:r Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu Leu Asn Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu Gly Leu Ser Val Glu Ala Asp Lys Al~a Ala Lys Arg Ala Val Val Val Gly Cys Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly Thr Al.a Met Arg Pro Leu Thr Ala Ala Val Thr Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro Arg Met Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys Gln Leu Gly Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Val Arg Val Asn Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser Gly Ser Ile Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala 2261094.seq Leu Gly Asp Val Glu Ile Gl,a Ile Ile Asp Lys Leu Ile Ser Ile Pro Tyr Val Glu Met Thr Leu Arl~ Leu Met Glu Arg Phe Gly Val Lys Ala 210 21.5 220 Glu His Ser Asp Ser Trp As~p Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly Gln Lys Tyr Lys Ser Pro Lys Asn Al,a Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Al,a Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val Thr Val Glu Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe Ala Glu Val Leu Glu Met Met Gly Al.a Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr Ser Val Thr Val Thr Gly Pro Pro Ar~~ Glu Pro Phe Gly Arg Lys His Leu Lys Ala Ile Asp Val Asn Met As:n Lys Met Pro Asp Val Ala Met Thr Leu Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg Asp Val Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile Arg Thr Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp Tyr Cys Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp Thr Tyr Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala Glu Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe Pro Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn . 2261094.seq (2) INFORMATIONS POUR LA S:EQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES :DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1340 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATIO:~T: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE : CDS
(B) EMPLACEMENT:6..1337 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
CCATG GCC GGC GCC GAG GAG .ATC GTG CTG CAG CCC ATC AAG GAG ATC 47 Ala Gly Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Lys Glu Ile Ser Gly Thr Val Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu Leu Asn Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu Gly Leu Ser Val Glu Ala Asp Lys Ala Ala Lys Arg Ala Val Val Val Gly Cys Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln g0 85 90 Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly Ile Ala Met Arg Ser Leu Thr Ala Ala g5 100 105 110 GTT ACT GCT GCT GGT GGA AA.T GCA ACT TAC GTG CTT GAT GGA GTA CCA 383 2261094.seq Val Thr Ala Ala Gly Gly As:n Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro AGA ATG AGG GAG AGA CCC AT'r GGC GAC TTG GTT GTC GGA TTG AAG CAG 431 Arg Met Arg Glu Arg Pro I1~~ Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys Gln CTT GGT GCA GAT GTT GAT TG'r TTC CTT GGC ACT GAC TGC CCA CCT GTT 479 Leu Gly Ala Asp Val Asp Cy,s Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Val Arg Val Asn Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser Gly Ser Ile Ser Ser Gln Ty:r Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Asp Lys Leu Ile Ser ATT CCG TAC GTC GAA ATG AC;?~ TTG AGA TTG ATG GAG CGT TTT GGT GTG 671 Ile Pro Tyr Val Glu Met Th:r Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Gly Val AAA GCA GAG CAT TCT GAT AG~~ TGG GAC AGA TTC TAC ATT AAG GGA GGT 719 Lys Ala Glu His Ser Asp Se:r Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly Gln Lys Tyr Lys Ser Pro Lys Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser 240 . 245 250 AGC GCA AGC TAT TTC TTG GC'T GGT GCT GCA ATT ACT GGA GGG ACT GTG 815 Ser Ala Ser Tyr Phe Leu Al.a Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val Thr Val Glu Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe GCT GAG GTA CTG GAG ATG AT~G GGA GCG AAG GTT ACA TGG ACC GAG ACT 911 Ala Glu Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr AGC GTA ACT GTT ACT GGC CC.A CCG CGG GAG CCA TTT GGG AGG AAA CAC 959 . 2261094.seq Ser Val Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Phe Gly Arg Lys His Leu Lys Ala Ile Asp Val As:n Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met 320 32.5 330 ACT CTT GCT GTG GTT GCC CT~~ TTT GCC GAT GGC CCG ACA GCC ATC AGA 1055 Thr Leu Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg GAC GTG GCT TCC TGG AGA GT:~r AAG GAG ACC GAG AGG ATG GTT GCG ATC 1103 Asp Val Ala Ser Trp Arg Va.l Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile Arg Thr Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp TAC TGC ATC ATC ACG CCG CC~J GAG AAG CTG AAC GTG ACG GCG ATC GAC 1199 Tyr Cys Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp ACG TAC GAC GAC CAC AGG AT~G GCG ATG GCC TTC TCC CTT GCC GCC TGT 1247 Thr Tyr Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala Glu Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr TTC CCC GAC TAC TTC GAT GT~G CTG AGC ACT TTC GTC AAG AAT TAA 1340 Phe Pro Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 444 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
