CA2593128A1 - Vecteurs viraux pour la surexpression ou pour l'extinction de genes chez les plantes et leurs applications - Google Patents

Abstract

L'invention a pour objet l'utilisation de gènes codant chez les plantes pour des protéines présentant une diversité fonctionnelle vis-à-vis du silencing, comprenant le choix du gène ayant le niveau d'efficacité pour construire un vecteur viral de plantes ayant la fonction de surexpression ou de silencing de gènes d'intérêt recherchée.

Description

2 PCT/FR2006/000017 Vecteurs viraux pour la surexpression ou pour l'extinction de gènes chez les plantes et leurs applications L'invention a pour objet des vecteurs viraux fonctionnels pour la surexpression, ou pour l'extinction post-transcriptionnelle (désignée ci-après par silencing ) de gènes d'intérêt chez les plantes. Elle vise plus particulièrement des vecteurs générés à partir de virus de plantes et comprenant des séquences codant pour des protéines présentant une diversité fonctionnelle vis-à-vis de la surexpression ou du silencing dë gènes chez les céréales, en particulier chez le riz.
L'un des principaux mécanismes de défense antivirale chez les plantes, et également chez les animaux, repose sur le phénomène de PTGS (post-transcriptional gene silencing ou extinction post-transcriptionnelle des gènes) qui conduit à la dégradation spécifique des ARN étrangers ou sur-exprimés.
Dans le cas des virus, le génome viral est le déclencheur et la cible du phénomène.
De manière concomitante, les virus ont développé des fonctions leur permettant de contourner ce type de mécanisme de défense, en spécialisant certaines de leurs protéines dans des fonctions de suppression du silencing ciblant des étapes clés du PTGS.
De nombreuses protéines, dites suppresseurs de silencing ont été décrites chez les virus phytopathogènes grâce à des interactions non-hôtes pour certaines chez Nicotiana benthamiana. En effet, des vecteurs PVX-protéine suppresseur potentielle ont été générés et inoculés (par agro-infiltration) sur des N. benthamiana présentant du PTGS afin d'évaluer le pouvoir suppresseur des protéines étudiées. La protéine Pl du virus de la panachure jaune du riz (désigné ci-après par RYMV pour Rice yellow mottle sobemovirus), virus FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) exclusivement restreint à l'infection du riz et de quelques graminées sauvages, a ainsi été décrite comme suppresseur de silencing.
La protéine P1 du RYMV est une protéine de 158 acides aminés codée par la première des 4 ORF virales. Cette protéine est traduite pendant la totalité du cycle infectieux et détectée sous forme d'un doublet de 18 et 19 kDa. Elle exerce une action indirecte sur la réplication virale et appâraît nécessaire au mouvement du RYMV de cellule à cellule et au mouvement longue distance.Des études de complémentation ont montré qu'elle agit en trans au cours de l'infection virale.
Cette protéine a été décrite comme suppresseur de silencing' agissant en mode cellule non autonome et donc sur la propagation du signal du PTGS.
Les inventeurs ont évalué l'efficacité de la protéine P1 et du RYMV pour la suppression du PTGS dans un contexte d'interaction naturelle entre le RYMV et son hôte, le riz.

Les travaux réalisés sur une collection d'isolats de RYMV, caractérisée en termes de pathogénie et de phylogénie, a permis de mettre en évidence une diversité de P1 et des différences fonctionnelles d'activité liées à cette diversité.
Ces travaux ont également permis d'explorer les effets quantitatifs et qualitatifs de ces P1 et de RYMV sur la suppression du PTGS.
L'invention a donc pour but la mise à profit de la diversité fonctionnelle de suppresseurs de silencing pour fournir de nouveaux .vecteurs viraux d'expression, ou de silencing et des outils de génomique fonctionnelle basés sur la diversité fonctionnelle d'une protéine suppresseur d'un virus de plante.
Elle vise également à fournir des vecteurs viraux d'expression et de VIGS (Extinction des gènes induite par les virus pour Virus Induced Gene Silencing )et leur construction à partir de virus de plantes, et plus

3 particulièrement à partir du RYMV dans le but de disposer d'outils efficaces pour la génomique fonctionnelle du riz, plante modèle pour les monocotylédones.
Selon un premier aspect, l'invention porte donc sur l'utilisation de gènes codant chez les plantes pour des protéines présentant une diversité fonctionnelle vis-à-vis du silencing, et le choix du,gène ayant le niveau d'efficacité
pour construire un vecteur viral de plantes ayant la fonction-de surexpression ou- de silencing de gènes d'intérêt recherchée.

L'invention porte également sur l'utilisation de gènes codant chez les plantes pour des protéines.P1 du RYMV, avec des effets suppresseurs faibles à forts selon les protéines, pour construire des vecteurs viraux de plantes fonctionnels pour la surexpression ou pour le silencing de gènes d'intérêt.
L'invention vise plus particulièrement l'utilisation de protéines sélectionnées pour un niveau d'activité donné en mettant en ceuvre une technique comprenant - le clonage de protéines suppresseurs de silencing présentant une diversité fonctionnelle en aval d'un promoteur approprié, tel que le promoteur 35S de RYMV, - l'inoculation des différentes protéines par biolistique sur de feuilles de riz, - l'inoculation mécanique de virus sur des lignées, telles que les lignées L2,4 et L10, - le dosage de la charge virale par DAS-ELISA en utilisant un anticorps polyclonal dirigé contre un isolat donné, par exemple un isolat de Madagascar, - la visualisation de la restauration de l'expression du gène rapporteur par test histochimique GUS

- la quantification de la restauration de l'expression du gène rapporteur par dosage de l'activité enzymatique, - la détection des siARN (preuves du PTGS) par Northern blot, et

4 - la sélection de la protéine présentant le niveau d'activité requis pour soit la surexpression, 'soit -le silencing d'un gène d'intérêt.
Pour la sélection de protéines P1, on applique la technique ci-dessus en clonant les différentes P1, plus particulièrement Tz3, Tz8, . Mg1, BF1, Ci63 en aval du promoteur 35S.
De manière préférée, les protéines sPl-Ci63 et Tz3 sont utilisées pour une grande efficacité dans la suppression du PTGS. Des protéines P1 comme sP1- Tz8 présentent une efficacité intermédiaire, alors que s-P1Mg1 et -BF1 sont peu efficaces dans la suppression du PTGS.
Les résultats obtenus, illustrés par les exemples, montrent que la variabilité de la suppression du PTGS par les différentes protéines P1 s'exprime à la fois à l'échelle quantitative, les protéines montrant une activité plus ou moins importante, mais également à l'échelle qualitative, les résultats montrant une vitesse de suppression du PTGS
différentielle.
L'activité des protéines P1 sur la suppression du PTGS a été évaluée par l'analyse de leur effet sur l'accumulation des miARN et des siARN. Il s'est avéré que l'efficacité
variable de suppression du PTGS entraîne une diminution variable de siARN spécifiques *des transgènes testés. Les analyses réalisées ont également révélé que les protéines P1 entraînent une diminution de l'accumulation des miARN.
L'invention concerne également l'utilisation du génome d'un isolat de RYMV, à effet suppreseur du PTGS variable, de fort à faible.
Selon un autre aspect, l'invention concerne des vecteurs viraux d'expression ou de silencing de gènes d'intérêt, caractérisés en ce qu'ils sont générés à partir du génome de RYMV et comprennent un gène codant pour un suppresseur de silencing choisi de manière à présenter le niveau d'efficacité

permettant de définir la fonctionnalité de surexpression ou de silencing recherchée.

La construction de tels vecteurs suppose de prendre en compte toutes les contra'intes imposées par la structure du

5 virus et dépend étroitement des capacités du virus à conserver son potentiel infectieux (par rapport au mouvement et à
l'encapsidation).

L'invention vise des vecteurs viraux d'expression ou de, silencing de gènes d'intérêt, caractérisés en ce qu'ils sont générés à partir du génome de RYMV et comprennent un gène codant pour des protéines Pl exprimant une diversité
fonctionnelle comme suppresseurs de silencing. Ce gène remplace celui du génome de RYMV codant pour une protéine Pl quelconque.

Ces vecteurs présentent avantageusement une intensité de réplication équivalente à celle de clone infectieux connus et induisent les mêmes symptômes.

Dans un mode de réalisation, les vecteurs de l'invention sont caractérisés en ce qu'il s'agit de vecteurs viraux d'expression contenant un insert d'un gène d'intérêt à
surexprimer ou à éteindre, de taille infé,rieure à 700 pb.
Pour des tailles d'insert supérieures à 700 pb, on ûtilise l'ORF réplicative (i.e. ORFZa, 2b) ou "amplicon", du RYMV ce qui permet de disposer de suffisamment d'espace pour l'insertion.
de grandes séquences.

