CA2678166A1 - Heparines comprenant au moins une liaison covalente avec la biotine ou un derive de la biotine, leur procede de preparation et leur utilisation - Google Patents
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Abstract
Héparines biotinylées, caractérisées en ce que les polysaccharides consti tutifs desdites héparines possèdent à leur extrémité réductrice une liaison covalente avec un groupe -(R1),-Biot et répondent à la formule générale (I): dans laquelle i est égal à O ou 1, R1 représente un enchaînement de formule -CO- (CH2)j-NH- ou -CO-(CH2)jNH-CO-(CH2)k-NH, où j et k sont des entiers po uvant prendre toute valeur de 1 à 10, Biot représente un groupe biotine ou d érivé de biotine, n représente un nombre entier ayant une valeur moyenne d'e nviron 25 pour une héparine de masse moléculaire moyenne de 15 000 Da, X rep résente H ou SO3Na, Y représente COCH3 ou SO3Na, le trait ondulé désigne une liaison située soit au-dessous, soit au-dessus du plan du cycle pyranosique auquel elle est rattachée. Leur procédé de préparation et leur utilisation en thérapeutique.
Description
HEPARINES COMPRENANT AU MOINS UNE LIAISON COVALENTE AVEC LA
BIOTINE OU UN DERIVE DE LA BIOTINE, LEUR PROCEDE DE
PREPARATION ET LEUR UTILISATION
La présente invention concerne des héparines présentant au moins une liaison covalente avec la biotine ou un dérivé de la biotine, ainsi que leur procédé
de préparation, des compositions pharmaceutiques les contenant et leur utilisation en thérapeutique.
L'héparine est un mélange de mucopolysaccharides sulfatés d'origine animale, d'un poids moléculaire voisin de 15 000 Daltons (Da). On parlera dans ce qui suit de l'héparine ou des héparines : les structures, masses moléculaires moyennes et polydispersité des chaînes polysaccharidiques de l'héparine peuvent en effet varier selon les espèces animales et l'organe d'origine de l'héparine (exemples:
héparine de mucus de porc, d'intestin de bceuf, etc).
L'héparine catalyse, notamment via l'antithrombine III (ATIII), l'inhibition de deux enzymes qui interviennent dans la cascade de la coagulation du sang, à savoir le facteur Xa et le facteur Ila (ou thrombine). Elle est ainsi utilisée en thérapeutique pour ses propriétés anticoagulantes et anti-thrombotiques.
L'héparine présente cependant des inconvénients qui limitent les conditions de son utilisation. En particulier, son activité anticoagulante importante (notamment son activité anti-facteur lla élevée) peut occasionner des hémorragies (Seminars in Thrombosis and Hemostasis, vol. 5, sup. 3, 1999). Les héparines sont connues pour ces effets secondaires hémorragiques indésirables.
Dans le domaine du traitement de la thrombose, le but est de rétablir ou maintenir la fluidité du sang tout en évitant de provoquer une hémorragie. Il est en effet bien connu que, pour une cause accidentelle quelconque, une hémorragie peut se déclencher chez un patient sous traitement. On peut également avoir besoin d'intervenir chirurgicalement chez un malade sous traitement anti-thrombotique. De plus, au cours de certains actes chirurgicaux, des anticoagulants peuvent être utilisés à forte dose de façon à empêcher la coagulation du sang, et il est souhaitable de les neutraliser à la fin de l'intervention. Le besoin se fait donc ressentir d'avoir des agents antithrombotiques neutralisables pour stopper l'activité
anticoagulante à tout moment.
BIOTINE OU UN DERIVE DE LA BIOTINE, LEUR PROCEDE DE
PREPARATION ET LEUR UTILISATION
La présente invention concerne des héparines présentant au moins une liaison covalente avec la biotine ou un dérivé de la biotine, ainsi que leur procédé
de préparation, des compositions pharmaceutiques les contenant et leur utilisation en thérapeutique.
L'héparine est un mélange de mucopolysaccharides sulfatés d'origine animale, d'un poids moléculaire voisin de 15 000 Daltons (Da). On parlera dans ce qui suit de l'héparine ou des héparines : les structures, masses moléculaires moyennes et polydispersité des chaînes polysaccharidiques de l'héparine peuvent en effet varier selon les espèces animales et l'organe d'origine de l'héparine (exemples:
héparine de mucus de porc, d'intestin de bceuf, etc).
L'héparine catalyse, notamment via l'antithrombine III (ATIII), l'inhibition de deux enzymes qui interviennent dans la cascade de la coagulation du sang, à savoir le facteur Xa et le facteur Ila (ou thrombine). Elle est ainsi utilisée en thérapeutique pour ses propriétés anticoagulantes et anti-thrombotiques.
L'héparine présente cependant des inconvénients qui limitent les conditions de son utilisation. En particulier, son activité anticoagulante importante (notamment son activité anti-facteur lla élevée) peut occasionner des hémorragies (Seminars in Thrombosis and Hemostasis, vol. 5, sup. 3, 1999). Les héparines sont connues pour ces effets secondaires hémorragiques indésirables.
Dans le domaine du traitement de la thrombose, le but est de rétablir ou maintenir la fluidité du sang tout en évitant de provoquer une hémorragie. Il est en effet bien connu que, pour une cause accidentelle quelconque, une hémorragie peut se déclencher chez un patient sous traitement. On peut également avoir besoin d'intervenir chirurgicalement chez un malade sous traitement anti-thrombotique. De plus, au cours de certains actes chirurgicaux, des anticoagulants peuvent être utilisés à forte dose de façon à empêcher la coagulation du sang, et il est souhaitable de les neutraliser à la fin de l'intervention. Le besoin se fait donc ressentir d'avoir des agents antithrombotiques neutralisables pour stopper l'activité
anticoagulante à tout moment.
2 Des agents antithrombotiques neutralisables, tels que des polysaccharides de synthèse biotinylés, ont été décrits dans les demandes de brevet WO 02/24754 et WO 06/030104. Leur synthèse, comprenant notamment le greffage de la biotine ou du dérivé de biotine réalisé sur des équivalents protégés des polysaccharides mentionnés ci-dessus et non sur ces polysaccharides eux-mêmes, n'est pas applicable aux composés de la présente invention. On souhaite en effet effectuer la biotinylation sur des produits finis, qui sont des mélanges de polysaccharides et sont donc des produits hétérogènes, sur lesquels le greffage de biotine tel que décrit dans les demandes de brevets sus-mentionnées ne permettrait pas d'induire une régio-sélectivité suffisante de la position de greffage et ne permettrait pas la biotinylation de l'ensemble des chaînes polysaccharidiques fonctionnalisables des héparines.
L'équipe de Osmond et al. décrit, dans Analytical Biochemistry, 31 (2002) 199-207, plusieurs techniques de biotinylation d'une héparine porcine, l'une d'elles étant décrite comme faisant intervenir un couplage de la biotine à l'extrémité
réductrice d'une héparine par une amination réductrice suivie d'un couplage avec la biotine.
Toutefois, les conditions opératoires décrites dans ce document ne permettent pas l'obtention de façon complète et reproductible d'héparines biotinylées : elles ne prennent pas en compte la diversité structurelle des héparines et la structure réelle des chaînes polysaccharidiques telles qu'elles sont présentes dans les héparines disponibles commercialement. Ces dernières comportent en grande partie des chaînes polysaccharidiques qui possèdent à leur extrémité réductrice une glycosérine dégradée, non fonctionnalisable par la biotine selon le protocole décrit par Osmond et al. Ainsi, les conditions opératoires décrites dans cette publication pour la biotinylation de l'héparine porcine ne permettent pas l'obtention de façon complète et reproductible d'héparines biotinylées avec des caractéristiques attendues, comme un taux de biotinylation suffisant pour permettre une neutralisation efficace.
L'équipe de Tseng et al. décrit, dans Biomaterials, 27 (2006), 2627-2636, une technique d'immobilisation d'héparine sur des films par interaction avec l'avidine, suite à la fonctionnalisation de l'héparine par la biotine. La biotinylation de l'héparine est effectuée par une oxydation à l'aide d'iode, suivie de la formation
L'équipe de Osmond et al. décrit, dans Analytical Biochemistry, 31 (2002) 199-207, plusieurs techniques de biotinylation d'une héparine porcine, l'une d'elles étant décrite comme faisant intervenir un couplage de la biotine à l'extrémité
réductrice d'une héparine par une amination réductrice suivie d'un couplage avec la biotine.
Toutefois, les conditions opératoires décrites dans ce document ne permettent pas l'obtention de façon complète et reproductible d'héparines biotinylées : elles ne prennent pas en compte la diversité structurelle des héparines et la structure réelle des chaînes polysaccharidiques telles qu'elles sont présentes dans les héparines disponibles commercialement. Ces dernières comportent en grande partie des chaînes polysaccharidiques qui possèdent à leur extrémité réductrice une glycosérine dégradée, non fonctionnalisable par la biotine selon le protocole décrit par Osmond et al. Ainsi, les conditions opératoires décrites dans cette publication pour la biotinylation de l'héparine porcine ne permettent pas l'obtention de façon complète et reproductible d'héparines biotinylées avec des caractéristiques attendues, comme un taux de biotinylation suffisant pour permettre une neutralisation efficace.
L'équipe de Tseng et al. décrit, dans Biomaterials, 27 (2006), 2627-2636, une technique d'immobilisation d'héparine sur des films par interaction avec l'avidine, suite à la fonctionnalisation de l'héparine par la biotine. La biotinylation de l'héparine est effectuée par une oxydation à l'aide d'iode, suivie de la formation
3 d'une lactone, puis du couplage avec un dérivé 2-(4-aminophényl)-éthylamine de biotine. Les conditions opératoires présentées par Tseng et al. ne présument toutefois pas de l'obtention de façon complète et reproductible d'héparines biotinylées au niveau de l'extrémité réductrice : en effet, rien n'indique que l'étape d'oxydation puisse être sélective au niveau de l'extrémité réductrice, ni que l'activité biologique de l'héparine soit conservée après un tel traitement.
