CA2584615C - Protection d'ingredients alimentaires bioactifs par l'utilisation de microorganismes presentant une capacite de metabolisation reduite - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un produit alimentaire contenant des microorganismes vivants et des ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt, dans lequel les microorganismes vivants et les ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt sont mis en AEuvre de manière à réduire la métabolisation desdits ingrédients bioactifs par lesdits microorganismes vivants. L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation à cette fin de microorganismes vivants présentant une capacité réduite de métabolisation des ingrédients bioactifs.

Description

Protection d'ingrédients alimentaires bioactifs par l'utilisation de microorganismes présentant une capacité
de métabolisation réduite La présente invention concerne un produit alimentaire contenant un ou plusieurs microorganismes vivants et au moins un ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt, dans lequel le ou lesdits microorganismes vivants et le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt sont mis en uvre de manière à réduire la métabolisation du ou desdits ingrédients bioactifs par le ou lesdits microorganismes.
Le marché des ingrédients alimentaires, en particulier des peptides, bioactifs ou fonctionnels (i.e., ayant une activité bénéfique pour le consommateur soit localement dans le tube digestif, soit à distance dans l'organisme, après être passés dans le système circulatoire) est, depuis quelques années, en plein essor.
Les peptides bioactifs sont des séquences définies d'acides aminés qui sont inactives au sein de leur protéine d'origine, mais qui présentent des propriétés particulières une fois libérées par action enzymatique. On les appelle aussi peptides fonctionnels. Ces peptides bioactifs sont capables d'exercer, entre autres, un effet sur le système digestif, les défenses de l'organisme (par exemple, un effet antimicrobien ou immunomodulateur), le système cardiovasculaire (notamment un effet antithrombotique ou antihypertenseur), et/ou le système nerveux (tel qu'un effet sédatif et analgésique de type opioïde) (voir tableaux 1 et 2 ci-après).
Le tableau 1 ci-après liste les principaux peptides fonctionnels libérés par l'hydrolyse des protéines du lait humain et du lait de vache.

2 Tableau 1 Protéines originelles Peptides fonctionnels* Origine du fait** Activités décrites caséine a a casomorphine V activité opiacée caséine a exorphine V activité opiacée casokinine V activité antihypertensive caséine (3 (3 casomorphine H V activité opiacée activité immunomodulatrice + activité
casokinine H V antihypertensive CPP H V action sur les minéraux caséine c CMP=GMP V modulation de la motricité gastrointestinale et de la libération d'hormones digestives casoxine H V antagoniste opiacé
casoplatellines activité antithrombotique a lactalbumine fragments 50-53 H V activité opiacée {acto lobuline lactor hines V activité opiacée + activité antih ertensive lactoferrine lactoferroxine V antagoniste opiacé
lactoransferrine H
(*) les séquences des acides aminés ne sont pas exactement les mêmes (") H: lait humain / V: lait de vache Le tableau 2 ci-après recense les principales activités physiologiques des peptides fonctionnels issus du lait connus à ce jour.