Les ORF absentes pourront être complémentées en trans (i.e. plantes transgéniques) ou en cis (i.e. co-inoculation).
Ces vecteurs viraux d'expression sont de bons candidats comme outils pour l'expression transitoire.de gènes.
Avantageusement, ils possèdent une séquence avec des sites de restriction d'intérêt pour le clonag-e de séquences exogènes.
Ces vecteurs sont encore caractérisés en ce qu'ils comprennent en outre un gène codant pour le suppresseur de

6 PTGS p19, afin de rendre le clone plus fonctionnel dans des cellules non hôtes, comme les protoplastes BY2.

Dans un autre mode de réalisation, les vecteurs de l'invention sont caractérisés en ce qu'il s'agit de vecteurs VIGS contenant des inserts d'une taille inférieure à 50pb quelle que soit leur orientation d'insertion dans le génome viral et dont la cible est l'ARNm du transgène.

Les vecteurs définis ci-dessus sont avantageusement,' obtenus selon un protocole comprenant les étapes de - amplification PCR ;
- digestion ;

- ligation ;

- transformation de bactéries compétentes.
Les vecteurs d'expression sont validés plus particulièrement selon un protocole comprenant les étapes de "
- transcripti.on in vitro ;

- préparation et électroporation de protoplastes avec 1es transcrits ;

- visualisation des inserts 3 à 7 jours après l'électroporation - extraction d'ARN selon la même cinéti.que ;

- validation de la réplication et st'abilité des gènes insérés par RT-PCR.

Les vecteurs VIGS sont plus "spécialement validés selon un protocole comprenant les étapes de - transcription in vitro ;

- inoculation mécanique de différentes variétés de riz présentant des degrés de résistance variable au R MV et.
des lignées transgéniques avec les transcrits ;

- caractérisation 'phénotypique avec la visualisation des phénotypes de silencing ;

- caractérisation moléculaire avec l'extraction d'ARN
totaux, Northern blot en gel de polyacrylamide des ARN

7 de bas poids moléculaire et détection des siARN
spécifiques des gènes ciblés par le VIGS.

L'invention fournit ainsi des outils de grand intérêt pour l'insertion de gènes exogènes dans le génome de RYMV en vue de leur surexpression ou de leur silencing.

L'étude de la suppression du PTGS par le RYMV a permis de mettre en évidence l'importance de la quantité de virus inoculée.

La construction et la validation des vecteurs viraux d'expression. et de VIGS permettent de développer un ensemble d'outils adaptés à l'étude de l'expression de gènes et à la production de molécules d'intérêt, de manière transitoire chez le riz (production de protéines dans des protoplastes de riz par électroporation, dans des suspensions cellulaires de riz par co-cultùre avec des agrobactéries comme A. tumefaciens, expression transitoire sur feüilles par bombardement). A
l'échelle tissulaire, l'inoculation par biolistique de feuille de riz permet d'effectuer des études de complémentation fonctionnelle.
Les résultats obtenus conformément à l'invention sur la suppression du PTGS par les protéines Pl et par le RYMV dans son ensemble permettent un meilleur ciblage de l'utilisation des vecteurs.

Une protéine P1, ou une combinaison de suppresseurs, possédant une faible activité de suppression du PTGS
constituera un outil idéal pour la création de vecteurs VIGS.
Au contraire, une forte activité de suppression du PTGS sera exploitée pour l'optimisation de vecteurs d'expression.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent et les figures 1 à 12, qui représentent, respectivement, Figure 1 : Cinétique de restauration de l'activité Gus pendant l'infection virale de 1 à 30 j ours après l'inoculation ( j ai. ),

8 dans une lignée transgénique avec extinction de gus.a- les résultats de coloration histochimique Gus dans les feuilles de riz de différentes lignées transgéniques et avec différentes conditions d'inoculation. Les témoins correspondent à L4NI :

lignée t,ransgénique L4 exprimant constitutivement le transgène uidA, et L10 NI/BI : lignéetransgénique L10 avec uidA éteint de manière constitutive non inoculée et inoculée avec un tampon. La coloration histochimique de l'activité Gus sur~des, feuilles inoculées par des virus à partir de L10 est contrôlée dans,les feuilles inoculées à 1 et 2 jours après inoculation et dans des feuilles infectées de manière s stémique à 7,14 et 30 jai. L'inoculation virale est effectuée avec un inoculum standard (condition H I). b- les résultats de la colora-cion histochimique de l'activité Gus dans des feuilles infectées par L10 à 30 jai. Pour chaque condition d'inoculation indépendante (H'I ou L I)les plantes avec une intensité de symptôme contrastée appartenant aux classes I à V sont rassemblées.

Figure 2 : Effet de la teneur en virus sur'la suppression du silencing par RYMV, révélée dans des feuilles infectées de manière systémique à partir de L10 récoltées à 30 jai. La mesure de l'activité Gus par fluorimétrie (exprimée en pmol MU/min/}.zg protéine et représentée avec. des histogrammes grisés) selon la teneur en virus évaluée par DAS-ELISA, les données correspondant à l'absorbance (A405nm) étant représentées par des points noirs.
Les témoins correspondent à 4 NI, la lignée transgénique L4 exprimant cônstitutivement le transgène uidA et L10 NI/BI, la lignée transgénique L10 avec uidA, éteint de manière constitutive respectivement non-inoculée et inoculée par un taampon. L'activité enzymatique a été également mesurée dans les feuilles à partir de plantes inoculées par le virus (i.e.
lignée L10 avec extinction de gus) classée selon l'intensité
de symptômes apparents (de la classe I à V) à 30 jai.

9 a- Résultats suivant l'inoculation' virale dans des conditions d'inoculation standard (H I); b- Résultats suivant l'inoculation virale dans des*conditions d'inoculation faiblés (LcI) Figure 3 : Effet quantitatif de différentes P1 sur des siRNA
gus-spécifiques . les expériences Northern blots pour la détection des siRNA gus-spécifiques 2 jours par biolistique de différentes s-P1 d'isolats de RYMV représentatifs, de la.
phylogénie du virus (sP1-Mgl, -Tz3, -Tz8, -Ci63). La détection, des siRNA est effectuée sur l'ARN total extrait de feuilles de cultivar de riz Taipei, de lignée de riz transgénique L4 avec expression constitutive du transgène gus, la lignée N.
benthamiana 16c (16c) et la lignée de riz transgénique L10 avec extinction constitutive du transgène gus. Les feuilles re riz sont analysées après différents traitements :, feuille intacte (ND pour non délivré), feûille blessée (BD pour délivrance de tampon par biolistique) et feuille inoculée avec sP1-Mg1, -Tz8, -Tz3, -Ci63, -BF1 (Mg1, Tz8, Tz3, Ci63, BF1) par biolistique. Les feuilles de 16c sont infiltrées (I) avec une souche de A. tumefaciens portant un-plasmide binaire avec un intron Gus pour l'induction transitoire de PTGS sur le gène uidA, et sont analysées 5 jours après infiltration. La coloration au bromure d'éthidium de ARNr sert de témoin.
Figure 4: Arbre de relation des différents isolats de RYMV.
L'arbre phylogénétique est construit selon la méthode de Neighbor-Joining à partir de l'alignement des séquences nucléiques de l'ORF3 codant la protéine de capside (CP) des différents isolats. Les isolats utilisés pour les différentes analyses sont surlignés en gris. L'appartenance à différents sérogroupes est indiquée sur la droite de l'arbre.
Figure 5 : Etude quantitative de la levée du PTGS en fonction des différents isolats. Résultats de dosages enzymatiques de l'activité Gus (Act. Gus) réalisés sur des protéines de feuilles systémiquement infectées, par les isolats dont les noms sont reportés en abscisse des diagrammes, et récoltées à
35 jai. Le niveau de restauration de l'activité.enzymatique*
estexprimé en pourcentage de l'activité enzymatique *de la lignée L4 de référence comme niveau d'activité attendu. Les 5 contrôles sont constitués par le dosage de l'activité Gus sur les protéines extraites de feuilles de la lignée L4 non inoculées (NI) et de la lignée non inoculées et inoculées avec du tampon (BI). Restauratiori de, l'activité enzymatique,'tous.
isolats confondus.

10 Figure 6 : Etude quantitative et qualitative de la levée du PTGS en fonction des différents isolats du sérogroupe 2en réponse à une inoculation contrôlée. Comparai.son~des résultats' de dosages enzymatiques de l'activité Gus à 20 et 40 jai après inoculation. Le diagramme inférieur représente la variation relative de restauration d'activité enzymatique entre 20 et 40 jours.

