CA2880867A1 - Souches mutantes de neospora et leurs utilisations - Google Patents

Souches mutantes de neospora et leurs utilisations Download PDF

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Abstract

La présente invention concerne une souche mutante de Neospora spp, dans laquelle la fonction de la protéine NcMIC3 et/ou la fonction de la protéine NcMIC1, est supprimée et leurs utilisations dans une composition pharmaceutique ou dans une composition vaccinale.

Description

SOUCHES MUTANTES DE NEOSPORA ET LEURS UTILISATIONS
La présente invention concerne une souche mutante de Neospora spp, son utilisation dans une composition pharmaceutique et son utilisation dans une composition vaccinale.
Neospora caninum est un parasite intracellulaire, responsable de la néosporose.
Il appartient au phylum des Apicomplexes (embranchement des Apicomplexa) qui regroupe un grand nombre de parasites majoritairement intracellulaires. Ces parasites sont responsables de maladies telles que la néosporose, la toxoplasmose, le paludisme, la coccidiose et la cryptosporidiose. Ils ont en commun un processus spécifique d'invasion de cellules hôtes en plusieurs étapes conduisant à la formation d'une vacuole parasitophore dans laquelle le parasite se développe.
Le cycle de vie de Neospora caninum présente deux phases distinctes : une phase asexuée chez un hôte intermédiaire tel que la souris, les ovins et les bovins qui conduit à la production de tachyzoïtes puis de kystes contenant les bradyzoïtes, et une phase sexuée chez l'hôte définitif (principalement le chien) qui conduit à la production d'oocystes, contenant des sporozoïtes, éliminés dans les fèces.
La néosporose animale pose un problème économique important dans le domaine de l'élevage agricole et notamment dans les élevages bovins où elle provoque une diminution de la prise de poids des veaux, une diminution de la fertilité, une diminution de la production laitière mais est surtout reconnue comme étant l'une des causes majeures d'avortements. Ainsi, chaque année dans le Monde, 30 à 40 millions d'avortements sont provoqués par Neospora caninum dans les cheptels bovins.
Contrairement à Toxoplasma gondii, la transmission materno-foetale du parasite et l'infection congénitale du foetus interviennent non seulement en cas de primo-infection au cours de la gestation mais également chez les vaches infectées de manière chronique préalablement à la gestation.
La contamination des bovins peut se faire selon deux voies bien disctinctes :
= Par contamination horizontale c'est-à-dire par ingestion d'aliments contaminés par des oocystes excrétés par un hôte définitif. En cas de gestation, le risque d'avortement est alors de 80%.
= Par contamination verticale c'est-à-dire par transmission materno-foetale du parasite de la mère à ses veaux. Une vache infectée préalablement à la
2 gestation, peut au cours des gestations suivantes, soit de nouveau avorter, soit donner naissance à un veau sain, soit, le plus souvent, transmettre le parasite à son veau. Ce veau sera infecté par Neospora caninum et si, il s'agit d'une femelle, elle aura, à son tour, un risque élevé de transmettre le parasite à sa descendance avec possibilité d'avortement.
Ces conséquences ont bien évidemment des répercussions économiques importantes pour les élevages. Ainsi, la néosporose est responsable d'une perte de 35 Me pour 1,2 million de vaches laitières en Californie (Dubey, J. Am. Vet. Med.
Assoc., 1999, Apr 15; 214(8):1160-3), de 19 Me pour 1,6 million de vaches aux Pays-Bas (Bartels et al., Vet. Parasitol., 2006, Apr 15; 137(1-2):17-27) et de 10 Me pour 0,7 million de vaches en Suisse (Hâsler et al., Prev. Vet. Med., 2006, Dec 18;77(3-4):230-53).
Le développement d'un vaccin constitue un objectif majeur pour lutter contre la néosporose. Plusieurs stratégies pour construire un vaccin contre la néosporose sont actuellement à l'étude :
= Les vaccins basés sur des parasites inactivés par irradiation, par chaleur, etc...
Ces vaccins génèrent une réponse immunitaire protectrice mais nécessitent généralement la présence d'adjuvants et également de nombreux rappels de vaccination. Actuellement, un seul vaccin dirigé contre la néosporose bovine est commercialisé dans certaines zones géographiques et notamment aux Etats-Unis.
Il s'agit du vaccin NeoGuard commercialisé par la société Intervet. Ce vaccin est constitué de tachyzoïtes inactivés de Neospora caninum et d'un adjuvant particulier (Havlogene). L'efficacité du vaccin NeoGuard , d'environ 50%, est considérée comme partielle. Par ailleurs, le mode d'administration de ce vaccin nécessite deux injections à quelques semaines d'intervalle lors de la première année de vaccination puis une à deux injections les années suivantes.
= Les vaccins basés sur des parasites vivants atténués ; ces souches sont généralement obtenues soit in vitro par passages successifs du parasite en culture dans des cellules hôtes en présence ou non d'agents mutagènes, soit par l'isolement dans la nature de souches moins virulentes, soit par d'autres procédés tels que l'irradiation. Ces vaccins sont généralement très efficaces mais présentent l'inconvénient majeur de ne pas être caractérisés sur le plan moléculaire et des retours vers une forme virulente sont toujours à craindre. Plusieurs isolats tels que Nc-Nowra (Miller et al., Aust. Vet. J., 2002, Oct; 80(10):620-5) et Nc-Spain-
3 (Regidor-Cerrillo et al., Parasitology, 2008, Dec; 135(14):1651-9) ont été
isolés à
partir de veaux infectés de manière asymptomatique. Le potentiel vaccinal de ces souches atténuées est en cours d'évaluation.
= Les vaccins recombinants : un virus de la vaccine exprimant l'antigène NcSRS2 de N. caninum a été évalué dans des expériences de vaccination chez la souris (Nishikawa et al., Parasitol. Res., 2000, Nov;86(11):934-9 ; Nishikawa et al., Vaccine, 2001, Jan 8; 19(11-12):1381-90) et a démontré sa capacité à induire une réponse immunitaire protectrice chez la souris. Plus récemment, une souche de Brucella abortus a été utilisée pour exprimer différents antigènes de N.
caninum (Ramamoorthy et al., Int. J. Parasitol., 2007, Nov;37(13):1531-8 and Ramamoorthy et al., Int J Parasitol., 2007 Nov;37(13):1521-9). Les souches exprimant la protéine NcMIC1 ou la protéine NcGRA6 protègent efficacement les souris d'une infection à N. caninum mais soulèvent la problématique de l'utilisation d'une souche pathogène chez le bovin.
= Les vaccins sub-unitaires composés de protéines issues des parasites capables d'induire une réponse immunitaire protectrice. Ces vaccins nécessitent généralement la présence non seulement d'adjuvants mais également de nombreux rappels de vaccination et sont généralement moins efficaces en terme de réponse immune induite chez l'individu vacciné. Plusieurs essais de vaccination ont été entrepris avec différentes protéines antigéniques. Ainsi, l'inoculation de la protéine NcSRS2 à des souris bloque la transmission materno-foetale (Haldorson et al., Int. J. Parasitol., 2005, Nov;35(13):1407-15) et associée à l'adjuvant de Freund, induit une réponse immunitaire proche de la réponse immunitaire induite par l'inoculation de tachyzoïtes N. caninum vivants (Staska et al., Infect. Immun., 2005, Mar;73(3):1321-9). Des essais de vaccination ont également été entrepris chez la souris avec la protéine NcMIC1 ou NcMIC3 et ont démontré une prévention des infections cérébrales après un challenge infectieux (Cannas et al., J. Parasitol., 2003, Feb;89(1):44-50 ; Allaedine et al., J. Parasitol., 2005, Jun;91(3):657-65). Il a aussi été démontré que des anticorps de souris immunisées avec la protéine Nc-AMA1 réduisaient significativement l'infection cellulaire de N. caninum.
4 Malgré des conséquences économiques fortes dans les élevages bovins, aucun vaccin efficace, sûr et d'utilisation simple n'est actuellement commercialisé
ou en phase de développement. Il existe, en conséquence, un réel besoin de mettre à
disposition un vaccin à la fois efficace contre la néosporose, facile à utiliser et présentant une excellente innocuité.
De manière surprenante, les inventeurs ont trouvé que la suppression de la fonction de la protéine NcMIC3 seule, ou la suppression de la fonction des deux protéines NcMIC3 et NcMIC1, dans une souche de Neospora caninum, conduit à une souche mutante qui possède des propriétés infectieuses et immunogènes conférant aux mammifères une protection vaccinale vis-à-vis des effets délétères de la néosporose.
La présente invention a donc pour objet une souche mutante de Neospora spp dans laquelle la fonction de la protéine NcMIC3 et/ou la fonction de la protéine NcMIC1, est supprimée.
La présente invention a donc également pour objet une souche mutante de Neospora spp dans laquelle la fonction de la protéine NcMIC3 est supprimée, notamment par une inhibition de l'expression du gène ncmic3, et/ou la fonction de la protéine NcMIC1 est supprimée, notamment par une inhibition de l'expression du gène ncmicl .
La présente invention a donc pour objet une souche mutante de Neospora spp dans laquelle la fonction de la protéine NcMIC3 est supprimée.
La présente invention a donc pour objet une souche mutante de Neospora spp dans laquelle la fonction de la protéine NcMIC1 est supprimée.
La présente invention a donc pour objet une souche mutante de Neospora spp dans laquelle la fonction de la protéine NcMIC3 et, éventuellement, la fonction de la protéine NcMIC1, est supprimée.
La présente invention a donc pour objet une souche mutante de Neospora spp dans laquelle la fonction de la protéine NcMIC3 est supprimée, notamment par une inhibition de l'expression du gène ncmic3, et éventuellement la fonction de la protéine NcMIC1 est supprimée, notamment par une inhibition de l'expression du gène ncmicl .

