CA2848976A1 - Augmentation de la recombinaison meiotique chez les plantes par inhibition de la proteine fancm - Google Patents
Augmentation de la recombinaison meiotique chez les plantes par inhibition de la proteine fancm Download PDFInfo
- Publication number
- CA2848976A1 CA2848976A1 CA2848976A CA2848976A CA2848976A1 CA 2848976 A1 CA2848976 A1 CA 2848976A1 CA 2848976 A CA2848976 A CA 2848976A CA 2848976 A CA2848976 A CA 2848976A CA 2848976 A1 CA2848976 A1 CA 2848976A1
- Authority
- CA
- Canada
- Prior art keywords
- fancm
- protein
- gene
- plant
- plants
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Abandoned
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 69
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 34
- 230000006798 recombination Effects 0.000 title abstract description 22
- 238000005215 recombination Methods 0.000 title abstract description 22
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title 1
- 102100034552 Fanconi anemia group M protein Human genes 0.000 claims abstract description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 101150090685 Fancm gene Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 claims abstract description 11
- 101000848187 Homo sapiens Fanconi anemia group M protein Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 claims abstract description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 82
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 41
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 18
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 claims description 12
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 8
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 6
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 5
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 5
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 claims description 4
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 claims description 3
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 14
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 8
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 abstract description 7
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 abstract description 4
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 abstract description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 abstract description 2
- 101710127385 Fanconi anemia group M protein Proteins 0.000 description 32
- 101100433229 Caenorhabditis elegans zip-4 gene Proteins 0.000 description 23
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 101000889890 Homo sapiens Testis-expressed protein 11 Proteins 0.000 description 13
- 101000685830 Homo sapiens Zinc transporter ZIP4 Proteins 0.000 description 13
- 102100023140 Zinc transporter ZIP4 Human genes 0.000 description 13
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 108091060290 Chromatid Proteins 0.000 description 10
- 210000004756 chromatid Anatomy 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 7
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 6
- 101000836826 Homo sapiens Protein shortage in chiasmata 1 ortholog Proteins 0.000 description 5
- 102100027102 Protein shortage in chiasmata 1 ortholog Human genes 0.000 description 5
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- -1 DM01 Proteins 0.000 description 4
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 4
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 101000968663 Homo sapiens MutS protein homolog 5 Proteins 0.000 description 4
- 102100021156 MutS protein homolog 5 Human genes 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 4
- 230000031877 prophase Effects 0.000 description 4
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 4
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 3
- 101000968674 Homo sapiens MutS protein homolog 4 Proteins 0.000 description 3
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 3
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 3
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 3
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- 101000968669 Arabidopsis thaliana DNA mismatch repair protein MSH5 Proteins 0.000 description 2
- 101000785670 Arabidopsis thaliana TPR repeat-containing protein ZIP4 Proteins 0.000 description 2
- 108091026821 Artificial microRNA Proteins 0.000 description 2
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 2
- 206010053138 Congenital aplastic anaemia Diseases 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- 201000004939 Fanconi anemia Diseases 0.000 description 2
- 101000843497 Homo sapiens Probable ATP-dependent DNA helicase HFM1 Proteins 0.000 description 2
- 101000693444 Homo sapiens Zinc transporter ZIP2 Proteins 0.000 description 2
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 2
- 102100021157 MutS protein homolog 4 Human genes 0.000 description 2
- 102100030730 Probable ATP-dependent DNA helicase HFM1 Human genes 0.000 description 2
- 102000002490 Rad51 Recombinase Human genes 0.000 description 2
- 108010068097 Rad51 Recombinase Proteins 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000030699 diplotene Effects 0.000 description 2
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000012470 leptotene Effects 0.000 description 2
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 2
- 230000010765 pachytene Effects 0.000 description 2
- 230000008775 paternal effect Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000012225 targeting induced local lesions in genomes Methods 0.000 description 2
- 230000009353 zygotene Effects 0.000 description 2
- 235000005254 Allium ampeloprasum Nutrition 0.000 description 1
- 240000006108 Allium ampeloprasum Species 0.000 description 1
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 description 1
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 1
- 108010037365 Arabidopsis Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000968672 Arabidopsis thaliana DNA mismatch repair protein MSH4 Proteins 0.000 description 1
- 101100119756 Arabidopsis thaliana FANCM gene Proteins 0.000 description 1
- 101100375585 Arabidopsis thaliana YAB1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 235000021537 Beetroot Nutrition 0.000 description 1
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 1
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 1
- 240000000385 Brassica napus var. napus Species 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 1
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000000540 Brassica rapa subsp rapa Nutrition 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 101100292209 Caenorhabditis elegans msh-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 description 1
- 241001515826 Cassava vein mosaic virus Species 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 240000006740 Cichorium endivia Species 0.000 description 1
- 244000241235 Citrullus lanatus Species 0.000 description 1
- 235000012828 Citrullus lanatus var citroides Nutrition 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241000219112 Cucumis Species 0.000 description 1
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 description 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 1
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 241000219130 Cucurbita pepo subsp. pepo Species 0.000 description 1
- 235000003954 Cucurbita pepo var melopepo Nutrition 0.000 description 1
- 244000019459 Cynara cardunculus Species 0.000 description 1
- 235000019106 Cynara scolymus Nutrition 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102100035186 DNA excision repair protein ERCC-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100028849 DNA mismatch repair protein Mlh3 Human genes 0.000 description 1
- 102100039116 DNA repair protein RAD50 Human genes 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 102100029716 DnaJ homolog subfamily A member 3, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 102100033996 Double-strand break repair protein MRE11 Human genes 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 102100036109 Dual specificity protein kinase TTK Human genes 0.000 description 1
- 235000016623 Fragaria vesca Nutrition 0.000 description 1
- 240000009088 Fragaria x ananassa Species 0.000 description 1
- 235000011363 Fragaria x ananassa Nutrition 0.000 description 1
- 208000031448 Genomic Instability Diseases 0.000 description 1
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 1
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000876529 Homo sapiens DNA excision repair protein ERCC-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000577867 Homo sapiens DNA mismatch repair protein Mlh3 Proteins 0.000 description 1
- 101000743929 Homo sapiens DNA repair protein RAD50 Proteins 0.000 description 1
- 101000866012 Homo sapiens DnaJ homolog subfamily A member 3, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101000591400 Homo sapiens Double-strand break repair protein MRE11 Proteins 0.000 description 1
- 101000659223 Homo sapiens Dual specificity protein kinase TTK Proteins 0.000 description 1
- 101001128138 Homo sapiens NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000981336 Homo sapiens Nibrin Proteins 0.000 description 1
- 101000904868 Homo sapiens Transcriptional regulator ATRX Proteins 0.000 description 1
- 101000693468 Homo sapiens Zinc transporter ZIP3 Proteins 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 244000081841 Malus domestica Species 0.000 description 1
- 235000011430 Malus pumila Nutrition 0.000 description 1
- 235000015103 Malus silvestris Nutrition 0.000 description 1
- 240000003183 Manihot esculenta Species 0.000 description 1
- 235000016735 Manihot esculenta subsp esculenta Nutrition 0.000 description 1
- 101000669895 Methanothermobacter thermautotrophicus (strain ATCC 29096 / DSM 1053 / JCM 10044 / NBRC 100330 / Delta H) Replication factor A Proteins 0.000 description 1
- 102000013609 MutL Protein Homolog 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010026664 MutL Protein Homolog 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031897 NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101100355599 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) mus-11 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006002 Pepper Substances 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 241000195887 Physcomitrella patens Species 0.000 description 1
- 235000016761 Piper aduncum Nutrition 0.000 description 1
- 240000003889 Piper guineense Species 0.000 description 1
- 235000017804 Piper guineense Nutrition 0.000 description 1
- 235000008184 Piper nigrum Nutrition 0.000 description 1
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 1
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 1
- 241000219000 Populus Species 0.000 description 1
- 241000218976 Populus trichocarpa Species 0.000 description 1
- 240000001987 Pyrus communis Species 0.000 description 1
- 235000014443 Pyrus communis Nutrition 0.000 description 1
- 101150006234 RAD52 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 1
- 102000053062 Rad52 DNA Repair and Recombination Human genes 0.000 description 1
- 108700031762 Rad52 DNA Repair and Recombination Proteins 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 240000000528 Ricinus communis Species 0.000 description 1
- 235000004443 Ricinus communis Nutrition 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 101150059721 SHOC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101100409457 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) CDC40 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100156959 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) XRS2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001074085 Scophthalmus aquosus Species 0.000 description 1
- 241000209056 Secale Species 0.000 description 1
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 235000002597 Solanum melongena Nutrition 0.000 description 1
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 240000003829 Sorghum propinquum Species 0.000 description 1
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 1
- 102100023931 Transcriptional regulator ATRX Human genes 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 241000722921 Tulipa gesneriana Species 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 1
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 1
- 101150041338 ZIP4 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 102100025446 Zinc transporter ZIP3 Human genes 0.000 description 1
- FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N [4,6-bis(cyanoamino)-1,3,5-triazin-2-yl]cyanamide Chemical compound N#CNC1=NC(NC#N)=NC(NC#N)=N1 FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 235000016520 artichoke thistle Nutrition 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 235000003733 chicria Nutrition 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 230000024321 chromosome segregation Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 231100000502 fertility decrease Toxicity 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 235000002532 grape seed extract Nutrition 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 102000045914 human FANCM Human genes 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 101150096888 msh-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 235000012045 salad Nutrition 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 210000004217 synaptonemal complex Anatomy 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
L' invention est relative à une méthode pour augmenter la fréquence de recombinaison méiotique chez les plantes, par l' inactivation de la protéine FANCM, notamment par mutagénèse ou extinction du gène FANCM codant pour ladite protéine. La présente invention est utilisable notamment dans le domaine de l'amélioration des plantes et de la cartographie génétique.