L'équipe de Kett et al. décrit, dans Biochimica et Biophysica Acta, 1620 (2003), 225-234, des études d'affinité entre l'avidine et divers glycosaminoglycanes et démontre que l'avidine présente une forte affinité envers l'héparine. Dans ces études d'affinité, l'héparine peut être dérivatisée par la biotine, mais rien n'indique quel est le site de biotinylation dans les chaînes polysaccharidiques de l'héparine.
La Demanderesse s'est donc donné pour but de pourvoir à de nouvelles héparines neutralisables par l'avidine ou la streptavidine et qui possèdent des propriétés biologiques comparables aux héparines natives.
La présente invention a pour objet de nouvelles héparines modifiées, ci-après appelées "héparines biotinylées", caractérisées en ce que les polysaccharides constitutifs desdites héparines possèdent à leur extrémité réductrice une liaison covalente avec un groupe -(R1)i-Biot et répondent à la formule générale (I) :
COONa OX OSO3Na COONa O O O OH
OH OX to OX H-(Ri)-Blot O
OSO3Na NHY OX NHY
n (I) dans laquelle:
-iestégalà0ou1, - R1 représente un enchaînement de formule (a) ou (b) :
H
N-CHZ j (a)
L'équipe de Kett et al. décrit, dans Biochimica et Biophysica Acta, 1620 (2003), 225-234, des études d'affinité entre l'avidine et divers glycosaminoglycanes et démontre que l'avidine présente une forte affinité envers l'héparine. Dans ces études d'affinité, l'héparine peut être dérivatisée par la biotine, mais rien n'indique quel est le site de biotinylation dans les chaînes polysaccharidiques de l'héparine.
La Demanderesse s'est donc donné pour but de pourvoir à de nouvelles héparines neutralisables par l'avidine ou la streptavidine et qui possèdent des propriétés biologiques comparables aux héparines natives.
La présente invention a pour objet de nouvelles héparines modifiées, ci-après appelées "héparines biotinylées", caractérisées en ce que les polysaccharides constitutifs desdites héparines possèdent à leur extrémité réductrice une liaison covalente avec un groupe -(R1)i-Biot et répondent à la formule générale (I) :
COONa OX OSO3Na COONa O O O OH
OH OX to OX H-(Ri)-Blot O
OSO3Na NHY OX NHY
n (I) dans laquelle:
-iestégalà0ou1, - R1 représente un enchaînement de formule (a) ou (b) :
H
N-CHZ j (a)
4 )CH2.NCH2 UL k H
H
O
(b) dans lesquelles j et k, identiques ou différents, sont des entiers pouvant prendre toute valeur de 1 à 10, - Biot représente un groupe biotine ou dérivé de biotine, - n représente un nombre entier ayant une valeur moyenne de l'ordre de 25 pour une héparine de masse moléculaire moyenne de 15 000 Da, - X représente H ou SO3Na, - Y représente COCH3 ou SO3Na, - le trait ondulé désigne une liaison située soit au-dessous, soit au-dessus du plan du cycle pyranosique auquel elle est rattachée, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
De manière surprenante, l'introduction de biotine ou d'un dérivé de biotine au niveau de l'extrémité réductrice des chaînes polysaccharidiques ne modifie pas l'activité pharmacologique des héparines. En effet, les nouvelles héparines biotinylées, objet de l'invention, ont des activités anti-thrombotiques comparables aux héparines natives, c'est-à-dire avant biotinylation.
Elles possèdent un avantage considérable par rapport aux héparines natives :
elles peuvent être rapidement neutralisées par un antidote spécifique, en situation d'urgence. Cet antidote spécifique est l'avidine, sous forme tétramérique ou monomérique, ou la streptavidine, de masses respectives égales à environ 66 000, 16 400 et 60 000 Da (The Merck Index, Twelfth edition, 1996, M.N. 920, pages 151-152; Revue Pierce Avidin-Biotin Handbook).
Elles possèdent également l'avantage de pouvoir être utiles dans des indications thérapeutiques pour lesquelles les doses utilisées sont plus élevées, tout en diminuant le risque hémorragique; elles peuvent ainsi être utiles en thérapeutique dans le domaine artériel.
Le groupe biotine (Biot) mentionné ci-dessus est un radical issu de l'acide hexahydro-2-oxo-1 H-thiéno[3,4-d]imidazole-4-pentanoïque. Avantageusement, le groupe Biot dans la formule générale (I) selon l'invention répond à la formule (c) :
s -iI-(CHZ)â'.õ
O H H
HNYNH
O (c) Les dérivés de biotine sont disponibles commercialement (catalogue "Pierce"
H
O
(b) dans lesquelles j et k, identiques ou différents, sont des entiers pouvant prendre toute valeur de 1 à 10, - Biot représente un groupe biotine ou dérivé de biotine, - n représente un nombre entier ayant une valeur moyenne de l'ordre de 25 pour une héparine de masse moléculaire moyenne de 15 000 Da, - X représente H ou SO3Na, - Y représente COCH3 ou SO3Na, - le trait ondulé désigne une liaison située soit au-dessous, soit au-dessus du plan du cycle pyranosique auquel elle est rattachée, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
De manière surprenante, l'introduction de biotine ou d'un dérivé de biotine au niveau de l'extrémité réductrice des chaînes polysaccharidiques ne modifie pas l'activité pharmacologique des héparines. En effet, les nouvelles héparines biotinylées, objet de l'invention, ont des activités anti-thrombotiques comparables aux héparines natives, c'est-à-dire avant biotinylation.
Elles possèdent un avantage considérable par rapport aux héparines natives :
elles peuvent être rapidement neutralisées par un antidote spécifique, en situation d'urgence. Cet antidote spécifique est l'avidine, sous forme tétramérique ou monomérique, ou la streptavidine, de masses respectives égales à environ 66 000, 16 400 et 60 000 Da (The Merck Index, Twelfth edition, 1996, M.N. 920, pages 151-152; Revue Pierce Avidin-Biotin Handbook).
Elles possèdent également l'avantage de pouvoir être utiles dans des indications thérapeutiques pour lesquelles les doses utilisées sont plus élevées, tout en diminuant le risque hémorragique; elles peuvent ainsi être utiles en thérapeutique dans le domaine artériel.
Le groupe biotine (Biot) mentionné ci-dessus est un radical issu de l'acide hexahydro-2-oxo-1 H-thiéno[3,4-d]imidazole-4-pentanoïque. Avantageusement, le groupe Biot dans la formule générale (I) selon l'invention répond à la formule (c) :
s -iI-(CHZ)â'.õ
O H H
HNYNH
O (c) Les dérivés de biotine sont disponibles commercialement (catalogue "Pierce"
5 Biotin-avidin products, 2005, pp. 7-11) ou peuvent être préparés en utilisant des méthodes classiques connues de l'Homme de l'art. On peut citer notamment les dérivés de biotine mentionnés dans la demande de brevet WO 02/24754.
Dans les héparines biotinylées selon l'invention, l'indice i peut être égal à
0, auquel cas la liaison avec la biotine ou le dérivé de biotine s'effectue directement sur la fonction amine portée par l'unité saccharidique au niveau de l'extrémité
réductrice des chaînes polysaccharidiques.
Alternativement, i peut être égal à 1 et la liaison avec le groupe biotine ou dérivé
de biotine peut consister par exemple en un enchaînement de formule (a) ci-dessus dans laquelle j est égal à 5, ou en un enchaînement de formule (b) ci-dessus dans laquelle j et k sont identiques et sont égaux à 5. Ainsi, dans la formule (I) ci-dessus, R1 peut représenter par exemple un enchaînement de formule -CO-(CH2)5-NH ou -CO-(CH2)5-NH-CO-(CH2)5-NH-.
Dans le cadre de la présente invention, on entend par "extrémité réductrice"
l'extrémité de la chaîne polysaccharidique dans lequelle la glucosamine ou la mannosamine terminale (la mannosamine résultant d'une épimérisation en milieu basique de la glucosamine) possède une fonction hémi-acétale cyclique, répondant à la formule (II) ci-dessous:
Dans les héparines biotinylées selon l'invention, l'indice i peut être égal à
0, auquel cas la liaison avec la biotine ou le dérivé de biotine s'effectue directement sur la fonction amine portée par l'unité saccharidique au niveau de l'extrémité
réductrice des chaînes polysaccharidiques.
Alternativement, i peut être égal à 1 et la liaison avec le groupe biotine ou dérivé
de biotine peut consister par exemple en un enchaînement de formule (a) ci-dessus dans laquelle j est égal à 5, ou en un enchaînement de formule (b) ci-dessus dans laquelle j et k sont identiques et sont égaux à 5. Ainsi, dans la formule (I) ci-dessus, R1 peut représenter par exemple un enchaînement de formule -CO-(CH2)5-NH ou -CO-(CH2)5-NH-CO-(CH2)5-NH-.
Dans le cadre de la présente invention, on entend par "extrémité réductrice"
l'extrémité de la chaîne polysaccharidique dans lequelle la glucosamine ou la mannosamine terminale (la mannosamine résultant d'une épimérisation en milieu basique de la glucosamine) possède une fonction hémi-acétale cyclique, répondant à la formule (II) ci-dessous:
6 ox O
OX OH
NHY
(II) dans laquelle:
- X représente H ou SO3Na, - Y représente COCH3 ou SO3Na, et - le trait ondulé désigne une liaison située soit au-dessous, soit au-dessus du plan du cycle pyranosique auquel elle est rattachée (au-dessous : glucosamine, au-dessus : mannosamine).