Figure 7 : Evaluation quantitative de, l'effet propre de la P1 des différents isolats représentatifs de la phylogénie du virus sur le PTGS. a- Résultats du dosage enzymatique de l'activité Gus réalisés sur desprotéines de feuilles de N.
benthamiana co-infiltrées avec des souches d'A. tumefaciens contenant pCambia1305.1 (Gus) et différentes constrùctions pBin-p19, pBin-P1-HA et bin-Pldont les noms sontreportés en abscisse des diagrammes, et récoltées à 3 et 4 jai. Le niveau de restauration de l'activité enzymatique est exprimé en pourcentage de 1'activité enzymatique des feuilles infiltrées par pCambia1305.1. seul comme activité de référence. Pour chaque protéine P1, trois échantillons indépendants ont été
'analysés et l'écart-type des lectures est représenté sur le diagramme par des barres. b- Comparaison des résultats de dosages enzymatiques de l'activité Gus à 3 et 4 jai, et représentation de la variation relative du renforcement de l'activité enzymatique par rapport à un niveau de référence entre 3 et 4 jai.

il Figure 8 Les différents clones infectieux utilisés et vecteurs viraux générés- correspond au promoteur de l'ARN sub-génomique, correspond à 14 nucléotides 'additionnels (ACG TAC
TAG TGGGC). La position et le nom d"es différents sites de restriction ùtilisés pour les clonages sont représentés sur le génome viral par des flèches descendantes. La position et le nom des amorces utilisées pour la validation des vecteurs par RT-PCR sont indiqués par des flèches.

Figure 9 : Etude du clone C-gfp, a- dans les protoplastes'EY2 et b- dans les protoplastes 02428. Résultats de RT-PCR réalisées sur des ARN des protoplastes électroporés et récoltés à 2, 3, 4, 5, 6 et 7 jae. Différentes conditions d'électroporations ont été analysées et les protoplastes ont été non électroporés (NE), électroporés avec des transcrits in vitro du clone C-gfp (Cg), électroporés avec des transcrits in vitro du clone C-gfp et lé plasmide p19 (Cg + p19), électroporés avec les transcrits in vitro du clone infectieux FL5 (FL) et électroporés avec le plasmide contrôle 35S-gfp (gfp). Trois amplifications PCR ont été réalisées sur les produits de RT, synthétisés à partir de l'amorce R20, avec les couples d'amorces R15-R16, R19-GFP2 et GFP1-GFP2.

Les pistes M, FL-ADN, Cg-ADN et gfp-ADN correspondent respectivement au marqueur de taille et aux amplifications PCR
réalisées sur de l'ADN plasmidique des clones FL5 et C-gfp et du 35S-gfp.
Figure 10 : Etude du clone C-Gus, a- dans les protoplastes BY2, b- dans les protoplastes 02428.

Résultats de RT-PCR réalisées sur des ARN des protoplastes électroporés et récoltés à 2, 3, 4, 5, 6 et 7 jae. Différentes conditions d'électroporations ont été analysées et les protoplastes ont été non électroporés (NE), électroporés avec des transcrits in vitro du clone C-Gus (CG), électroporés avec des transcrits in vitro du clone C-Gus et le plasmide p19 (CG
+ p19) électroporés avec les transcrits in vitro du clonè

infectieux FL5 (FL) et électroporés avec le plasmide contrôle 35S-Gus (Gus). Trois amplifications PCR ont été réalisées sur les produits de RT, synthétisés à partir de l'amorce R20 avec les couples d'amorces R15-R16, R19-GUS2 et GUS1-GUS2.

Les pistes M, FL-ADN, CG-ADN et Gus-ADN correspondent respectivement au marqueur de taille et aux amplifications PCR
réalisées sur de l'ADN plasmidique des clones FL5 et C-Guset du contrôle 35S-Gus.
Figure 11 : Etude du clone Sit-gfp, a- dans les protoplastes BY2, b- dans les protoplastes 02428. Résultats de RT-PCR
réalisées sur des ARN des protoplastes électroporés et récoltés à 2, 3, 4, 5, 6 et 7 jae. Différentes conditions d'électroporations ont été analysées et les protoplastes ont été non électroporés (NE), électroporés avec des transcrits in vitro du clone Sit-gfp (Sg), électroporés avec des transcrits in vitro du clone Sit-gfp et le plasmide p19 (Sg + p19) électroporés avec les transcrits in vitro du clone infectieux FL5 (FL) et électroporés avec le plasmide contrôle 35S-gfp (gfp). Trois amplifications PCR ont été réalisées sur les produits de RT, synthétisés à partir de l'amorce R20, avec les couples d'amorces R15-R16, R19-GFP2 et GFP1-GFP2. Les amplifications de taille inférieure à la taille attendue avec les amorces R19-GFP.2 correspondent à une amplification avec les amorces R19 et R20 (amorce résiduelle de la RT).=

Les pistes M, FL-ADN, Sg-ADN et gfp-ADN correspondent respectivement au marqueur de taille et aux amplifications PCR
réalisées sur de l'ADN plasmidique des clones FL5 et Sit-gfp et du contrôle 35S-gfp.
Figure 12 : Etude de l'expression des gènes rapporteurs dans des protoplastes de N. tabaccum (BY2) et des protoplastes d'O.
s. (02428) quatre jours après électroporation avec les transcrits in vitro générés à partir des différents recombinants. Pour les recombinants exprimant la Gfp (C-gfp et Sit-gfp), la visualisation de la protéine a été effectuée sous illumination UV- (uv) après une observation des protoplastes sous lumière visible (vis). L'auto-fluorescence des protoplastes non électroporés (NE) ainsi que la fluorescence générée par l'expression du plasmide contrôle 35S-gfp ont été

évaluées et comparée à celle émise dans les protoplastes électroporés avec"les vecteurs d'expression.

L'expression du Gus détectée par test histochimique chez les protoplastes 02428 électroporés avec le plasmide contrôle 35S-Gus ou le recombinant C-Gus, a été évaluée sous lumière visible.
MATERIEL ET METHODES

La présente demande de brevet utilise les propriétés de matériel biologique issu de différents pays d'Afrique.' L'application de l'invention se fera dans le respect des accords de la convention de Rio sur la biodiversité
(http://www.biodiv.org).

La protéine Pl de plusieurs isolats de RYMV originaires de différents pays d'Afrique est utilisée pour, obtenir la sur-expression ou l'extinction de gènes. L'utilisation des protéines Pl des isolats référencés dans le tableau ci-dessous est expressément visée dans la description et les revendications.

Nom, origine, année de prélèvement et connaissances acquises sur les isolats du virus de la panachure jaune du riz (RYMV) utilisés dans le brevet'Vecteurs viraux pour la surexpression ou pour l'extinction de genes d'intérêt chez les plantes et leurs applications'; nom et institut de recherche d'appartenance des chercheurs impliqués.
Isolats Origine Année Connaissances Chercheur Institut de prëlèvenzent acquises de recherche BF1 Burkina Faso 1990 séquence partielle Jean-Loup Notteghem CIRAD
C163 Côte d'Ivoire 1997 séquence entière Placide N'Guessan CNRA
Mg] Madagascar 1989 sécluence entière Jean-Loup Notteghem CIRAD
Tz3 Tanzanie 1997 séquence entière Zakia Abubalcar ZARC
Tz8 Tanzanie 1997 séquence entière Zalcia Abubalcar ZARC

Clones infectieux On rapporte les résultats obtenus avec les clones infectieux suivants qui sont illustrés sur la figure 1:

- FL5 (Brugidou et al, 1995, qui correspond au cDNA
complet du génome viral cloné en aval du promoteLir du bactériophage T7;

- FL5ACP, dont une partie de l'ORF3 codant pour la protéine capside a été délétée( à savoir 3634 à 4167 nt et qui possède 14 nucléotides additionne,is dans la partie en 3'aval de la délétion (ACG TAC TAG TGG GC), correspondant à des sites uniques de restriction intéressants pour l'insertion de séquences surnuméraires;

- nouveau clone CP*, construit par insertion d'un fragment de 720pb correspondant à l'ORF de la CP
amplifiée par 5'r PCR à partir de FL5(à savoir 'avec les amorces sens 5' ACA AAG ATG GCC AGG AAG GGC AAG 3' et reverse 5' GAA TTC TAC GTA TCA CGT ATT GAG TGT TGG ATC
3', Tm 60 C) et digéré par MscI (en gras) et SnaBI
(souligné), dans FL50CP digéré par MscI (position 3450 nt) et SnaBI (position 3637 nt).

Vecteurs d'expression I,'es vecteurs viraux d'expression ont. été générés à partir du recombinant CP*.