Description
AUGMENTATION DE LA RECOMBINAISON MEIOTIQUE CHEZ LES PLANTES
PAR INHIBITION DE LA PROTEINE FANCM
La présente invention est relative à une méthode pour augmenter la recombinaison méiotique chez les plantes.
La recombinaison méiotique est un échange d'ADN
entre chromosomes homologues au cours de la méiose ; elle intervient pendant la prophase de la première division méiotique. Un des produits de la recombinaison est le crossing-over, qui entraine un échange réciproque de continuité entre deux chromatides homologues. Cette prophase (prophase I) comprend 5 stades successifs : leptotène, zygotène, pachytène, diplotène, et diacinèse. Au leptotène les chromosomes s'individualisent, chaque chromosome étant formé
de deux chromatides s urs issues de la duplication intervenue préalablement à la prophase. Durant le zygotène, les chromosomes homologues s'apparient, formant une structure appelée bivalent qui contient quatre chromatides, deux chromatides s urs maternelles et deux chromatides s urs paternelles, homologues des chromatides maternelles. Au pachytène les chromosomes sont totalement appariés, et des nodules de recombinaison se forment entre les chromatides homologues étroitement reliées entre elles par le complexe synaptonémal (SC) ; au diplotène, le SC se dissocie progressivement, et les chromosomes homologues commencent à se séparer, mais restent joints au niveau des chiasmas, qui correspondent aux sites de crossing-overs (C05). Les chromosomes se condensent au cours de la diacinèse ; les chiasmas subsistent jusqu'a la métaphase I pendant laquelle ils maintiennent l'appariement 'des bivalents de part et d'autre de la plaque équatoriale.
La recombinaison méiotique est déclenchée par la formation de cassures double-brin (CDB) dans l'une ou l'autre des chromatides homologues, et résulte de la réparation de ces cassures utilisant comme matrice une chromatide du chromosome homologue.
La recombinaison méiotique a pour conséquence de provoquer un réassortiment des allèles d'origine paternelle et maternelle dans le génome, ce qui contribue à générer de la
PAR INHIBITION DE LA PROTEINE FANCM
La présente invention est relative à une méthode pour augmenter la recombinaison méiotique chez les plantes.
La recombinaison méiotique est un échange d'ADN
entre chromosomes homologues au cours de la méiose ; elle intervient pendant la prophase de la première division méiotique. Un des produits de la recombinaison est le crossing-over, qui entraine un échange réciproque de continuité entre deux chromatides homologues. Cette prophase (prophase I) comprend 5 stades successifs : leptotène, zygotène, pachytène, diplotène, et diacinèse. Au leptotène les chromosomes s'individualisent, chaque chromosome étant formé
de deux chromatides s urs issues de la duplication intervenue préalablement à la prophase. Durant le zygotène, les chromosomes homologues s'apparient, formant une structure appelée bivalent qui contient quatre chromatides, deux chromatides s urs maternelles et deux chromatides s urs paternelles, homologues des chromatides maternelles. Au pachytène les chromosomes sont totalement appariés, et des nodules de recombinaison se forment entre les chromatides homologues étroitement reliées entre elles par le complexe synaptonémal (SC) ; au diplotène, le SC se dissocie progressivement, et les chromosomes homologues commencent à se séparer, mais restent joints au niveau des chiasmas, qui correspondent aux sites de crossing-overs (C05). Les chromosomes se condensent au cours de la diacinèse ; les chiasmas subsistent jusqu'a la métaphase I pendant laquelle ils maintiennent l'appariement 'des bivalents de part et d'autre de la plaque équatoriale.
La recombinaison méiotique est déclenchée par la formation de cassures double-brin (CDB) dans l'une ou l'autre des chromatides homologues, et résulte de la réparation de ces cassures utilisant comme matrice une chromatide du chromosome homologue.
La recombinaison méiotique a pour conséquence de provoquer un réassortiment des allèles d'origine paternelle et maternelle dans le génome, ce qui contribue à générer de la
2 diversité génétique. Elle présente donc un intérêt particulier dans les programmes d'amélioration des plantes (WIJNKER & de JONG, Trends in Plant Science, 13, 640-646, 2008). Notamment, une amélioration du taux de recombinaison peut permettre d'augmenter le brassage génétique, et donc les probabilités d'obtenir de nouvelles combinaisons de caractéristiques ; elle peut permettre aussi de faciliter l'introgression de gènes d'intérêt, ainsi que la cartographie génétique et le clonage positionnel de gènes d'intérêt.
Diverses méthodes pour contrôler la recombinaison méiotique ont été proposées, basées sur la sur-expression ou l'extinction de l'un ou l'autre des très nombreux gènes identifiés comme étant impliqués ou potentiellement impliqués dans ce mécanisme. Par exemple, la Demande POT W0/0208432 propose la surexpression de la protéine RAD51, qui est impliquée dans la recombinaison homologue, pour stimuler la recombinaison méiotique ; la Demande US 2004023388 propose de surexprimer un activateur de la recombinaison méiotique choisi parmi : SP011, MRE11, RAD50, XRS2/NBS1, DM01, RAD51, RPA, MSH4, MSHS, MLH1, RAD52, RAD54, TID1, RAD5S, RADS7, RADS9, une résolvase, une protéine liant l'ADN simple brin, une protéine impliquée dans le remodelage de la chromatine, ou une protéine du complexe synaptonémal, pour augmenter la fréquence de recombinaison entre chromatides homologues ; la Demande POT
WO 2004016795 propose d'augmenter la recombinaison entre chromosomes homologues en exprimant une protéine SP011 fusionnée à un domaine de liaison à l'ADN ; la Demande POT
WO 03104451 propose d'augmenter le potentiel de recombinaison entre des chromosomes homologues par la surexpression d'une protéine (MutS) impliquée dans la réparation des mésappariements.
Cependant, dans la plupart des cas, l'effet de ces gènes candidats sur la formation de COs méiotiques in planta n'a pas été confirmé, et il est donc nécessaire d'identifier d'autres gènes intervenant dans ce phénomène.
L'un des facteurs connus pour agir sur le taux de recombinaison méiotique est le phénomène d'interférence: la formation d'un CO à un endroit du chromosome inhibe la
Diverses méthodes pour contrôler la recombinaison méiotique ont été proposées, basées sur la sur-expression ou l'extinction de l'un ou l'autre des très nombreux gènes identifiés comme étant impliqués ou potentiellement impliqués dans ce mécanisme. Par exemple, la Demande POT W0/0208432 propose la surexpression de la protéine RAD51, qui est impliquée dans la recombinaison homologue, pour stimuler la recombinaison méiotique ; la Demande US 2004023388 propose de surexprimer un activateur de la recombinaison méiotique choisi parmi : SP011, MRE11, RAD50, XRS2/NBS1, DM01, RAD51, RPA, MSH4, MSHS, MLH1, RAD52, RAD54, TID1, RAD5S, RADS7, RADS9, une résolvase, une protéine liant l'ADN simple brin, une protéine impliquée dans le remodelage de la chromatine, ou une protéine du complexe synaptonémal, pour augmenter la fréquence de recombinaison entre chromatides homologues ; la Demande POT
WO 2004016795 propose d'augmenter la recombinaison entre chromosomes homologues en exprimant une protéine SP011 fusionnée à un domaine de liaison à l'ADN ; la Demande POT
WO 03104451 propose d'augmenter le potentiel de recombinaison entre des chromosomes homologues par la surexpression d'une protéine (MutS) impliquée dans la réparation des mésappariements.
Cependant, dans la plupart des cas, l'effet de ces gènes candidats sur la formation de COs méiotiques in planta n'a pas été confirmé, et il est donc nécessaire d'identifier d'autres gènes intervenant dans ce phénomène.
L'un des facteurs connus pour agir sur le taux de recombinaison méiotique est le phénomène d'interférence: la formation d'un CO à un endroit du chromosome inhibe la
3 formation d'autres COs à proximité. Toutefois, il a été
récemment montré qu'il existait en fait 2 voies distinctes de formation des COs méiotiques (HOLLINGSWORTH & BRILL, Genes Dey., 18,117-125, 2004 ; BERCHOWITZ & COPENHAVER, Current genomics, 11, 91-102, 2010). La première génère des COs interférents dénommés COs de type I (COI), et fait intervenir un ensemble de gènes collectivement désignés sous les appellations de gènes ZMM (ZIPI, ZIP2, ZIP3, ZIP4, MER3, MSH4, MSH5) ainsi que les protéines MI,H1 et MLH3 ; la seconde voie génère des COs non-interférents, dénommés COs de type II
(COII), et dépend du gène MISSI.
L'utilisation de l'une et/ou l'autre de ces deux voies est variable d'un organisme à l'autre. Chez les végétaux supérieurs, représentés par la plante modèle Arabidopsis thaliana, les 2 voies coexistent, celle des COs de type I
étant prédominante ; il a été observé que l'inactivation des gènes AtMSH4, AtMSH5, atMER3, SHOC1, ou AtZIP4 (homologues respectifs chez Arabidopsis thaliana des gènes MSH4, MSH5, MER3, ZIP2 et ZIP4) induisait jusqu'à 85% de réduction de la fréquence des COs (HIGGINS et al., 2004, précité ; MERCIER et al., 2005, précité ; CHELYSHEVA et al., PLoS Genet. 3, e83, 2007 ; HIGGINS et al., Plant J., 55, 28-39, 2008 ; MACAISNE et al., Current Biology, 18, 1432-1437, 2008), cette diminution s'accompagnant d'une forte réduction de la fertilité.