On entend par "polysaccharides constitutifs de l'héparine" des polysaccharides caractérisés par la répétition d'un motif disaccharidique contenant un résidu d'acide uronique (acide D-glucuronique ou acide L-iduronique) et d'une D-glucosamine, qui peut être N-sulfatée ou N-acétylée. L'unité disaccharidique peut également être O-sulfatée en positions C6 et/ou C3 de la D-glucosamine et en position C2 de l'acide uronique (Heparin-binding proteins, H. Edward Conrad, 1998, p. 1).
Comme indiqué plus haut, l'héparine est un mélange de mucopolysaccharides sulfatés d'origine animale. Les héparines natives, c'est à dire les héparines de départ avant la biotinylation, sont dénommées "héparines ".
Les héparines utilisées dans la présente invention peuvent être notamment d'origine bovine, ovine ou porcine ; plus précisément, elles peuvent être issues de poumons de bceufs, de muqueuses intestinales de bceuf, de muqueuses intestinales de porc ou de muqueuses intestinales de mouton. Avantageusement, les héparines utilisées dans la présente invention sont d'origine porcine, par exemple issues de muqueuses intestinales de porc.
Les héparines biotinylées selon la présente invention sont telles que au moins 60%, avantageusement au moins 64%, des polysaccharides constitutifs desdites héparines possèdent à leur extrémité réductrice une liaison covalente avec un groupe -(R1); Biot et répondent à la fomule (I) telle que définie précédemment, et
OX OH
NHY
(II) dans laquelle:
- X représente H ou SO3Na, - Y représente COCH3 ou SO3Na, et - le trait ondulé désigne une liaison située soit au-dessous, soit au-dessus du plan du cycle pyranosique auquel elle est rattachée (au-dessous : glucosamine, au-dessus : mannosamine).
On entend par "polysaccharides constitutifs de l'héparine" des polysaccharides caractérisés par la répétition d'un motif disaccharidique contenant un résidu d'acide uronique (acide D-glucuronique ou acide L-iduronique) et d'une D-glucosamine, qui peut être N-sulfatée ou N-acétylée. L'unité disaccharidique peut également être O-sulfatée en positions C6 et/ou C3 de la D-glucosamine et en position C2 de l'acide uronique (Heparin-binding proteins, H. Edward Conrad, 1998, p. 1).
Comme indiqué plus haut, l'héparine est un mélange de mucopolysaccharides sulfatés d'origine animale. Les héparines natives, c'est à dire les héparines de départ avant la biotinylation, sont dénommées "héparines ".
Les héparines utilisées dans la présente invention peuvent être notamment d'origine bovine, ovine ou porcine ; plus précisément, elles peuvent être issues de poumons de bceufs, de muqueuses intestinales de bceuf, de muqueuses intestinales de porc ou de muqueuses intestinales de mouton. Avantageusement, les héparines utilisées dans la présente invention sont d'origine porcine, par exemple issues de muqueuses intestinales de porc.
Les héparines biotinylées selon la présente invention sont telles que au moins 60%, avantageusement au moins 64%, des polysaccharides constitutifs desdites héparines possèdent à leur extrémité réductrice une liaison covalente avec un groupe -(R1); Biot et répondent à la fomule (I) telle que définie précédemment, et
7 ce quelle que soit la structure originelle de l'héparine ; avantageusement, au moins 80% des polysaccharides constitutifs desdites héparines possèdent à leur extrémité réductrice une liaison covalente avec un groupe -(R1);-Biot.
L'invention englobe les héparines biotinylées sous la forme de l'un quelconque de leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
La présente invention a également pour objet un procédé pour la préparation des héparines biotinylées mentionnées plus haut, caractérisé en ce que :
a) on traite l'héparine avec l'héparinase 3, b) puis on effectue une amination réductrice sur le produit précédemment obtenu en présence d'un sel d'amine et d'un agent réducteur, à une température comprise entre 20 et 80 C, c) enfin on effectue une acylation avec un groupe -(R1)i-Biot activé, où R1, i et Biot sont tels que définis en rapport avec la formule (I) ci-dessus, en présence d'une base en milieu aqueux ou en milieu organique.
Les étapes du procédé de préparation ci-dessus peuvent être contrôlées par un suivi analytique HPLC, notamment de type SAX, et plus particulièrement de type CTA-SAX, après dépolymérisation des constituants du mélange dérivé d'héparine en présence d'un mélange d'héparinases 1, 2 et 3. Un tel suivi analytique peut par exemple être effectué en utilisant la méthode décrite dans la demande de brevet US2005/0186679 Al.
On vérifie notamment, après l'étape d'amination réductrice b), qu'au moins 80%, avantageusement au moins 90%, des polysaccharides constitutifs desdites héparines portent à leur extrémité réductrice une fonction -NH2 (polysaccharides amino-réduits).
On vérifie notamment, après l'étape d'acylation c), qu'au moins 80%, avantageusement au moins 90%, desdits polysaccharides amino-réduits sont biotinylés.
Le rendement global du procédé de préparation des héparines biotinylées selon l'invention est donc d'au moins 60%, avantageusement d'au moins 64%.
Avantageusement, ce rendement est d'au moins 80%.
L'invention englobe les héparines biotinylées sous la forme de l'un quelconque de leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
La présente invention a également pour objet un procédé pour la préparation des héparines biotinylées mentionnées plus haut, caractérisé en ce que :
a) on traite l'héparine avec l'héparinase 3, b) puis on effectue une amination réductrice sur le produit précédemment obtenu en présence d'un sel d'amine et d'un agent réducteur, à une température comprise entre 20 et 80 C, c) enfin on effectue une acylation avec un groupe -(R1)i-Biot activé, où R1, i et Biot sont tels que définis en rapport avec la formule (I) ci-dessus, en présence d'une base en milieu aqueux ou en milieu organique.
Les étapes du procédé de préparation ci-dessus peuvent être contrôlées par un suivi analytique HPLC, notamment de type SAX, et plus particulièrement de type CTA-SAX, après dépolymérisation des constituants du mélange dérivé d'héparine en présence d'un mélange d'héparinases 1, 2 et 3. Un tel suivi analytique peut par exemple être effectué en utilisant la méthode décrite dans la demande de brevet US2005/0186679 Al.
On vérifie notamment, après l'étape d'amination réductrice b), qu'au moins 80%, avantageusement au moins 90%, des polysaccharides constitutifs desdites héparines portent à leur extrémité réductrice une fonction -NH2 (polysaccharides amino-réduits).
On vérifie notamment, après l'étape d'acylation c), qu'au moins 80%, avantageusement au moins 90%, desdits polysaccharides amino-réduits sont biotinylés.
Le rendement global du procédé de préparation des héparines biotinylées selon l'invention est donc d'au moins 60%, avantageusement d'au moins 64%.
Avantageusement, ce rendement est d'au moins 80%.
8 PCT/FR2008/000172 On entend par :
- héparinase 1 : l'enzyme héparine lyase I(EC 4.2.2.7) de Flavobacterium heparinum, - héparinase 2: l'enzyme héparine lyase II de Flavobacterium heparinum, - héparinase 3: l'enzyme héparine lyase III (EC 4.2.2.8) de Flavobacterium heparinum.
L'héparinase 3 permet d'éliminer la zone de liaison aux protéines (glycosérine) dans les chaînes polysaccharidiques des héparines et d'obtenir des chaînes dont les extrémités réductrices sont exemptes de résidus de glycosérine. Les héparinases 1 et 2 permettent le clivage des chaînes polysaccharidiques en fragments de bas poids moléculaires (réactions de dépolymérisation de l'héparine).
Le procédé de préparation des composés selon l'invention utilise comme héparines de départ (héparines "natives") des héparines préparées comme précédemment rapporté dans la littérature. On se réfèrera notamment à
l'ouvrage "L'héparine, fabrication, structure, propriétés, analyses", J.P. Duclos, Ed.
Masson, 1984. Les héparines peuvent notamment être préparées selon le procédé décrit dans la demande de brevet US 2005/0215519 Al.
Dans l'étape b) d'amination réductrice du procédé de préparation ci-dessus, le sel d'amine peut être un sel d'amine quaternaire; il s'agit avantageusement d'un sel d'halogénure d'ammonium répondant à la formule NH4Z, où Z représente un atome d'halogène, tel qu'un atome de chlore, fluor, brome ou iode.
Dans l'étape b) d'amination réductrice du procédé de préparation ci-dessus, l'agent réducteur peut être un sel de borohydrure, par exemple un sel de cyanobohydrure.
Dans l'étape b) d'amination réductrice du procédé de préparation ci-dessus, la température est avantageusement comprise entre 50 et 80 C.
Dans l'étape c) d'acylation du procédé de préparation ci-dessus, la base peut être un sel de carbonate ou d'hydrogénocarbonate, notamment sous forme de sel de sodium ou de potassium, ou encore toute autre base organique hydrosoluble ou soluble en milieu organique connue de l'Homme de l'art.
- héparinase 1 : l'enzyme héparine lyase I(EC 4.2.2.7) de Flavobacterium heparinum, - héparinase 2: l'enzyme héparine lyase II de Flavobacterium heparinum, - héparinase 3: l'enzyme héparine lyase III (EC 4.2.2.8) de Flavobacterium heparinum.