Les protéines sont les effecteurs de l'activité cellulaire. La suppression de la fonction d'une protéine peut résulter de son absence de biosynthèse ou de sa non fonctionnalité. L'origine de ce dysfonctionnement peut être liée à des perturbations
5 survenant lors de la transcription du gène codant la protéine, lors de sa traduction ou encore survenir lors de processus de maturation de la protéine (modifications post-traductionelles). La délétion du gène explique également qu'aucune protéine ne puisse être synthétisée.
Les protéines NcMIC1 et NcMIC3 sont des protéines des micronèmes, organelles sécrétoires des Apicomplexes qui jouent un rôle central dans la reconnaissance et l'adhésion aux cellules hôtes. Chez Neospora caninum, la protéine NcMIC1 est une protéine de 460 acides aminés codée par le gène ncmicl qui comporte 4 exons.
La séquence polypeptidique de NcMIC1 contient un peptide signal de 20 acides aminés suivi par deux régions de répétition (48 acides aminés et 44 acides aminés) en tandem (Keller et al., Infect Immun. 2002 Jun;70(6):3187-98).
La protéine NcMIC3 de Neospora caninum est codée par le gène ncmic3 qui comporte un seul exon. Cette protéine possède 362 acides aminés.
Les Inventeurs ont construit une souche mutante de Neospora caninum appelée Neo ncmicl-3 KO, dans laquelle la fonction de la protéine NcMIC1 et la fonction de la protéine NcMIC3 ont été supprimées, une souche mutante Neo ncmic3 KO, dans laquelle seule la fonction de la protéine NcMIC3 a été supprimée et, une souche mutante Neo ncmicl KO, dans laquelle seule la fonction de la protéine NcMIC1 a été
supprimée.
Ces trois souches mutantes de Neospora caninum sont le premier exemple de souches vivantes atténuées de Neospora caninum obtenues par la délétion ciblée et contrôlée de gènes de virulence ou par la suppression ciblée et contrôlée des fonctions de protéines de virulence.
Dans la présente invention, on entend par la fonction de la protéine NcMIC1 est supprimée , soit l'absence de l'expression de la protéine NcMIC1, soit l'expression d'une protéine NcMIC1 non fonctionnelle, par exemple l'expression d'une protéine ne possédant pas la fonction de la protéine NcMIC1 et ayant une certaine identité de séquence en acides aminés avec celle de la protéine NcMIC1.
6 On entend par la fonction de la protéine NcMIC3 est supprimée , soit l'absence de l'expression de NcMIC3, soit l'expression d'une protéine NcMIC3 non fonctionnelle, par exemple une protéine ne possédant pas la fonction de la protéine NcMIC3 et ayant une certaine identité de séquence en acides aminés avec celle de la protéine NcMIC3.
L'absence de l'expression de la protéine NcMIC1 ou de la protéine NcMIC3 peut résulter de la délétion de la totalité du gène ncmicl ou ncmic3, ou de sa région codante, ou d'une mutation, d'une délétion ou d'une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans la région codante du gène ncmicl ou ncmic3 entrainant l'absence d'expression des protéines ou des protéines avec peu d'identité de séquence en acides aminés avec les protéines NcMIC1 ou NcMIC3, ou d'un dysfonctionnement de la région promotrice ou de la région régulatrice en cis ou en trans du gène ncmicl ou ncmic3, ou d'un dysfonctionnement d'un ou plusieurs facteurs de transcription susceptibles de se lier à ladite région promotrice, ou d'un dysfonctionnement de la traduction de l'ARN
messager, ou de quelques modifications épigénétiques bien connues de l'homme de l'art.
Ainsi, on entend par inhibition de l'expression du gène ncmicl ou ncmic3 , tous les mécanismes qui perturbent la transcription du gène ncmicl ou ncmic3 en un ARN
messager ou tous les mécanismes qui perturbent la traduction des ARN messager en protéines NcMIC1 ou NcMIC3, ces deux étapes étant nécessaires à la synthèse d'une protéine NcMIC1 ou NcMIC3 fonctionnelle.
Une protéine NcMIC1 non fonctionnelle ou une protéine NcMIC3 non fonctionnelle est une protéine qui ne possède pas la capacité de reconnaître les cellules hôtes ou qui ne permet pas l'adhésion du parasite audites cellules hôtes. Une protéine non fonctionnelle peut résulter d'une mutation, d'une délétion ou d'une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans la région codante du gène ncmicl ou ncmic3. Dans ce cas de figure, la modification de l'acide nucléique de la région codante ne bloque pas le mécanisme d'expression de la protéine qui peut éventuellement conserver une certaine identité de séquence en acides aminés avec celle de la protéine NcMIC1 ou celle de la protéine NcMIC3, mais change le cadre de lecture de PARNm correspondant lors de la traduction de la protéine. La non fonctionnalité de la protéine NcMIC3, ou de la protéine NcMIC1, peut également être la conséquence de modifications post-traductionnelles
7 inopérantes ou insuffisantes (i.e. glycosylation, isoprénylation, phosphorylation, sulfatation, amidation, acétylation, alkylation, etc) et qui lui permettaient d'assurer sa fonction.
La fonction de la protéine NcMIC3, ou de la protéine NcMIC1, peut également être supprimée de manière indirecte, notamment en altérant ou en supprimant l'expression d'une ou plusieurs autres protéines (notamment d'autres adhésines) qui se lient à la protéine NcMIC3, ou à la protéine NcMIC1, pour former un complexe fonctionnel. La déstructuration d'un tel complexe entraine une perte de fonction de la protéine NcMIC3, ou de la protéine NcMIC1.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une souche mutante de Neospora dans laquelle seule la fonction de la protéine NcMIC3 est supprimée.
Les Inventeurs ont constaté que la suppression de la fonction de la protéine NcMIC3 seule chez Neospora caninum permet de réduire significativement la virulence in vivo du parasite. Néanmoins, la double suppression de la fonction de la protéine NcMIC3 et de la fonction de la protéine NcMIC1 chez Neospora caninum accentue encore davantage l'atténuation de la virulence du parasite.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une souche mutante de Neospora spp dans laquelle la fonction de la protéine NcMIC3 et la fonction de la protéine NcMIC1 sont supprimées.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une souche mutante de Neospora spp dans laquelle à la fois la fonction de la protéine NcMIC3 et la fonction de la protéine NcMIC1 sont supprimées par une inhibition de l'expression des deux gènes ncmic3 et ncmicl .
La fonction de la protéine NcMIC3 de la souche mutante de Neospora spp peut être supprimée par :
8 - une mutation, une délétion ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans la séquence nucléotidique du gène ncmic3 ou dans une séquence nucléotidique qui conditionne l'expression de la protéine NcMIC3, ou - une déstabilisation de l'ARN messager résultant de la transcription du gène ncmic3, ou - une inhibition de la traduction de l'ARN messager du gène ncmic3 ou d'une séquence nucléotidique qui conditionne l'expression de la protéine NcMIC3.
La fonction de la protéine NcMIC1 de la souche mutante de Neospora spp peut être supprimée par:
- une mutation, une délétion ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans la séquence nucléotidique du gène ncmicl ou dans une séquence nucléotidique qui conditionne l'expression de la protéine NcMIC1, ou - une déstabilisation de l'ARN messager résultant de la transcription du gène ncmicl, ou - une inhibition de la traduction de l'ARN messager du gène ncmicl ou d'une séquence nucléotidique qui conditionne l'expression de la protéine NcMIC1.
Par mutation d'un ou plusieurs nucléotides , on entend la substitution, permutation ou le remplacement d'un ou plusieurs nucléotides d'une séquence nucléotidique par un ou plusieurs nucléotides non présents dans la séquence sauvage. Par séquence sauvage, on désigne la séquence nucléotidique trouvée à l'état naturel dans la souche sauvage du parasite. La séquence sauvage est par définition dépourvue de toute intervention humaine par le biais du génie génétique. Dans la présente invention, la souche sauvage de référence de N. caninum est la souche NC1.
Par délétion d'un ou plusieurs nucléotides , on entend la suppression d'un ou plusieurs nucléotides d'une séquence nucléotidique.
Par insertion d'un ou plusieurs nucléotides , on entend l'addition, l'ajout ou l'intégration d'un ou plusieurs nucléotides dans une séquence nucléotidique.
La mutation, la délétion ou l'insertion d'un ou plusieurs nucléotides peut avoir lieu à l'intérieur d'un ou plusieurs exons du gène correspondant et modifier par conséquent la région codante dudit gène, ou bien avoir lieu à l'intérieur d'un ou plusieurs introns et modifier le site d'épissage d'un intron concerné. Cette modification du site
9 d'épissage change par conséquent le cadre de lecture de l'ARNm et aboutit à la traduction d'une nouvelle protéine dont la séquence en acides aminés diffère de la séquence de la protéine dite sauvage.
Par déstabilisation de l'ARN messager , on entend une diminution de sa durée de demi-vie, c'est-à-dire de la période de temps pendant laquelle un ARN
messager est disponible pour permettre sa traduction en une protéine. La stabilisation des ARN messagers est assurée par des éléments cis (les séquences 5' et 3' UTR
bordant les séquences codantes d'un gène) et des éléments trans, notamment des protéines capables de se lier aux éléments cis. La durée de demi-vie d'un ARN messager peut varier en réponse à divers stimuli tels que des facteurs environnementaux, des facteurs de croissance ou des hormones. Une modification, réalisée in vitro par génie génétique, des séquences nucléotidiques des éléments cis est susceptible de modifier la durée de demi-vie de l'ARN messager.
Par inhibition de la traduction de l'ARN messager d'un gène , on entend le blocage de la traduction de l'ARN messager en la protéine lui correspondant.
Dans ce cas de figure, l'ARN messager d'un gène est présent dans la cellule, alors que la protéine lui correspondant est absente. L'inhibition de la traduction de l'ARN messager d'un gène peut résulter du dysfonctionnement d'un élément de la machinerie traductionnelle, notamment des ribosomes, des ARNs ribosomiques (ARNr) ou des ARNs de transfert (ARNt), ou des aminoacyl-ARNt synthétases.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une souche mutante de Neospora spp, dans laquelle :
- la fonction de la protéine NcMIC3 est supprimée par une mutation, une délétion ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans la séquence nucléotidique du gène ncmic3, ou - la fonction de la protéine NcMIC1 est supprimée par une mutation, une délétion ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans la séquence nucléotidique du gène ncmicl .
Dans un mode de réalisation plus particulier, l'invention concerne une souche mutante de Neospora spp, dans laquelle :