Les Inventeurs ont maintenant découvert que l'inactivation du gène Fanconi Anemia Complementation Group M (FANCM) d'Arabidopsis thaliana (AtFNCM) compensait les effets de l'inactivation d'AtMSH5, de SHOC1, ou d'AtZIP4, et permettait d'augmenter le nombre de COs méiotiques et de restaurer la fertilité chez les mutants zmm Atzip4-/-, Atmsh5-/- and Atshocl-/-. Ils ont en outre découvert que les effets de l'inactivation du gène FANCM sur l'augmentation du nombre de COs méiotiques se produisaient non seulement chez les mutants zmm, mais également chez les plantes de type sauvage possédant des gènes ZMM fonctionnels.
La protéine FANCM a initialement été identifiée chez l'homme dans le cadre de la recherche de mutations associées à l'anémie de Fanconi, qui est une maladie génétique
récemment montré qu'il existait en fait 2 voies distinctes de formation des COs méiotiques (HOLLINGSWORTH & BRILL, Genes Dey., 18,117-125, 2004 ; BERCHOWITZ & COPENHAVER, Current genomics, 11, 91-102, 2010). La première génère des COs interférents dénommés COs de type I (COI), et fait intervenir un ensemble de gènes collectivement désignés sous les appellations de gènes ZMM (ZIPI, ZIP2, ZIP3, ZIP4, MER3, MSH4, MSH5) ainsi que les protéines MI,H1 et MLH3 ; la seconde voie génère des COs non-interférents, dénommés COs de type II
(COII), et dépend du gène MISSI.
L'utilisation de l'une et/ou l'autre de ces deux voies est variable d'un organisme à l'autre. Chez les végétaux supérieurs, représentés par la plante modèle Arabidopsis thaliana, les 2 voies coexistent, celle des COs de type I
étant prédominante ; il a été observé que l'inactivation des gènes AtMSH4, AtMSH5, atMER3, SHOC1, ou AtZIP4 (homologues respectifs chez Arabidopsis thaliana des gènes MSH4, MSH5, MER3, ZIP2 et ZIP4) induisait jusqu'à 85% de réduction de la fréquence des COs (HIGGINS et al., 2004, précité ; MERCIER et al., 2005, précité ; CHELYSHEVA et al., PLoS Genet. 3, e83, 2007 ; HIGGINS et al., Plant J., 55, 28-39, 2008 ; MACAISNE et al., Current Biology, 18, 1432-1437, 2008), cette diminution s'accompagnant d'une forte réduction de la fertilité.
Les Inventeurs ont maintenant découvert que l'inactivation du gène Fanconi Anemia Complementation Group M (FANCM) d'Arabidopsis thaliana (AtFNCM) compensait les effets de l'inactivation d'AtMSH5, de SHOC1, ou d'AtZIP4, et permettait d'augmenter le nombre de COs méiotiques et de restaurer la fertilité chez les mutants zmm Atzip4-/-, Atmsh5-/- and Atshocl-/-. Ils ont en outre découvert que les effets de l'inactivation du gène FANCM sur l'augmentation du nombre de COs méiotiques se produisaient non seulement chez les mutants zmm, mais également chez les plantes de type sauvage possédant des gènes ZMM fonctionnels.
La protéine FANCM a initialement été identifiée chez l'homme dans le cadre de la recherche de mutations associées à l'anémie de Fanconi, qui est une maladie génétique
4 se caractérisant par une instabilité génomique et une prédisposition au cancer. Cette protéine participe à la réparation de lésions de l'ADN ; la protéine FANCM humaine contient deux domaines hélicase dans sa moitié N-terminale :
un domaine DEXDc (cd00046, et un domaine HELICc (cd00079) ainsi qu'un domaine endonucléase ERCC1/XPF dans sa moitié C-terminale, ce dernier domaine n'étant toutefois probablement pas fonctionnel car il est dégénéré pour plusieurs résidus essentiels à l'activité endonucléase (MEETEI et al, Nat Genet., 37, 958-963, 2005).
La protéine FANCM apparaît conservée, et divers homologues de cette protéine ont été identifiés chez les eucaryotes, sur la base des homologies de séquences. Les protéines FANCM de vertébrés possèdent, comme la FANCM
humaine, les domaines hélicase et le domaine endonucléase ; la FANCM de drosophile, ainsi que l'homologue de FANCM chez la levure Saccharomyces cerevisiae (dénommé MPH1 pour Miltator Phenotype 1 ), sont plus courts, et possèdent uniquement les domaines hélicase. Les FANCM de plantes, représentées par la protéine d'Arabidopsis thaliana, sont également dépourvues du domaine endonucléase. AtFANCM est codée par le gène AT1G35530 ; deux isoformes prédites de cette protéine sont décrites dans les bases de données de séquences : l'une (GenBank : NP 001185141 ; UniProtKB : F4HYE4) représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 1, a une taille de 1390 acides aminés ; l'autre (GenBank :
NP 174785 ; UniProtKB : F4HYE5), a une taille de 1324 acides aminés. Ces deux isoformes diffèrent entre elles par la présence de deux insertions dans la séquence NP 001185141/F4HYE4 : l'une de 45 acides aminés entre les positions 575 et 576 de la séquence NP 174785/F4HYE5, et l'autre de 21 acides aminés entre les positions 1045 et 1046 de la séquence NP_174785/F4HYE5.
Quelle que soit l'isoforme concernée, AtFANCM
possède dans sa moitié N terminale, les deux domaines hélicase DEXDc (acides aminés 129-272 de SEQ ID NO: 1) et HELICc (acides aminés 445-570 de SEQ ID NO: 1) ; ces deux domaines sont respectivement décrits sous les références cd00046 et cd00079 dans la base de données CDD (MARCHLER-BAUER et al., Nucleic Acids Res.39(D)225-9, 2011).
Une recherche dans les bases de données de séquence a permis d'identifier des orthologues d'AtFANCM chez un large
un domaine DEXDc (cd00046, et un domaine HELICc (cd00079) ainsi qu'un domaine endonucléase ERCC1/XPF dans sa moitié C-terminale, ce dernier domaine n'étant toutefois probablement pas fonctionnel car il est dégénéré pour plusieurs résidus essentiels à l'activité endonucléase (MEETEI et al, Nat Genet., 37, 958-963, 2005).
La protéine FANCM apparaît conservée, et divers homologues de cette protéine ont été identifiés chez les eucaryotes, sur la base des homologies de séquences. Les protéines FANCM de vertébrés possèdent, comme la FANCM
humaine, les domaines hélicase et le domaine endonucléase ; la FANCM de drosophile, ainsi que l'homologue de FANCM chez la levure Saccharomyces cerevisiae (dénommé MPH1 pour Miltator Phenotype 1 ), sont plus courts, et possèdent uniquement les domaines hélicase. Les FANCM de plantes, représentées par la protéine d'Arabidopsis thaliana, sont également dépourvues du domaine endonucléase. AtFANCM est codée par le gène AT1G35530 ; deux isoformes prédites de cette protéine sont décrites dans les bases de données de séquences : l'une (GenBank : NP 001185141 ; UniProtKB : F4HYE4) représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 1, a une taille de 1390 acides aminés ; l'autre (GenBank :
NP 174785 ; UniProtKB : F4HYE5), a une taille de 1324 acides aminés. Ces deux isoformes diffèrent entre elles par la présence de deux insertions dans la séquence NP 001185141/F4HYE4 : l'une de 45 acides aminés entre les positions 575 et 576 de la séquence NP 174785/F4HYE5, et l'autre de 21 acides aminés entre les positions 1045 et 1046 de la séquence NP_174785/F4HYE5.
Quelle que soit l'isoforme concernée, AtFANCM
possède dans sa moitié N terminale, les deux domaines hélicase DEXDc (acides aminés 129-272 de SEQ ID NO: 1) et HELICc (acides aminés 445-570 de SEQ ID NO: 1) ; ces deux domaines sont respectivement décrits sous les références cd00046 et cd00079 dans la base de données CDD (MARCHLER-BAUER et al., Nucleic Acids Res.39(D)225-9, 2011).
Une recherche dans les bases de données de séquence a permis d'identifier des orthologues d'AtFANCM chez un large
5 panel d'eucaryotes, et il peut être supposé que cette protéine est conservée dans l'ensemble des plantes supérieures.
A titres d'exemples non-limitatifs d'orthologues d'AtFANCM, on citera notamment :
- la protéine de Vitis vinifera dont la séquence polypeptidique est disponible dans la base de données GenBank sous le numéro d'accès, CBI18266 ;
- la protéine de Physcomitrella patens dont la séquence polypeptidique est disponible dans la base de données Phytozome sous le numéro d'accès Pp1s9_477V6 ;
- la protéine de Ricinus communis dont la séquence polypeptidique est disponible dans la base de données GenBank sous le numéro d'accès XP 002526811 ;
- la protéine d'Oryza sativa dont la séquence polypeptidique est disponible dans la base de données GenBank sous le numéro d'accès AAX96303 ;
- la protéine de Populus tri chocarpa dont la séquence polypeptidique est disponible dans la base de données Phytozome sous le numéro d'accès POPTR_0013s11390.
La présente invention a pour objet une méthode pour augmenter la fréquence des COs méiotiques chez une plante, caractérisée en ce qu'elle comprend l'inhibition dans ladite plante, d'une protéine ci-après dénommée FANCM, ladite protéine ayant au moins 30%, et par ordre de préférence croissante, au moins 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 98% d'identité de séquence, ou au moins 45%, et par ordre de préférence croissante, au moins 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 98% de similarité de séquence avec la protéine AtFANCM de séquence SEQ ID NO: 1, et contenant un domaine hélicase DEXDc (cd00046) et un domaine hélicase HELICc (cd00079).