Ala Gly Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Lys Glu Ile Ser Gly 2261094.seq Thr Val Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu Leu Asn Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu Gly Leu Ser Val Glu Ala Asp Lys Al.a Ala Lys Arg Ala Val Val val Gly Cys Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly Ile Al~a Met Arg Ser Leu Thr Ala Ala Val Thr Ala Ala Gly Gly Asn Ala Th:r Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro Arg Met Arg Glu Arg Pro Ile Gly As:p Leu Val Val Gly Leu Lys Gln Leu Gly Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Val Arg Val Asn Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser Gly Ser Ile Ser Ser Gln Tyr Leu Se:r Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Asp Lys Leu Ile Ser Ile Pro Tyr Val Glu Met Thr Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Gly Val Lys Ala Glu His Ser Asp Ser Trp As:p Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly Gln Lys Tyr Lys Ser Pro Lys Asn Al.a Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Al,a Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val Thr Val 2261094.seq Glu Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe Ala Glu Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr Ser Val Thr Val Thr Gly Pro Pro Ar~_~ Glu Pro Phe Gly Arg Lys His Leu Lys Ala Ile Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met Thr Leu Ala Val Val Ala Leu Phe Al,a Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg Asp Val Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile Arg Thr Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp Tyr Cys Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp Thr Tyr Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala Glu Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe Pro Asp Tyr Phe Asp Val Leu Se:r Thr Phe Val Lys Asn

Claims (38)

REVENDICATIONS
1. Construction chimère comprenant au moins deux gènes chimères élémentaires comprenant chacun des éléments de régulation nécessaires à sa transcription dans les plantes et une séquence codante codant pour une enzyme conférant aux plantes la tolérance à un herbicide, caractérisé en ce que l'une des séquences codantes code pour une hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase (HPPD).
2. Construction chimère selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un troisième gène chimère élémentaire contenant une séquence codante pour une enzyme conférant aux plantes une tolérance herbicide.
3. Construction chimère selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé
en ce que la deuxième séquence codante est issu d'un gène de nitrilase Klebsiella sp.
conférant une tolérance à un herbicide de la famille des dihalogénohydroxybenzonitriles.
4. Construction chimère selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'herbicide est le bromoxynil.
5. Construction chimère selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'herbicide est l'ioxynil.
6. Construction chimère selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé
en ce que la deuxième séquence codante code pour une enzyme de tolérance au glyphosate.
7. Construction chimère selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la deuxième séquence codante code pour une 5-enol-pyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) conférant une tolérance à un herbicide inhibiteur de l'EPSPS.
8. Construction chimère selon la revendication 7, caractérisé en ce que la deuxième séquence codante code pour une EPSPS conférant une tolérance au glyphosate.
9. Construction chimère selon la revendication 6, caractérisé en ce que la deuxième séquence codante code pour la glyphosate oxydoréductase, enzyme de détoxification du glyphosate.
10. Construction chimère selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé
en ce que la séquence codante pour l'HPPD est issue de Pseudomonas sp.
11. Construction chimère selon la revendication 10, caractérisé en ce que la séquence codante pour l'HPPD est issue de Pseudomonas fluorescens.
12. Construction chimère selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé
en ce que la séquence codante pour l'HPPD est d'origine, végétale.
13. Construction chimère selon la revendication 12, caractérisé en ce que la séquence codante pour l'HPPD est issue d'Arabidopsis thaliana.
14. Construction chimère selon la revendication 12, caractérisé en ce que la séquence codante pour l'HPPD est issue de Duucus carota.
15. Vecteur caractérisé en ce qu'il comprend une construction chimère selon l'une des revendications 1 à 14.
16. Vecteur selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il est constitué
par un plasmide.