- la fonction de la protéine NcMIC3 est supprimée par une mutation, une délétion ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans la séquence nucléotidique du gène ncmic3, et éventuellement - la fonction de la protéine NcMIC1 est supprimée par une mutation, une délétion ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans la séquence nucléotidique du gène ncmicl.
Une telle mutation, délétion ou insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans la séquence nucléotidique du gène ncmic3 ou du gène ncmicl peut conduire à
l'absence d'expression de la protéine NcMIC3 ou NcMIC1, ou à la production d'une protéine non
10 fonctionnelle ayant ou non une certaine identité de séquence d'acides aminés avec celle de la protéine NcMIC3 ou NcMIC1.
Plus particulièrement, l'invention concerne une souche mutante de Neospora spp, dans laquelle à la fois la fonction de la protéine NcMIC3 et la fonction de la protéine NcMIC1 sont supprimées par une mutation, une délétion ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans les séquences nucléotidiques des gènes ncmic3 et ncmicl.
Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne une souche mutante de Neospora spp, dans laquelle :
- la fonction de la protéine NcMIC3 est supprimée par la délétion de tout ou partie du gène ncmic3 ou de sa région promotrice, ou - la fonction de la protéine NcMIC1 est supprimée par la délétion de tout ou partie du gène ncmicl ou de sa région promotrice.
Dans un autre mode de réalisation plus particulier, l'invention concerne une souche mutante de Neospora spp, dans laquelle :
- la fonction de la protéine NcMIC3 est supprimée par la délétion de tout ou partie du gène ncmic3 ou de sa région promotrice, et éventuellement - la fonction de la protéine NcMIC1 est supprimée par la délétion de tout ou partie du gène ncmicl ou de sa région promotrice.
On entend par délétion du gène , la suppression du gène entier c'est-à-dire les introns et les exons, ou de la région codante entière du gène c'est-à-dire uniquement les exons. On entend par région promotrice , la séquence nucléotidique située en amont
11 de la région 5' UTR transcrite non traduite qui sert de boitier de régulation de l'expression d'un gène.
Plus particulièrement, l'invention concerne une souche mutante de Neospora spp, dans laquelle la fonction de la protéine NcMIC3 est supprimée par la délétion de tout ou partie du gène ncmic3 ou de sa région promotrice et la fonction de la protéine NcMIC1 est supprimée par la délétion de tout ou partie du gène ncmicl ou de sa région promotrice.
Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne une souche mutante de Neospora spp, dans laquelle :
- la fonction de la protéine NcMIC3 est supprimée par une mutation, une délétion ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans une séquence nucléotidique qui conditionne l'expression de la protéine NcMIC3, ou - la fonction de la protéine NcMIC1 est supprimée par une mutation, une délétion ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans une séquence nucléotidique qui conditionne l'expression de la protéine NcMIC1.
Dans un autre mode de réalisation plus particulier, l'invention concerne une souche mutante de Neospora spp, dans laquelle :
- la fonction de la protéine NcMIC3 est supprimée par une mutation, une délétion ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans une séquence nucléotidique qui conditionne l'expression de la protéine NcMIC3, et éventuellement - la fonction de la protéine NcMIC1 est supprimée par une mutation, une délétion ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans une séquence nucléotidique qui conditionne l'expression de la protéine NcMIC1.
Plus particulièrement, l'invention concerne une souche mutante de Neospora spp, dans laquelle - la fonction de la protéine NcMIC3 est supprimée par une mutation, une délétion ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans une séquence nucléotidique qui conditionne l'expression de la protéine NcMIC3, et - la fonction de la protéine NcMIC1 est supprimée par une mutation, une délétion ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans une séquence nucléotidique qui conditionne l'expression de la protéine NcMIC1.
12 Dans un mode de réalisation particulier, la souche mutante de Neospora spp selon la présente invention est une souche mutante de Neospora caninum.
La présente invention a également pour objectif de mettre à disposition une composition pharmaceutique comprenant une souche mutante de Neospora dans laquelle la fonction de la protéine NcMIC3, et/ou la fonction de la protéine NcMIC1, est supprimée.
La présente invention a également pour objectif de mettre à disposition une composition pharmaceutique comprenant une souche mutante de Neospora dans laquelle la fonction de la protéine NcMIC3, et éventuellement la fonction de la protéine NcMIC1, est supprimée.
Ladite composition pharmaceutique comprenant une souche mutante telle que décrite ci-dessus et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Plus particulièrement, une telle composition pharmaceutique est administrée en une dose unitaire variant de 102 à 109 tachyzoïtes d'une souche mutante de Neospora spp.
Plus particulièrement, une telle composition pharmaceutique est administrée en une dose unitaire variant de 102 à 109 tachyzoïtes de la souche Neo ncmic1-3 KO.
Encore plus particulièrement, une telle composition pharmaceutique est administrée en une dose unitaire variant de 103 à 108, notamment de 104 à 107, notamment de 105 à 106 tachyzoïtes de la souche Neo ncmic1-3 KO.
Encore plus particulièrement, une telle composition pharmaceutique est administrée en une dose unitaire variant de 102 à 108, notamment de 102 à 107, notamment de 102 à 106, notamment de 102 à 105, notamment de 102 à 104, notamment de 102 à 103 tachyzoïtes de la souche Neo ncmic1-3 KO.
Encore plus particulièrement, une telle composition pharmaceutique est administrée en une dose unitaire de 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, ou de 109 tachyzoïtes de la souche Neo ncmic1-3 KO.
13 Dans un mode de réalisation plus particulier, la première administration peut être suivie de rappels ultérieurs possibles, selon les doses unitaires indiquées précédemment.
Par ailleurs, la présente invention a pour objectif de fournir une composition vaccinale comprenant une souche mutante Neospora spp selon la présente invention et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Une telle composition pharmaceutique ou composition vaccinale peut être administrée par voie parentérale (intraveineuse, sous-cutanée, intradermique, intramusculaire, et intrapéritonéale) ou par voie entérale.
Le choix d'un véhicule pharmaceutique acceptable contenu dans une telle composition pharmaceutique ou composition vaccinale peut être fait en fonction du mode d'administration envisagé sur la base des connaissances de l'homme du métier.
Une telle composition pharmaceutique ou vaccinale peut être utilisée pour le traitement de la néosporose de primo-infection, de réactivation ou de réinfection chez les animaux de compagnie, tels que les chiens et les chevaux, et les animaux de rentes, tels que les ovins, les caprins, les bovins, les porcins, les camélidés et les cervidés.
Plus particulièrement, une telle composition pharmaceutique ou vaccinale peut être utilisée pour le traitement de la néosporose de primo-infection, de réactivation ou de réinfection chez les animaux de compagnie, tels que les chiens et les chevaux, et les animaux de rentes, tels que les ovins, les caprins, les bovins, les porcins, les camélidés et les cervidés et notamment pour prévenir la transmission materno-foetale du parasite afin de réduire le nombre d'avortements mais également le risque de contamination verticale des mères à leur descendance.
Encore plus particulièrement, une telle composition pharmaceutique ou vaccinale peut être utilisée pour le traitement de la néosporose de primo-infection, de réactivation ou de réinfection chez les animaux de compagnie, tels que les chiens et les chevaux, et les animaux de rentes, tels que les ovins, les caprins, les bovins, les porcins, les camélidés et les cervidés et notamment pour prévenir la transmission materno-foetale du parasite afin de réduire le nombre d'avortements mais également le risque de contamination verticale des mères à leur descendance en cas d'infection au cours de la
14 gestation (i.e. infection aigue) mais également préalablement à la gestation (i.e. infection chronique).
L'invention concerne également une méthode de diagnostic in vitro permettant de différencier les animaux vaccinés avec les souches mutantes Neo ncmicl KO, Neo ncmic3 KO, Neo ncmicl-3 KO et les animaux naturellement infectés par les souches sauvages de N. caninum. Ces tests diagnostic, dénommés DIVA, (Differentiating Infected from Vaccinated Animal) sont de plus en plus exigés par les instances réglementaires notamment à des fins de pharmacovigilance et d'études épidémiologiques mais également afin d'identifier les raisons éventuelles d'avortements survenus chez des animaux vaccinés.