Selon un mode de mise en uvre préféré de la présente invention, le domaine hélicase DEXDc de ladite protéine FANCM a au moins 65%, et par ordre de préférence
A titres d'exemples non-limitatifs d'orthologues d'AtFANCM, on citera notamment :
- la protéine de Vitis vinifera dont la séquence polypeptidique est disponible dans la base de données GenBank sous le numéro d'accès, CBI18266 ;
- la protéine de Physcomitrella patens dont la séquence polypeptidique est disponible dans la base de données Phytozome sous le numéro d'accès Pp1s9_477V6 ;
- la protéine de Ricinus communis dont la séquence polypeptidique est disponible dans la base de données GenBank sous le numéro d'accès XP 002526811 ;
- la protéine d'Oryza sativa dont la séquence polypeptidique est disponible dans la base de données GenBank sous le numéro d'accès AAX96303 ;
- la protéine de Populus tri chocarpa dont la séquence polypeptidique est disponible dans la base de données Phytozome sous le numéro d'accès POPTR_0013s11390.
La présente invention a pour objet une méthode pour augmenter la fréquence des COs méiotiques chez une plante, caractérisée en ce qu'elle comprend l'inhibition dans ladite plante, d'une protéine ci-après dénommée FANCM, ladite protéine ayant au moins 30%, et par ordre de préférence croissante, au moins 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 98% d'identité de séquence, ou au moins 45%, et par ordre de préférence croissante, au moins 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 98% de similarité de séquence avec la protéine AtFANCM de séquence SEQ ID NO: 1, et contenant un domaine hélicase DEXDc (cd00046) et un domaine hélicase HELICc (cd00079).
Selon un mode de mise en uvre préféré de la présente invention, le domaine hélicase DEXDc de ladite protéine FANCM a au moins 65%, et par ordre de préférence
6 croissante, au moins 70,75, 80, 85, 90, 95 ou 98% d'identité
de séquence, ou au moins 75%, et par ordre de préférence croissante, au moins 80,85, 90, 95 ou 98% de similarité de séquence avec le domaine DEXDc de la protéine AtFANCM (acides aminés 129-272 de la SEQ ID NO: 1).
Selon un autre mode de mise en uvre préféré de la présente invention, le domaine hélicase HELICc de ladite protéine FANCM a au moins 60%, et par ordre de préférence croissante, au moins 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 98%
d'identité de séquence, ou au moins 70%, et par ordre de préférence croissante, au moins 75, 80, 85, 90, 95 ou 98% de similarité de séquence avec le domaine HELICc de la protéine AtFANCM (acides aminés 445-570 de la SEQ ID NO: 1).
Les valeurs d'identité et de similarité de séquence indiquées ici sont calculées en utilisant le programme BLASTP
ou le programme Needle avec les paramètres par défaut. Les calculs de similarité sont effectués en utilisant la matrice BLOSUM62.
L'inhibition de la protéine FANCM peut être obtenue en supprimant ou en diminuant son activité ou en supprimant ou diminuant l'expression du gène correspondant.
L'inhibition peut notamment être obtenue par mutagenèse du gène FANCM. Par exemple, une mutation dans la séquence codante peut induire, selon la nature de la mutation, l'expression d'une protéine inactive, ou d'une protéine à
activité réduite; une mutation au niveau d'un site d'épissage peut également altérer ou abolir la fonction de la protéine ;
une mutation dans la séquence promotrice peut induire l'absence d'expression de ladite protéine, ou la diminution de son expression.
La mutagenèse peut être effectuée par exemple par la suppression de tout ou partie de la séquence codante ou du promoteur de FANCM, ou par insertion d'une séquence exogène, par exemple un transposon ou un ADN-T, au sein de ladite séquence codante ou dudit promoteur. Elle peut également être effectuée en induisant des mutations ponctuelles, par exemple par mutagénèse ENS, ou par radiations.
de séquence, ou au moins 75%, et par ordre de préférence croissante, au moins 80,85, 90, 95 ou 98% de similarité de séquence avec le domaine DEXDc de la protéine AtFANCM (acides aminés 129-272 de la SEQ ID NO: 1).
Selon un autre mode de mise en uvre préféré de la présente invention, le domaine hélicase HELICc de ladite protéine FANCM a au moins 60%, et par ordre de préférence croissante, au moins 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 98%
d'identité de séquence, ou au moins 70%, et par ordre de préférence croissante, au moins 75, 80, 85, 90, 95 ou 98% de similarité de séquence avec le domaine HELICc de la protéine AtFANCM (acides aminés 445-570 de la SEQ ID NO: 1).
Les valeurs d'identité et de similarité de séquence indiquées ici sont calculées en utilisant le programme BLASTP
ou le programme Needle avec les paramètres par défaut. Les calculs de similarité sont effectués en utilisant la matrice BLOSUM62.
L'inhibition de la protéine FANCM peut être obtenue en supprimant ou en diminuant son activité ou en supprimant ou diminuant l'expression du gène correspondant.
L'inhibition peut notamment être obtenue par mutagenèse du gène FANCM. Par exemple, une mutation dans la séquence codante peut induire, selon la nature de la mutation, l'expression d'une protéine inactive, ou d'une protéine à
activité réduite; une mutation au niveau d'un site d'épissage peut également altérer ou abolir la fonction de la protéine ;
une mutation dans la séquence promotrice peut induire l'absence d'expression de ladite protéine, ou la diminution de son expression.
La mutagenèse peut être effectuée par exemple par la suppression de tout ou partie de la séquence codante ou du promoteur de FANCM, ou par insertion d'une séquence exogène, par exemple un transposon ou un ADN-T, au sein de ladite séquence codante ou dudit promoteur. Elle peut également être effectuée en induisant des mutations ponctuelles, par exemple par mutagénèse ENS, ou par radiations.
7 Les allèles mutés peuvent être détectés par exemple par PCR, en utilisant des amorces spécifiques du gène FANON.
Différentes méthodes de mutagénèse et de criblage à
haut débit sont décrites dans l'art antérieur. A titre d'exemples, on peut citer des méthodes de type TILLING
(Targeting Induced Local Lesions In Genome), décrit par McCALLUM et al., Plant Physiol., 123, 439-442, 2000).
L'absence de fonctionnalité de FANON chez les mutants peut être vérifiée sur la base des caractéristiques phénotypiques de leur descendance ; les plantes homozygotes pour une mutation inactivant le gène FANON ont un taux de COs méiotiques supérieur à celui des plantes sauvages (ne portant pas la mutation dans le gène FANON) dont elles sont issues.
Généralement ce taux de COs méiotiques est au moins 2 fois supérieur, de préférence au moins 3 fois supérieur à celui des plantes sauvages dont elles sont issues.
Les plantes mutantes contenant une mutation dans le gène FANCM qui induit l'inhibition de la protéine FANON font également partie de l'objet de la présente invention, à
l'exception des plantes de l'espèce Arabidopsis thaliana chez lesquelles ladite mutation est une insertion d'ADN-T dans ledit gène. Cette mutation peut être par exemple une délétion de tout ou partie de la séquence codante ou du promoteur de FANON, ou bien une mutation ponctuelle de cette séquence codante ou de ce promoteur.
Avantageusement, l'inhibition de la protéine FANON
est obtenue par extinction (silencing) du gène FANON.
Différentes techniques d'extinction de gènes dans les plantes sont connues en elles-mêmes (pour revue voir par exemple :
WATSON & GRIERSON, Transgenic Plants : Fundamentals and Applications (Hiatt, A, ed) New York : Marcel Dekker, 255-281, 1992 ; CHICAS & MACINO, EMBO reports, 21, 992-996, 2001). On peut citer l'inhibition antisens ou co-suppression, décrites par exemple dans les Brevets US 5190065 et US 5283323. Il est également possible d'utiliser des ribozymes ciblant l'ARNm de la protéine FANON.
De préférence, l'extinction du gène FANON est induite par interférence ARN ciblant ledit gène.
Différentes méthodes de mutagénèse et de criblage à
haut débit sont décrites dans l'art antérieur. A titre d'exemples, on peut citer des méthodes de type TILLING
(Targeting Induced Local Lesions In Genome), décrit par McCALLUM et al., Plant Physiol., 123, 439-442, 2000).
L'absence de fonctionnalité de FANON chez les mutants peut être vérifiée sur la base des caractéristiques phénotypiques de leur descendance ; les plantes homozygotes pour une mutation inactivant le gène FANON ont un taux de COs méiotiques supérieur à celui des plantes sauvages (ne portant pas la mutation dans le gène FANON) dont elles sont issues.
Généralement ce taux de COs méiotiques est au moins 2 fois supérieur, de préférence au moins 3 fois supérieur à celui des plantes sauvages dont elles sont issues.
Les plantes mutantes contenant une mutation dans le gène FANCM qui induit l'inhibition de la protéine FANON font également partie de l'objet de la présente invention, à
l'exception des plantes de l'espèce Arabidopsis thaliana chez lesquelles ladite mutation est une insertion d'ADN-T dans ledit gène. Cette mutation peut être par exemple une délétion de tout ou partie de la séquence codante ou du promoteur de FANON, ou bien une mutation ponctuelle de cette séquence codante ou de ce promoteur.
Avantageusement, l'inhibition de la protéine FANON
est obtenue par extinction (silencing) du gène FANON.
Différentes techniques d'extinction de gènes dans les plantes sont connues en elles-mêmes (pour revue voir par exemple :
WATSON & GRIERSON, Transgenic Plants : Fundamentals and Applications (Hiatt, A, ed) New York : Marcel Dekker, 255-281, 1992 ; CHICAS & MACINO, EMBO reports, 21, 992-996, 2001). On peut citer l'inhibition antisens ou co-suppression, décrites par exemple dans les Brevets US 5190065 et US 5283323. Il est également possible d'utiliser des ribozymes ciblant l'ARNm de la protéine FANON.
De préférence, l'extinction du gène FANON est induite par interférence ARN ciblant ledit gène.