L'héparinase 3 permet d'éliminer la zone de liaison aux protéines (glycosérine) dans les chaînes polysaccharidiques des héparines et d'obtenir des chaînes dont les extrémités réductrices sont exemptes de résidus de glycosérine. Les héparinases 1 et 2 permettent le clivage des chaînes polysaccharidiques en fragments de bas poids moléculaires (réactions de dépolymérisation de l'héparine).
Le procédé de préparation des composés selon l'invention utilise comme héparines de départ (héparines "natives") des héparines préparées comme précédemment rapporté dans la littérature. On se réfèrera notamment à
l'ouvrage "L'héparine, fabrication, structure, propriétés, analyses", J.P. Duclos, Ed.
Masson, 1984. Les héparines peuvent notamment être préparées selon le procédé décrit dans la demande de brevet US 2005/0215519 Al.
Dans l'étape b) d'amination réductrice du procédé de préparation ci-dessus, le sel d'amine peut être un sel d'amine quaternaire; il s'agit avantageusement d'un sel d'halogénure d'ammonium répondant à la formule NH4Z, où Z représente un atome d'halogène, tel qu'un atome de chlore, fluor, brome ou iode.
Dans l'étape b) d'amination réductrice du procédé de préparation ci-dessus, l'agent réducteur peut être un sel de borohydrure, par exemple un sel de cyanobohydrure.
Dans l'étape b) d'amination réductrice du procédé de préparation ci-dessus, la température est avantageusement comprise entre 50 et 80 C.
Dans l'étape c) d'acylation du procédé de préparation ci-dessus, la base peut être un sel de carbonate ou d'hydrogénocarbonate, notamment sous forme de sel de sodium ou de potassium, ou encore toute autre base organique hydrosoluble ou soluble en milieu organique connue de l'Homme de l'art.
9 Dans l'étape c) d'acylation du procédé de préparation ci-dessus, on entend par milieu organique par exemple le dichlorométhane ou le diméthylformamide.
Le procédé de préparation des héparines biotinylées selon l'invention comprend avantageusement les étapes suivantes :
a) on traite l'héparine avec l'héparinase 3, b) puis on effectue une amination réductrice sur le produit précédemment obtenu en présence d'un sel d'halogénure d'ammonium et d'un sel de borohydrure, à une température comprise entre 50 et 80 C, c) enfin on effectue une acylation avec un un groupe -(R1)i-Biot tel que défini précédemment sous forme d'ester activé, en présence d'une base en milieu aqueux.
Les dérivés biotinylés -(R1)i-Biot tels que définis plus haut peuvent être mis en jeu dans la réaction d'acylation directement sous forme d'esters activés, préformés ou générés in situ en utilisant des conditions classiques de couplage connues de l'Homme de l'art. On peut notamment utiliser des esters activés sous forme de dérivés N-hydroxy-succinimide ou de dérivés 3-suifo-N-hydroxy-succinimide.
Le procédé de préparation selon l'invention est illustré dans le schéma 1.
Schéma 1 Na OX OSO,Na CbONa Héparinase 3 o p o 0 HEPARINE ox X H ox OH
OSO,Na Nx2= OX
rY
Composé 1 NH4Z / Agent réducteur ONa OX OSO,Na COONa O O OH
OH X H A NHx OSO,Na NHY OX
n NHy Composé 2 o Su1FoNHS(RI)iBiot ONa oX OSO,Na x Base COOxa HN NH
O O OH H n. mp O H X x H H-( Rl)I O
S
OSO,Na NHy OX
O NHY
Composé 3 5 Selon le schéma 1, l'héparine est traitée par l'héparinase 3 pour éliminer la liaison protéique restante (c'est-à-dire les glycosérines, natives ou dégradées) et obtenir un composé 1 comportant une extrémité réductrice exempte de résidu de glycosérine. Cette héparine (composé 1) peut alors être soumise à une amination réductrice pour fournir le composé 2, présentant une fonction amine libre au niveau
Le procédé de préparation des héparines biotinylées selon l'invention comprend avantageusement les étapes suivantes :
a) on traite l'héparine avec l'héparinase 3, b) puis on effectue une amination réductrice sur le produit précédemment obtenu en présence d'un sel d'halogénure d'ammonium et d'un sel de borohydrure, à une température comprise entre 50 et 80 C, c) enfin on effectue une acylation avec un un groupe -(R1)i-Biot tel que défini précédemment sous forme d'ester activé, en présence d'une base en milieu aqueux.
Les dérivés biotinylés -(R1)i-Biot tels que définis plus haut peuvent être mis en jeu dans la réaction d'acylation directement sous forme d'esters activés, préformés ou générés in situ en utilisant des conditions classiques de couplage connues de l'Homme de l'art. On peut notamment utiliser des esters activés sous forme de dérivés N-hydroxy-succinimide ou de dérivés 3-suifo-N-hydroxy-succinimide.
Le procédé de préparation selon l'invention est illustré dans le schéma 1.
Schéma 1 Na OX OSO,Na CbONa Héparinase 3 o p o 0 HEPARINE ox X H ox OH
OSO,Na Nx2= OX
rY
Composé 1 NH4Z / Agent réducteur ONa OX OSO,Na COONa O O OH
OH X H A NHx OSO,Na NHY OX
n NHy Composé 2 o Su1FoNHS(RI)iBiot ONa oX OSO,Na x Base COOxa HN NH
O O OH H n. mp O H X x H H-( Rl)I O
S
OSO,Na NHy OX
O NHY
Composé 3 5 Selon le schéma 1, l'héparine est traitée par l'héparinase 3 pour éliminer la liaison protéique restante (c'est-à-dire les glycosérines, natives ou dégradées) et obtenir un composé 1 comportant une extrémité réductrice exempte de résidu de glycosérine. Cette héparine (composé 1) peut alors être soumise à une amination réductrice pour fournir le composé 2, présentant une fonction amine libre au niveau
10 de l'extrémité réductrice, en présence d'un sel d'amine et d'un agent réducteur tel qu'un sel de borohydrure.
Ce composé peut alors être acylé pour fournir le composé biotinylé 3, par réaction avec un dérivé activé de biotine -(R1)i-Biot, tel que défini précédemment, en présence d'une base. Cette réaction peut par exemple être effectuée avec le sel de sodium de l'ester de 6-biotinamidohexanoyl hexanoate de 3-sulfosuccinimidyl lorsque R1 représente l'enchaînement -CO-(CH2)5-NH-CO-(CH2)5-NH-, ou avec le sel de sodium de l'ester de 6-biotinamido hexanoate de 3-suifosuccinimidyl lorsque
Ce composé peut alors être acylé pour fournir le composé biotinylé 3, par réaction avec un dérivé activé de biotine -(R1)i-Biot, tel que défini précédemment, en présence d'une base. Cette réaction peut par exemple être effectuée avec le sel de sodium de l'ester de 6-biotinamidohexanoyl hexanoate de 3-sulfosuccinimidyl lorsque R1 représente l'enchaînement -CO-(CH2)5-NH-CO-(CH2)5-NH-, ou avec le sel de sodium de l'ester de 6-biotinamido hexanoate de 3-suifosuccinimidyl lorsque
11 R1 représente l'enchaînement -CO-(CH2)5-NH-, ou encore avec le sel de sodium de l'ester de biotinoyl-3-sulfosuccinimidyl lorsque R1 n'est pas présent (i =
0).
Dans le schéma 1, il est entendu que les composés 1, 2 et 3 sont une représentation théorique, puisqu'il s'agit en réalité, en tant que dérivés d'héparine, de mélanges de chaînes polysaccharidiques.
Dans ce qui suit, des exemples de synthèse des héparines biotinylées selon l'invention et de différents intermédiaires utiles à leur obtention sont détaillés à titre d'illustration.
Les abréviations suivantes sont utilisées :
Héparine EPB : héparine commercialisée par la société Bioibérica ;
HPLC : "High Performance Liquid Chromatography" ;
SAX : "Strong anion exchange chromatography" ;
CTA : "Cetyl Trimethyl Ammonium" ;
Q.S.P. : "Quantité Suffisante Pour" ;
LC :"Long Chain" (correspond à l'enchaînement 6-amino-hexanoyl) ;
Sulfo-NHS : sel de sodium de l'ester 3-sulfo-succinimidyl ;
Héparinase 1: enzyme héparine lyase I(EC 4.2.2.7) de Flavobacterium heparinum ;
Héparinase 2: enzyme héparine lyase Il de Flavobacterium heparinum ;
Héparinase 3: enzyme héparine lyase III (EC 4.2.2.8) de Flavobacterium heparinum.
Exemple 1 1.1 Héparine EPB purifiée par dépolymérisation avec l'héparinase 3:
A une température proche de 20 C, 1 g d'héparine brute EPB est mis en solution dans 15 ml de la solution aqueuse de 5 mM de phosphate de sodium ajustée à
pH = 7,0 0,1, 20 mM de chlorure de sodium et 1mg/ml de BSA. 0,5 UI
d'héparinase 3 sont ajoutés à la solution d'héparine. Le mélange réactionnel obtenu est agité pendant 5 jours. 1 g de chlorure de sodium et 45 ml de méthanol sont ajoutés au mélange réactionnel. La suspension obtenue est filtrée sur membrane 0,45 Nm. Le gâteau est lavé au méthanol, à l'éther diéthylique, puis
0).
Dans le schéma 1, il est entendu que les composés 1, 2 et 3 sont une représentation théorique, puisqu'il s'agit en réalité, en tant que dérivés d'héparine, de mélanges de chaînes polysaccharidiques.
Dans ce qui suit, des exemples de synthèse des héparines biotinylées selon l'invention et de différents intermédiaires utiles à leur obtention sont détaillés à titre d'illustration.