Tableau 2 ~_ -_ _ _ _ _ - - -- --_ - __ ---- ------ ---, -T _-- --_ - . -- --- -- - - - Activités Peptides In vitro In vivo animal In vivo homme ~ Réf. ~C
-- _ -- -- O
Caséinomacropeptide production de CCK par Beucher (CMP) cellule intestinale de rat 1994 --- -- - ------ --- - ----- -- - ----- -- - ---- -- - ---- - - --- --------- -----------Veau: après ingestion de CMP
(210 mg/kg), inhibition de la Homme: après ingestion de sécrétion gastrique et diminution CMP (4g), diminution de la Yvon 1994 de la concentration plasmatique sécrétion acide en CKK
Lapin après introduction dans Ben lumen: effet antisecrétoire sur Mansour casomorphines l'iléon 1988 --------- - ----------------------- ------- - - ---- - -- -------------- ---- -- ------- ----- -------------------------------- ---- --------Chien: après administration intragastrique, modulation de Schusdziarra l'insulinémie post-prandiale; >
Effet sur la annulation de cet effet par la 1983 0 digestion naloxone CD
(3 casomorphines Plusieurs effets au niveau Tomé 1987, naturelles et certains de de l'iléon de lapin 1988 - Mahé
leurs analogues 1989 Analogues de (3 Stimuiation de l'absorption Ben casomorphines non intestinale d'électrolytes Mansour métabolisés 1988 Chien: administration 10g caséine/300mL eau par sonde Caséine intragastrique: inhibition de la Defilippi motilité du grêle, annulée par la 1995 naloxone.vs. 10g de protéine de soja: pas d'effet Tableau 2 (suite) __-- -- - - -- -Activités Peptides In vitro In vivo animal In vivo homme Réf, - - _ _ - - ~ _- _ --- -- - - _ -__ - _ - _ - - - - _ _ _ _ ~
Lactoferricine Tomita 1994 Casocidine 1(caséine a Inhibition de la croissance - Zucht ~
Si -165-203 des souches pathogènes 1995 Fragment caséine a S1B Souris, Mouton: efficace en Effet Inhibition de la croissance antimicrobien (1-23 N terminal) = des souches pathogènes injection IM contre Staphylococcus Lahov 1996 isracidine aureus Migliore-Fragment caséine R Souris: effet protecteur en injection Samour humaine IV contre K. pneumoniae 1989 Fragments de a Prolifération des Kayser lactalbumine bovine et lymphocytes humains de caséine x bovine (PBL) activités par Con A 1996 (3 casokinine 10 et (3 Prolifération ou Kayser casomorphine 7 de suppression des PBL
s nthèse suivant concentration 1996 CD
Stimulation de la CD
Caséine 0 humaine 54- phagocytose des globules 59 a rouges de mouton par les Parker 1984 acr Effet immuno lactalbumine 51-53 de so p sages péritonéaux ~
modulateur Stimulation des macrophages périonéaux Migliore-(3 bovine de la souris Pas de protection in vivo Samour 1O
Caséine Caséine 191-193 1988 Caséine 63-68 Caséine ic bovine Inhibition de la prolifération des lymphocytes B des Otani 1992, Caseino-macropeptides plaques de Peyer chez 106-169 souris et lapin Tableau 2 (suite) -- --- _ _ _ - - --- -- - - _ T _- _ _ _--_ __ _ -_ _ - _--- - _ __-_ . _- _--__ Activités Peptides In vitro In vivo animal In vivo homme Réf.
Caséinoglycopeptide bovin (bCGP) CGP isolé dans le plasma de Chabance O
Caséinoglycopeptide nouveaux-nés après ingestion 1995 humain (hCGP) de lait infantile ou lait de mère Peptide 106-116 de Inhibition de l'agrégation Jollès 1986 ~
Effet caséine x bovine plaquettaire antithromboti ue Tétrapeptide de q Inhibition de l'agrégation lactotransferrine plaquettaire Raha 1988 humaine (39-42) ----------Rat et cobaye avec thrombose artérielle expérimentale: après injection IV, activité Drouet 1990 antithrombotique Hydrolysats ~
enzymatiques de (3 Inhibition de l'ACE Mullaly N
lactoglobuline et d'a 1997 OD
lactalbumine ~
Fragments Rats recevant de l'angiotensine I:
synthétiques de Inhibition de l'ACE après injection IV, retour au niveau Kohmura O
caséine humaine initial de ression artérielle 1989 ~
Peptides de lait Rats hypertendus: ingestion de 10 fermenté par L. mL lait fermenté / kg poids Masuda helveticus et S. corporel, on retrouve les peptides 1996 1O
dans l'aorte avec inhibition de cerevisiae l'ACE
Effet Peptides issus de lair antihypertenseur fermenté par L. Rats hypertendus: après ingestion, Yamamoto helveticus diminution de la pression artérielle 1994 Peptides issus de la fermentation de lait Rats hypertendus: après ingestion, par L. helveticus + S. Nakamura cerevisiae Val Pro Pro diminution de la pression artérielle 1995 (VPP) 0 II Pro Pro Rats normaux: pas d'effet (IPP) ô
------- --- ----------------------- --- ----- - -- ---- --------- ---- -- ------------- ----- ----------- -------- ------ - -- --- - -------- -- ----- -----------Homme hypertendu (36 sujets): après 8 semaines d'ingestion de 95 mL/j, Hata 1996 diminution de la pression artérielle Tableau 2 (suite) - - - - - --- - - --- -- - - - - ~- -- - -- -- Activités Peptides In vitro In vivo animal In vivo homme Réf. j 0 _----Rats: après injection intra-carotides, accumulation de R Ermisch casomorphines dans la zone sans 1983 (3 casomorphines barrière hématoencéphalique ---------- ---- - _ ----- ---- ---- ------------- - - - - - - --- - - --- - - - - -- -- - - - -Veaux nouveaux-nés: après leur premier repas de lait de vache, (3 Umbach _ 1985 casomorphines dans le sang --------------- --------- - ------ -------------- --- ----- ---- -------- -- ------------------------------------------- ----- -- -------- ------------Mini-pores: après ingestion de caséine bovine, (3 casomorphine Meisel 1986 isolée du chyme duodéna4 Chiots: après ingestion de lait de mère, existence de Singh 1989 >
Effets opiacés casomorphines dans_le san~ - ....... ------- - ------------------------ ----------------- ----- N
----Homme: après ingestion de OD
lait de vache, présence de 0 Svedberg casomorphines dans le 1985 contenu intestinal grêle ------ ----- - ------ - ------ ----------- -- ----- - ----- ------- ------------- -- -------------- - ------- ------------ -- ------ ---- -------- ------- ô
o mais pas dans le sang d'adulte Teschemac her 1986 Effet opioïde sur iléon Yoshikawa Peptides de caséine (3 isoié de cobaye annulé 1986 1O
humaine de synthèse par la naloxone Effets opiôides Casoxines (caséine,c) antagonistes sur muscle Chiba 1989 bovine et humaine de l'iléon isolé de cobaye Ces peptides sont le plus souvent obtenus par hydrolyse de protéines végétales (par exemple des protéines de soja) ou animales (par exemple, les caséines ou les protéines sériques du lait), hydrolyse générée par des procédés enzymatiques et/ou fermentaires, le plus souvent accompagnée d'une concentration de la fraction active, étape généralement nécessaire pour apporter le bénéfice santé visé. La fabrication et l'utilisation de ces peptides pour un bénéfice santé font l'objet d'une littérature abondante (voir notamment la Danone World Newsletter N 17 de Septembre 1998).
Parmi les vecteurs alimentaires susceptibles d'accueillir de tels ingrédients, les produits laitiers fermentés figurent en bonne position de part leur bénéfice santé dû à la présence de ferments et de produits de fermentation (c'est-à-dire les molécules issues de la transformation, par les bactéries lactiques, des substrats présents dans le lait). Jusqu'à
présent, la communauté scientifique prenait surtout en compte les propriétés des ferments. Les chercheurs commencent depuis peu à
s'intéresser aux produits de fermentation, parmi lesquels certains peptides occupent une place particulière, car ce sont des messagers biologiques nombreux et spécifiques. Les produits laitiers fermentés paraissent donc particulièrement appropriés comme vecteurs d'hydrolysats de peptides bioactifs obtenus, par exemple, à partir de substrats laitiers comme les caséines ou les protéines sériques.
Un problème majeur se pose alors : les microorganismes et, en particulier, les bactéries lactiques utilisées dans la fabrication des produits laitiers frais (type yoghourts, spécialités laitiéres fermentées, boissons fermentées à base de lait, etc...), sont généralement capables de consommer les peptides pour satisfaire leurs besoins nutritionnels et, plus particulièrement leurs besoins en azote. On parlera à cet effet dans ce qui suit de métabolisation des peptides . Les bactéries lactiques sont en effet dotées de plusieurs systèmes de dégradation et/ou transport leur permettant de métaboliser les peptides, les faisant alors disparaître du milieu :

1/ un système protéolytique (protéases de paroi PRT) qui découpe protéines et gros peptides pour faciliter leur assimilation ( système de métabolisation extracellulaire ), 2/ des systèmes de transport vers l'intérieur de la cellule, dont l'un est spécifique des oligo-peptides d'une taille proche de 10 acides aminés, l'autre étant adapté au transport de di- et tri-peptides (les lactobacilles possèdent un système supplémentaire de perméases à tri-peptides) ( système(s) de transport vers l'intérieur de la cellule ), et

3/ un système enzymatique intracellulaire capable de dégrader les peptides en acides aminés (comprenant une quinzaine d'endo- et exopeptidases) ( système de métabolisation intracellulaire ).
Etant donné que la quantité de peptides naturellement présents dans le lait est généralement trop faible par rapport aux besoins des bactéries lactiques, il est commun d'accélérer leur croissance en fournissant un supplément de peptides. Ceux-ci sont alors totalement consommés pendant la fermentation.
En définitive, du fait : (i) du besoin en azote des bactéries lactiques, dont les peptides constituent la principale source dans le lait, (ii) de la capacité
de ces bactéries à consommer efficacement les peptides, et (iii) de la survie d'une population importante de bactéries lactiques dans les produits fermentés à base de lait, jusqu'à la date limite de consommation (DLC), la mise en oruvre d'ingrédients à base de peptides fonctionnels dans les produits laitiers fermentés est difficile, voire impossible, car ces ingrédients sont le plus souvent consommés par les bactéries lactiques, pendant la fermentation, voire pendant le stockage des produits jusqu'à DLC.
En outre, non seulement ce problème de dégradation par métabolisation intempestive des peptides par les bactéries n'est pas spécifique à un peptide donné, mais il n'est pas non plus spécifique à un ferment (ou microorganisme, de préférence bactérie, capable de fermenter) particulier.
Il s'agit là d'un problème général, qui se pose quels que soient le ou les peptides et le ou les microorganismes considérés.
On citera, à titre d'exemple, le cas du peptide bioactif aS, [91-100] (voir le brevet européen EP 0 714 910 ; peptide aux propriétés relaxantes contenu dans l'hydrolysat de protéines de lait commercialisé notamment par la société Ingredia : 51-53, Avenue Fernand Lobbedez BP 946 62033 ARRAS Cedex, France, sous le nom Lactium ). La Demanderesse a ainsi observé que la population de bactéries lactiques vivantes dans le produit fini continue de métaboliser le peptide bioactif pendant le stockage du produit fini, si bien qu'après seulement 10 jours (pour des produits frais dont la DLC est de 28 jours), entre 35 et 55% environ du peptide bioactif aS, [91-100] ont disparu, ce qui est tout à fait inacceptable pour garantir un effet santé chez le consommateur (données non montrées).
Puisque la consommation du peptide bioactif est le fait de l'activité
métabolique des ferments, on pourrait envisager de réduire ce phénomène en détruisant tout ou partie des microorganismes, par exemple à l'aide d'un traitement thermique approprié (thermisation ou pasteurisation). En ce cas, il est possible de préserver le peptide bioactif aS, [91-100] (par exemple après chauffage à 75 C pendant environ 1 min).
Toutefois, une telle solution présente de nombreux inconvénients :