8 Un ARN interférent (ARNi) est un petit ARN qui peut éteindre un gène cible de manière séquence spécifique. Les ARN
interférents comprennent en particulier les petits ARN
interférents (siRNA) et les micro-ARN (miRNA).
Initialement, les constructions d'ADN pour exprimer des ARN interférents dans les plantes contenaient un fragment de 300 pb ou plus (généralement de 300 à 800 pb) de l'ADNc du gène ciblé, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié. Actuellement, les constructions les plus largement utilisées sont celles qui peuvent produire un transcrit d'ARN
en épingle à cheveux (hpRNA). Dans ces constructions, le fragment du gène cible est inversement répété, avec généralement une région d'espacement entre les répétitions (pour revue, cf. WATSON et al., FEBS Letters, 579, 5982-5987, 2005). On peut également utiliser des micro-ARN artificiels (amiRNAs) dirigés contre le gène FANCM (OSSOWSKI et al., The Plant Journal, 53, 674-690, 2008 ; SCHWAB et al., Methods Mol Biol., 592, 71-88, 2010 ; WEI et al., Funct Integr Genomics.,
interférents comprennent en particulier les petits ARN
interférents (siRNA) et les micro-ARN (miRNA).
Initialement, les constructions d'ADN pour exprimer des ARN interférents dans les plantes contenaient un fragment de 300 pb ou plus (généralement de 300 à 800 pb) de l'ADNc du gène ciblé, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié. Actuellement, les constructions les plus largement utilisées sont celles qui peuvent produire un transcrit d'ARN
en épingle à cheveux (hpRNA). Dans ces constructions, le fragment du gène cible est inversement répété, avec généralement une région d'espacement entre les répétitions (pour revue, cf. WATSON et al., FEBS Letters, 579, 5982-5987, 2005). On peut également utiliser des micro-ARN artificiels (amiRNAs) dirigés contre le gène FANCM (OSSOWSKI et al., The Plant Journal, 53, 674-690, 2008 ; SCHWAB et al., Methods Mol Biol., 592, 71-88, 2010 ; WEI et al., Funct Integr Genomics.,
9, 499-511, 2009).
La présente invention a pour objet des constructions d'ADN recombinant, et notamment des cassettes d'expression, produisant un ARNi permettant d'éteindre le gène FANCM.
Une cassette d'expression conforme à l'invention comprend une séquence d'ADN recombinant dont le transcrit est un ARNi, notamment un hpRNA ou un amiRNA, ciblant le gène FANCM, placée sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur fonctionnel dans une cellule végétale.
Un large choix de promoteurs appropriés pour l'expression de gènes hétérologues dans des cellules végétales ou des plantes est disponible dans l'art.
Ces promoteurs peuvent être obtenus par exemple à
partir de plantes, de virus de plantes, ou de bactéries comme Agrobacterium. Ils incluent des promoteurs constitutifs, à
savoir des promoteurs qui sont actifs dans la plupart des tissus et cellules et dans la plupart des conditions environnementales, ainsi que des promoteurs tissu-spécifiques ou cellule spécifiques, qui sont actifs uniquement ou principalement dans certains tissus ou certains types de cellules, et des promoteurs inductibles qui sont activés par des stimuli physiques ou chimiques.
Des exemples de promoteurs constitutifs qui sont couramment utilisés dans les cellules végétales sont le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) décrit par KAY et al. (Science, 236, 4805, 1987), ou ses dérivés, le promoteur du virus de la mosaïque des nervures de manioc (CsVMV) décrit dans la Demande Internationale WO 97/48819, le promoteur de l'ubiquitine du maïs ou le promoteur Actine-Intron-actine du riz (McELROY et al., Mol. Gen. Genet., 231, 150-160, 1991 ; GenBank numéro d'accès S 44221).
Dans le cadre de la présente invention on pourra aussi utiliser un promoteur spécifique de la méiose (c'est-à-dire actif exclusivement ou préférentiellement dans les cellules en méiose). A titre d'exemple non limitatif on peut citer le promoteur DM01 (KLIMYUK & JONES, Plant J., 11, 1-14, 1997).
Les cassettes d'expression de l'invention comprennent généralement un terminateur transcriptionnel, par exemple le terminateur 3'NOS de la nopaline synthase (DEPICKER
et al., J. Mol. Appl. Genet., 1, 561-573, 1982), ou le terminateur 3'CaMV (FRANCK et al., Oeil, 21, 285-294, 1980).
Elles peuvent également comprendre d'autres éléments de régulation de la transcription tels que des amplificateurs.
Les constructions d'ADN recombinant conformes à
l'invention englobent également des vecteurs recombinants contenant une cassette d'expression conforme à l'invention.
Ces vecteurs recombinants peuvent également inclure un ou plusieurs gènes marqueurs, qui permettent la sélection des cellules ou plantes transformées.
Le choix du vecteur le plus approprié dépend notamment de l'hôte prévu et de la méthode envisagée pour la transformation de l'hôte en question. De nombreuses méthodes pour la transformation génétique de cellules végétales ou de plantes sont disponibles dans l'art, pour de nombreuses espèces végétales, dicotylédones ou monocotylédones. A titre d'exemples non-limitatifs, on peut citer la transformation médiée par virus, la transformation par microinjection, par électroporation, la transformation par microprojectiles, la transformation par Agrobacterium, etc.
L'invention a également pour objet une cellule-hôte comprenant une construction d'ADN recombinant conforme à
l'invention. Ladite cellule-hôte peut être une cellule procaryote, par exemple une cellule d'Agrobacterium, ou une cellule eucaryote, par exemple une cellule végétale
La présente invention a pour objet des constructions d'ADN recombinant, et notamment des cassettes d'expression, produisant un ARNi permettant d'éteindre le gène FANCM.
Une cassette d'expression conforme à l'invention comprend une séquence d'ADN recombinant dont le transcrit est un ARNi, notamment un hpRNA ou un amiRNA, ciblant le gène FANCM, placée sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur fonctionnel dans une cellule végétale.
Un large choix de promoteurs appropriés pour l'expression de gènes hétérologues dans des cellules végétales ou des plantes est disponible dans l'art.
Ces promoteurs peuvent être obtenus par exemple à
partir de plantes, de virus de plantes, ou de bactéries comme Agrobacterium. Ils incluent des promoteurs constitutifs, à
savoir des promoteurs qui sont actifs dans la plupart des tissus et cellules et dans la plupart des conditions environnementales, ainsi que des promoteurs tissu-spécifiques ou cellule spécifiques, qui sont actifs uniquement ou principalement dans certains tissus ou certains types de cellules, et des promoteurs inductibles qui sont activés par des stimuli physiques ou chimiques.
Des exemples de promoteurs constitutifs qui sont couramment utilisés dans les cellules végétales sont le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) décrit par KAY et al. (Science, 236, 4805, 1987), ou ses dérivés, le promoteur du virus de la mosaïque des nervures de manioc (CsVMV) décrit dans la Demande Internationale WO 97/48819, le promoteur de l'ubiquitine du maïs ou le promoteur Actine-Intron-actine du riz (McELROY et al., Mol. Gen. Genet., 231, 150-160, 1991 ; GenBank numéro d'accès S 44221).
Dans le cadre de la présente invention on pourra aussi utiliser un promoteur spécifique de la méiose (c'est-à-dire actif exclusivement ou préférentiellement dans les cellules en méiose). A titre d'exemple non limitatif on peut citer le promoteur DM01 (KLIMYUK & JONES, Plant J., 11, 1-14, 1997).
Les cassettes d'expression de l'invention comprennent généralement un terminateur transcriptionnel, par exemple le terminateur 3'NOS de la nopaline synthase (DEPICKER
et al., J. Mol. Appl. Genet., 1, 561-573, 1982), ou le terminateur 3'CaMV (FRANCK et al., Oeil, 21, 285-294, 1980).
Elles peuvent également comprendre d'autres éléments de régulation de la transcription tels que des amplificateurs.
Les constructions d'ADN recombinant conformes à
l'invention englobent également des vecteurs recombinants contenant une cassette d'expression conforme à l'invention.
Ces vecteurs recombinants peuvent également inclure un ou plusieurs gènes marqueurs, qui permettent la sélection des cellules ou plantes transformées.
Le choix du vecteur le plus approprié dépend notamment de l'hôte prévu et de la méthode envisagée pour la transformation de l'hôte en question. De nombreuses méthodes pour la transformation génétique de cellules végétales ou de plantes sont disponibles dans l'art, pour de nombreuses espèces végétales, dicotylédones ou monocotylédones. A titre d'exemples non-limitatifs, on peut citer la transformation médiée par virus, la transformation par microinjection, par électroporation, la transformation par microprojectiles, la transformation par Agrobacterium, etc.
L'invention a également pour objet une cellule-hôte comprenant une construction d'ADN recombinant conforme à
l'invention. Ladite cellule-hôte peut être une cellule procaryote, par exemple une cellule d'Agrobacterium, ou une cellule eucaryote, par exemple une cellule végétale
10 génétiquement transformés par une construction d'ADN de l'invention. La construction peut être exprimée transitoirement, elle peut aussi être incorporée dans un réplicon extrachromosomique stable, ou intégrée dans le chromosome.
L'invention fournit également un procédé pour produire une plante transgénique ayant un taux de COs méiotiques supérieur à celui de la plante sauvage dont elle est issue, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- la transformation d'une cellule végétale avec un vecteur contenant une cassette d'expression conforme à
l'invention ;
- la culture de ladite cellule transformée afin de régénérer une plante ayant dans son génome un transgène contenant ladite cassette d'expression.