Les abréviations suivantes sont utilisées :
Héparine EPB : héparine commercialisée par la société Bioibérica ;
HPLC : "High Performance Liquid Chromatography" ;
SAX : "Strong anion exchange chromatography" ;
CTA : "Cetyl Trimethyl Ammonium" ;
Q.S.P. : "Quantité Suffisante Pour" ;
LC :"Long Chain" (correspond à l'enchaînement 6-amino-hexanoyl) ;
Sulfo-NHS : sel de sodium de l'ester 3-sulfo-succinimidyl ;
Héparinase 1: enzyme héparine lyase I(EC 4.2.2.7) de Flavobacterium heparinum ;
Héparinase 2: enzyme héparine lyase Il de Flavobacterium heparinum ;
Héparinase 3: enzyme héparine lyase III (EC 4.2.2.8) de Flavobacterium heparinum.
Exemple 1 1.1 Héparine EPB purifiée par dépolymérisation avec l'héparinase 3:
A une température proche de 20 C, 1 g d'héparine brute EPB est mis en solution dans 15 ml de la solution aqueuse de 5 mM de phosphate de sodium ajustée à
pH = 7,0 0,1, 20 mM de chlorure de sodium et 1mg/ml de BSA. 0,5 UI
d'héparinase 3 sont ajoutés à la solution d'héparine. Le mélange réactionnel obtenu est agité pendant 5 jours. 1 g de chlorure de sodium et 45 ml de méthanol sont ajoutés au mélange réactionnel. La suspension obtenue est filtrée sur membrane 0,45 Nm. Le gâteau est lavé au méthanol, à l'éther diéthylique, puis
12 séché sous vide. On obtient 0,98 g d'un solide blanc. Le rendement observé est de 98 %.
Le produit peut être contrôlé par dépolymérisation à l'aide d'un mélange d'héparinases 1, 2 et 3 et analysé par HPLC-SAX en utilisant la méthode décrite dans la demande de brevet US2005/0186679 Al. Les résultats montrent une disparition d'au moins 80% des espèces glycosérines présentes dans l'héparine de départ.
Spectre RMN 'H du mélange de polysaccharides dans D20 (25 C, ô en ppm), principaux signaux: 2,05 (CH3CO, s), 3,28 (CH, m), 3,65 (CH, m), 3,77 (CH, m), 4,05 (CH, m), 4,10 (CH, s), 4,20 (CH, s), 4,25 (CH, d, 12Hz), 4,35 (CH, s), 4,42 (CH, m), 4,88 (CH, s), 5,22 (CH, s), 5,42 (CH, s).
1.2 Héparine dépolymérisée par héparinase 3 amino-réduite :
0,5 g d'héparine purifiée par héparinase 3 sont mis en solution dans une solution aqueuse 5 M de chlorure d'ammonium. 0,5 g de cyanoborohydrure de sodium sont ajoutés à la solution d'héparine. Le mélange est porté à 70 C pendant 24 heures.
La solution est ramenée à une température proche de 20 C, diluée à l'eau (QSP
50 mi), puis déssalée sur une colonne de Séphadex G10. La fraction obtenue est injectée sur une colonne de Q-sépharose. Le produit est élué à l'eau, puis avec un gradient en perchlorate de sodium. Le produit obtenu est déssalé sur une colonne de Séphadex G10 puis lyophilisé. On obtient 444 mg d'un lyophilisat blanc. Le rendement observé est de 89 %. Le produit est engagé tel que dans l'étape suivante d'acylation.
Spectre RMN 'H du mélange de polysaccharides dans D20 (25 C, S en ppm), principaux signaux: 2,05 (CH3CO, s), 3,28 (CH, m), 3,65 (CH, m), 3,77 (CH, m), 4,05 (CH, m), 4,10 (CH, s), 4,20 (CH, s), 4,25 (CH, d, 12Hz), 4,35 (CH, s), 4,42 (CH, m), 4,88 (CH, s), 5,22 (CH, s), 5,42 (CH, s).
1.3 Héparine dépolymérisée par héparinase 3, amino-réduite et biotinylée :
A une température voisine de 20 C, 200 mg d'héparine dépolymérisée amino-réduite sont mis en solution dans 2 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium. 37 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés à la solution obtenue. La solution obtenue est agitée à une température proche de 20 C pendant 1 heure.
La solution est diluée par 4 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium.
Le produit peut être contrôlé par dépolymérisation à l'aide d'un mélange d'héparinases 1, 2 et 3 et analysé par HPLC-SAX en utilisant la méthode décrite dans la demande de brevet US2005/0186679 Al. Les résultats montrent une disparition d'au moins 80% des espèces glycosérines présentes dans l'héparine de départ.
Spectre RMN 'H du mélange de polysaccharides dans D20 (25 C, ô en ppm), principaux signaux: 2,05 (CH3CO, s), 3,28 (CH, m), 3,65 (CH, m), 3,77 (CH, m), 4,05 (CH, m), 4,10 (CH, s), 4,20 (CH, s), 4,25 (CH, d, 12Hz), 4,35 (CH, s), 4,42 (CH, m), 4,88 (CH, s), 5,22 (CH, s), 5,42 (CH, s).
1.2 Héparine dépolymérisée par héparinase 3 amino-réduite :
0,5 g d'héparine purifiée par héparinase 3 sont mis en solution dans une solution aqueuse 5 M de chlorure d'ammonium. 0,5 g de cyanoborohydrure de sodium sont ajoutés à la solution d'héparine. Le mélange est porté à 70 C pendant 24 heures.
La solution est ramenée à une température proche de 20 C, diluée à l'eau (QSP
50 mi), puis déssalée sur une colonne de Séphadex G10. La fraction obtenue est injectée sur une colonne de Q-sépharose. Le produit est élué à l'eau, puis avec un gradient en perchlorate de sodium. Le produit obtenu est déssalé sur une colonne de Séphadex G10 puis lyophilisé. On obtient 444 mg d'un lyophilisat blanc. Le rendement observé est de 89 %. Le produit est engagé tel que dans l'étape suivante d'acylation.
Spectre RMN 'H du mélange de polysaccharides dans D20 (25 C, S en ppm), principaux signaux: 2,05 (CH3CO, s), 3,28 (CH, m), 3,65 (CH, m), 3,77 (CH, m), 4,05 (CH, m), 4,10 (CH, s), 4,20 (CH, s), 4,25 (CH, d, 12Hz), 4,35 (CH, s), 4,42 (CH, m), 4,88 (CH, s), 5,22 (CH, s), 5,42 (CH, s).
1.3 Héparine dépolymérisée par héparinase 3, amino-réduite et biotinylée :
A une température voisine de 20 C, 200 mg d'héparine dépolymérisée amino-réduite sont mis en solution dans 2 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium. 37 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés à la solution obtenue. La solution obtenue est agitée à une température proche de 20 C pendant 1 heure.
La solution est diluée par 4 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium.
13 37 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés et le mélange est agité pendant 2 heures. 37 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés de nouveau et le mélange réactionnel est agité pendant 16 heures. Le milieu réactionnel obtenu est dilué à
l'eau (Q.S.P. 200 mi), filtré sur membrane 0,45 pm et injecté sur une colonne de Q-Sépharose. Le produit est élué à l'eau, puis avec un gradient en perchlorate de sodium. Le produit obtenu est déssalé sur une colonne de Séphadex G10 puis lyophilisé. On obtient 188 mg d'un lyophilisat blanc. Le rendement observé est de 94%.
Le produit peut être contrôlé par dépolymérisation à l'aide d'un mélange d'héparinases 1, 2 et 3 et analysé par HPLC-SAX, en utilisant la méthode décrite dans la demande de brevet US200510186679 Al.
Spectre RMN 'H du mélange de polysaccharides dans D20 (25 C, ô en ppm), principaux signaux: entre 1,3 et 1,8 (CH2 biotine, m), 2,05 (CH3CO, s), 2,25 (CH2CO biotine, t, 7Hz), 2,79 (1 H, d, 12Hz), 3,00 (1 H, dd, 12 et 5Hz), 3,20 (NCH2 biotine, m), 3,30 (CH, m), 3,68 (CH, m), 3,80 (CH, m), 4,05 (CH, m), 4,10 (CH, s), 4,20 (CH, s), 4,25 (CH, m), 4,35 (CH, s), 4,45 (CH, m), 4,63 (NCH biotine, m), 4,85 (CH, s), 5,22 (CH, s), 5,42 (CH, s).
Exemple 2 2.1 Héparine obtenue selon US 2005/0215519 A1, dépolymérisation avec l'héparinase 3:
A une température proche de 20 C, 1 g d'héparine selon US 2005/0215519 Al est mis en solution dans 15 ml de la solution aqueuse de 5 mM de phosphate de sodium ajusté à pH = 7,0 0,1, 20 mM de chlorure de sodium et 1 mg / ml de BSA.
0,5 UI d'héparinase 3 sont ajoutés à la solution d'héparine. Le mélange réactionnel obtenu est agité pendant 7 jours. 1 g de chlorure de sodium et 45 ml de méthanol sont ajoutés au mélange réactionnel. La suspension obtenue est filtrée sur membrane 0,45 pm. Le gâteau est lavé au méthanol, à l'éther diéthylique, puis séché sous vide. On obtient 0,96 g d'un solide blanc. Le rendement observé est de 96 %.
Le produit peut être contrôlé par dépolymérisation à l'aide d'un mélange d'héparinases 1, 2 et 3 et analysé par HPLC-SAX en utilisant la méthode décrite dans la demande de brevet US 2005/0186679 Al. Les résultats montrent une
l'eau (Q.S.P. 200 mi), filtré sur membrane 0,45 pm et injecté sur une colonne de Q-Sépharose. Le produit est élué à l'eau, puis avec un gradient en perchlorate de sodium. Le produit obtenu est déssalé sur une colonne de Séphadex G10 puis lyophilisé. On obtient 188 mg d'un lyophilisat blanc. Le rendement observé est de 94%.