- la thermisation d'une masse laitière fermentée implique l'usage de stabilisants ajoutés avant le traitement thermique (pectines, amidons, carraghénanes, etc...), ce qui complique le procédé et augmente sensiblement le coût de la formule ;

- la ligne de fabrication industrielle est plus complexe et demande 5 un investissement spécifique plus important ;

- le produit ne bénéficie plus d'appellations liées aux produits contenant des ferments vivants (type yoghourt) et perd de fait les bénéfices associés à la consommation de ferments lactiques ; et - l'impact organoleptique, généralement négatif, est significatif.
Il existe dès lors un besoin pour un produit alimentaire contenant à la fois des microorganismes vivants, par exemple un yoghourt, et un ou plusieurs ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt, dans lequel ces ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt seraient protégés contre la métabolisation par lesdits microorganismes vivants, et ce, tout en préservant les qualités organoleptiques du produit alimentaire.
Par la présente invention, la Demanderesse apporte une solution qui permet de satisfaire le besoin existant.
Un objet de la présente invention est donc un produit alimentaire contenant un ou plusieurs microorganismes vivants et au moins un ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt, caractérisé en ce que le ou lesdits microorganismes vivants et le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt sont mis en uvre de manière à réduire la métabolisation du ou desdits ingrédients bioactifs par le ou lesdits microorganismes vivants.
Ainsi, la Demanderesse a pu montrer qu'un ou plusieurs ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt pouvaient être efficacement protégés contre la métabolisation par des microorganismes vivants, dès lors que les conditions de mise en oeuvre des uns avec les autres sont appropriées.

De telles conditions de mise en oeuvre appropriées peuvent faire appel à
divers moyens, parmi lesquefs :
a) l'utilisation de microorganismes vivants dont la capacité à
métaboliser les ingrédients bioactifs est réduite ; et/ou b) l'utilisation d'ingrédients alimentaires leurres qui sont délibérement livrés en pâture aux microorganismes vivants ;
et/ou c) la mise en oeuvre d'une protection physique des ingrédients bioactifs, notamment par encapsulation de ces derniers.

On notera à cet égard qu'un ou plusieurs de, voire tous, ces moyens peuvent être avantageusement combinés au sein d'un même produit alimentaire.
Comme indiqué brièvement dans la description générale qui précède, par métabolisé ou métabolisation , on entend désigner selon la présente invention la transformation ou dégradation d'une substance par un ou plusieurs microorganismes vivants, visant à sa consommation à titre de source de nutriments, et ayant pour conséquence finale sa disparition, plus ou moins complète, du milieu.
Au sens de l'invention, la métabolisation d'un ingrédient est réduite si elle est inférieure à la métabolisation du même ingrédient lorsque ce dernier n'est pas protégé par au moins l'un des moyens prévus dans le cadre de la présente invention.
Avantageusement, et idéalement, cette métabolisation réduite tend vers, voire vaut, zéro, ce qui revient à peu, quasiment pas, voire pas, de métabolisation dudit ingrédient.
Selon un mode particulier de réalisation de la présente invention, la quantité résiduelle d'ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt dans ledit produit alimentaire est, 3 semaines après sa préparation, comprise entre 50 et 100 % environ par rapport à la quantité d'ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt présente dans le produit juste après sa préparation.
Préférentiellement, ladite quantité résiduelle est comprise entre 80 et 100% environ.
Par quantité résiduelle en ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt dans ledit produit alimentaire , on entend désigner selon la présente invention le pourcentage d'ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt présent dans ledit produit alimentaire lorsque ce dernier est maintenu dans des conditions de stockage adaptées (par exemple, de l'ordre de 4 à
10 C pour un produit frais) pendant 3 semaines, par rapport au pourcentage d'ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt présent au départ, c'est-à-dire juste après fabrication du produit.
Selon un mode particulier de réalisation de la présente invention, le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt sont choisis parmi - des protéines, - des peptides, - des analogues ou dérivés de ceux-ci, et - leurs combinaisons.
Préférentiellement, l'ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt est choisi parmi : le peptide bioactif aS, [91-100] (voir le brevet européen EP 0 714 910), le peptide C6-asl 194-199 (voir le brevet américain US
6514941), le peptide C7-P177-183 (voir le brevet américain US
6514941), le peptide C12-as123-34 (voir le brevet US américain 6 514 941), les caséinophosphopeptides, l'a.-casomorphine, la caséine a exorphine, la casokinine, la R-casomorphine, les caséinomacropeptides (CMP) aussi appelés glycomacropeptides (GMP) ou caséinoglycomacropeptides (CGMP), la casoxine, les casoplatellines, les fragments 50-53, les P-lactorphines, la lactoferroxine, les peptides Val-Pro-Pro (voir le brevet européen EP 0 583 074), Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln (voir la demande EP 0 737 690), Tyr-Lys-Val-Pro-Gin-Leu (voir la demande EP 0 737 690), Tyr-Pro (voir la demande EP 1 302 207 et le brevet EP 0 821 968), lle-Pro-Pro (voir Nakamura et al., 1995 ; et brevet japonais JP 6 197 786), des fragments, analogues, dérivés de ceux-ci, des protéines et/ou peptides les contenant, et leurs combinaisons (pour une revue, voir notamment la Danone World Newsletter N 17 de septembre 1998).
De manière encore plus préférée, l'ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt est choisi parmi : le peptide bioactif aS, [91-100], des fragments, analogues, dérivés de celui-ci, des protéines et/ou peptides les contenant, et leurs combinaisons.
On entend par analogue , n'importe quelle version modifiée d'un composé initial, ici une protéine ou un peptide, ladite version modifiée pouvant être naturelle ou synthétique, dans laquelle un ou plusieurs atomes, tels que des atomes de carbone, d'hydrogène, d'oxygène, ou des hétéroatomes tels que l'azote, le soufre ou un halogène, ont été ajoutés ou supprimés de la structure du composé initial, de manière à obtenir un nouveau composé moléculaire.
Un dérivé au sens de l'invention est n'importe quel composé qui présente une ressemblance ou un motif structurel en commun avec un composé de référence (protéine ou peptide). Entrent également dans cette définition, d'une part les composés qui, seuls ou avec d'autres composés, peuvent être des précurseurs ou des produits intermédiaires dans la synthèse d'un composé de référence, moyennant une ou plusieurs réactions chimiques, et d'autre part les composés qui peuvent être formés à partir dudit composé de référence, seul ou avec d'autres composés, via une ou plusieurs réactions chimiques.
Sont ainsi couverts par la définition de dèrivés ci-dessus au moins les hydrolysats, notamment trypsiques, de protéines et/ou peptides, les fractions d'hydrolysats, ainsi que les mélanges d'hydrolysats et/ou de fractions d'hydrolysats.