17. Cellule végétale isolée, caractérisée en ce qu'elle contient au moins deux gènes chimères élémentaires contenant chacun une séquence codante codant pour une enzyme conférant aux plantes la tolérance à un herbicide, dont l'un est un inhibiteur de l'hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase (HPPD).
18. Cellule végétale selon la revendication 17, caractérisée en ce qu'elle contient trois gènes chimères élémentaires contenant chacun des éléments de régulation et une séquence codante codant pour une enzyme conférant aux plantes la tolérance à un herbicide.
19. Cellule végétale selon l'une quelconque des revendications 17 ou 18, caractérisée en ce qu'elle contient au moins une construction chimère, selon l'une quelconque des revendications 1 à 14.
20. Procédé de transformation des plantes pour les rendre tolérantes à
au moins deux herbicides, caractérisé en ce qu'on insère dans une cellule végétale une construction chimère selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 et que les cellules transformées sont soumises à une régénération.
21. Procédé d'obtention de plantes à tolérance herbicide multiple caractérisées en ce qu'elles comprennent une cellule végétale telle que définie dans la revendication 17, ledit procédé étant caractérisé en ce que:
- dans une première étape, on insère dans plusieurs cellules respectivement un des gènes élémentaires contenant chacun des éléments de régulation nécessaires à sa transcription dans les plantes et une séquence codante codant pour une enzyme conférant aux plantes la tolérance à un herbicide, et que - ensuite les plantes sont croisées pour obtenir des plantes à tolérance multiple.
22. Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que la cellule végétale contient trois gènes chimères élémentaires contenant chacun des éléments de régulation et une séquence codante codant pour une enzyme conférant aux plantes la tolérance à un herbicide.
23. Procédé selon la revendication 21 ou 22, caractérisé en ce que la cellule végétale contient au moins une construction chimère, selon l'une quelconque des revendications 1 à 14.
24. Procédé de traitement herbicide de plantes caractérisées en ce qu'elles comprennent une cellule végétale telle que définie dans la revendication 17, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'on applique au moins deux herbicides.
25. Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce que la cellule végétale contient trois gènes chimères élémentaires contenant chacun des éléments de régulation et une séquence codante codant pour une enzyme conférant aux plantes la tolérance à un herbicide.
26. Procédé selon la revendication 24 ou 25, caractérisé en ce que la cellule végétale contient au moins une construction chimère, selon l'une quelconque des revendications 1 à 14.
27. Procédé selon l'une quelconque des revendications 24 à 26, caractérisé en ce qu'on applique trois herbicides.
28. Procédé selon l'une quelconque des revendications 24 à 27, caractérisé en ce que l'un des herbicides est un inhibiteur de l'HPPD.
29. Procédé selon l'une quelconque des revendications 24 à 28, caractérisé en ce que les herbicides sont appliqués simultanément.
30. Procédé selon la revendication 29, caractérisé en ce que les herbicides sont appliqués sous la forme d'une seule composition prête à
l'emploi.
31. Procédé selon la revendication 30, caractérisé en ce que les herbicides sont appliqués sous la forme d'un mélange extemporané.
32. Procédé selon l'une quelconque des revendications 24 à 28, caractérisé en ce que les herbicides sont appliqués successivement.
33. Procédé selon l'une quelconque des revendications 24 à 32, caractérisé en ce que l'herbicide inhibiteur de l'HPPD est l'isoxaflutole.
34. Procédé selon l'une quelconque des revendications 24 à 32, caractérisé en ce que l'herbicide inhibiteur de l'HPPD est la sulcotrione.
35. Procédé selon l'une quelconque des revendications 24 à 34, caractérisé en ce que le deuxième herbicide appartient à la famille des dihalogénohydroxybenzonitriles.
36. Procédé selon la revendication 35, caractérisé en ce que l'herbicide est choisi dans le groupe comprenant le bromoxynil et l'ioxynil.
37. Procédé selon l'une quelconque des revendications 24 à 34, caractérisé en ce que le deuxième herbicide est un inhibiteur de l'EPSPS.
38. Procédé selon la revendication 37, caractérisé en ce que l'inhibiteur de l'EPSPS est le glyphosate ou le sulfosate.
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