Le produit peut être contrôlé par dépolymérisation à l'aide d'un mélange d'héparinases 1, 2 et 3 et analysé par HPLC-SAX, en utilisant la méthode décrite dans la demande de brevet US200510186679 Al.
Spectre RMN 'H du mélange de polysaccharides dans D20 (25 C, ô en ppm), principaux signaux: entre 1,3 et 1,8 (CH2 biotine, m), 2,05 (CH3CO, s), 2,25 (CH2CO biotine, t, 7Hz), 2,79 (1 H, d, 12Hz), 3,00 (1 H, dd, 12 et 5Hz), 3,20 (NCH2 biotine, m), 3,30 (CH, m), 3,68 (CH, m), 3,80 (CH, m), 4,05 (CH, m), 4,10 (CH, s), 4,20 (CH, s), 4,25 (CH, m), 4,35 (CH, s), 4,45 (CH, m), 4,63 (NCH biotine, m), 4,85 (CH, s), 5,22 (CH, s), 5,42 (CH, s).
Exemple 2 2.1 Héparine obtenue selon US 2005/0215519 A1, dépolymérisation avec l'héparinase 3:
A une température proche de 20 C, 1 g d'héparine selon US 2005/0215519 Al est mis en solution dans 15 ml de la solution aqueuse de 5 mM de phosphate de sodium ajusté à pH = 7,0 0,1, 20 mM de chlorure de sodium et 1 mg / ml de BSA.
0,5 UI d'héparinase 3 sont ajoutés à la solution d'héparine. Le mélange réactionnel obtenu est agité pendant 7 jours. 1 g de chlorure de sodium et 45 ml de méthanol sont ajoutés au mélange réactionnel. La suspension obtenue est filtrée sur membrane 0,45 pm. Le gâteau est lavé au méthanol, à l'éther diéthylique, puis séché sous vide. On obtient 0,96 g d'un solide blanc. Le rendement observé est de 96 %.
Le produit peut être contrôlé par dépolymérisation à l'aide d'un mélange d'héparinases 1, 2 et 3 et analysé par HPLC-SAX en utilisant la méthode décrite dans la demande de brevet US 2005/0186679 Al. Les résultats montrent une
14 disparition d'au moins 80 % des espèces glycosérines présentes dans l'héparine de départ.
Spectre RMN 'H du mélange de polysaccharides dans D20 (25 C, S en ppm), principaux signaux: 2,05 (CH3CO, s), 3,28 (CH, m), 3,65 (CH, m), 3,77 (CH, m), 4,05 (CH, m), 4,10 (CH, s), 4,20 (CH, s), 4,25 (CH, d, 12Hz), 4,35 (CH, s), 4,42 (CH, m), 4,88 (CH, s), 5,22 (CH, s), 5,42 (CH, s).
2.2 Héparine selon selon US 2005/0215519 Al dépolymérisée par héparinase 3 et amino-réduite :
0,5 g d'héparine selon US 200510215519 Al traitée par héparinase 3 sont mis en solution dans 20 ml d'une solution aqueuse 5 M de chlorure d'ammonium. 0,5 g de cyanoborohydrure de sodium sont ajoutés à la solution d'héparine. Le mélange est porté à 70 C pendant 24 heures. La solution est ramenée à une température proche de 20 C, diluée à l'eau (Q.S.P. 50 ml), puis déssalée sur une colonne de Séphadex G10. La fraction récoltée est lyophilisée. On obtient 446 mg d'un lyophilisat blanc. Le rendement observé est de 89 %. Le produit est engagé tel que dans l'étape suivante d'acylation.
Spectre RMN 'H du mélange de polysaccharides dans D20 (25 C, S en ppm), principaux signaux: 2,05 (CH3CO, s), 3,28 (CH, m), 3,65 (CH, m), 3,77 (CH, m), 4,05 (CH, m), 4,10 (CH, s), 4,20 (CH, s), 4,25 (CH, d, 12Hz), 4,35 (CH, s), 4,42 (CH, m), 4,88 (CH, s), 5,22 (CH, s), 5,42 (CH, s).
2.3 Héparine selon US 2005/0215519 Al dépolymérisée par héparinase 3, amino-réduite et biotinylée :
A une température voisine de 20 C, 200 mg d'héparine dépolymérisée amino-réduite sont mis en solution dans 2 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium. 37 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés à la solution obtenue. La solution est agitée à une température proche de 20 C pendant 1 heure. La suspension obtenue est diluée par 4 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium. 37 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés et le mélange est agité
pendant 2 heures. 37 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés de nouveau et le mélange réactionnel est agité pendant 16 heures. Le milieu réactionnel obtenu est dilué à l'eau (Q.S.P. 200 ml), filtré sur membrane 0,45 pm et injecté sur une colonne de Q-Sépharose. Le produit est élué à l'eau, puis avec un gradient en perchlorate de sodium. Le produit obtenu est déssalé sur une colonne de Séphadex G10 puis lyophilisé. On obtient 188 mg d'un lyophilisat blanc. Le rendement observé est de 94 %.
Le produit peut être contrôlé par dépolymérisation à l'aide d'un mélange 5 d'héparinases 1, 2 et 3 et analysé par HPLC-SAX en utilisant la méthode décrite dans la demande de brevet US 2005/0186679 Al.
Spectre RMN 'H du mélange de polysaccharides dans D20 (25 C, ô en ppm), principaux signaux: entre 1,3 et 1,8 (CH2 biotine, m), 2,05 (CH3CO, s), 2,25 (CH2CO biotine, t, 7Hz), 2,79 (1 H, d, 12Hz), 3,00 (1 H, dd, 12 et 5Hz), 3,20 (NCH2 10 biotine, m), 3,30 (CH, m), 3,68 (CH, m), 3,80 (CH, m), 4,05 (CH, m), 4,10 (CH, s), 4,20 (CH, s), 4,25 (CH, m), 4,35 (CH, s), 4,45 (CH, m), 4,63 (NCH biotine, m), 4,85 (CH, s), 5,22 (CH, s), 5,42 (CH, s).
Les composés selon l'invention ont fait l'objet d'études biochimiques et
Spectre RMN 'H du mélange de polysaccharides dans D20 (25 C, S en ppm), principaux signaux: 2,05 (CH3CO, s), 3,28 (CH, m), 3,65 (CH, m), 3,77 (CH, m), 4,05 (CH, m), 4,10 (CH, s), 4,20 (CH, s), 4,25 (CH, d, 12Hz), 4,35 (CH, s), 4,42 (CH, m), 4,88 (CH, s), 5,22 (CH, s), 5,42 (CH, s).
2.2 Héparine selon selon US 2005/0215519 Al dépolymérisée par héparinase 3 et amino-réduite :
0,5 g d'héparine selon US 200510215519 Al traitée par héparinase 3 sont mis en solution dans 20 ml d'une solution aqueuse 5 M de chlorure d'ammonium. 0,5 g de cyanoborohydrure de sodium sont ajoutés à la solution d'héparine. Le mélange est porté à 70 C pendant 24 heures. La solution est ramenée à une température proche de 20 C, diluée à l'eau (Q.S.P. 50 ml), puis déssalée sur une colonne de Séphadex G10. La fraction récoltée est lyophilisée. On obtient 446 mg d'un lyophilisat blanc. Le rendement observé est de 89 %. Le produit est engagé tel que dans l'étape suivante d'acylation.
Spectre RMN 'H du mélange de polysaccharides dans D20 (25 C, S en ppm), principaux signaux: 2,05 (CH3CO, s), 3,28 (CH, m), 3,65 (CH, m), 3,77 (CH, m), 4,05 (CH, m), 4,10 (CH, s), 4,20 (CH, s), 4,25 (CH, d, 12Hz), 4,35 (CH, s), 4,42 (CH, m), 4,88 (CH, s), 5,22 (CH, s), 5,42 (CH, s).
2.3 Héparine selon US 2005/0215519 Al dépolymérisée par héparinase 3, amino-réduite et biotinylée :
A une température voisine de 20 C, 200 mg d'héparine dépolymérisée amino-réduite sont mis en solution dans 2 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium. 37 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés à la solution obtenue. La solution est agitée à une température proche de 20 C pendant 1 heure. La suspension obtenue est diluée par 4 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium. 37 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés et le mélange est agité
pendant 2 heures. 37 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés de nouveau et le mélange réactionnel est agité pendant 16 heures. Le milieu réactionnel obtenu est dilué à l'eau (Q.S.P. 200 ml), filtré sur membrane 0,45 pm et injecté sur une colonne de Q-Sépharose. Le produit est élué à l'eau, puis avec un gradient en perchlorate de sodium. Le produit obtenu est déssalé sur une colonne de Séphadex G10 puis lyophilisé. On obtient 188 mg d'un lyophilisat blanc. Le rendement observé est de 94 %.
Le produit peut être contrôlé par dépolymérisation à l'aide d'un mélange 5 d'héparinases 1, 2 et 3 et analysé par HPLC-SAX en utilisant la méthode décrite dans la demande de brevet US 2005/0186679 Al.
Spectre RMN 'H du mélange de polysaccharides dans D20 (25 C, ô en ppm), principaux signaux: entre 1,3 et 1,8 (CH2 biotine, m), 2,05 (CH3CO, s), 2,25 (CH2CO biotine, t, 7Hz), 2,79 (1 H, d, 12Hz), 3,00 (1 H, dd, 12 et 5Hz), 3,20 (NCH2 10 biotine, m), 3,30 (CH, m), 3,68 (CH, m), 3,80 (CH, m), 4,05 (CH, m), 4,10 (CH, s), 4,20 (CH, s), 4,25 (CH, m), 4,35 (CH, s), 4,45 (CH, m), 4,63 (NCH biotine, m), 4,85 (CH, s), 5,22 (CH, s), 5,42 (CH, s).