De plus, les termes analogue et dérivé d'un peptide ou d'une protéine susmentionnés couvrent par exemple un peptide ou une protéine glycosylé(e) ou phosphorylé(e) ou encore ayant subi n'importe quel greffage de groupement chimique.
Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, l'ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt peut être notamment un sucre ou un acide gras.
Avantageusement, le ou lesdits microorganismes vivants se caractérisent par une capacité réduite, voire nulle, de métabolisation des ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt.
Selon la présente invention, une capacité réduite de métabolisation est telle que la quantité d'ingrédients bioactifs d'intérêt métabolisée pendant la fermentation (qui disparaît donc du milieu) est inférieure ou égale à 40%
de la quantité d'ingrédients initiale (avant fermentation).
Ceci se traduit mathématiquement par:
Qr 0,6 Qo (1) Où:
Qr : quantité d'ingrédients bioactifs résiduelle (présente dans le milieu après fermentation) Qo : quantité d'ingrédients bioactifs initiale La quantité d'ingrédients bioactifs résiduelle Qr peut être mesurée par une méthode de chromatographie liquide CLHP couplée à un détecteur de type MS/MS. Un exemple de procédure expérimentale est donné dans les exemples ci-dessous.
Préférentiellement, le ou lesdits microorganismes vivants sont des souches sauvages et/ou des variants naturels et/ou des mutants obtenus par génie génétique.
Par souche variante ou variant , on entend désigner dans la présente demande une souche obtenue principalement par mutation sélective à partir d'une souche de référence, et présentant la propriété

d'intérêt recherchée, à savoir la capacité, réduite ou nulle, à métaboliser le ou lesdits ingrédient(s) alimentaire(s) bioactifs d'intérêt décrite ci-avant.
Un mutant ou une souche mutante au sens de l'invention est une souche obtenue grâce à des techniques de mutagénèse dirigée, à partir 5 d'une souche de référence. Un tel mutant présente, comme les variants définis ci-dessus, la propriété d'intérêt recherchée.
Les techniques d'obtention de variants naturels par mutation sélective, ou d'obtention de mutants par génie génétique, notamment par transformation génétique à l'aide de vecteurs, sont connues de l'homme 10 du métier. A cet égard, l'on pourra notamment se référer à l'ouvrage Sambrook et Russel (2001). En particulier, l'homme du métier pourra inspirer le protocole de mutation sélective de la procédure expérimentale décrite par Biswas et al. (1993).
Selon un mode particulier de réalisation de la présente invention, le ou 15 lesdits microorganismes vivants sont des bactéries, de préférence des bactéries lactiques, vivantes.
De préférence, la capacité d'au moins un mécanisme choisi parmi - un système de métabolisation extracellulaire des protéines et des peptides, - un système de transport des peptides vers l'intérieur de la cellule, ou - un système de métabolisation intracellulaire des peptides, est réduite chez lesdites bactéries vivantes.
On désigne ici par capacité réduite d'un mécanisme de métabolisation et/ou transport , un mécanisme de métabolisation et/ou transport tel que mentionné supra, dont la capacité (ou l'activité) ne lui permet pas de métaboliser et/ou transporter plus de 40% environ d'ingrédients bioactifs d'intérêt pendant la fermentation.
De manière encore préférée, le ou lesdits mécanisme(s) est (sont) non fonctionnel(s) chez lesdites bactéries vivantes.

En particulier, ledit mécanisme, de capacité réduite ou non fonctionnel, est un système de transport des peptides vers l'intérieur de la cellule.
Plus particulièrement encore, ledit système de transport de peptides est le système AMI (voir, par exemple, Garault et al., 2002) ou le système OPP
(chez L. bulgaricus : Peltoniemi et al., 2002 ; chez L. lactis : Detmers et a/., 1998).
Les bactéries vivantes susceptibles d'être utilisées dans le cadre de l'invention peuvent notamment être choisies parmi :
- Streptococcus spp, de préférence Streptococcus thermophilus ;
- Lactobacillus spp ;
- Lactococcus spp ; et - Bifidobacterium spp.
De préférence, lesdites bactéries vivantes sont choisies parmi - Streptococcus thermophilus, déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures des Microorganismes (Institut Pasteur, Paris, France)) le 24/01/02 sous le numéro I-2774 ;
- Streptococcus thermophilus, déposée à la CNCM le 10/05/04 sous le numéro 1-3211 ;
- Streptococcus thermophilus, déposée à la CNCM le 16/09/04 sous le numéro 1-3301; et - Streptococcus thermophilus, déposée à la CNCM le 16/09/04 sous le numéro 1-3302.
De manière encore préférée, lesdites bactéries vivantes sont des bactéries S. thermophilus déposées à la CNCM le 10/05/04 sous le numéro 1-3211.
Avantageusement, le produit alimentaire selon la présente invention contient au moins les bactéries vivantes S. thermophilus et Lactobacillus spp.

Préférentiellement, lesdites bactéries vivantes Streptococcus thermophilus sont choisies parmi S. thermophilus déposée à la CNCM le 24/01/02 sous le numéro 1-2774, S. thermophilus déposée à la CNCM le 10/05/04 sous le numéro 1-3211, S. thermophilus déposée à la CNCM le 16/09/04 sous le numéro 1-3301, et S. thermophilus déposée à la CNCM le 16/09/04 sous le numéro 1-3302.
La teneur du produit alimentaire selon l'invention en microorganismes vivants peut varier et sera choisie par l'homme du métier à la lumière de ses connaissances générales dans le domaine. En pratique, on recherchera de préférence une teneur globale standard, par exemple de l'ordre de 10' à 109 bactéries par gramme de produit alimentaire.
Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt sont encapsulés.
Par encapsulé ou encapsulation , on entend désigner selon la présente invention la mise en uvre d'un procédé de protection d'un principe actif dans un véhicule de type microparticule afin de permettre un relarguarge contrôlé de ce principe actif. En l'espèce, le principe actif est constitué par un ou plusieurs ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt.
Cette encapsulation apporte une solution complémentaire à celle selon la présente invention, en ce qu'elle permet auxdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt de ne pas être métabolisés par les microorganismes vivants.
En outre, et de manière tout à fait avantageuse, l'encapsulation permet d'obtenir un produit final organoleptiquement plus acceptable, par exemple en masquant l'amertume plus ou moins forte de certains ingrédients bioactifs, en particulier de certains peptides.
Enfin, l'encapsulation permet aux ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt de parvenir jusqu'au niveau de l'intestin, sans être dégradés, et de traverser la barrière intestinale sans dommages afin d'y déployer leurs effets.