La présente invention concerne également un procédé in vitro de diagnostic différentiel pour discriminer un mammifère vacciné par les compositions de l'invention d'un mammifère non vacciné, ledit procédé comprenant une étape de :
détermination de la concentration en anticorps anti-NcMIC1 et/ou anti-NcMIC3 et/ou anti-DHFR et/ou anti-CAT-GFP, et/ou, détermination de la concentration en antigène NcMIC1 et/ou NcMIC3 et/ou DHFR et/ou CAT-GFP, détermination du niveau d'expression des gènes ncmicl, ncmic3, dhfr et/ou cat-gfp, et/ou détermination de la présence ou de l'absence des gènes ncmicl, ncmic3, dhfr et/ou cat-gfp, dans un échantillon biologique du susdit mammifère.
La présente invention concerne également un procédé in vitro de diagnostic différentiel pour discriminer un mammifère vacciné par les compositions de l'invention d'un mammifère non vacciné, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :
i) détermination de la concentration en anticorps anti-NcMIC1 et/ou anti-NcMIC3 et/ou anti-DHFR et/ou anti-CAT-GFP, et/ou, détermination de la concentration en antigène NcMIC1 et/ou NcMIC3 et/ou DHFR et/ou CAT-GFP, ii) détermination du niveau d'expression des gènes ncmicl, ncmic3, dhfr et/ou cat-gfp, et/ou, détermination de la présence ou de l'absence des gènes ncmicl, ncmic3, dhfr et/ou cat-gfp, dans un échantillon biologique du susdit mammifère.
Selon un mode de réalisation particulier, le procédé de l'invention peut être mis 5 en oeuvre sur un échantillon biologique choisi parmi le groupe constitué par le sang et le sérum mais également certains tissus et organes tels que le placenta, le cerveau, les muscles, etc...
Les souches sauvages de Neospora caninum possèdent dans leur génome les gènes ncmicl et ncmic3 et expriment les protéines NcMIC1 et NcMIC3.
10 Les souches mutantes de Neospora caninum telles que définies selon la présente invention possèdent respectivement :
- le gène ncmicl et le gène de sélection dhfr pour la souche mutante Neo ncmic3 KO; le gène de sélection dhfr est inséré par recombinaison homologue en lieu et place du gène ncmic3 dans le génome de cette souche
15 mutante. La souche mutante Neo ncmic3 KO exprime les protéines NcMIC1 et DHFR et n'exprime pas la protéine NcMIC3, - le gène ncmic3 et le gène de sélection cat-gfp pour la souche mutante Neo ncmicl KO; le gène de sélection cat-gfp est inséré par recombinaison homologue en lieu et place du gène ncmicl dans le génome de cette souche mutante. La souche mutante Neo ncmicl KO exprime les protéines NcMIC3 et CAT-GFP et n'exprime pas la protéine NcMIC1, - les gènes de sélection dhfr et cat-gfp pour la souche mutante Neo ncmicl-3 KO; les gènes de sélection dhfr et cat-gfp sont insérés par recombinaison homologue en lieu et place respectivement du gène ncmic3 et ncmicl dans le génome de cette souche mutante. La souche mutante Neo ncmicl-3 KO
exprime les protéines DHFR et CAT-GFP et n'exprime pas les protéines NcMIC1 et NcMIC3.
Le diagnostic entre des animaux vaccinés par les souches mutantes de l'invention et des animaux infectés par des souches sauvages de N. caninum peut être indirect et basé
sur la détection et l'identification d'anticorps, ou direct et basé sur la détection de l'agent infectieux avec des technologies d'immunologie ou moléculaires.
16 La présente invention concerne également un procédé de mise en évidence, dans un échantillon biologique notamment choisi parmi le groupe constitué par le sang et le sérum issu d'un mammifère, d'un anticorps anti-NcMIC1 et/ou d'un anticorps anti-NcMIC3 et/ou d'un anticorps anti-DHFR et/ou d'un anticorps anti-CAT-GFP, ledit procédé comprenant l'étape suivante :
- détermination de la présence d'au moins un anticorps présent dans un échantillon biologique préalablement prélevé d'un mammifère par formation in vitro d'un complexe immun, ledit complexe immun étant constitué de la protéine NcMIC1 liée à l'anticorps anti-NcMIC1 ou de la protéine NcMIC3 liée à l'anticorps anti-NcMIC3 ou la protéine DHFR liée à l'anticorps anti-DHFR ou la protéine CAT-GFP liée à
l'anticorps anti-CAT-GFP, par comparaison avec un échantillon biologique de référence.
Par complexe immun , on désigne l'interaction physique entre un antigène et un anticorps spécifiquement dirigé contre cet antigène. Dans la présente invention, cette interaction est réalisée in vitro entre les protéines NcMIC1, NcMIC3, DHFR, CAT-GFP
et les anticorps spécifiquement dirigés contre chacune de ces protéines.
Par détection et l'identification d'anticorps on entend la détection d'anticorps spécifiques des antigènes recherchés et présents dans le sérum des individus.
La détection des anticorps est réalisée par des techniques d'ELISA indirect classique ou de compétition.
Les techniques d'ELISA indirect reposent sur l'utilisation d'antigènes fixés sur des supports solides. Le sérum des individus à diagnostiquer est déposé sur le support pour générer des interactions entre l'antigène fixé et les anticorps éventuellement présents dans le sérum des individus à diagnostiquer. Après lavage, l'interaction antigène-anticorps est mise en évidence en utilisant des anticorps secondaires marqués reconnaissant spécifiquement les anticorps conjugué anti-espèce. La mise en évidence d'anticorps dirigés contre les protéines DHFR et/ou CAT-GFP permettra de mettre en évidence une inoculation antérieure des souches mutantes à l'individu. Au contraire, la mise en évidence d'anticorps dirigés contre les protéines NcMIC1 et NcMIC3 mettra en évidence une contamination préalable de l'individu par une souche sauvage de N.
caninum.
L'ELISA de compétition repose sur la compétition entre les anticorps présents éventuellement dans le sérum de l'individu à diagnostiquer et des anticorps présents dans un sérum de détection. Les antigènes sont fixés sur des supports solides. Le sérum des
17 individus à diagnostiquer et le sérum de compétition sont déposés sur le support. La liaison spécifique de l'anticorps de détection est mise en évidence en utilisant un conjugué anti-espèce approprié et marqué. La présence éventuelle d'anticorps dans le sérum de l'individu à diagnostiquer génère une compétition avec les anticorps présents dans le sérum de détection et entraîne une diminution de la révélation.
L'ELISA indirect avec les protéines DHFR et/ou CAT-GFP permettra de mettre en évidence l'inoculation des souches mutantes de l'invention à l'animal. L'ELISA indirect avec les protéines NcMIC1 et NcMIC3 permettra de mettre en évidence la contamination de l'animal par une souche sauvage de N. caninum.
La présente invention concerne également un procédé de mise en évidence, dans un échantillon biologique notamment choisi parmi le groupe constitué par le sang et le sérum mais également certains tissus et organes tels que le placenta, le cerveau, les muscles, etc... issu d'un mammifère, de l'antigène NcMIC1 et/ou de l'antigène NcMIC3 et/ou de l'antigène DHFR et/ou de l'antigène CAT-GFP, ledit procédé comprenant l'étape suivante :
- détermination de la présence d'au moins un antigène dans un échantillon biologique préalablement prélevé d'un mammifère par formation in vitro d'un complexe immun, ledit complexe immun étant constitué de la protéine NcMIC1 liée à l'anticorps anti-NcMIC1 ou de la protéine NcMIC3 liée à
l'anticorps anti-NcMIC3 ou la protéine DHFR liée à l'anticorps anti-DHFR
ou la protéine CAT-GFP liée à l'anticorps anti-CAT-GFP, par comparaison avec un échantillon biologique référence.
Dans un mode de réalisation plus particulier, la présente invention concerne un procédé de mise en évidence des antigènes NcMIC1 et/ou NcMIC3 et/ou DHFR et/ou CAT-GFP et des anticorps anti-NcMIC1 et/ou anti-NcMIC3 et/ou anti-DHFR et/ou anti-CAT-GFP.
Par détection de l'agent infectieux avec des technologies d'immunologie on désigne l'ensemble des techniques permettant de détecter des protéines antigéniques spécifiques des souches sauvages de N. caninum (i.e. protéines NcMIC1 et NcMIC3) et des protéines spécifiques des souches mutantes de l'invention (i.e. protéines DHFR et/ou CAT-GFP).
18 La détection des protéines antigéniques peut résulter d' expériences d'immunohistochimie, d'immunotransfert, de méthode immuno-enzymatique avec capture d'antigène (ELISA), d'immunochromatographie ou de protéomique bien connues de l'homme de l'art. Ces essais peuvent être réalisés à partir de différents échantillons biologiques.
Par Immunohistochimie , on entend la détection d'antigènes dans des tissus fixés en utilisant des anticorps dirigés spécifiquement contre l'antigène et marqués.
L'immunohistochimie avec des anticorps spécifiques des protéines DHFR et/ou CAT-GFP permettra de mettre en évidence l'inoculation des souches mutantes de l'invention à
l'animal. L'immunohistochimie avec des anticorps spécifiques des protéines NcMIC1 et NcMIC3 permettra de mettre en évidence la contamination de l'animal par une souche sauvage de N. caninum.
Par Immunotransfert , on entend la détection d'antigènes dans des échantillons biologiques après séparation des protéines de l'échantillon par gel d'électrophorèse et révélation avec des anticorps dirigés spécifiquement contre l'antigène et marqués.
L'immunotransfert avec des anticorps spécifiques des protéines DHFR et/ou CAT-GFP
permettra de mettre en évidence l'inoculation des souches mutantes à l'animal.