Les composés selon l'invention ont fait l'objet d'études biochimiques et
15 pharmacologiques.
Mesure de l'activité anti-facteur Ila et de l'activité anti-facteur Xa L'activité anti-facteur Ila (anti-Flla) et l'activité anti-facteur Xa (anti-FXa) dans le plasma humain ou un système tampon sont analysés par méthode chromogènique : l'activité anti-facteur Ila est testée au moyen du kit d'anti-facteur Ila d'héparine d'Actichrome (American diagnostica) contenant le substrat chromogène S-2238, l'a-thrombine et l'ATIII humain (antithrombine III).
L'activité
anti-FXa est déterminée avec l'instrument automatisé de coagulation ACL 7000 (Instrumentation Laboratory) employant le kit Héparine (Instrumentation Laboratory) contenant de l'ATIII, le facteur Xa et le substrat chromogène S-2765.
Les deux analyses sont réalisées exactement selon les instructions du fabricant.
Les standards suivants sont employés pour établir une courbe d'étalonnage standard pour mesurer l'activité in vitro des fractions d'héparines biotinylées dans le plasma humain et le système tampon :
- 1er standard international pour les héparines de bas poids moléculaire (National Institute for Biological Standards and Control, Londres, R-U, établi en 1987, code n 85/600),
Mesure de l'activité anti-facteur Ila et de l'activité anti-facteur Xa L'activité anti-facteur Ila (anti-Flla) et l'activité anti-facteur Xa (anti-FXa) dans le plasma humain ou un système tampon sont analysés par méthode chromogènique : l'activité anti-facteur Ila est testée au moyen du kit d'anti-facteur Ila d'héparine d'Actichrome (American diagnostica) contenant le substrat chromogène S-2238, l'a-thrombine et l'ATIII humain (antithrombine III).
L'activité
anti-FXa est déterminée avec l'instrument automatisé de coagulation ACL 7000 (Instrumentation Laboratory) employant le kit Héparine (Instrumentation Laboratory) contenant de l'ATIII, le facteur Xa et le substrat chromogène S-2765.
Les deux analyses sont réalisées exactement selon les instructions du fabricant.
Les standards suivants sont employés pour établir une courbe d'étalonnage standard pour mesurer l'activité in vitro des fractions d'héparines biotinylées dans le plasma humain et le système tampon :
- 1er standard international pour les héparines de bas poids moléculaire (National Institute for Biological Standards and Control, Londres, R-U, établi en 1987, code n 85/600),
16 - 2ème standard intemational pour les héparines de bas poids moléculaire (National Institute for Biological Standards and Controi, Londres, R-U, établi en 1987, code n 01/608, utilisé depuis juin 2006), - l'enoxaparine (Clexane , sanofi-aventis, France) a été employé comme référence interne.
Pour les déterminations d'activité anti-Flla, 10 NI d'échantillon ou de standards internationaux des héparines de bas poids moléculaire sont dilués au 1:16 avec l'antithrombine dans le plasma humain ou le système tampon contenant Tris HCI
0,05 M, NaCI 0,154M, à pH 7,4. 10 pl de cette solution sont ajoutés dans une plaque 96 puits microtitre. La mesure est reproduite en triple (sur 3 puits).
La plaque microtitre est maintenue à 37 C en agitant à 300 t/min. 40 NI de thrombine sont ajoutés à chacun des puits et incubés pendant exactement 2 mn. 40 NI de Spectrozyme sont ajoutés. Après 90 secondes, la réaction est arrêtée par ajout de 40 NI d'acide acétique. L'absorption est mesurée à 405 nm en utilisant un SpectraMax 340 (Molecular devices).
Pour des mesures d'activité anti-FXa, l'échantillon ou les standards internationaux des héparines de bas poids moléculaire sont dilués dans le plasma humain ou le système tampon contenant Tris HCI 0,05 M, NaCI 0,154M, pH 7,4. Les échantillons contenant les héparinoïdes dans le plasma ou le tampon sont encore dilués au 1:20 avec un tampon de travail contenant l'ATIII, et placés en double dans le rotor de sondage. Le réactif facteur Xa et le substrat chromogène sont versés dans les réservoirs indiqués de l'instrument automatisé de coagulation ACL
7000.
La mesure de l'activité anti-FXa est réalisée avec le protocole "héparine"
intégrée dans le logiciel de l'ACL 7000. Pendant l'analyse, 50 NI de l'échantillon (dilué avec le tampon de travail) sont mélangés à 50 NI du réactif facteur Xa. Après un temps d'incubation de 60 secondes à 37 C, 50 NI de substrat chromogène de concentration 1,1 mM sont ajoutés et les changements de l'absorption en fonction du temps sont mesurés à la longueur d'onde de 405 nM.
Les résultats obtenus sont décrits notamment dans le tableau ci-dessous.
Pour les déterminations d'activité anti-Flla, 10 NI d'échantillon ou de standards internationaux des héparines de bas poids moléculaire sont dilués au 1:16 avec l'antithrombine dans le plasma humain ou le système tampon contenant Tris HCI
0,05 M, NaCI 0,154M, à pH 7,4. 10 pl de cette solution sont ajoutés dans une plaque 96 puits microtitre. La mesure est reproduite en triple (sur 3 puits).
La plaque microtitre est maintenue à 37 C en agitant à 300 t/min. 40 NI de thrombine sont ajoutés à chacun des puits et incubés pendant exactement 2 mn. 40 NI de Spectrozyme sont ajoutés. Après 90 secondes, la réaction est arrêtée par ajout de 40 NI d'acide acétique. L'absorption est mesurée à 405 nm en utilisant un SpectraMax 340 (Molecular devices).
Pour des mesures d'activité anti-FXa, l'échantillon ou les standards internationaux des héparines de bas poids moléculaire sont dilués dans le plasma humain ou le système tampon contenant Tris HCI 0,05 M, NaCI 0,154M, pH 7,4. Les échantillons contenant les héparinoïdes dans le plasma ou le tampon sont encore dilués au 1:20 avec un tampon de travail contenant l'ATIII, et placés en double dans le rotor de sondage. Le réactif facteur Xa et le substrat chromogène sont versés dans les réservoirs indiqués de l'instrument automatisé de coagulation ACL
7000.
La mesure de l'activité anti-FXa est réalisée avec le protocole "héparine"
intégrée dans le logiciel de l'ACL 7000. Pendant l'analyse, 50 NI de l'échantillon (dilué avec le tampon de travail) sont mélangés à 50 NI du réactif facteur Xa. Après un temps d'incubation de 60 secondes à 37 C, 50 NI de substrat chromogène de concentration 1,1 mM sont ajoutés et les changements de l'absorption en fonction du temps sont mesurés à la longueur d'onde de 405 nM.
Les résultats obtenus sont décrits notamment dans le tableau ci-dessous.
17 Activité anti-FXa (UI / mg) Héparine EPB 235 Héparine EPB purifiée par l'héparinase 3 Héparine EPB purifiée par l'héparinase 3 et amino-réduite Héparine EPB purifiée par l'héparinase 3, amino-réduite et biotinylée Héparine selon US 2005/0215519 Al 214 Héparine selon US 2005/0215519 Al 257 purifiée par I'héparinase 3 Héparine selon US 2005/0215519 Al purifiée par l'héparinase 3 et 203 amino-réduite Héparine selon US 200510215519 Al purifiée par l'héparinase 3, 214 amino-réduite et biotinylée Il apparaît ainsi que l'activité anti-FXa des héparines biotinylées selon l'invention est conservée par comparaison avec les héparines natives de départ.
Les héparines biotinylées selon la présente invention peuvent être utilisées pour la préparation de médicaments. Elles peuvent notamment être utilisées comme médicaments anti-thrombotiques. Ainsi, selon un autre de ses aspects, l'invention a pour objet des médicaments qui comprennent une héparine biotinylée telle que définie ci-avant. Ces médicaments trouvent leur emploi en thérapeutique, en particulier dans le traitement et la prévention des thromboses veineuses, des accidents thrombotiques artériels, notamment dans le cas d'infarctus du myocarde ou d'angor instable, des thromboses artérielles périphériques, telles que les arthériopathies des membres inférieurs, des thromboses artérielles cérébrales et des accidents vasculaires cérébraux. Ils sont également utiles dans la prévention et le traitement de la prolifération des cellules musculaires lisses, de l'angiogénèse, et comme agents neuroprotecteurs de l'athérosclérose et de l'artériosclérose.
Les héparines biotinylées selon la présente invention peuvent être utilisées pour la préparation de médicaments. Elles peuvent notamment être utilisées comme médicaments anti-thrombotiques. Ainsi, selon un autre de ses aspects, l'invention a pour objet des médicaments qui comprennent une héparine biotinylée telle que définie ci-avant. Ces médicaments trouvent leur emploi en thérapeutique, en particulier dans le traitement et la prévention des thromboses veineuses, des accidents thrombotiques artériels, notamment dans le cas d'infarctus du myocarde ou d'angor instable, des thromboses artérielles périphériques, telles que les arthériopathies des membres inférieurs, des thromboses artérielles cérébrales et des accidents vasculaires cérébraux. Ils sont également utiles dans la prévention et le traitement de la prolifération des cellules musculaires lisses, de l'angiogénèse, et comme agents neuroprotecteurs de l'athérosclérose et de l'artériosclérose.