Selon un autre mode de réalisation particulier de la présente invention, le produit alimentaire contient en outre au moins un ingrédient aiimentaire leurre.
Par ingrédient alimentaire leurre , on entend désigner selon la présente invention un ingrédient alimentaire (de préférence un peptide, une protéine, un analogue ou un dérivé de ceux-ci, et leurs combinaisons) capable de servir de source de nutriments (notamment de source d'azote) pour des microorganismes vivants, et destiné à être préférentiellement métabolisé par lesdits microorganismes, de manière à détourner ces derniers des ingrédients bioactifs d'intérêt que l'on entend bien entendu préserver en priorité. Ainsi, l'ingrédient leurre représente une source nutritive pour les microorganismes, que l'on sacrifie délibérement afin de sauvegarder le plus possible les ingrédients bioactifs d'intérêt. L'ingrédient alimentaire leurre agit à cet égard comme un inhibiteur compétitif du transport des ingrédients bioactifs d'intérét.
On notera que les modes de réalisation particuliers susdécrits peuvent avantageusement être combinés.
Préférentiellement, le produit alimentaire selon la présente invention est un produit fermenté.
De manière encore préférée, le produit alimentaire fermenté est un produit laitier ou végétal.
Par produit laitier , on entend désigner selon la présente invention, en plus du lait, les produits dérivés du lait, tels la crème, la crème glacée, le beurre, le fromage, le yoghourt ; les produits secondaires, comme le lactosérum, la caséine ; ainsi que n'importe quel aliment préparé
contenant, comme ingrédient principal, du lait ou des constituants du lait.
Par produit végétal , on entend désigner, entre autres, des produits obtenus à partir d'une base végétale telle que, par exemple, les jus de fruits et les jus végétaux parmi lesquels (e jus de soja, le jus d'avoine ou le jus de riz.

En outre, les définitions ci-dessus de produit laitier et produit végétal couvrent chacune n'importe quel produit à base d'un mélange de produits laitiers et végétaux, tels qu'un mélange de lait et de jus de fruits, par exemple.
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un produit alimentaire tel que décrit ci-dessus, dans lequel un ou plusieurs microorganisme(s) vivant(s) et un ou plusieurs ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt encapsulés sont ajoutés dans le mélange destiné à constituer ledit produit alimentaire.
Selon un mode de réalisation, le ou lesdits ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt sont ajoutés audit mélange les uns après les autres.
Alternativement et préférentiellement, le ou lesdits ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt sont ajoutés simultanément dans ledit mélange.
Les conditions de culture des microorganismes dépendent desdits microorganismes et sont connues de l'homme du métier. A titre d'exemple, on précisera que les températures optimales de croissance pour S. thermophilus se situent généralement entre 36 et 42 C environ ;
elles se situent entre 42 et 46 C environ pour L. delbrueckii spp.
bulgaricus (que l'on trouve typiquement dans les yoghourts).
En règle générale, l'arrêt de la fermentation, qui dépend du pH que l'on souhaite atteindre, est obtenu par refroidissement rapide, ce qui permet de ralentir l'activité métabolique des microorganismes.
Selon un mode particulier de réalisation de la présente invention, le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt sont préparés directement dans le mélange destiné à constituer ledit produit alimentaire.
On parlera à cet égard de synthèse in situ du ou desdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt.
En cas de synthèse in situ, on peut indifféremment prévoir que le ou lesdits microorganismes vivants sont ajoutés dans le mélange destiné à

constituer ledit produit alimentaire, avant, pendant ou après, la synthèse in situ du ou desdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt.
La présente invention a en outre pour objet l'utilisation d'un produit alimentaire tel que décrit supra comme aliment fonctionnel.
5 Par aliment fonctionnel , on entend désigner un produit alimentaire qui affecte avantageusement une ou plusieurs fonctions cibles de l'organisme, indépendamment de ses effets nutritionnels. Il peut ainsi en résulter une amélioration de l'état de santé et/ou du bien-être et/ou une réduction des risques d'apparition de maladies chez un consommateur qui ingère des 10 quantités normales dudit produit. A titre d'exemples d'activités d'un aliment fonctionnel , on citera notamment des activités anti-cancéreuses, immunostimulatrices, promotrices de la santé osseuse, anti-stress, opiacées, anti-hypertension, amélioratrices de la biodisponibilité du calcium, ou encore anti-microbiennes (Functional Food Science in Europe, 15 1998).
De tels aliments fonctionnels peuvent être destinés à l'homme et/ou aux animaux.
La présente invention a également pour objet l'utilisation, dans un produit alimentaire, d'un microorganisme vivant ayant une capacité réduite de 20 métabolisation d'un ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt, pour protéger ledit ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt contre la métabolisation par ledit microorganisme vivant.
La présente invention est illustrée par les figures suivantes, qui ne sont en aucun cas limitatives.

Figure 1: Chromatogramme LC-MS illustrant la disparition du peptide bioactif aS1 [91-100] inclus dans l'ingrédient Lactium pendant la fermentation lactique. Le détecteur MS/MS est réglé de façon à ne faire apparaître que le signal des ions de m/z = 634.5 Da (masse du peptide aS1 [91-100] doublement chargé) qui présentent, après fragmentation, des ions fils de m/z = 991.5 Da ; 771.5 Da ; 658.3 Da (fragments caractéristiques du peptide aS1 [91-100]).
Figure 2: Identification et quantification des principaux peptides de l'ingrédient Lactium par LC-MS/MS avant et après fermentation du mix laitier par un ferment consistant en un mélange des souches I-2783 (déposée à la CNCM le 24/01/02), 1-2774 (déposée à la CNCM le 24/01/02), I-2835 (déposée à la CNCM le 04/04/02) et le 1-1968 (déposée à la CNCM le 14/01/98). Après fermentation, ces peptides ne sont plus retrouvés qu'à l'état de traces et se confondent avec la ligne de base.
? signifie que l'identification de la séquence n'a pas été possible ou n'est pas certaine ; seule la masse du peptide est alors rapportée.
Figure 3: Profils peptidiques comparés (chromatogrammes LC-MS/MS) d'un mix laitier contenant 1.5 g/L d'hydrolysat DMV C12 , avant (1) et après fermentation (2) jusqu'à pH 4.7 par le ferment lactique Hansen YC380. La quasi-totalité des peptides de l'hydrolysat, dont le peptide bioactif C12 (fragment aSl [23-34]), a disparu suite à la métabolisation par les souches du ferment.
Figure 4: Courbes illustrant l'évolution de la teneur résiduelle en peptide bioactif aS1 [91-100] dans un produit fini constitué de 95% de masse fermentée par le ferment contenant les souches I-2783, I-2774, 1-2835 et 1-1968, et de 5% de sirop de sucre aromatisé contenant le peptide aS1 [91-100], pendant le stockage à 10 C. L'expérience a été réalisée à
raison de 4 essais indépendants El, E2, E3 et E4.
Figure 5: Courbes illustrant l'évolution de la teneur résiduelle en peptide bioactif aSl [91-100], ajouté après fermentation dans un produit fermenté
puis thermisé à 75 C pendant 1 minute, et stocké à 10 C jusqu'à la date limite de consommation (DLC).
Figure 6: Illustration de l'évolution de la teneur résiduelle en peptide bioactif aSl [91-100] dans un produit fini constitué de 95% de masse fermentée par le ferment contenant la souche 1-2774 et du formiate et de 5% de sirop de sucre aromatisé contenant le peptide aS1 [91-100]
(apporté sous la forme de Lactium , dosé à 1.5 g/Kg de produit fini), pendant le stockage à 10 C jusqu'à DLC.
Figure 7: Illustration de l'évolution de la teneur résiduelle en peptide bioactif aS1 [91-100], ajouté avant fermentation, dans un produit fini constitué de masse laitière fermentée par le ferment contenant la souche I-2774 et du formiate.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples suivants, donnés à titre purement illustratif.