L'invention englobe également des plantes génétiquement transformées par une construction d'ADN de l'invention. De préférence, lesdites plantes sont des plantes transgéniques, dans laquelle ladite construction est contenue dans un transgène intégré dans le génome de la plante, de sorte qu'il est transmis aux générations successives de plantes. L'expression de la construction d'ADN de l'invention résulte en une régulation négative de l'expression du gène FANCM, qui confère auxdites plantes transgéniques un taux de COs méiotiques supérieur à celui des plantes sauvages (ne contenant pas la construction d'ADN de l'invention) dont elles sont issues. Généralement ce taux de COs méiotiques est au
L'invention fournit également un procédé pour produire une plante transgénique ayant un taux de COs méiotiques supérieur à celui de la plante sauvage dont elle est issue, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- la transformation d'une cellule végétale avec un vecteur contenant une cassette d'expression conforme à
l'invention ;
- la culture de ladite cellule transformée afin de régénérer une plante ayant dans son génome un transgène contenant ladite cassette d'expression.
L'invention englobe également des plantes génétiquement transformées par une construction d'ADN de l'invention. De préférence, lesdites plantes sont des plantes transgéniques, dans laquelle ladite construction est contenue dans un transgène intégré dans le génome de la plante, de sorte qu'il est transmis aux générations successives de plantes. L'expression de la construction d'ADN de l'invention résulte en une régulation négative de l'expression du gène FANCM, qui confère auxdites plantes transgéniques un taux de COs méiotiques supérieur à celui des plantes sauvages (ne contenant pas la construction d'ADN de l'invention) dont elles sont issues. Généralement ce taux de COs méiotiques est au
11 moins 2 fois supérieur, de préférence au moins 3 fois supérieur à celui des plantes sauvages dont elles sont issues.
La présente invention peut s'appliquer notamment dans le domaine de l'amélioration des plantes, afin d'accélérer l'obtention de nouvelles variétés. Elle permet aussi de faciliter le croisement entre espèces apparentées, et donc l'introgression de caractères d'intérêt. Elle permet également d'accélérer l'établissement de cartes génétiques et les clonages positionnels.
La présente invention s'applique à un large éventail de plantes d'intérêt agronomique monocotylédones ou dicotylédones. A titre d'exemples non-limitatifs, on peut citer le colza, le tournesol, la pomme de terre, le maïs, le blé, l'orge, le seigle, le sorgo, le riz, le haricot, la carotte, la tomate, la courgette, le poivron, l'aubergine, le navet, l'oignon, le pois, le concombre, le poireau, l'artichaut, la betterave, le choux, le chou-fleur, les salades, l'endive, le melon, la pastèque, le fraisier, le pommier, le poirier, le prunier, le peuplier, la vigne, le coton, la rose, la tulipe, etc.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à
des exemples non-limitatifs illustrant les effets de mutations du gène AtFANCM sur la recombinaison méiotique et le taux de COs.
EXEMPLE 1 : OBTENTION DE MUTANTS SUPPRESSEURS DE MUTATIONS DE
GENES ZMM
Des graines d'Arabidgpsis thaliana homozygotes pour l'insertion d'ADN-T dans ZIP4, SHOC1, ou MSH5 (Atzip4-/-, Atmsh5-/- ou Atshocl-/-) ont été mutées par ENS (éthylméthane sulfonate). Les plantes issues des graines mutées (population Ml, hétérozygotes pour les mutations induites par l'EMS, et homozygotes pour la mutation du gène ZMM) ont un phénotype identique, résultant de l'inactivation du gène ZMM, qui se traduit par une diminution forte de la fréquence de CO et une baisse très importante de la fertilité (plantes semi stériles ), résultant en la formation de siliques courtes qui se différencient facilement de celles des plantes sauvages.
La présente invention peut s'appliquer notamment dans le domaine de l'amélioration des plantes, afin d'accélérer l'obtention de nouvelles variétés. Elle permet aussi de faciliter le croisement entre espèces apparentées, et donc l'introgression de caractères d'intérêt. Elle permet également d'accélérer l'établissement de cartes génétiques et les clonages positionnels.
La présente invention s'applique à un large éventail de plantes d'intérêt agronomique monocotylédones ou dicotylédones. A titre d'exemples non-limitatifs, on peut citer le colza, le tournesol, la pomme de terre, le maïs, le blé, l'orge, le seigle, le sorgo, le riz, le haricot, la carotte, la tomate, la courgette, le poivron, l'aubergine, le navet, l'oignon, le pois, le concombre, le poireau, l'artichaut, la betterave, le choux, le chou-fleur, les salades, l'endive, le melon, la pastèque, le fraisier, le pommier, le poirier, le prunier, le peuplier, la vigne, le coton, la rose, la tulipe, etc.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à
des exemples non-limitatifs illustrant les effets de mutations du gène AtFANCM sur la recombinaison méiotique et le taux de COs.
EXEMPLE 1 : OBTENTION DE MUTANTS SUPPRESSEURS DE MUTATIONS DE
GENES ZMM
Des graines d'Arabidgpsis thaliana homozygotes pour l'insertion d'ADN-T dans ZIP4, SHOC1, ou MSH5 (Atzip4-/-, Atmsh5-/- ou Atshocl-/-) ont été mutées par ENS (éthylméthane sulfonate). Les plantes issues des graines mutées (population Ml, hétérozygotes pour les mutations induites par l'EMS, et homozygotes pour la mutation du gène ZMM) ont un phénotype identique, résultant de l'inactivation du gène ZMM, qui se traduit par une diminution forte de la fréquence de CO et une baisse très importante de la fertilité (plantes semi stériles ), résultant en la formation de siliques courtes qui se différencient facilement de celles des plantes sauvages.
12 Les plantes M1 ont été auto-pollinisées, pour produire une population de descendants (population M2) contenant potentiellement des plantes homozygotes pour les mutations induites par l'EMS. Des plantes de la population M2 ayant une silique plus longue que celle des plantes zmm homozygotes de la génération M1 ont été sélectionnées et génotypées afin de vérifier leur statut homozygote pour l'insertion d'ADN-T dans le gène ZMM concerné. La ségrégation de leurs chromosomes au cours de la méiose a été comparée avec celle de plantes sauvages et de plantes zmm homozygotes non-mutées à l'EMS.
Les résultats sont illustrés par la Figure 1.
Légende de la Figure 1 : Le haut de la figure montre la longueur des siliques des différentes plantes comparées. Les encadrés en bas de la figure illustrent la ségrégation des chromosomes lors de la métaphase I. A :
ZMM/SUPPRESSOR : plante sauvage ; B : zmm/SUPPRESSOR : plante homozygote pour la mutation zmm et sauvage pour la mutation à
l'EMS ; C : zmm/suppressor : plante homozygote pour la mutation zmm et pour la mutation induite par l'EMS ; D :
ZMM/suppressor : plante ne portant pas la mutation zmm et homozygote pour la mutation induite par l'EMS.
Dans les plantes zmm/SUPPRESSOR, on observe une mauvaise ségrégation des chromosomes qui résulte d'une diminution de la formation des CO et donc des bivalents, induite par la mutation zmm, et qui conduit à des gamètes déséquilibrés, non-viables. Au contraire, dans les plantes zmm/suppressor et ZNA/suppressor comme dans les plantes sauvages, on observe une ségrégation des chromosomes normale, identique à celle des plantes sauvages, et conduisant à la formation de gamètes équilibrés.
La fertilité des plantes ZNAlsuppressor est identique à celle des plantes sauvages. Elles ne présentent par ailleurs pas de différences phénotypiques visibles avec les plantes sauvages. Les mutations induites par l'EMS sont récessives. En effet, elles ne se traduisent pas par un phénotype détectable à l'état hétérozygote dans la population de mutants Ml, et les plantes résultant du rétrocroisement des mutants zmm/suppressor avec les mutants zmm initiaux dont ils
Les résultats sont illustrés par la Figure 1.
Légende de la Figure 1 : Le haut de la figure montre la longueur des siliques des différentes plantes comparées. Les encadrés en bas de la figure illustrent la ségrégation des chromosomes lors de la métaphase I. A :
ZMM/SUPPRESSOR : plante sauvage ; B : zmm/SUPPRESSOR : plante homozygote pour la mutation zmm et sauvage pour la mutation à
l'EMS ; C : zmm/suppressor : plante homozygote pour la mutation zmm et pour la mutation induite par l'EMS ; D :
ZMM/suppressor : plante ne portant pas la mutation zmm et homozygote pour la mutation induite par l'EMS.
Dans les plantes zmm/SUPPRESSOR, on observe une mauvaise ségrégation des chromosomes qui résulte d'une diminution de la formation des CO et donc des bivalents, induite par la mutation zmm, et qui conduit à des gamètes déséquilibrés, non-viables. Au contraire, dans les plantes zmm/suppressor et ZNA/suppressor comme dans les plantes sauvages, on observe une ségrégation des chromosomes normale, identique à celle des plantes sauvages, et conduisant à la formation de gamètes équilibrés.
La fertilité des plantes ZNAlsuppressor est identique à celle des plantes sauvages. Elles ne présentent par ailleurs pas de différences phénotypiques visibles avec les plantes sauvages. Les mutations induites par l'EMS sont récessives. En effet, elles ne se traduisent pas par un phénotype détectable à l'état hétérozygote dans la population de mutants Ml, et les plantes résultant du rétrocroisement des mutants zmm/suppressor avec les mutants zmm initiaux dont ils
13 sont respectivement issus, ont un phénotype qui ne diffère pas de celui des mutants initiaux. Par ailleurs, la ségrégation des phénotypes fertile et semi-stérile chez les descendants issus de l'auto-pollinisation des plantes résultant du rétrocroisement des mutants zmm/suppressor avec les mutants zmm initiaux dont ils sont respectivement issus indique qu'un seul locus est concerné par la mutation.