L'immunotransfert avec des anticorps spécifiques des protéines NcMIC1 et NcMIC3 permettra de mettre en évidence la contamination de l'animal par une souche sauvage.
Par Méthode immuno-enzymatique avec capture d'antigène (ELISA) on désigne la détection d'antigènes par utilisation d'anticorps de capture dirigés spécifiquement contre l'antigène et fixé sur une plaque solide (ELISA indirect de type sandwich). L'antigène présent dans l'échantillon est capturé par l'anticorps spécifique puis sa présence est révélée par un deuxième anticorps marqué. L'ELISA avec des anticorps spécifiques des protéines DHFR et/ou CAT-GFP permettra de mettre en évidence l'inoculation des souches mutantes de l'invention à l'animal. L'ELISA
avec des anticorps spécifiques des protéines NcMIC1 et NcMIC3 permettra de mettre en évidence la contamination de l'animal par une souche sauvage de N. caninum.
Par Immunochromatographie on désigne une méthode pour la détection d'antigènes basée sur la purification de l'échantillon par chromatographie d'affinité
utilisant un anticorps spécifique de l'antigène marqué et fixé sur une colonne de chromatographie. L'immunochromatographie avec des anticorps spécifiques des protéines DHFR et/ou CAT-GFP permettra de mettre en évidence l'inoculation des
19 souches mutantes de l'invention à l'animal. L'immunochromatographie avec des anticorps spécifiques des protéines NcMIC1 et NcMIC3 permettra de mettre en évidence la contamination de l'animal par une souche sauvage de N. caninum.
Par détection de l'agent infectieux avec des technologies moléculaires on désigne les techniques de biologie moléculaire bien connues de l'homme de l'art pour identifier la présence de séquences nucléotidiques spécifiques des souches sauvages et des souches mutantes et notamment par réaction d'amplification en chaîne par polymérase (PCR), PCR en temps réel, par diagnostic par polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP) pouvant être lié aux méthodes PCR ou par diagnostic à l'aide de sondes nucléiques.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un oligonucléotide consistant en une séquence d'acide nucléique choisie dans le groupe comprenant SEQ ID
NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 ou leurs séquences complémentaires.
Nom de l'amorce Séquence 5' -> 3' n de séquence ATG Ncmicl ATGGGCCAGTCGGTGGTTTT SEQ ID
NO: 35 ATG Ncmic3 ATGCGTGGCGGGGCGTCCGC SEQ ID
NO: 36 ATG DHFR ATGCAGAAACCGGTGTGTC SEQ ID
NO: 37 ATG CATGFP
ATGCATGAGAAAAAAATCACTG SEQ ID NO: 38 stop Ncmicl TTACAATTCAGATTCACCCG SEQ ID
NO :39 stop Ncmic3 TTATCGAGCCGTTCCGCATTTG SEQ ID NO :40 stop DHFR
CTAGACAGCCATCTCCATCTG SEQ ID NO :41 stop CATGFP TTAATCGAGCGGGTCCTGGT SEQ ID
NO :42 Olig 1 CAGATGGAGATGGCTGTCTAG SEQ ID NO :43 Olig 2 CGCTTTCGTTCTGATTGACA SEQ ID
NO :44 Olig 3 AAAACCACCGACTGGCCCAT SEQ ID
NO :45 Olig 4 TCCTCTCGTTGTTGGAAGCT SEQ ID
NO :46 Olig 5 TAGCACGGGAAAGGATTGAC SEQ ID
NO :47 Olig 6 CAAGATCCGCCACAACATC SEQ ID
NO :48 NO: 49 Par oligonucléotide , on désigne une séquence d'acide nucléique qui peut être utilisée comme amorce dans un procédé d'amplification ou comme sonde dans un procédé de détection. Dans la présente invention, les oligonucléotides consistent en une séquence d'au moins 15, préférentiellement 20 nucléotides, et préférentiellement moins de 30 nucléotides, capable de s'hybrider à une molécule d'ADN génomique ou à
un ADN complémentaire. Par hybridation , on désigne l'interaction physique existante entre deux molécules d'acide nucléique. Cette hybridation peut impliquer des homoduplex ADN/ADN ou ARN/ARN ou des hétéroduplex ADN/ARN.
10 Par acide nucléique , on désigne une succession de nucléotides liés entre eux par des liaisons phosphodiester. Une molécule d'acide nucléique peut être linéaire, circulaire, simple brin, double brin, partiellement double brin. Les séquences d'acides nucléiques sont décrites dans la présente invention selon l'usage bien connu de l'homme de l'art, c'est-à-dire qu'elles sont définies par une séquence numérotée selon la direction 15 5' vers 3'.
Par séquences complémentaires , on désigne deux séquences nucléiques qui possèdent des nucléotides complémentaires pouvant interagir entre eux par des liaisons hydrogènes. En face d'une adénine, il y a toujours une thymine ou un uracile (dans le cas d'un hétéroduplex ADN/ARN); en face d'une cytosine, il y a toujours une guanine. A
20 titre d'exemple, et sans que cela ne restreigne la portée de l'invention, la séquence 5' ATCG 3' et la séquence 5' CGAT 3' sont complémentaires.
L'invention concerne également les couples d'oligonucléotides consistant en les couples de séquences choisis parmi :
- SEQ ID NO: 21 et SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 21 et SEQ ID NO: 28, SEQ
ID NO: 21 et SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 21 et SEQ ID NO: 46, - SEQ ID NO: 39 et SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 39 et SEQ ID NO: 28, SEQ
ID NO: 39 et SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39 et SEQ ID NO: 46, SEQ ID
NO: 39 et SEQ ID NO: 24, - SEQ ID NO: 27 et SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 27 et SEQ ID NO: 35, SEQ
ID NO: 27 et SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 27 et SEQ ID NO: 24, - SEQ ID NO: 45 et SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 45 et SEQ ID NO: 24, - SEQ ID NO: 47 et SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 et SEQ ID NO: 24,
21 - SEQ ID NO: 26 et SEQ ID NO: 24, - SEQ ID NO: 11 et SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 11 et SEQ ID NO: 8, SEQ
ID NO: 11 et SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 11 et SEQ ID NO: 6, - SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 8, SEQ ID
NO: 5 et SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 14, - SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO: 8, SEQ ID
NO: 7 et SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO: 14, - SEQ ID NO: 36 et SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 36 et SEQ ID NO: 40, SEQ
ID NO: 36 et SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 36 et SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:
36 et SEQ ID NO: 12, - SEQ ID NO: 15 et SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 15 et SEQ ID NO: 14, - SEQ ID NO: 11 et SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 11 et SEQ ID NO: 10, SEQ
ID NO: 11 et SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 11 et SEQ ID NO: 44, SEQ ID
NO: 11 et SEQ ID NO: 6, - SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 10, SEQ ID
NO: 5 et SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 14, - SEQ ID NO: 37 et SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 37 et SEQ ID NO: 41, SEQ
ID NO: 37 et SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 37 et SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:
37 et SEQ ID NO: 14, - SEQ ID NO: 9 et SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 9 et SEQ ID NO: 41, SEQ ID
NO: 9 et SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 9 et SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 et SEQ ID NO: 14, - SEQ ID NO: 43 et SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 43 et SEQ ID NO: 6, SEQ
ID NO: 43 et SEQ ID NO: 14, - SEQ ID NO: 16 et SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 16 et SEQ ID NO: 6, SEQ
ID NO: 16 et SEQ ID NO: 14, - SEQ ID NO: 21 et SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 21 et SEQ ID NO: 30, SEQ
ID NO: 21 et SEQ ID NO: 42, - SEQ ID NO: 38 et SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 38 et SEQ ID NO: 42, SEQ
ID NO: 38 et SEQ ID NO: 24,
22 - SEQ ID NO: 49 et SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 49 et SEQ ID NO: 42, SEQ
ID NO: 49 et SEQ ID NO: 24, - SEQ ID NO: 29 et SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 29 et SEQ ID NO: 42, SEQ
ID NO: 29 et SEQ ID NO: 24, - SEQ ID NO: 23 et SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 23 et SEQ ID NO: 42, SEQ
ID NO: 23 et SEQ ID NO: 24, - SEQ ID NO: 48 et SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 48 et SEQ ID NO: 42, SEQ
ID NO: 48 et SEQ ID NO: 24, ou leurs séquences complémentaires.
Par couple d'oligonuclétides , on désigne deux nucléotides tels que définis par leurs séquences.
Un autre but de l'invention est de proposer des sets d'oligonucléotides consistant en les triades de séquences choisis parmi :
- SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO: 12 et SEQ ID NO: 36, - SEQ ID NO: 43 et SEQ ID NO: 44 et SEQ ID NO: 16, - SEQ ID NO: 45 et SEQ ID NO: 46 et SEQ ID NO: 47, - SEQ ID NO: 23 et SEQ ID NO: 30 et SEQ ID NO: 48, ou leurs séquences complémentaires.
Pour chaque triade, les 2 premières SEQ ID correspondent aux amorces et la troisième correspond à la séquence de la sonde.
Par sets d'oligonucléotides , on entend des groupes de trois oligonucléotides tels que définis par leurs séquences respectives.
Les souches sauvages de Neospora caninum possèdent dans leur génome les gènes ncmicl et ncmic3.
L'analyse, dans un échantillon biologique de la présence et/ou du niveau d'expression des quatre gènes ncmicl, ncmic3, dhfr, cat-gfp permet de déterminer si l'animal est porteur d'une souche de Neospora caninum résultant d'une infection par une souche sauvage ou bien résultant d'une vaccination par l'une des trois souches mutantes telles que décrites dans la présente invention. Le but est de pouvoir établir un diagnostic
23 différentiel permettant de discriminer, au sein d'un troupeau, les animaux vaccinés des animaux non vaccinés et/ou infectés.
L'invention concerne également l'utilisation d'au moins un oligonucléotide consistant en une séquence d'acide nucléique choisie dans le groupe comprenant SEQ ID
NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 ou leurs séquences complémentaires, pour la détection de gènes ncmicl, et/ou ncmic3, et/ou dhfr, et/ou cat-gfp provenant du génome de souches sauvages et/ou des souches mutantes Neo ncmicl KO et/ou Neo ncmic3 KO et/ou Neo ncmicl-3 KO
de Neospora caninum.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation d'au moins un oligonucléotide consistant en la séquence choisie parmi SEQ ID NO:
21, SEQ
ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID
NO: 35, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 ou leur séquence complémentaire, comme amorce pour réaliser une hybridation et éventuellement une amplification du gène ncmicl provenant du génome de souches sauvages et/ou de la souche mutante Neo ncmic3 KO de Neospora caninum.
Dans un mode de réalisation plus particulier, l'invention concerne l'utilisation d'oligonucléotides consistant en au moins un couple de séquences choisi parmi : SEQ ID
NO: 21 et SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 21 et SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 21 et SEQ
ID NO: 35, SEQ ID NO: 21 et SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 39 et SEQ ID NO: 25, SEQ