Exemples Exemple 1: Mise en oruvre d'ingrédients bioactifs d'intérét sans mettre en application l'invention revendiquée 1.1) Exemple avec le peptide bioactif aS1 [91-100] contenu dans l'hydrolysat Lactium La mise en oeuvre d'ingrédients du type peptide ou protéine, souvent apportés sous forme de poudres, est plus simple lorsque ceux-ci sont ajoutés lors de l'étape de préparation du mix laitier (poudrage du lait), avant le traitement thermique de sanitation (i.e., 95 C, 8 min) et, donc, avant la fermentation. En ce cas, le risque de métabolisation du peptide actif est très élevé. C'est, pour l'exemple, le cas lors de l'utilisation d'un ingrédient fonctionnel comme le Lactium (Ingredia, France) contenant un peptide bio-actif (fragment 91-100 de la caséine aSl).
Protocole : le milieu a été préparé par hydratation d'une poudre de lait écrémé à 120 g/L, additionné de 1.5 g/L d'ingrédient Lactium (correspondant à environ 30 mg/L de peptide bioactif aS1 [91-100]), puis pasteurisé à 95 C pendant 8 minutes.

Le ferment lactique a été ajouté à un taux de 0.02%, et la fermentation a été conduite à la température optimale du ferment sélectionné (entre 37 et 42 C), jusqu'à atteindre un pH de 4.70.
L'analyse des peptides résiduels, et notamment celle du peptide bioactif aSl [91-100], a été conduite avec une méthode de chromatographie liquide CLHP couplée à un détecteur de type MS/MS comme décrit ci-après :
- l'échantillon a été préparé par dilution du milieu fermenté dans un mélange d'eau, de méthanol et d'acide trifluoroacétique (50/50/0.1%), dans un rapport de 1 à 6 environ. Le surnageant après centrifugation constituait l'échantillon représentatif du contenu peptidique du milieu fermenté.
- Cet échantillon a été injecté dans un système chromatographique CLHP de type Agilent 1100 (société Agilent Technologies France, 1 rue Galvani 91745 Massy cedex, France), équipé d'une colonne adaptée à l'analyse des peptides, de type Waters Symetry (5 m 2.1 x 150 mm, WAT056975, Waters France, 5, Rue Jacques Monod, 78280 Guyancourt) à la température de 40 C, débit de 0.25 mI/min.
Les peptides ont été élués de façon classique avec un gradient croissant de solvant B (Acétonitrile + 0.100 /o d'acide formique) dans le solvant A (Eau + 0.106% acide formique), sur une durée de 40 min à 2 heures en fonction de la résolution souhaitée.
- La détection a été effectuée à l'aide d'un détecteur spécifique de type MS/MS, par exemple avec un appareil à trappe ionique comme l'Esquire3000+ (Bruker Daltonique, rue de l'Industrie, 67166 Wissembourg Cedex), réglé soit pour l'analyse globale du contenu peptidique (mode MS-MS), soit pour la quantification précise et spécifique d'un peptide à partir de ses fragments caractéristiques. Par exemple, le peptide a.S1 [91-100]) a été isolé à partir de sa masse (ion doublement chargé de masse 634.5 Da) et quantifié à partir de l'intensité de ses ions fils caractéristiques après fragmentation (ions de m/z de 991.5 Da, 771.5 Da et 658.3 Da). De façon encore plus précise, un étalon interne constitué du même peptide de synthèse deutéré deux fois (fragment caractéristique de 993.5 Da) a permis de prendre en compte et de s'affranchir d'éventuelles interférences liées à la matrice.
Les résultats sont illustrés par la figure 1.
Lors de sa mise en oruvre à ce stade (avant fermentation par un ferment consistant en un mélange des souches 1-2783 (déposée à la CNCM le 24/01/02), 1-2774 (déposée à la CNCM le 24/01/02), I-2835 (déposée à la CNCM le 04/04/02) et 1-1968 (déposée à la CNCM le 14/01/98), ou un ferment tel que YC380 (Chr. Hansen SA, Le Moulin d'Aulnay, BP64, 91292 ARPAJON Cedex France), on a mis en évidence que plus de 95%
du peptide bioactif aSi [91-100] étaient consommés après fermentation.
Ces observations montrent que l'incorporation de peptides bioactifs conformément à ce qui précède n'est pas applicable telle quelle à
l'obtention de produits alimentaires, notamment laitiers, supplémentés avec des quantités de peptides et/ou protéines bioactifs suffisamment stables dans le temps pour observer l'effet recherché chez le consommateur.

1. 2) Exemples avec d'autres peptides bioactifs d'intérêt Les résultats sont illustrés par les figures 2 et 3.
L'ingrédient Lactium contient de nombreux autres peptides, dont certains présentent potentiellement une activité biologique (comme le fragment 23-34 de la caséine aSl, que l'on retrouve aussi commercialisé
dans l'ingrédient C12 de la société DMV International). Il est intéressant de constater que la quasi-totalité des peptides apportés par l'ajout du Lactium sont largement consommés pendant la fermentation.
Quelle que soit leur origine (provenant des différentes caséines aS1, aS2, K, P) et leur taille (de 2 à 3 résidus jusqu'à 12 résidus et plus), tous les peptides sont globalement consommés pendant le processus de fermentation.

1.3) Mise en oeuvre du peptide bioactif aS1 [91-100] (Lactium ) avec 5 d'autres ferments Afin de vérifier que ce phénomène n'était pas particulier aux deux ferments utilisés dans le paragraphe 1.1) ci-dessus, les principaux ferments industriels, ainsi que différentes souches pures rentrant dans la composition de ces ferments, ont été testés sur la base du même test : du 10 lait reconstitué à partir de poudre de lait, auquel a été ajouté le Lactium à une dose de 1,5 g/L, a été fermenté dans des conditions standard (température optimale du ferment entre 37 et 42 C, arrêt de la fermentation à pH 4.7, 2 répétitions). L'analyse du taux de peptide bioactif aS1 [91-100] a ensuite été réalisée sur l'échantillon avant et après 15 fermentation.
Les résultats obtenus sur les souches pures sont présentés dans le Tableau 3 ci-dessous :
Tableau 3 Souches pures (S. thermophilus) % de peptide aSl [91-100] restant a rés fermentation 1-1630 (24/10/95) 0,3 1-1477 (22/09/94) 0,3 Souches pures Lactobacillus 1-1632 (24/10/95) 0,2 1-1519 30/12/94) 0,1 1-1968 (14/01/98) 1,6 1-2809 19/02/02 0,4 Dans le tableau 3 ci-dessus, qui reflète la consommation du peptide bioactif aSi [91-100] par différents ferments et souches industrielles lors de la fermentation d'un mix laitier contenant 1 .5 g/L de Lactium , les souches pures ont été identifiées par leurs numéro et date de dépôt respectifs auprès de la CNCM (Institut Pasteur, Paris, France).