Fusions :
Dans un premier temps, des fusions transcriptionnelles par insertion de séquences exogènes au site SpeI (positions 3996 à
4172 nt) ont été.=réalisées, entraînant une délétion partielle dans l'ORF de la CP correspondant à 54 acides aminés dans la protéine. Les séquences complètes du gène gfp+ (accès dans WO 2006/072742 1 s PCT/FR2006/000017 GenBank n U84737) et du gène uidA (accès dans GenBank n AJ414112)ont été amplifiées avec les oligonucléotides - Amorces gpf+ : sens 5'GAA TTC ACT AGT GTG AGC AAG GGC
GAG GA 3', antisens 5' GAA TTC ACT AGT TTA CTT GTA CAG
CTC GTC CAT 3'(Tm 62 C) ;

- Amorces uidA : sens 5'GAA TTC ACT AGT TTA CGT. CCT GTA
GAA ACC 3' , antisens 5' GAA TTC ACT AGT TCA TTG TTT GCC
TCC CTG 3' (Tm 60 C)(les séquences çomplémentairés aux-séquences des gènes rapporteurs sont soulignées). Les produits PCR (à savoir 720 pb pour gpf+ et 1816 pb pour u.idA) ont été clonés au site SpeI de CP*' et les construction ainsi réalisées sont respectivement dénommées C-gfp et C-Gus.
Duplication du promoteur de l'ARN sub-génomique (SIT) (Hacker & Siva=kumaraan, 1997) :
Le promoteur est inséré dans la partie 3' de. l' ORF de la CP par amplification PCR à partir de FL5 avec les amorces sens 5'ACA AAG ATG GCC AGG AAG GGC AAG 3' et antisens 5'GAA TTC TAC
GTA GCA TGC CAT CTT TGT GGG AGA CTC GCC CTA TCC CAC TCA CGT
ATT GAG TGT TGG ATC 3' (Tm 60 C).
Les sites SphI et SnaBI ont également été introduits par PCR en 5' du SIT (souligné) Le fragment de 774 pbainsi amplifié a été introduit par ligation dans FL50CP 'aux sites MscI et SnaBI, le clone généré a"eté appelé C-Sit.

Clonage de gfp+ en aval du SIT
Un fragment PCR de 720 pb,correspondant à la séquence complète du gène gfp+ amplifié avec les amorces sens 5'GAA TTC=
GCA TGC GTG AGC AAG GGC GAG GAG3' et antisens 5'GAA TTC GCA
TGC TTA CTT GTA CAG CTC GTC CAT3' a été cloné au site SphI de C-Sit. Ce recombinant est désigné Sit-gfp.
.Vecteurs VIGS

Les vecteurs VGS ont été générés par l'insertion de fragments PCR de tailles différentes, de 44 à 121 pb, des gènes= sgfp (accès dans GenBank n U43284, AAC5365=9) (Pang et al , 1996 ; Sallaud et a1, 2003) et pds (accès dans Genbank n AF049356) de O.sativa L.spp.indica cv. IR36 au site SnaBI
(position 4170 nt) de CP*. Les résultats sont donnés dans le tableau 1 ci-dessous.
Les inserts n'ont pas tous été intégrés dans la même orientation, s correspond à l'orientation sens et as' à l'orientation antisens.Les inserts gf*, gf**, f* fp* et fp**
ont été amplifiés à l'aide des amorces précisées dans le":
tableau à partir de l'ADN du plasmide pCambia5305. L'insert pds* a été amplifié par PCR en présence des amorces appropriées à partir d,'un produit d'une réaction de rétro-transcription réalisée sur 750 ng d'ARN extrait de feuilles de riz cv. IR64 en présence d'amorces oligonucléoti'diques de type d'oligodT.
Tableau I

Position de l'insert sur Gène - Nom le gène Oligonucléotide antisens Oligonucléotide sens 5'-3' *Tm du vecteur (taille de 5'-3' l'insert en Pb) Gfp - gf*as 242-286 (44) GAATTCTACGTAGCACGACTTCTT GAATTCTACGTACCTGGACGTAGC 55 C
Gfp - gf**s 242-334 (92) GAATTCTACGTAGCACGACTTCTT GAATTCTACGTACGGGCGCGGGACT 55 C
Gfp - f*as 479-532 (53) GAATTCTACGTACGGCATCAA GAATTCTACGTAGCACGCTGCCGT 57 C
Gfp -fp*s 677-716 (39) GAATTCTACGTACGCCGCCGGGAT GAATTCTACGTATTGTACAGCTCG 55 C
Pds -pds*s 996-1071 (51) GAATTCTACGTAATAGAACTTAATCCT GAATTCTACGTATCCATCGGTAAG

*Tm température d'hybridation moyenne des deux amorces, utilisée pour les amplifications PCR) .Validation Transcription in vitro des recombinants - Vecteurs d'expression électroporation Environ un milliori de protoplastes de tabac (Nicotiana tabaccum var BY2) ou de riz (0. sativa var 02428, sensible au RYMV) ont été électroporés avec 30 }zg de transcrits in vitro correspondant aux vecteurs d'expression.

Sept électroporations indépendantes ont été réalisées pour chaque vecteur recombinant et ont été' mélangées en fin d'expérimentation.

- Vecteurs VIGS
. inoculation më-canique de différente.s variétés de riz présentant des degrés de résistance variable au RYMV.
Les transcrits in vitro générés à partir des vecteurs VIGS, ciblant le gène- pds, ont été inoculés méçaniquement sur-des variétés de riz présentant différents degrés*de résistance au RYMV : cv.IR64 spp.indica (sensible), cv.Azucena spp.
japonica (partiellement résistant), cv.Nipponbare spp.japonica, cv. Ta.ipei309 spp.japonica) et des lignées transgéniques (cv. Taipei309) (Pang et a1 et Sallaud et al ci-dessus).
Pour chaque variété ou lignée, quatre à cinq jeunes plantes (i.e. 15 jours après semis, stade deux feuilles), ont été inoculées mécaniquement à l'aide de carborundum.
L'inoculum correspond à 20 pg de transcrits in vitro dilués deux fois dans 20 mM de tampon sodium phosphate pH 7.

Caractérisation phénotypique :visualisation des phénotypes de silencing (gfp = disparition de la gfp sous illumination UV, pds = blanchissement des feuilles).

Caractérisation moléculaire : extraction d'ARN totaux (Trizol), Northern blot en gel de polyacrylamide des ARN de bas poids moléculaire et détection des siARN spécifiques des gènes ciblés par les VIGS.

Protocoles de biologie moléculaire et de culture cellulaire A) Analyse de la suppression du PTGS

la.Evaluation de la,charge virale par DAS-ELISA

Le contenu en virus dans les feuilles systémiquement infectées est estimé par dosage irnmuno-enzymatique selon la technique DAS-ELISA (Double Antibody Saridwich-Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay).

Un millilitre PBS-T (1.36 M NaCl, 14 mM KH2P04r 80 mM
Na2HPO9, 26 mM KCl, pH 6.8, 0.5 % v/v Tween 20) a été ajouté à
100 mg de poudre issue des feuilles systémiquement infec-tées broyées, constituant ainsi la solution d'antigènes. Des anticorps polyclonaux (dilués au 1/1000éme), issus d'un sérum dirigé contre un isolat de Madagascar, ont préalablement été
fixés sur des plaques de microtitration (Nunc) selon le mode opératoire précédemment décrit (N'Guessan et al., 2000). Des étapes d'incubation et de lavages successives conduisent à la détection d'une réaction positive entre les antigènes déposés et l'anticorps polyclonal couplé à la phosphatase alcaline. La réaction entre la phosphatase alcaline et son substrat, le-pNPP (p-nitrophényl phosphatase substrate) ((SIGMA"), dilué
dans une solution de diéthanolamine (SIGMA ) génère une réaction colorée dont l'intensité est mesurée par lecture de la densité optique à 405 nm avec un fluorimètre (Mul.tiskan fluorimeter, Labsystem).
2a.Extraction de protéines Les protéines totales hydrosolubles sont extraites à
partir de 100 mg de feuilles broyées, dans un tampon phosphate (50 mM NaHPOq, 10 mM NaZEDTA, 1 mg.ml-1 N-Laurylsarcosine, 0.1 %
v/v triton), le surnageant est récupéré à l'issue de deux centrifugations successives de 30 min à 20 000 g à 4 C. Les protéines sont dosées selon la méthode de Bradford (Coomassie protein assay kit, Pierce) (Bradford, 1976) . Une gamme étàlon est réalisée par mesure de la densité optique à 595 nm obtenue avec des concentrations connues de BSA.