18 PCT/FR2008/000172 La présente invention, selon un autre de ses aspects, concerne également une méthode de traitement des pathologies sus-mentionnées qui comprend l'administration, à un patient, d'une dose efficace d'un composé selon l'invention, ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables. L'utilisation des héparines biotinylées telles que définies précédemment pour le traitement et la prévention des pathologies sus-mentionnées fait donc partie de l'invention, ainsi que l'utilisation desdites héparines biotinylées pour la fabrication d'un médicament destiné à traiter ou à prévenir ces pathologies.
Selon un autre de ses aspects, la présente invention a pour objet une composition pharmaceutique conprenant, en tant que principe actif, une héparine biotinylée selon l'invention ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables, ainsi qu'au moins un excipient inerte, pharmaceutiquement acceptable. Lesdits excipients sont choisis selon la forme pharmaceutique et le mode d'administration souhaités, par exemple la voie orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, transdermique, transmuqueux, locale ou rectale.
Dans chaque unité de dosage, le principe actif est présent dans les quantités adaptées aux doses joumalières envisagées afin d'obtenir l'effet prophylactique ou thérapeutique désiré. Chaque unité de dosage peut contenir de 25 à 150 mg de principe actif, avantageusement de 30 à 100 mg. Ces doses de composés anticoagulants peuvent être neutralisées par l'avidine ou la streptavidine.
Il peut y avoir des cas particuliers où des dosages plus élevés ou plus faibles sont appropriés ; de tels dosages ne sortent pas du cadre de l'invention. Selon la pratique habituelle, le dosage approprié à chaque patient est déterminé par le médecin selon le mode d'administration, le poids et la réponse dudit patient.
Les composés selon l'invention peuvent également être utilisés en association avec un ou plusieurs autres principes actifs utiles pour la thérapeutique souhaitée, tels que des anti-thrombotiques, des anticoagulants ou des antiagrégants plaquettaires.
La présente invention a également pour objet un procédé mettant en oeuvre l'avidine ou la streptavidine, caractérisé en ce qu'il permet de neutraliser les héparines biotinylées selon l'invention. Ainsi, l'avidine ou la streptavidine peuvent
Selon un autre de ses aspects, la présente invention a pour objet une composition pharmaceutique conprenant, en tant que principe actif, une héparine biotinylée selon l'invention ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables, ainsi qu'au moins un excipient inerte, pharmaceutiquement acceptable. Lesdits excipients sont choisis selon la forme pharmaceutique et le mode d'administration souhaités, par exemple la voie orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, transdermique, transmuqueux, locale ou rectale.
Dans chaque unité de dosage, le principe actif est présent dans les quantités adaptées aux doses joumalières envisagées afin d'obtenir l'effet prophylactique ou thérapeutique désiré. Chaque unité de dosage peut contenir de 25 à 150 mg de principe actif, avantageusement de 30 à 100 mg. Ces doses de composés anticoagulants peuvent être neutralisées par l'avidine ou la streptavidine.
Il peut y avoir des cas particuliers où des dosages plus élevés ou plus faibles sont appropriés ; de tels dosages ne sortent pas du cadre de l'invention. Selon la pratique habituelle, le dosage approprié à chaque patient est déterminé par le médecin selon le mode d'administration, le poids et la réponse dudit patient.
Les composés selon l'invention peuvent également être utilisés en association avec un ou plusieurs autres principes actifs utiles pour la thérapeutique souhaitée, tels que des anti-thrombotiques, des anticoagulants ou des antiagrégants plaquettaires.
La présente invention a également pour objet un procédé mettant en oeuvre l'avidine ou la streptavidine, caractérisé en ce qu'il permet de neutraliser les héparines biotinylées selon l'invention. Ainsi, l'avidine ou la streptavidine peuvent
19 être utilisés pour la préparation de médicaments destinés à neutraliser les héparines biotinylées selon la présente invention.
Claims (17)
1. Héparines biotinylées, caractérisées en ce que les polysaccharides constitutifs desdites héparines possèdent à leur extrémité réductrice une liaison covalente avec un groupe -(R1)i-Biot et répondent à la formule générale (I) dans laquelle:
- i est égal à 0 ou 1, - R1 représente un enchainement de formule (a) ou (b) :
dans lesquelles j et k, identiques ou différents, sont des entiers pouvant prendre toute valeur de 1 à 10, - Biot représente un groupe biotine ou dérivé de biotine, - n représente un nombre entier ayant une valeur moyenne de l'ordre de 25 pour une héparine de masse moléculaire moyenne de 15 000 Da, - X représente H ou SO3Na, - Y représente COCH3 ou SO3Na, - le trait ondulé désigne une liaison située soit au-dessous, soit au-dessus du plan du cycle pyranosique auquel elle est rattachée, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
- i est égal à 0 ou 1, - R1 représente un enchainement de formule (a) ou (b) :
dans lesquelles j et k, identiques ou différents, sont des entiers pouvant prendre toute valeur de 1 à 10, - Biot représente un groupe biotine ou dérivé de biotine, - n représente un nombre entier ayant une valeur moyenne de l'ordre de 25 pour une héparine de masse moléculaire moyenne de 15 000 Da, - X représente H ou SO3Na, - Y représente COCH3 ou SO3Na, - le trait ondulé désigne une liaison située soit au-dessous, soit au-dessus du plan du cycle pyranosique auquel elle est rattachée, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
2. Héparines selon la revendication 1, caractérisées en ce que i est égal à 0, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
3. Héparines selon la revendication 1, caractérisées en ce que i est égal à 1 et R1 représente un enchaînement de formule (a) dans laquelle j est égal à 5, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
4. Héparines selon la revendication 1, caractérisées en ce que i est égal à 1 et R1 représente un enchaînement de formule (b) dans laquelle j et k sont identiques et sont égaux à 5, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
5. Héparines selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisées en ce que Biot représente le groupe biotine de formule (c) :
ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
6. Héparines selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisées en ce qu'au moins 64% des polysaccharides constitutifs desdites héparines possèdent à
leur extrémité réductrice une liaison covalente avec un groupe -(R1)i-Biot, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
leur extrémité réductrice une liaison covalente avec un groupe -(R1)i-Biot, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
7. Héparines selon la revendication 6, caractérisées en ce qu'au moins 80% des polysaccharides constitutifs desdites héparines possèdent à leur extrémité
réductrice une liaison covalente avec un groupe -(R1)i-Biot, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
réductrice une liaison covalente avec un groupe -(R1)i-Biot, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
8. Héparines selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisées en ce que lesdites héparines sont d'origine porcine.
9. Héparines selon la revendication 8, caractérisées en ce que lesdites héparines sont issues de muqueuses intestinales de porc.
10. Procédé pour la préparation des héparines biotinylées telles que définies dans l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
a) on traite l'héparine avec l'héparinase 3, b) puis on effectue une amination réductrice sur le produit précédemment obtenu en présence d'un sel d'amine et d'un agent réducteur, à une température comprise entre 20 et 80°C, c) enfin on effectue une acylation avec un groupe -(R1)i-Biot activé, où R1, i et Biot sont tels que définis dans l'une quelconque des revendications 1 à 5, en présence d'une base en milieu aqueux ou en milieu organique.
a) on traite l'héparine avec l'héparinase 3, b) puis on effectue une amination réductrice sur le produit précédemment obtenu en présence d'un sel d'amine et d'un agent réducteur, à une température comprise entre 20 et 80°C, c) enfin on effectue une acylation avec un groupe -(R1)i-Biot activé, où R1, i et Biot sont tels que définis dans l'une quelconque des revendications 1 à 5, en présence d'une base en milieu aqueux ou en milieu organique.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
a) on traite l'héparine avec l'héparinase 3, b) puis on effectue une amination réductrice sur le produit précédemment obtenu en présence d'un sel d'halogénure d'ammonium et d'un sel de borohydrure, à une température comprise entre 50 et 80°C, c) enfin on effectue une acylation avec un groupe -(R1)i-Biot sous forme d'ester activé, en présence d'une base en milieu aqueux.
a) on traite l'héparine avec l'héparinase 3, b) puis on effectue une amination réductrice sur le produit précédemment obtenu en présence d'un sel d'halogénure d'ammonium et d'un sel de borohydrure, à une température comprise entre 50 et 80°C, c) enfin on effectue une acylation avec un groupe -(R1)i-Biot sous forme d'ester activé, en présence d'une base en milieu aqueux.
12. Médicament, caractérisé en ce qu'il comprend une héparine biotinylée selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 ou un sel pharmaceutiquement acceptable desdites héparines biotinylées.
13. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend, en tant que principe actif, une héparine biotinylée selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, ou un sel pharmaceutiquement acceptable desdites héparines biotinylées, ainsi qu'au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
14. Utilisation d'une héparine biotinylée selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 en tant que médicament antithrombotique.
15. Utilisation selon la revendication 14 pour le traitement et la prévention des thromboses veineuses, des accidents thrombotiques artériels, notamment dans le cas d'infarctus du myocarde ou d'angor instable, des thromboses artérielles périphériques, telles que les arthériopathies des membres inférieurs, des thromboses artérielles cérébrales, des accidents vasculaires cérébraux, pour le traitement et la prévention de la prolifération des cellules musculaires lisses, de l'angiogénèse, et comme agent neuroprotecteur de l'athérosclérose et de l'artériosclérose.
16. Procédé mettant en oeuvre l'avidine ou la streptavidine, caractérisé en ce qu'il permet de neutraliser les héparines biotinylées selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.
17. Utilisation d'avidine ou de streptavidine pour la préparation de médicaments destinés à neutraliser les héparines biotinylées selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.
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