Le Tableau 3 montre que la totalité des ferments et souches testés métabolisent de 94 à 100% du peptide bioactif aS1 [91-100] pendant la fermentation d'un mix laitier standard. La mise en oeuvre de cet ingrédient est donc impossible dans des conditions classiques pour produire des produits alimentaires, notamment laitiers, contenant des peptides et/ou protéines bioactifs en quantités suffisamment stables au cours du temps pour produire un effet chez le consommateur.
En outre, afin de vérifier que ce phénomène n'était pas particulier à
l'ingrédient Lactium , plusieurs combinaisons de ferments et d'autres ingrédients à base de peptides bioactifs ont été étudiées en mettant en ceuvre le même test (lait reconstitué + ingrédient à tester à une dose de 1,5 g/L, fermenté dans des conditions standard, arrêt de la fermentation à
pH 4.7, 2 répétitions). Les diverses combinaisons testées sont rapportées dans le Tableau 4 ci-dessous.
Tableau 4 Ferments/souches Peptide aSl Autres peptides DMV DMV CPP
pures [91-100] dans Lactium C12 x0 dans Lactium Mélange de 4 X X X X
souches:
I-2783 (24/01/02) 1-2774 (24/01 /02) 1-2835 (04/04/02) 1-1968 (14101198) 1-1630 (24/10/95) X X X
YC380 Hansen X X X X

Les ingrédients C12 et CPP produits par la société DMV International sont des hydrolysats de protéines de lait contenant des peptides bioactifs ciblant respectivement le contrôle de l'hypertension et l'assimilation des minéraux.

Sur l'ensemble des expérimentations, il est apparu que tous les ferments testés ont une importante capacité de métabolisation des peptides, quelles que soient leur nature et leur taille.

1.4) Ajout après fermentation Une alternative logique à la procédure étudiée ci-dessus est d'introduire l'ingrédient fonctionnel après la fermentation (procédé de type différentiation retardée ), par exemple avec le sirop permettant d'aromatiser la masse fermentée. La mise en oeuvre de la même quantité
d'ingrédient Lactium selon ce protocole conduit aux résultats illustrés par la figure 4.
Comme le montre la figure 4, même ajouté à froid (4 C) après fermentation, le peptide actif (apporté par l'équivalent de 1.5 g de Lactium par kg de produit fini) est rapidement dégradé au cours du stockage, pour ne laisser que 30 à 40% de la quantité initiale à la date limite de consommation (DLC).
Ainsi, la population de bactéries lactiques vivantes dans le produit fini continue de métaboliser le peptide bioactif pendant le stockage du produit fini, si bien qu'après seulement 10 jours (pour des produits frais dont la DLC est de 28 jours), entre 35 et 50% du peptide aS1 [91-100] ont disparu, ce qui reste inacceptable pour obtenir l'effet recherché chez le consommateur.

1.5) Traitement thermique du produit laitier fermenté contenant l'ingrédient bioactif d'intérêt En ce cas, il est possible d'assurer la stabilité du peptide aS1 [91-100]
(Figure 5), mais au détriment de la qualité globale du produit fini. Cette solution présente en effet de nombreux inconvénients - la thermisation d'une masse laitière fermentée implique l'usage de stabilisants ajoutés avant le traitement thermique (pectines, amidons, carraghenanes, etc...), ce qui complique le procédé et augmente sensiblement le coût de la formule ;
- la ligne de fabrication industrielle est plus complexe et demande un investissement spécifique plus important ;
- le produit ne bénéficie plus d'appellations liées aux produits contenant des ferments vivants (type yoghourt) et perd de fait les bénéfices associés à la consommation de ferments lactiques ;
- l'impact organoleptique (généralement négatif) est significatif.
Exemple 2: Mise en oeuvre d'ingrédients bioactifs d'intérêt en mettant en application l'invention revendiquée Un criblage a été réalisé sur des ferments industriels, sur la base de leur capacité à ne pas consommer le peptide aS1 [91-100]. Sur les 30 ferments testés, tous consomment l'essentiel du peptide aS1 [91-100]
pendant la fermentation, sauf un, le ferment contenant la seule souche I-2774 et du formiate, la souche 1-2774 étant microbiologiquement atypique.
Une autre souche a été testée : il s'agit d'un variant naturel de la souche 1-1630 déposée à la CNCM le 24/10/95 (qui, elle, consomme le peptide).
Ce variant 1-3211 (déposé à la CNCM le 10/05/04) a été obtenu par génération de mutants naturels ne disposant pas de système de transport de peptide (système AMI-). Il s'avère effectivement que ce variant ne consomme pas le peptide aSI [91-100], ni la plupart des autres peptides.
Parmi les applications testées au niveau pilote et même industriel, la mise en ceuvre du peptide bioactif asl [91-100] apporté sous la forme d'ingrédient Lactium (Ingrédia) a pu être effectuée avec succès grâce à
l'utilisation du ferment contenant la souche 1-2774 et du formiate. La figure 6 présente les résultats de stabilité obtenus.

De façon encore plus spectaculaire, le peptide en question a pu être avantageusement introduit avant fermentation (ce qui simplifie la mise en ceuvre industrielle), comme le montre la figure 7.
Ainsi, la disparition du peptide d'intérêt pendant la fermentation (d'une durée de 12 heures à- 41 C) ne dépasse pas 3 à 4% de la quantité
initiale, là où les autres ferments consomment la quasi-totalité des peptides. Dans des conditions identiques aux expérimentations décrites dans le Tableau 4, les souches 1-2774 et I-3211 donnent en effet des taux de survie du peptide aS1 [91-100] après fermentation supérieurs à 85%.
La capacité, fortement réduite, de métabolisation des peptides par les souches 1-2774 et 1-3211 permet plus largement la mise en oeuvre de tout type de peptide bioactif, dont entre autres, de nombreux hydrolysats commerciaux qui ont fait l'objet de tests concluants. Les expérimentations décrites dans le Tableau 4 ont ainsi été étendues avec succès à
l'utilisation des ferments/souches 1-2774 et 1-3211.