3a . Evaluation de l',activà.té GUS par test histochimique et dosage fluorimétrique On rapporte ci-après deux types d'expérimentations menés pour détecter l'activité enzymatique de la (3-glucuronidase (GUS).Le test histochimique sur feuilles a été réalisé comme décrit dans la littérature (Jefferson et al., 1987) après infiltration sous. vide (15 min, 0.33 MPa) en présence de 1mg.m1-1 X-GlucA (5-bromo-4-chloro-3-indolyl (3-D glucurônide) (Duchefa) dilué dans un tampon approprié (50 mM sodium phosphate, 0.25 mM K3Fe (CN) 6r 0.25 mM KqFe (CN) 6, 0.5 % v/v.
Triton). Les échantillons sont alors incubés pendant 12 h à
l'obscurité à 37 C. Les feuilles sont ensuite décolorées par un traitement avec une solution qui déstabilise' la.
chlorophylle (10 % v/v de formaldéhyde, 5 % v/v d'acide acétique glacial, 42.5 % v/v d'éthanol) pendant 24 h à
température ambiante. Enfin, les feuilles sont rincées plusieurs fois et sont conservées dans de l'éthanol 70 %
(v/v).

Un dosage fluorimétrique de l'activité Gus a été réalisé
sur les protéines hydrosolubles extraites des feuilles systémiquement infectées. Cinq microlitres de protéines ont alors été soumises au dosage enzymatique de l'activité Gus en présence de 1 mM de substrat (MUG (4-méthylumbelliféryl-(3-D-glucuronide), Sigma") dans un volume réactionnel de 200 pl. La cinétique d'apparition du produit fluorescent de la réaction enzymatique (i.e. MU, excitation à 365 nm, émission à 455 nm) est réalisée pendant 2 h, avec des lectures à intervalle de 30 min, à l'aide d'un fluorimètre (Fluoroskan fluorimeter, Labsystem). Une gamme étalon de référence est réalisée par la -mesure de fluorescence de différentes concentrations de MU.
L'activité enzymatique du Gus est exprimée en quantité de produit synthétisée par unité de temps et rapportée à,une même quantité de protéines : pmol MU/min/pg protéine.
4a.Analyse des ARN par Northern-blot Les ARN des différents échantillons ont été extraits à
partir de 100 mg de poudre à l'aide de Trizol (InvitrogenTM) selon les recommandations du fournisseur et sont repris dans 30 à 50 }il de formamide déionisé 50 %. La quantité et- la qualité des ARN ont respectivement été évaluées par mesure de la densité optique à 260 nm, et 2 pg d'ARN ont été déposés sur un gel d'agarose1 % et migrés à 50 V/cm dans du TBE 0.5 X.
Quinze microgrammes d'ARN totaux, complétés après dénaturation avec 1-4 de tampon de charge (50 % v/v glycérol, 50 5 mM Tris pH 7.7, 5 mM EDTA, 0.03 % v/v Bleu de bromophénol) sont séparés par électrophorèse en conditions dénaturantes sur un gel de polyacrylamide de 17.5 % (7 M urée, 17.5 %, v/v acrylamide-bisacrylamide 19:1, 0.5 X TBE, 0.04 % v/v Temed, 0.08 % v/v Persulfate d'ammonium) comme décrit précédemment, 10 (Hamilton & Baulcombe, 1999) pendant 2 h à 100 V/cm dans du TBE 0.5 X. Les ARN de bas poids moléculaire ainsi séparés sont électro-transférés sur une membrane de nylon non chargée (Hybond NX, Amersham) pendant 1 h à 100V à 4 C dans du TBE
0.5X.
15 Pour la détection des siARN, la sonde est marquée par ancrage aléatoire d'amorces, à l'aide du kit MegaprimeT" DNA
labelling system (Amersham) en présence de 20 U de Klenow et de 5pCi de a-32P-dCTP dans un volume réactionnel de 50 pl, selon les recommandations. du fournisseur. Le marquage est 20 effectué pendant 1 h à 37 C et la sonde marquée ést ensuite purifiée sur une colonne Sephadex-G50 (Amersham) avant d'être dénaturée et incorporée au tampon d'hybridation (PerfectHybTM
Plus hybridization buffer, Sigma ).
Les sondes utilisées pour la détection de miARN sont synthétisées par phosphorylation d'amorces oligonucléotidiques (20 pmol) complémentaires des miARN choisis, par 10 unités de' T4 polynucléotide kinase (Qbiogene) en présence de 2pl de tampon de réaction et de 5 pCi de y-32P-dCTP, dans un. volume réactionnel de 20 ul. Le marquage est effectué pendant 1 h à
37 C, et la sonde marquée est purifiée sur une colonne Sephadex-G25 (Amersham) avant d'être dénaturée et incorporée au tampon d'hybridation.

Les membranes sont ensuite hybridées toute la nuit à la température adéquate (i.e. 42 C pour la détection de siARN, Tm-20 C pour la détection desmiARN). Deux étapes. successives de lavage de 20 min à 50 C sont ensuite réalisées avec une solution de SSC 2 X et de SDS 2 %. Enfin les membranes, enveloppées dans du Saran Wrap sont exposées contre un film d'autoradiographie (LifeRayTM XDA Plus, Ferrania imaging technologies) à -80 C pour une durée variable selon l'intensité du signal. souhaitée. Le film d'autoradiographie est révélé manuellement.
Une fois les membranes hybridées, elles peuvent être déshybridées par deux traitements successifs de 20 min avec une solution de SDS 0.1 % portée à ébullition, pour des expérimentations successives d'hybridation.
B) Préparation des constructions et.clonage lb. Préparation des vecteurs et inserts Les vecteurs sont préparés par digestion de l'ADN
plasmidique avec l'enzyme appropriée dans un volume réactionnel de 100 pl. Les produits de digestion sont ensuite purifiés à l'aide du kit GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification kit (Amersham) selon les recommandations du fournisseur et sont repris dans 30 }il de tampon d'élution. Les vecteurs digérés par des enzymes générant des bouts francs .sont traités à la phosphatase alcaline. Ainsi la totalité du produit de digestion purifié est déphosphorylé par 1 U de CIP1 (New England Biolabs) avec du tampon NEB3 1 X (New England Biolabs) dans un volume réactionnel de 40 ul, pendant 1 h à 37 C. Les vecteurs déphosphorylés sont ensuite purifiés sur une colonne GFXTM (GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification kit, Amersham).
Les inserts sont des produits d'amplification PCR
réalisées avec une polymérase haute fidélité (Pfu, Promega) dans un volume réactionnel de 50 ul. Les amplifications PCR
sont réalisées selon les recommandations du fournisseur, en présence de son tampon (1X), de 200 pM de dNTP, de 0.5 pM de chaque amorce et de 1.25 U de Taq. A l'issue d'une dénaturation de 3 min à 95 C, les cycles PCR ont été
effectués selon des conditions particulières : l'ancrage des amorces à la matrice est effectué au Tm moyen des amorces pendant 30 sec et l'élongation du fragment est réalisée à 72 C durant 1 min par kpb à amplifier, 30 cycles d'amplification ont été réalisés. Les produits PCR de la taille attendue sont ensuite purifiés à partir d'un gel d'agarose sur une colonne GFXT" (GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification kit, Amersham) et repris dans 30 p1 de tampon d'élution. Les inserts sont alors digérés avec les enzymes appropriées dans un volume réactionnel de 40 ul. Les produits de digestion sont purifiés sur une colonne GFXTM (GFXTM PCR, DNA and Gel Band Purification kit, Amersham).
La qualité et la quantité des vecteurs et inserts sont évaluées respectivement par électrophorèse en conditions non dénaturantes dans du TAE 1X et par mesure de la densité
optique à 260 nm.
2b.Ligation Cent ng de vecteur ont été utilisés poùr chaque réaction de ligation, auxquels ont été rajoutés la quantité voulue d'insert selon la formule : ng insert = ratio (insert/vecteur) x (ng vecteur x taille insert)/taille vecteur. Plusieurs types de ratios moléculaires de vecteur et d'insert ont été