ID NO: 39 et SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 39 et SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39 et SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 39 et SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27 et SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 27 et SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 27 et SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 27 et SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 45 et SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 45 et SEQ ID NO:
24, SEQ ID NO: 47 et SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 et SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO:

26 et SEQ ID NO: 24, ou leurs séquences complémentaires, comme amorces pour réaliser une hybridation et éventuellement une amplification du gène ncmicl provenant du génome de souches sauvages et/ou de la souche mutante Neo ncmic3 KO de Neospora caninum.
Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation d'au moins un oligonucléotide consistant en la séquence choisie parmi SEQ ID
NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ
ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 40, ou leur séquence complémentaire, comme amorce pour réaliser une hybridation et éventuellement une amplification du gène ncmic3 provenant du génome de souches sauvages et/ou de la souche mutante Neo ncmicl KO de Neospora caninum.
Dans un autre mode de réalisation plus particulier, l'invention concerne l'utilisation d'oligonucléotides consistant en au moins un couple de séquences choisi parmi SEQ ID NO: 11 et SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 11 et SEQ ID NO: 8, SEQ ID
NO: 11 et SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 11 et SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 5 et SEQ ID
NO: 12, SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 40, SEQ ID
NO: 5 et SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 7 et SEQ ID
NO: 12, SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO: 40, SEQ ID
NO: 7 et SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 36 et SEQ ID
NO: 8, SEQ ID NO: 36 et SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 36 et SEQ ID NO: 6, SEQ ID
NO: 36 et SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 36 et SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15 et SEQ
ID NO: 6, SEQ ID NO: 15 et SEQ ID NO: 14, ou leurs séquences complémentaires, comme amorces pour réaliser une hybridation et éventuellement une amplification du gène ncmic3 provenant du génome de souches sauvages et/ou de la souche mutante Neo ncmicl KO de Neospora caninum.
Dans encore un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation d'au moins un oligonucléotide consistant en la séquence choisie parmi SEQ
ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:

13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, ou leur séquence complémentaire, comme amorce pour réaliser une hybridation et éventuellement une amplification du gène de sélection dhfr provenant du génome des souches mutantes Neo ncmic3 KO et/ou Neo ncmicl-3 KO de Neospora caninum.

Dans encore un autre mode de réalisation plus particulier, l'invention concerne l'utilisation d'oligonucléotides consistant en au moins un couple de séquences choisi parmi : SEQ ID NO: 11 et SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 11 et SEQ ID NO: 10, SEQ ID

NO: 11 et SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 11 et SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 11 et SEQ
5 ID NO: 6, SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 10, SEQ ID
NO: 5 et SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 5 et SEQ ID
NO: 6, SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 37 et SEQ ID NO: 10, SEQ ID
NO: 37 et SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 37 et SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 37 et SEQ
ID NO: 6, SEQ ID NO: 37 et SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 9 et SEQ ID NO: 10, SEQ
10 ID NO: 9 et SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 9 et SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 9 et SEQ
ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 et SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 43 et SEQ ID NO: 44, SEQ
ID NO: 43 et SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 43 et SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 et SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 16 et SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16 et SEQ ID NO: 14, ou leurs séquences complémentaires, comme amorces pour réaliser une hybridation et 15 éventuellement une amplification du gène de sélection dhfr provenant du génome de souches mutantes Neo ncmic3 KO et/ou Neo ncmic1-3 KO Neospora caninum.
Dans encore un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation d'au moins un oligonucléotide consistant en la séquence choisie parmi SEQ
ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 29, SEQ ID
20 NO: 30, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 ou leur séquence complémentaire, comme amorce pour réaliser une hybridation et éventuellement une amplification du gène de sélection cat-gfp provenant du génome des souches mutantes Neo ncmicl KO et/ou Neo ncmic1-3 KO de Neospora caninum.
Dans encore un autre mode de réalisation plus particulier, l'invention concerne
25 l'utilisation d'oligonucléotides consistant en au moins un couple de séquences choisi parmi : SEQ ID NO: 21 et SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 21 et SEQ ID NO: 30, SEQ ID

NO: 21 et SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 38 et SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 38 et SEQ
ID NO: 42, SEQ ID NO: 38 et SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 49 et SEQ ID NO: 30, SEQ