EXEMPLE 2 : LOCALISATION DES MUTATIONS DANS LE GENE FANCM
Parmi les mutants EMS décrits à l'Exemple 1 ci-dessus, cinq lignées de mutants suppresseurs de mutation du gène ZIP4, 3 lignées de mutants suppresseurs de la mutation du gène SHOC1, et une lignée de mutants suppresseurs de la mutation du gène MSH5 ont été isolées. Ces lignées sont respectivement dénommées : zip4(s)1), zip4(s)3, zip4(s)6, zip4(s)7, zip4(s)8, shocl(s)8, shocl(s)14, shoc1(s)38, et msh5(s)59.
Les mutations correspondantes ont toutes été
localisées dans un même gène (At1g35530), homologue du gène FANCM (Fanconi Anemia Complementation Group M). Des tests de complémentation ont confirmé que ces mutations étaient bien responsables du phénotype observé.
Le Tableau I ci-dessous indique la nature et la position des mutations identifiées.
Tableau I
Noms de l'allèle Effet de la mutation / position par rapport à la protéine FANCM
zip4(s)1 fancm-1 Substitution G510D
zip4(s)3 fancm-2 Mutation du site accepteur d'épissage de l'exon 17 zip4(s)6 fancm-3 Mutation du site accepteur d'épissage de l'exon 13 /
zip4(s)7 fancm-4 Substitution E586K
zip4(s)8 fancm-5 Substitution G138R
shoc1(s)8 fancm-6 Substitution S535F
shoc1(s)14 fancm-7 Mutation du site accepteur d'épissage de l'exon 2 msh5(s)59 fancm-8 Substitution G402E
EXEMPLE 3 : INFLUENCE DE L'INACTIVATION DU GENE FACNCM SUR LA
FREQUENCE DE RECOMBINAISON MEIOTIQUE
La fréquence de recombinaison méiotique chez des plantes FANCM/ZIP4 (plantes sauvages), FANCM/zip4 (homozygotes pour la mutation zip4 et non-mutées dans FANCM), fancm-1/ZIP4 (homozygotes pour la mutation fancm-1 et non-mutées dans ZIP4)
EXEMPLE 2 : LOCALISATION DES MUTATIONS DANS LE GENE FANCM
Parmi les mutants EMS décrits à l'Exemple 1 ci-dessus, cinq lignées de mutants suppresseurs de mutation du gène ZIP4, 3 lignées de mutants suppresseurs de la mutation du gène SHOC1, et une lignée de mutants suppresseurs de la mutation du gène MSH5 ont été isolées. Ces lignées sont respectivement dénommées : zip4(s)1), zip4(s)3, zip4(s)6, zip4(s)7, zip4(s)8, shocl(s)8, shocl(s)14, shoc1(s)38, et msh5(s)59.
Les mutations correspondantes ont toutes été
localisées dans un même gène (At1g35530), homologue du gène FANCM (Fanconi Anemia Complementation Group M). Des tests de complémentation ont confirmé que ces mutations étaient bien responsables du phénotype observé.
Le Tableau I ci-dessous indique la nature et la position des mutations identifiées.
Tableau I
Noms de l'allèle Effet de la mutation / position par rapport à la protéine FANCM
zip4(s)1 fancm-1 Substitution G510D
zip4(s)3 fancm-2 Mutation du site accepteur d'épissage de l'exon 17 zip4(s)6 fancm-3 Mutation du site accepteur d'épissage de l'exon 13 /
zip4(s)7 fancm-4 Substitution E586K
zip4(s)8 fancm-5 Substitution G138R
shoc1(s)8 fancm-6 Substitution S535F
shoc1(s)14 fancm-7 Mutation du site accepteur d'épissage de l'exon 2 msh5(s)59 fancm-8 Substitution G402E
EXEMPLE 3 : INFLUENCE DE L'INACTIVATION DU GENE FACNCM SUR LA
FREQUENCE DE RECOMBINAISON MEIOTIQUE
La fréquence de recombinaison méiotique chez des plantes FANCM/ZIP4 (plantes sauvages), FANCM/zip4 (homozygotes pour la mutation zip4 et non-mutées dans FANCM), fancm-1/ZIP4 (homozygotes pour la mutation fancm-1 et non-mutées dans ZIP4)
14 et fancm-1/zip4 (homozygotes pour les 2 mutations zip4 et fancm-1, a été comparée.
La fréquence de recombinaison méiotique a été
mesurée par analyse de tétrades à l'aide de marqueurs fluorescents, comme décrit par BERCHOWITZ & COPENHAVER (Nat.
Protoc., 3, 41-50, 2008).) La distance génétique dans 2 intervalles adjacents sur le chromosome 5 (I5c et I5d) a été mesurée chez des plantes FANCM/ZIP4, FANCM/zip4, fancm-1/zip4 ou fancm-1/ZIP4.
Les résultats sont illustrés par la Figure 2.
Légende de la Figure 2 :
Axe des abscisses : génotype des plantes testées ;
Le nombre de tétrades testées pour chaque génotype est indiqué
entre parenthèses.
Axe des ordonnées : distance génétique (en cM).
En noir : distance génétique mesurée pour l'intervalle I5c ; en gris clair : distance génétique mesurée pour l'intervalle I5d.
I5c et I5d mesurent respectivement 6,19 cM et 5,65 cM chez les plantes FANCM/ZIP4 et seulement 2,98 cM et 1,86 cM
chez les plantes FANCM/zip4. En revanche la distance génétique est très fortement augmentée dans les plantes fancm/zip4 (18,45 cM et 14,57 cM pour I5c et I5d respectivement) et encore plus dans le cas de fancm/ZI24 (respectivement 21,06 cM
et 17,20 cM pour I5c et I5d).
Dans une autre série d'expérimentations, la distance génétique a été mesurée sur un plus grand nombre d'intervalles adjacents, situés sur le chromosome 1 (Ilb et Ilc), le chromosome 2 (I2a et I2b), le chromosome 3 (I3b et I3c), et le chromosome 5 (I5c et I5d). Les résultats sont illustrés par la Figure 3.
Légende de la Figure 3 :
ri= FANCM/ZIP4 LI= : FANCM/zip4 = fancm-1/zip4 e : fancm-1/ZIP4 Axe des abscisses : intervalle testé.
Axe des ordonnées : distance génétique (en cM).
La recombinaison est réduite d'un facteur de 2 à 3 chez le mutant FANCM/zip4 comparé au type sauvage. Chez fancm-1/zip4 les distances génétiques sont augmentées d'un facteur 5 de 1,9 à 3,1 par rapport au type sauvage (P < 10-5). Ceci confirme que la mutation de FANCM non seulement restaure la formation de COs en l'absence de ZIP4, mais augment également la fréquence des COs bien au-delà de celle observée chez les plantes sauvages Chez fancm-1/ZIP4), la recombinaison est 10 augmentée encore plus que chez fancm-1/zip4, en moyenne de 12%
(P < 0.05 dans 3 intervalles individuels sur 6). Ainsi, si l'on compare le mutant fancm-1 au type sauvage, la distance génétique est augmentée d'un facteur de 2 à 3.6 (P < 10-8) sur les 8 intervalles testés, ce qui souligne l'importance de
La fréquence de recombinaison méiotique a été
mesurée par analyse de tétrades à l'aide de marqueurs fluorescents, comme décrit par BERCHOWITZ & COPENHAVER (Nat.
Protoc., 3, 41-50, 2008).) La distance génétique dans 2 intervalles adjacents sur le chromosome 5 (I5c et I5d) a été mesurée chez des plantes FANCM/ZIP4, FANCM/zip4, fancm-1/zip4 ou fancm-1/ZIP4.
Les résultats sont illustrés par la Figure 2.
Légende de la Figure 2 :
Axe des abscisses : génotype des plantes testées ;
Le nombre de tétrades testées pour chaque génotype est indiqué
entre parenthèses.
Axe des ordonnées : distance génétique (en cM).
En noir : distance génétique mesurée pour l'intervalle I5c ; en gris clair : distance génétique mesurée pour l'intervalle I5d.
I5c et I5d mesurent respectivement 6,19 cM et 5,65 cM chez les plantes FANCM/ZIP4 et seulement 2,98 cM et 1,86 cM
chez les plantes FANCM/zip4. En revanche la distance génétique est très fortement augmentée dans les plantes fancm/zip4 (18,45 cM et 14,57 cM pour I5c et I5d respectivement) et encore plus dans le cas de fancm/ZI24 (respectivement 21,06 cM
et 17,20 cM pour I5c et I5d).
Dans une autre série d'expérimentations, la distance génétique a été mesurée sur un plus grand nombre d'intervalles adjacents, situés sur le chromosome 1 (Ilb et Ilc), le chromosome 2 (I2a et I2b), le chromosome 3 (I3b et I3c), et le chromosome 5 (I5c et I5d). Les résultats sont illustrés par la Figure 3.
Légende de la Figure 3 :
ri= FANCM/ZIP4 LI= : FANCM/zip4 = fancm-1/zip4 e : fancm-1/ZIP4 Axe des abscisses : intervalle testé.
Axe des ordonnées : distance génétique (en cM).
La recombinaison est réduite d'un facteur de 2 à 3 chez le mutant FANCM/zip4 comparé au type sauvage. Chez fancm-1/zip4 les distances génétiques sont augmentées d'un facteur 5 de 1,9 à 3,1 par rapport au type sauvage (P < 10-5). Ceci confirme que la mutation de FANCM non seulement restaure la formation de COs en l'absence de ZIP4, mais augment également la fréquence des COs bien au-delà de celle observée chez les plantes sauvages Chez fancm-1/ZIP4), la recombinaison est 10 augmentée encore plus que chez fancm-1/zip4, en moyenne de 12%
(P < 0.05 dans 3 intervalles individuels sur 6). Ainsi, si l'on compare le mutant fancm-1 au type sauvage, la distance génétique est augmentée d'un facteur de 2 à 3.6 (P < 10-8) sur les 8 intervalles testés, ce qui souligne l'importance de
15 FANCM dans la limitation de la fréquence des COs.
Claims (11)
1) Procédé pour augmenter la fréquence des COs méiotiques chez une plante, caractérisé en ce qu'il comprend l'inhibition dans ladite plante, d'une protéine ci-après dénommée FANCM, ladite protéine contenant un domaine hélicase DEXDc (cd00046) et un domaine hélicase HELICc (cd00079), et ayant au moins 30% d'identité de séquence, ou au moins 45% de similarité de séquence avec la protéine AtFANCM de séquence SEQ ID NO: 1.