utilisés : 1:1, 1:3, 1:5. Une unité et demi de T4 DNA ligase (Invitrogen) avec 2pl de tampon ligase 5X (Invitrogen) ont été utilisés pour les différentes réactions de ligation, effectuées dans un volume réactionnel de 10 pl pendant 20 h à
16 C.
3b.Transformation de Escherichia coli compétentes (JM110, Promega) Cinq microlitres de produit de ligation sont ajoutés à 50 ul de cellules compétentes. Après incubation de 10 min dans la glace, les bactéries sont transformées par choc thermique de 50 sec à 42 C et sont replacées immédiatement dans la glace pendant 2= min. Sept cents microlitres de milieu SOC froid sont alors ajoutés aux cellules qui sont.incubées pendant* l h à 37 C sous agitation (225 rpm). Les bactéries sont ensuite étalées par aliquots (i.e. de 50 à 300 pl) sur milieu sélectif (i: e. LB. additionné de 50 pg.ml-1 d' ampicilline) et les cultures sont ainsi mises à l'étuve pendant 1 nuit à 37 C.-La validation. des clones positifs s'effectue par uné PCR-sur-les colonies.
4b.Préparation d'ADN plasmidique de E. coli Les bactéries (i.e. 20 pl de culture glycérolée ou eolonie récoltée à l'aide d'une anse de platine) sont ensemencée.s dans 10 ml de milieu LB sélectif. Après une nuit de'culture à 37, C
sous agitation (225 rpm), les cultures sont centrifugées pendant 15 min à 4000 rpm et l'ADN plasmidique est extrait à
partir des culots bactériens à l'aide du kit GE'XTM Micro plasmid prep kit (Amersham) selon les recommandations du fournisseur et repris dans 60 pl de tampon d'élution.
5b.Electroporation d'Agrobacterium tumefaciens (souche GV3101) Un à 2pl d'ADN sont ajoutës à 40 pl d'agrobactéries compétentes qui sont ensuite incubées 2 min dans la glace.
L'intégration de l'ADN plasmidique dans les agrobactéries est alors effectué par électroporation (Biorad Gene Pulser system) dans une cuve de 4 mm préalablement refroidie, par application d'une décharge électrique de 2.5 kV (25 pFa ; 200 Ohms). Un ml de.milieu SOC froid est alors ajouté aux cellules avant de les incuber pendant 3 h à 28 C sous agitation (225 rpm).
Des aliquots de la transformation (i.e. 50 à 300 l) sont étalés sur un milieu sélectif (i.e. LB additionné de 50 ug.ml-1 rifampicine et de 50 pg.ml-1 kanamycine) et les cultures sont ainsi incubées 2 à 3 jours à 28 C.
6b.Préparation d'ADN plasmidique de A. tumefaciens par lyse alcaline Les agrobactéries sont ensemencées dans 10 ml de milieu LB

sélectif et cultivées pe,ndant 30 h (ou plus selon la souche utilisée) à 28 C sous agitation (225 rpm). Lè culot bactérien obtenu après centrifugation des cellules pendant 15 min à 4000 rpm est resuspendu dans 100 pl de Tris 50 mM, d'EDTA 10 mM, de RNAseA 100 }zg.ml'1 et de lysozyme 5 mg.ml-1. Après une incubation de 5 min dans la glace, 200 ul de tampon de lyse sont ajoutés (200 mM NaOH, 1 % w/v SDS) . La lyse des pârois-bactériennes est effectuée pendant 4 min à 4 C. Enfin 200 ~Zl 10' d'acétate de sodium 3 M (pH 5.5) sont ajoutés et le mélange est centrifugé pendant 10 min à 13000 rpm à 4 C. L'ADN
contenu dans le surnageant est précipité à l'éthanol (1/10ème v/v 3 M NâAC pH 5.5,,2 volumes éthanol 100 %) pendant 30 min à
-20 C après deux étapes de purification au phénol-chloroforme. L'ADN précipité est culoté par une centrifugation de 45 min à 15000 g à 4 C. Après une étape de lavage à
l'éthanol 70 %, le culot d'ADN est élué dans 60 p1 de Tris-.HCl pH 8 1M.
C) Protocoles de biologie cellulaire lc.Obtention de protoplastes de tabac (BY2) Les protoplastes de tabac sont isolés à partir d'une culture de suspensions cellulaires BY2 de Nicotiana tabaccum âgées de 2 à 3 jours. Après 20 min de décantation à
température ambiante de 50 ml de suspensions cellulaires, le surnageant est retiré et remplacé par 40 ml de mannitol 0.4 M.
Les cellules sont plasmolysées à l'issue d'une incubation de min à température ambiante, le mannitol est alors retiré.
Une première étape d'isolement des protoplastes est effectuée, par une incubation des cellules plasmolysées avec 12.5 ml de 30 solution enzymatique, pendant 30 min à 28 C sous faible agitation (55 rpm) à l'obscurité. Les agrégats cellulaires sont ensuite dissociés pâr 5 pipetages et refoulements successifs à l'aide d'une pipette pasteur en plastique. Une deuxième incubation est alors effectuée pendant 2 h à 28 C

sous agitation (55 rpm) à l'obscurité. Les protoplastes ainsi obtenus sont centrifugés à 100 g pendant 15 min à 4 C et la solution enzymatique est retirée.

Avant l'électroporation, 20 ml de mannitol 0.4 M sont 5 ajoutés pour le maintien des protoplastes qui sont conservés dans la glace. Le comptage des protoplastes isolés est alors réalisé. Les protoplastes sont ensuite centrifugés à 100 g pendant 15 min à 4 C et repris dans un volume adéquat de mannitol 0.4 M afin d'obtenir une densité 106 protoplastes par 10 ml, ils sont alors maintenus dans la glace, avant l'électroporation.

lb.Obtention de protoplastes de riz (02428) Les protoplastes de riz sont.isolés à partir d'une culture de suspensions cellulaire de 02428 d'O. sativa âgées de 3 à 5' 15 jours comme décrit précédemment (Brugidou et al., 1995;
Ndjiondjop et al., 2001) en apportant quelques modifi'cations.
Après une centrifugation de 10 min à 100 g, le surnageant est retiré et remplacé par 15 à 25 ml de milieu PIS additionné de 15 à 25 ml de milieu R2 (en conservant un ratio de 1:1 de 20 chaque milieu) pour 100 ml de cellules sédimentées. Les protoplastes sont ainsi isolés à l'issue d'une incubation de 20 h à 28 C à 1'obscurité sous faible agitation (55 rpm).
Quelques millilitres de milieu CPW13% MMa sont ensuite ajoutés à la solution de protoplastes isolés pour faciliter la 25 filtration des protoplastes à travers un tamis (50 pm). Les protoplastes filtrés sont centrifugés pendant 10 min à 100 g à
4 C, le surnageant est alors éliminé et remplacé par 15 ml de CPW 13% MMa pour le maintien des protoplastes conservés dans la glace avant l'électroporation. Pendant le comptage des protoplastes,' ces derniers sont sédimentés par 10 min de centrifugation à 100 g à 4 C et les culots sont repris dans le volume approprié de CPW 0.04 % MMa de manière à obtenir la densité de protoplastes voulue et sont maintenus dans la glace avant l'électroporation.

1c.Comptage des protoplastes Le nombre et la viabilité des protoplastes sont évalués par comptage à l'aide d'un hémocytomètre en présence de bleu trypan. Les protoplastes (200 pl) sont dilués au 1/5en1e dans.

une solution de Hank's balanced salts (300 ul) (Sigma) et de bleu trypan (500 pl).
1d.Electroporation de protoplastes de tabac et de riz Une réaction d'électroporation est réalisée en mélangeant 600 ul de milieu d'électroporation avec 200 pl d'inoculum ( i. e. 30 pg de transcrit in vitro ou 5 pg d'ADN plasmidique dilués dans du tampon d'électroporation) avec des protoplastes sédimentés à l'issue d'une centrifugation (i.e. 5 min, 100 g, 4 C) de 1 ml de protoplastes isolés. Le mélange est soumis à
une décharge électrique de 250 V (25 pFa, 200 Ohms) par l'utilisation de Biorad Gene Pulser system. Après électroporation, les protoplastes sont maintenus 30 min dans la glace, 5 min à température ambiante et sont centrifugés 10 min à 100 g à 4 C. Le surna-geant est retiré et remplacé par un volume adéquat de milieu de culture de protoplastes (i.e.

milieu R2 pour le riz.), les protoplastes sont alors maintenus pendant 7 jours à 28 C sous agitation (90 rpm) à l'obscurité.
D) Validation des constructions e vecteurs viraux d'expression et de VIGS
1d.ILa transcription in vitro L'ADN plasmidique des différentes constructions est-linéarisé par restriction à l'aide de l'enzyme HindIII (i.e.
3' du génome viral) suivie d'un traitement de 1 h à 37 C avec 2 mg.ml-1 de protéinase K. L'ADN linéarisé est purifié par deux traitements au phénol chloroforme et précipité à l'éthanol pendant une nuit à -20 C.
La transcription in vitro est réalisée dans un volume réactionnel de 100 pl, sur 5 pg d'ADN linéarisé en présence de 10 mM DTT, 0.1 mg.ml-i BSA, 0.5 mM Cap analog structure (m7G ( 5' ) ppp ( 5' ) G, New England Biolabs), rNTP (2 mM rATP, 200 }zM

rGTP, 2mM rCTP, 2 mM rUTP), 80 U RNAsin (Promega), 100 U T7 RNA polymerase (Promega) avec son tampon de réaction. A
l'issue d'une heure de réaction à 37 C, 1 ul de transcrits sont migrés sur un gel d' agarose et 12 U de T7 RNA polymerase sont rajoutés pour.une deuxième heure de réaction.
A l'issue de la transcription, la qualité et la quantité
des transcrits sont évaluées par migration sur gel d'agarose et par mesure de la densité optique à 260 nm.