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Imprimé (original sous forme électronique) 0-1 Formulaire PCT/RO/134 (SAFE) Indications relatives à des micro-organismes ou autre matériel biologique déposés (règle 13bis du PCT) 0-1-1 Préparée avec 0-2 Demande internationale n P C T/ E P 2 0 0 5/ 0 5 5 3 0 9 0-3 Référence du dossier du déposant ou 348695D22351 du mandataire 1 Les indications ci-dessous ont trait au micro-organisme ou autre matériel biologique visé dans la description :
1-1 page 34 1-2 ligne 28 1-3 Identification du dépôt 1-3-1 Nom de l'institution de dépôt CNCM Collection nationale de cultures de micro-organismes 1-3-2 Adresse de l'institution de dépôt FR- Institut Pasteur, 28, rue du Dr Roux, F-75724 Paris Cedex 15 1-3-3 Date du dépôt 24 Janvier 2002 (24 . 01. 2002 ) 1-3-4 Numéro d'ordre CNCM I-2774 1-5 Etats désignés pour lesquels les de toutes les désignations indications sont données 2 Les indications ci-dessous ont trait au micro-organisme ou autre matériel biologique visé dans la description :
2-1 page 34 2-2 ligne 30 2-3 Identification du dépôt 2-3-1 Nom de l'institution de dépôt CNCM Collection nationale de cultures de micro-organismes 2-3-2 Adresse de l'institution de dépôt FR- Institut Pasteur, 28, rue du Dr Roux, F-75724 Paris Cedex 15 2-3-3 Datedudépôt 10 Mai 2004 (10.05.2004) 2-3-4 Numéro d'ordre CNCM I-3211 2-5 Etats désignés pour lesquels les de toutes les désignations indications sont données 3 Les indications ci-dessous ont trait au micro-organisme ou autre matériel biologique visé dans la description :
3-1 page 35 3-2 ligne 1 3-3 Identification du dépôt 3-3-1 Nom de l'institution de dépôt CNCM Collection nationale de cultures de micro-organismes 3-3-2 Adresse de l'institution de dépôt FR- Institut Pasteur, 28, rue du Dr Roux, F-75724 Paris Cedex 15 3-3-3 Datedudépôt 16 Septembre 2004 (16.09.2004) 3-3-4 Numéro d'ordre CNCM I-3301 3-5 Etats désignés pour lesquels les de toutes les désignations indications sont données PCT
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4 Les indications ci-dessous ont trait au micro-organisme ou autre matériel biologique visé dans la description :
4-1 page 35 4-2 ligne 3 4-3 Identification du dépôt 4-3-1 Nom de l'institution de dépôt CNCM Collection nationale de cultures de micro-organismes 4-3-2 Adresse de l'institution de dépôt FR- Institut Pasteur, 28, rue du Dr Roux, F-75724 Paris Cedex 15 4-3-3 Datedudépôt 16 Septembre 2004 (16.09.2004) 4-3-4 Numéro d'ordre CNCM I-3302 4-5 Etats désignés pour lesquels les de toutes les désignations indications sont données RÉSERVÉ A L'OFFICE RÉCEPTEUR
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Claims (20)

1. Produit alimentaire contenant un ou plusieurs bactéries lactiques vivantes et au moins un ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt, caractérisé en ce que la capacité du système AMI de transport des peptides vers l'intérieur de la cellule est réduite chez la ou lesdites bactéries lactiques vivantes , de manière à réduire la métabolisation du ou desdits ingrédients alimentaires d'intérêt par la ou lesdites bactéries lactiques vivantes.

2. Produit alimentaire selon la revendication 1, caractérisé en ce que la quantité résiduelle d'ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt dans ledit produit alimentaire est, 3 semaines après sa préparation, comprise entre 50 et 100 % environ par rapport à la quantité d'ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt présente dans le produit juste après sa préparation.

3. Produit alimentaire selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite quantité résiduelle est comprise entre 80 et 100% environ par rapport à
ladite quantité d'ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt présente dans le produit juste après sa préparation.

4. Produit alimentaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt sont:
- des protéines, - des peptides, - des analogues ou dérivés de ceux-ci ou - leurs combinaisons.

5. Produit alimentaire selon la revendication 4, caractérisé en ce que le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt sont:
- le peptide .alpha.S1 [91-100], - le peptide C6-.alpha.s1 194-199, - le peptide C7.beta.177-183, - le peptide C12-.alpha.s1 23-34, - un caséinophosphopeptide, - l'.alpha.-casomorphine, - la caséine .alpha. exorphine, - la casokinine, - la .beta.-casomorphine, - un caséinomacropeptide, - un glycomacropeptide, - la casoxine, - une casoplatelline, - un fragment 50-53, - une .beta.-lactorphine, - la lactoferroxine, - un peptide Val-Pro-Pro, Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln, Tyr-Lys-Val-Pro-Gln-Leu, Tyr-Pro, ou Ile-Pro-Pro, des fragments, analogues, dérivés de ceux-ci, des protéines et/ou peptides les contenant, ou - leurs combinaisons.

6. Produit alimentaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que lesdites bactéries lactiques vivantes sont les bactéries:
- Streptococcus spp;
- Lactobacillus spp ;
- Lactococcus spp ou - Bifidobacterium spp.

7. Produit alimentaire selon la revendication 6, caractérisé en ce que lesdites bactéries Streptococcus spp sont des bactéries Streptococcus thermophilus.

8. Produit alimentaire selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce qu'il contient au moins les bactéries lactiques vivantes S. thermophilus et Lactobacillus spp.

9. Produit alimentaire selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que lesdites bactéries S. thermophilus sont des bactéries:
- Streptococcus thermophilus telles que déposées à la CNCM
le 24/01/02 sous le numéro 1-2774 ;
- Streptococcus thermophilus telles que déposées à la CNCM
le 10/05/04 sous le numéro 1-3211 ;
- Streptococcus thermophilus telles que déposées à la CNCM
le 16/09/04 sous le numéro 1-3301 ou - Streptococcus thermophilus telles que déposées à la CNCM
le 16/09/04 sous le numéro 1-3302.

10. Produit alimentaire selon la revendication 9, caractérisé en ce que lesdites bactéries S. thermophilus sont des bactéries Streptococcus thermophilus telles que déposées à la CNCM le 10/05/04 sous le numéro 1-3211.

11. Produit alimentaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il est un produit fermenté.

12. Produit alimentaire selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il est un produit laitier ou végétal.

13. Procédé de préparation d'un produit alimentaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que la ou lesdites bactéries lactiques vivantes et le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt sont ajoutés les uns après les autres dans le mélange destiné à
constituer ledit produit alimentaire.

14. Procédé de préparation d'un produit alimentaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que la ou lesdites bactéries lactiques vivantes et le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt sont ajoutés simultanément dans le mélange destiné à
constituer ledit produit alimentaire.

15. Procédé de préparation d'un produit alimentaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt sont préparés directement dans le mélange destiné à constituer ledit produit alimentaire.

16. Procédé de préparation d'un produit alimentaire selon la revendication 15, caractérisé en ce que la ou lesdites bactéries lactiques vivantes sont ajoutés, dans le mélange destiné à constituer ledit produit alimentaire, avant la synthèse in situ du ou desdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt.

17. Procédé de préparation d'un produit alimentaire selon la revendication 15, caractérisé en ce que la ou lesdites bactéries lactiques vivantes sont ajoutés, dans le mélange destiné à constituer ledit produit alimentaire, pendant la synthèse in situ du ou desdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt.

18. Procédé de préparation d'un produit alimentaire selon la revendication 15, caractérisé en ce que la ou lesdites bactéries lactiques vivantes sont ajoutés, dans le mélange destiné à constituer ledit produit alimentaire, après la synthèse in situ du ou desdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt.

19. Utilisation d'un produit alimentaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 comme aliment fonctionnel.

20. Utilisation, dans un produit alimentaire contenant un ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt, d'une bactérie lactique vivante ayant une capacité réduite de son système AMI de transport des peptides vers l'intérieur de la cellule, pour protéger ledit ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt contre la métabolisation par ladite bactérie lactique vivante.