2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le domaine hélicase DEXDc de ladite protéine FANCM a au moins 65% d'identité de séquence, ou au moins 75% de similarité de séquence avec le domaine DEXDc de la protéine AtFANCM (acides aminés 129-272 de la SEQ ID NO: 1).
3) Procédé selon une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le domaine hélicase HELICc de ladite protéine FANCM a au moins 60% d'identité de séquence, ou au moins 70% de similarité de séquence avec le domaine HELICc de la protéine AtFANCM (acides aminés 445-570 de la SEQ
ID NO: 1).
ID NO: 1).
4) Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'inhibition de la protéine FANCM
est obtenue par mutagenèse du gène FANCM ou de son promoteur.
est obtenue par mutagenèse du gène FANCM ou de son promoteur.
5) Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'inhibition de la protéine FANCM
est obtenue par extinction du gène FANCM en exprimant dans ladite plante un ARN interférent ciblant ledit gène.
est obtenue par extinction du gène FANCM en exprimant dans ladite plante un ARN interférent ciblant ledit gène.
6) Cassette d'expression, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence d'ADN recombinant dont le transcrit est un ARN interférent ciblant le gène FANCM placée sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur fonctionnel dans une cellule végétale.
7) Cassette d'expression selon la revendication 6, caractérisée en ce que ledit ARN interférent est choisi parmi :
- un hpRNA ciblant le gène FANCM;
- un amiRNA ciblant le gène FANCM;
- un hpRNA ciblant le gène FANCM;
- un amiRNA ciblant le gène FANCM;
8) Vecteur recombinant contenant une cassette d'expression selon une quelconque des revendications 6 ou 7.
9) Cellule-hôte contenant une cassette d'expression selon une quelconque des revendications 6 ou 7.
10) Plante mutante caractérisée en ce qu'elle contient une mutation dans le gène FANCM, ladite mutation induisant l'inhibition de la protéine FANCM dans ladite plante à l'exception d'une plante de l'espèce Arabidopsis thaliana chez laquelle ladite mutation est une insertion d'ADN-T dans ledit gène.
11) Plante transgénique contenant un transgène comprenant une cassette d'expression selon une quelconque des revendications 6 ou 7.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR1158262A FR2980212A1 (fr) | 2011-09-16 | 2011-09-16 | Augmentation de la recombinaison meiotique chez les plantes par inhibition de la proteine fancm |
| FR1158262 | 2011-09-16 | ||
| PCT/IB2012/054813 WO2013038376A1 (fr) | 2011-09-16 | 2012-09-14 | Augmentation de la recombinaison meiotique chez les plantes par inhibition de la proteine fancm |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CA2848976A1 true CA2848976A1 (fr) | 2013-03-21 |
Family
ID=47080756
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CA2848976A Abandoned CA2848976A1 (fr) | 2011-09-16 | 2012-09-14 | Augmentation de la recombinaison meiotique chez les plantes par inhibition de la proteine fancm |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20140289902A1 (fr) |
| EP (1) | EP2755995A1 (fr) |
| AU (1) | AU2012310107B2 (fr) |
| BR (1) | BR112014005969A8 (fr) |
| CA (1) | CA2848976A1 (fr) |
| FR (1) | FR2980212A1 (fr) |
| IL (1) | IL231471A0 (fr) |
| WO (1) | WO2013038376A1 (fr) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR3008107B1 (fr) | 2013-07-03 | 2015-08-07 | Agronomique Inst Nat Rech | Augmentation de la recombinaison meiotique chez les plantes par inhibition de la proteine fidg |
| FR3021668B1 (fr) | 2014-05-30 | 2018-11-16 | Institut National De La Recherche Agronomique | Augmentation de la recombinaison meiotique chez les plantes par inhibition d'une proteine recq4 ou top3a du complexe rtr |
| WO2017062581A1 (fr) | 2015-10-06 | 2017-04-13 | Proteostasis Therapeutics, Inc. | Composés, compositions et méthodes permettant de moduler le cftr |
| WO2019010091A1 (fr) * | 2017-07-06 | 2019-01-10 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Procédés et compositions destinés à faciliter la recombinaison homologue |
| US10425561B2 (en) * | 2017-09-08 | 2019-09-24 | Apple Inc. | Portable electronic device |
| CN115011609B (zh) * | 2022-06-06 | 2024-03-19 | 江苏大学 | BnaFANCM基因、应用及获得油菜雄性不育突变体的方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5283323A (en) | 1985-08-07 | 1994-02-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method of producing immune response |
| US5190065A (en) | 1991-11-29 | 1993-03-02 | International Business Machines Corporation | Self-contained washing unit for printed circuit boards |
| WO1997048819A1 (fr) | 1996-06-20 | 1997-12-24 | The Scripps Research Institute | Promoteurs du virus de la mosaique des nervures du manioc et leurs utilisations |
| AUPQ901500A0 (en) | 2000-07-27 | 2000-08-17 | Rhobio | Composition and method for increased meiotic recombination in plants |
| US8716022B2 (en) | 2000-11-17 | 2014-05-06 | Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food | Modulation of meiotic recombination |
| JP4347689B2 (ja) * | 2001-08-23 | 2009-10-21 | ライク・ズワーン・ザードテールト・アン・ザードハンデル・ベスローテン・フェンノートシャップ | 逆育種 |
| CA2488668C (fr) | 2002-06-06 | 2013-02-26 | Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food | Modification de recombinaison et de reparation d'adn |
| US7273758B2 (en) | 2002-07-19 | 2007-09-25 | Centre National De La Recherche Scientifique | Methods for inducing targeted stimulation of meiotic recombination and kits for performing said methods |
-
2011
- 2011-09-16 FR FR1158262A patent/FR2980212A1/fr active Pending
-
2012
- 2012-09-14 BR BR112014005969A patent/BR112014005969A8/pt not_active IP Right Cessation
- 2012-09-14 WO PCT/IB2012/054813 patent/WO2013038376A1/fr not_active Ceased
- 2012-09-14 EP EP12778802.4A patent/EP2755995A1/fr not_active Withdrawn
- 2012-09-14 AU AU2012310107A patent/AU2012310107B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2012-09-14 CA CA2848976A patent/CA2848976A1/fr not_active Abandoned
- 2012-09-14 US US14/343,838 patent/US20140289902A1/en not_active Abandoned
-
2014
- 2014-03-12 IL IL231471A patent/IL231471A0/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR112014005969A2 (pt) | 2017-06-13 |
| WO2013038376A1 (fr) | 2013-03-21 |
| US20140289902A1 (en) | 2014-09-25 |
| AU2012310107B2 (en) | 2017-08-31 |
| IL231471A0 (en) | 2014-04-30 |
| AU2012310107A1 (en) | 2014-04-10 |
| BR112014005969A8 (pt) | 2017-09-12 |
| EP2755995A1 (fr) | 2014-07-23 |
| FR2980212A1 (fr) | 2013-03-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US12006506B2 (en) | Methods and compositions for obtaining useful plant traits | |
| CN103796508B (zh) | 具有有用性状的植物和相关方法 | |
| CN109402141B (zh) | 小麦雄性不育基因wms及其花药特异性启动子的应用 | |
| EP2755995A1 (fr) | Augmentation de la recombinaison meiotique chez les plantes par inhibition de la proteine fancm | |
| BR112019019977A2 (pt) | métodos para aumentar o rendimento de grãos | |
| Kamau et al. | A mutation in GIANT CHLOROPLAST encoding a PARC6 homolog affects spikelet fertility in rice | |
| WO2007030014A2 (fr) | Recombinaison homologue dans les plantes | |
| EP3149027B1 (fr) | Augmentation de la recombinaison méiotique chez les plantes par inhibition d'une protéine recq4 ou top3a du complexe rtr | |
| JP2012223137A (ja) | デンプン顆粒結合型デンプン合成酵素をコードする核酸、プライマー対、抑制剤およびモチ性ソバ属植物 | |
| EP3016506B1 (fr) | Augmentation de la recombinaison méiotique chez les plantes par inhibition de la protéine fidg | |
| Van Minnebruggen et al. | The ang3 mutation identified the ribosomal protein gene RPL5B with a role in cell expansion during organ growth | |
| CN105087597A (zh) | 使植物的生物量增产的基因及其利用方法 | |
| Ahmadli et al. | High temperature increases centromere-mediated genome elimination frequency in Arabidopsis deficient in cenH3 or its assembly factor KNL2 | |
| US10364438B1 (en) | Methods and compositions for obtaining useful plant traits | |
| EP2547772A1 (fr) | Methode pour modifier la date de floraison d'une plante | |
| JP2023526035A (ja) | 標的突然変異生成によって変異体植物を得るための方法 | |
| FR2816320A1 (fr) | Utilisation d'un acide nucleique pour conferer a une plante une resistance a l'agression par un pathogene, et plante transformee avec un tel acide nucleique | |
| CN105368870A (zh) | 具有高水稻种子生产力的新水稻品种及其制备方法 | |
| WO2011025007A1 (fr) | Gène associé à la tacheture foliaire pourpre du sorgho et son utilisation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FZDE | Discontinued |
Effective date: 20180914 |