2d.Extraction d'ARN
Les ARN des différents échantillons ont été extraits à
partir de 4 ml de culture de protoplastes (centrifugation préalable de 10 min à 100 g) avec 0.5 ml de TRIzol Reagent (InvitrogenTM) selon les recommandations du fournisseur. Les ARN extraits sont repris dans 10 pl d'eau RNAse free.
La quantité et la qualité des ARN ont respectivement été
évaluées par mesure de la densité 'optique à 260 nm, et par électrophorèse en conditions non dénaturantes de 2 pg d'ARN
dans du TBE 0.5X â 50 V/cm.
3d.Analyse des ARN RT-PCR
Pour s'affranchir du biais de l'amplification de la matrice résiduelle d'ADN (i.e. à l'issue de la transcription in vitro) correspondant aux vecteurs recombinants linéarisés, un traitement à la DNAse sur lesARN est réalisé. L'efficacité
du traitement est évaluée à l'issue d'une amplification PCR

sur 2pl d'ARN DNAsés, en utilisant les mêmes amorces que celles utilisées pour la validation des recombinants.
Sept cent cinquante nanogrammes d'ARN sont traités avec 1 U de RQ1-DNAse (Promega) en présence de son tampon dans un volume réactionnel de 10 pl, pendant' 30 min à 37 C. La réaction est stoppée par l'addition de 1 l de solution soin (Promega) suivie d'une' incubation de 5 min à 65 C. Ce traitement est réalisé en double sur les échantillons, la moitié servira à évaluer l'efficacité du traitement comme cela est décrit ci-dessus, l'autre moitié est utilisée pour valider les vecteurs selon la démarche qui suit. Les ARN DNAsés sont incubés pendant 5 min à 65 C avec 10 pmol d'amorce antisens (R20 : 5'CTC CCC CAC CCA TCC CGA GA3' ou oligodT) et 10 nmol de dNTP RNAse free. Dans la glace, un mélange de 1X de tampon de RT (Invitrogen), de DTT 10 mM (Invitrogen), de 40U de RNAse out (Invitrogen), est ajouté au mélange précédent et incubé
pendant 2 min à 42 C. Enfin, 200 U de Superscript II
(Invitrogen) est ajoutée au mélange réactionnel. 'Le brin-complémentaire des ARN est synthétisé à l'issue d'une.

incubation de 50 min à 42 C, et la réaction est stoppée après min d'incubation à 70 C. Les échantillons sont ensuite traités avec 100 U de RNase H (Invitrogen) pendant 30 min à
37 C.
A l'issue de la réaction de rétro-transcription, une PCR
15 est réalisée sur 2.5 ou 5 ul des échantillons dans un volume réactionnel 12.5 p1 (ou 5u1 de RT dans un volume final de 15 pl) en présence de 2 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 0.1 }iM de chaque amorce, 0.02 U d'ADN polymérase (Iriterchim) et d'e 1 X de tampon d'amplification. Le programme d'amplification débute par une dénaturation de 3 min à 94 C, puis 30 cycles d'amplification sont réalisés (dénaturation de 45-sec à,94 C, hybridation de 30 sec au Tm moyen des amorces utilisées, élongation de 1 min par kpb à amplifier à 72 C), un étape finale d'élongation de 5 min à 72 C termine la réaction d'amplification.
Dix microlitres des produits d'amplification sont séparés par électrophorèse en conditions non dénaturantes, sur un gel d'agarose dans du TAE 1X, à 100 V/cm.
4d. Analyse des protéines par Western-blot - Séparation des protéines Dix microgrammes de protéines sont mélangés à1--4 de tampon de charge et dénaturés pendant 15 min à 100 C. Les protéines sont ensuite séparées en conditions dénaturantes sur un gel SDS-PAGE de 12.5 ~. L'électrophorèse est effectuée en deux temps dans un tampon de migration approprié

- les échantillons sont concentrés dans la première partie du gel (i.e. stacking) par une migratiôn à 80 5. V/cm, - ils sont ensuite"séparés à l'issue d'une migration de 3 à 4 h (i. e. jusqu'à la sortie du bleu de charge) à 100 V/cm.
- Electro-transfert A l'issue de la migration, les protéines sont électro-transférées sur une membrane de nitrocellulose de 0.45 pm (Trans-Blot Transfer Medium, Biorad) par l'application d'un courant électrique de 100 V pendant 1 h ou de 20 V pendant la nuit à 4 C.

- Immuno-détection Toutes les étapes d'incubation et de lavage sont réalisées à température ambiante sous agitation, à l'aide d'un agitateur à plateau, à des vitesses variables de 20-25 rev/min et 45-50 rev/min pour les étapes d'incubation et de lavage respectivement.
La membrane est incubée pendant 1 h dans une solution de blocage contenant du TBSt et 0.5 % w/v de BSA (immuno-détection avec des anticorps monoclonaux) ou 3 % w/v de lait écrémé en poudre (Non-fat dry milk, Biorad) (immuno-détection avec des anticorps polyclonaux). La membrane est ensuite incubée pendant 1 h avec le premier anticorps dilué au 1/1000éme dans la même solution de blocage. L'anticorps monoclonal utilisé, Mab E. a été obtenu à partir d'un épitope du RYMV, alors que la solution d'anticorps polyclonaux, Pab Mali, a été obtenue à'partir de la particule virale entière d'un isolat du Mali. La membrane est alors rincée par 6 lavages successifs de 5 min avec du TBSt puis incubée 1 h avec le deuxième anticorps (anti-IgG de souris ou de lapin coûplés à la péroxydase pour révéler respectivément des réactions, sérologiques avec des anticorps monoclonaux ou polyclonaux) dilué au 1/40000ème dans une solution de blocage neuve. Six lavages successifs de 5 min dans du TBSt de la membrane sont 5 alors réalisés. La révélation de l'interaction antigène-antïcorps est révélée par chimiluminescence, et l'excitation.
est provoquée par une réaction chimique avec la peroxydase en présence d'une solution de West Pico (Pierce) appliquée sur la-membrane et incubée 5 min à la lumière. La membrane enveloppée 10 dans du Saran est alors exposée à un film autoradiographique (CL-X PosureTM Film, Pierce) à températuré ambiante pour une durée variable selon l'intensité du signal désirée. Le film d'autoradiographie a été révélé manuellement.
Tampons de biolog'ie moléculaire 15 TBE 10X : 0.9 M Tris-borate, 20 mM EDTA
TAE 50X : 2 M Tris-acétate, 50 mM EDTA
Tampons et solutions pour Western-blot Gel de séparation : 12 % acrylamide bis acrylamide (29:1), 0.4 M Tris HCl pH8.8, 0.1 % SDS, 0.1 % Persulfate d'ammonium, 20 0.1 % Temed Gel de concentration : 5 % acrylamide bis acrylamide (29:1), 125 mM Tris HCl pH6.8, 0.1 % SDS, 0.1 % Persulfate d'ammonium, 0.1 % Temed Tampon de migration : 25 mM Tris base, 0.25 M Glycine, 25 0.1 % SDS

Tampon de transfert : 20 mM Tris base, 0.15 M Glycine, 2 % méthanol Tampon de charge 4X : 200 mM Tris HCl pH 6.8, 400 mM DTT, 8 % SDS, 0.4 % Bleu de bromophénol, 40 % Glycérol 30 TBS pH 7.5 : 20 mM Tris base, 75 mM NaCl, 2.5 mM MgC12 TBS-t : TBS, 0.05 % Tween 20 Milieux de culture cellulaire et bactérienne LB (pH 7) : 10 g.1-1 tryptone, 5 g.l-1 extrait de levure, 10 g . 1-1 NaCl SOC : 20 g.1-1 tryptone, 5 g/L extrait de levure, 0,5 g.1-1 NaCl, 2.5 mM KCl (pH 7) Du glucose stérile (20 mM) est ajouté au milieu après autoclavage.

Milieux de culture cellulaire Cellules de tabac BY2 Entretien des suspensions de tabac' (pH 5.8) :~.3 g.1-1 MS
salts (Duchefa M0221), 1 mg.1-1 Thiamine HCI, 100 mg.1-1*Myo-inositol, 30 g. 1'1 Sucrose, 0.2 mg.l-1 2,4-D

Milieu de culture des protoplastes (pH 5.8) : 4.3 g.l-1 MS
salts (Duchefa M0221), 1 mg.l-1 Thiamine HCl, 100 mg.l-1 Myo-inositol, 10g.1-1 Sucrose , 0.4 M D-Mannitol, 0.2 mg.l-1 2,4-D
Solution enzymatique pourla préparation de protoplastes (pH 5.5) : 1% Cellulase Onozuka RS, 0.1 % Pectolyase Y-23, 0.4 M- D-mannitol. La solution est stérilisée par filtration à
0.22 pm et aliquotée par volume de 25 ml. Stockage à -20 C

Milieu d' électroporation de protoplastes (pH 5.8) : 0.3 M
Mannitol, 70 mM KCl, 5 mM MES

Cellules de riz 02428 Milieu PIS (solution enzymatique pour la préparation des protoplastes) (pH 6) : 2 % Cellulase RS, 0.1 % Pectolyase Y23.
Les enzymes sont diluées dans du CPW 13 % MMa et stérilisées par filtration à 0.22pm. La solution est conservée à-20 C
Milieu CPW 13% MMa'(protoplastes) .

Solution 100* X : 20 mM KH2PO4, 0.1 M KNO31 0.2 M MgSO4 CPW 13% MMa (pH 5.8) : 10 ml/1 solution 100X, 10 mg/ml KI, 10 mg/ml CuSOq, 5H20, 5 mM MES, 10 mM CaCl2r 0.7 M Mannitol.
Conserver la solution à -20 C.

Milieu CPW 0.04 % MMa (protoplastes) Le milieu présente la même composition que le milieu CPW13 %MMa, seule la concentration de mannitol varie : 0.4 M
Milieux R2 (protoplastes) .

Macroéléments R2-I (10X) : 40g.1-1 KNO3, 3.3 g.l-1 (NHq) ZSOq, 3. 12 g. 1-1 NaH2PO4 H20, 10 mM MgSO4 Macroéléments R2-II (10X) : 1.46 g.1-1 CaC12 2H20 Microéléments R2 (1000X) : 1.6 g.1"1 MnSO4 H20, 2.2 g.1-1 ZnSO4 7H20, 2.83 g.1-1 H3B03i 0.125g.1-1 CuSO4 5H20, 0.125 g.l-1 Na2MoO4 2H20 Vitamines R2 (40X) : 40 mg.1-1 Thiamine HCl FeNaEDTA (100X) : 1.25 g.1-1 FeSO47 H20, 0.5 mM Na2EDTA
Milieu R2 (pH 5.8) : 1X Macroéléments R2-I, 1X
Macroéléments R2-II (1X), 1X Microéléments R2, 1X Vitaminés R2 (1X), 1X FeNaEDTA, 2.5 mg.1-1 2,4-D, 0.4 M Maltose, 0.5 mg.1-1 Acide nicotinique, 100 mg.1-1 Myo-inositol, 0.5 mg.1-1 Pyrodoxine.

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

Bradford, M. (1976). A rapid and sensitive method for quaiitification of microgram qûantities of protein utilising the principle of protein-dye binding. Annal of Biochen2estry 72, 248-254.
Brugidou, C., Holt, C., Yassi, M. N., S., Z., Beachy, R. N. and Fauquet, C.
(1995). Synthesis of an infectious fiill-Iength cDNA clone of Rice yellow mottle virus and mutagenesis of the coat.protein.
Virology 206, 108-115.

Hacker, D. L. and Sivakumarann, K. (1997). Mapping and expressiôn of Southern Bean naosaic virus genomic and sub-genomic RNAs. Virology 234, 317-327.

Hamilton, A. J. and Baulcombe, D. C. (1999). A Species of Small Antisense RNA
in Posttranscriptional Gene Silencing in Plants. Science 286, 950-951.

Pang, S. Z., DeBoer, D. L., Wan, Y., Ye, G., Layton, J. G., Neher, M. K., Armstrong, C. L., Fry, J. E., Hinchee, M. and Fromm, M. E. (1996). An Improved Green Fluorescent Protein Gene as a Vital Marker in Plants. Plant Physiology 112, 893-900.

Sallaud, C., Meynard, D., van Boxtel, J., Gay, C., Bès, M., Brizard, J. P., Larmande, P., Ortega, D., Raynal, M., Portefaix, M. et al. (2003). Highly efficient production and characterization of T-DNA plants for rice (Oryza sativa L.) functional genomics. Theoretical and Applied Genetics 106, 1396-1408.

Claims (13)

1/ Utilisation de gènes codant pour un suppresseur de silencing tel les protéines P1 du RYMV présentant une diversité fonctionnelle vis-à-vis du silencing, comprenant le choix du gène ayant le niveau d'efficacité pour construire un vecteur viral de plantes ayant la fonction de surexpression ou de silencing de gènes d'intérêt recherchée.

2/ Utilisation de protéines P1 isolées des isolats du RYMV pour la sélection de protéines P1, on clone les différentes P1, plus particulièrement [Tz3, Tz8, Mg1, BF1, CI63] en aval du promoteur 35S, pour un niveau, d'activité
donné sur le PTGS, en mettant en uvre une technique comprenant :

- le clonage de gènes codant des protéines suppresseurs de silencing présentant une diversité fonctionnelle en aval d'un promoteur approprié, tel que le promoteur 35S
de RYMV, - l'inoculation des différentes cassettes d'expression codant pour les protéines suppresseurs par biolistique sur de feuilles de riz, - l'inoculation mécanique de virus RYMV sur des lignées, telles que les lignées L2,4 et L10, - le dosage de la charge virale par DAS-ELISA en utilisant un anticorps polyclonal dirigé contre un isolat donné, par exemple un isolat de Madagascar, - la visualisation de la restauration de l'expression du gène rapporteur (GUS) codant pour la bêta glucoramidase par test histochimique, - la quantification de la restauration de l'expression du gène rapporteur par dosage de l'activité enzymatique du GUS, - la détection des siARN (preuves du PTGS) par Northern blot, et - la sélection de la protéine P1 présentant le niveau d'activité requis pour soit la surexpression, soit le silencing d'un gène d'intérêt.

3/ Utilisation selon la revendication 2,caractérisée en ce que pour la sélection de protéines P1, on clone les différentes P1, plus particulièrement [Tz3, Tz8, Mg1, BF1, CI63] en aval du promoteur 35S.

4/ Utilisation selon la revendication 3, caractérisée par la mise en oeuvre de la protéine Pl CI63 ou Tz3 pour obtenir une forte efficacité dans la suppression du PTGS.

5/ Utilisation selon la revendication 3,caractérisée par la mise en uvre de la protéine P1 Tz8 une efficaçité de PTGS
intermédiaire, et de la protéine Pl Mgl ou BFl pour une faible efficacité dans la suppression du PTGS.

6/ Vecteurs viraux d'expression ou de silencing de gènes d'intérêt, caractérisés en ce qu'ils sont générés à partir du génome de RYMV et comprennent un gène codant pour les protéines Pl de RYMV.

7/ Vecteurs selon la revendication 6, caractérisés en ce qu'ils sont générés à partir du génome de RYMV et comprennent un gène codant pour des protéines Pl exprimant une diversité
fonctionnelle comme suppresseurs de silencing, ce gène remplaçant celui du génome de RYMV codant pour une protéine Pl.

8/ Vecteurs selon la revendication 7, caractérisés en ce qu'il s'agit de vecteurs viraux d'expression contenant un insert d'un gène d'intérêt à surexprimer ou à éteindre, de taille inférieure à 700 pb.

9/ Vecteurs selon la revendication 6, caractérisés en ce qu'il s'agit de vecteurs VIGS contenant des inserts d'une taille inférieure à 50 pb quelle que soit leur orientation d'insertion dans le génome viral et dont la cible est l'ARNm de l'insert.

10/ Vecteurs selon la revendication 8 ou 9, caractérisés par des tailles d'insert supérieures à 700 pb, utilisant le système amplicon du RYMV.

11/ Vecteurs selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus selon un protocole comprenant les étapes de - amplification PCR ;
- digestion ;
- ligation - transformation de bactéries compétentes.

12/ Vecteurs selon la revendication 11, caractérisés en c~e que les vecteurs d'expression sont validés selon un protocole comprenant les étapes de - transcription in vitro ;

préparation et électroporation de protoplastes avec les transcrits ;

- visualisation des inserts 3 à 7 jours après l'électro-poration ;

- extraction d'ARN selon la même cinétique ;

validation de la réplication et stabilité des gènes insérés par RT-PCR.

13/ Vecteurs selon la revendication 10, caractérisés en ce que les vecteurs VIGS sont validés selon un protocole comprenant les étapes de :

- transcription in vitro ;

- inoculation mécanique de différentes variétés de riz présentant des degrés de résistance variable au RYMV et des lignées transgéniques avec les transcrits ;

- caractérisation phénotypique avec la visualisation des phénotypes de silencing ;

- caractérisation moléculaire avec l'extraction d'ARN
totaux, Northern blot en gel de polyacrylamide des ARN
de bas poids moléculaire et détection des siARN
spécifiques des gènes ciblés par le VIGS.