ID NO: 49 et SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 49 et SEQ ID NO: 24,SEQ ID NO: 29 et SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 29 et SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 29 et SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 23 et SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 23 et SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 23 et SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 48 et SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 48 et SEQ ID NO:
42, SEQ ID NO: 48 et SEQ ID NO: 24, ou leurs séquences complémentaires, comme
26 amorces pour réaliser une hybridation et éventuellement une amplification du gène de sélection cat-gfp provenant du génome de souches mutantes Neo ncmicl KO et/ou Neo ncmicl-3 KO Neospora caninum.
Par amplification , on désigne l'augmentation de la concentration d'une séquence d'ADN spécifique parmi un mélange de séquences d'ADN. Les techniques d'amplification de l'ADN sont des techniques bien connues de l'homme de l'art.
L'invention concerne également l'utilisation d'au moins un oligonucléotide consistant en une séquence d'acide nucléique choisie dans le groupe comprenant SEQ ID
NO: 35 à 42, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, ou de sa séquence complémentaire, comme sonde pour réaliser une hybridation avec un acide nucléique provenant du génome de souches sauvages et/ou des souches mutantes Neo ncmicl KO
et/ou Neo ncmic3 KO et/ou Neo ncmicl-3 KO de Neospora caninum.
L'invention concerne également l'utilisation de l'oligonucléotide consistant en une séquence d'acide nucléique choisie dans le groupe comprenant SEQ ID NO: 35 à 42, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, ou de sa séquence complémentaire, le susdit oligonucléotide étant marqué à une extrémité par un fluorophore et éventuellement à l'autre extrémité par un quencher.
Par fluorophore , on désigne les molécules capables d'émettre de la lumière lorsqu'elles sont excitées par une source lumineuse. Les fluorophores sont des molécules bien connues par l'homme de l'art, dont les plus utilisés sont Fam, Tet, Hex, Tamra, Texas Red, Cy3, Cy5. Cette liste non exhaustive a pour but d'illustrer la notion de fluorophore mais ne doit en aucun cas restreindre la présente invention à
l'utilisation de ces seuls fluorophores.
Par quencher , on désigne une espèce chimique, capable de désactiver un état excité créé dans une entité moléculaire par transfert d'énergie, d'électron ou par un mécanisme chimique. Les quenchers sont des molécules bien connues par l'homme de l'art, dont les plus utilisés sont Dabcyl, Eclipse Dark Quencher, Black Hole Quencher.
Un fluorophore peut également servir de quencher. Pour cela, le spectre d'émission du fluorophore greffé en 5' ne doit pas chevaucher le spectre d'excitation du fluorophore-quencher greffé en 3'. Cette liste non exhaustive a pour but d'illustrer la notion de
27 quencher mais ne doit en aucun cas restreindre la présente invention à
l'utilisation de ces seuls quenchers.
Dans la présente invention, les sondes utilisées peuvent rentrer dans la définition de la technologie Taqman, FRET (Fluorescent Resonnance Energy Transfer), Molecular Beacon ou Scorpion ou toute autre technologie de PCR (ou RT-PCR) en temps réel bien connue de l'homme de l'art.
L'invention concerne également un procédé de détection de Neospora caninum par amplification in vitro à partir d'un échantillon biologique, ledit procédé
comportant les étapes de :
- mise en contact du set d'oligonucléotides tel que défini ci-dessus avec un échantillon biologique, ou un acide nucléique issu du susdit échantillon biologique, dans des conditions permettant aux oligonucléotides de s'hybrider à un acide nucléique de Neospora caninum présent dans le susdit échantillon, - amplification de l'acide nucléique de Neospora caninum en utilisant les oligonucléotides comme amorces, - détection du produit d'amplification caractérisant la présence de Neospora caninum dans l'échantillon.
Selon un mode de réalisation particulier, le procédé de détection de l'invention peut être mis en oeuvre sur un échantillon biologique choisi parmi le groupe constitué par le sang, le sérum ou le plasma mais également certains tissus et organes tels que le placenta, le cerveau, les muscles, etc...
Selon un autre mode de réalisation, dans le procédé de détection de Neospora caninum, l'acide nucléique de Neospora caninum est amplifié par PCR. La PCR
peut être qualitative, quantitative ou semi-quantitative. Suivant qu'une sonde de détection est utilisé ou pas, on parle de PCR en temps réel ou de PCR classique.
Selon un autre mode de réalisation plus particulier, dans le procédé de détection de Neospora caninum, la détection du produit d'amplification est réalisée en utilisant au moins l'un des oligonucléotides de séquence SEQ ID NO: 35 à 42, SEQ ID NO: 16, SEQ
ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, ou sa séquence complémentaire, ou de tout autre oligonucléotide de séquence incluse dans celle de l'amplicon obtenu à partir des amorces
28 ayant permis l'amplification du fragment génique d'intérêt, marqué à une extrémité par un fluorophore et à l'autre extrémité par un quencher comme sonde.
L'invention concerne également un kit d'amplification de Neospora caninum à
partir d'un échantillon biologique, ledit kit comprenant l'un des susdits sets d'oligonucléotides, ou leurs séquences complémentaires, et des moyens permettant l'amplification d'un acide nucléique de Neospora caninum.
Selon un mode de réalisation particulier, ledit kit d'amplification comprend :
- au moins un set d'oligonucléotides consistant en les oligonucléotides de séquences - SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO: 12 et SEQ ID NO: 36, - SEQ ID NO: 43 et SEQ ID NO: 44 et SEQ ID NO: 16, - SEQ ID NO: 45 et SEQ ID NO: 46 et SEQ ID NO: 47, - SEQ ID NO: 23 et SEQ ID NO: 30 et SEQ ID NO: 48, et - un moyen pour amplifier un acide nucléique de Neospora caninum, - éventuellement un contrôle interne.
Par moyen pour amplifier un acide nucléique , on désigne les dNTPs, une Taq Polymérase, les sels et tampons qui permettent la réalisation d'une PCR.
Par contrôle interne , on désigne une séquence nucléique (ADN exogène) sans rapport avec le génome de Neospora caninum, des amorces et une sonde permettant l'amplification et la détection de cet ADN exogène. Ce contrôle interne est placé dans le mix servant à la PCR pour la détection de Neospora caninum et atteste du bon fonctionnement de l'amplification.
Les figures et les exemples suivants visent à illustrer davantage la présente invention.
Figure 1 : cette figure illustre les 2 étapes de recombinaison homologue pour obtenir la souche Neo ncmic1-3 KO. La première étape de recombinaison homologue permet l'intégration du gène codant pour l'enzyme dihydrofolate réductase (DHFR) au locus du gène ncmic3. Une sélection avec la pyriméthamine permet d'amplifier la souche simple mutante Neo ncmic3 KO. La souche Neo ncmic3 KO ainsi obtenue sert à la seconde étape de recombinaison homologue qui permet l'intégration du gène codant pour
29 la protéine chimérique chloramphénicol-acétyl-transférase/green fluorescent protein (CAT-GFP) au locus du gène ncmicl . Une sélection avec le chloramphénicol permet ensuite d'amplifier la souche double mutante Neo ncmic1-3 KO.
Figure 2-A: cette figure est une représentation schématique du plasmide pNcMic3KO-DHFR. Ce plasmide de 11 312 paires de bases comprend le gène de sélection DHFR flanqué par les régions homologues (5HR-NcMic3 et 3HR-NcMic3) des séquences flanquant le gène ncmic3, le gène de résistance à l'ampicilline (Amp) ainsi que le site de restriction Not I qui permet sa linéarisation.
Figure 2-B : cette figure est une représentation schématique du plasmide pNcMiclKO-CAT-GFP. Ce plasmide de 10 069 paires de bases comprend le gène de sélection CAT-GFP flanqué par les régions homologues (3HR-NcMicl et 5HR-NcMicl) des séquences flanquant le gène ncmicl, le gène de résistance à l'ampicilline (Amp) ainsi que le site de restriction Kpn I qui permet sa linéarisation.
Figure 3-A : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus respectivement chez la souche sauvage NC1 de N. caninum et chez la souche mutante Neo ncmic3 KO, en utilisant les jeux d'amorces des PCR n 1, n 2 ou n 3 du Tableau II qui correspondent aux SEQ ID NO : 5 à SEQ ID NO: 10.
Figure 3-B : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus respectivement chez la souche sauvage NC1 de N. caninum et chez la souche mutante Neo ncmic3 KO, en utilisant les jeux d'amorces des PCR n 4, n 5, n 6 ou n 7 du Tableau II qui correspondent aux SEQ ID NO: 11 à SEQ ID NO: 16.
Figure 4-A : cette figure illustre l'analyse de la détection de la protéine NcMIC3 chez la souche sauvage NC1 de N. caninum par immunofluorescence, en utilisant un anticorps reconnaissant spécifiquement la protéine NcMIC3. Un même champ microscopique est visualisé en lumière directe (image A) ou en fluorescence (image B).
Figure 4-B : cette figure illustre l'analyse de la détection de la protéine NcMIC3 chez la souche mutante de N. caninum Neo ncmic3 KO par immuno fluorescence, en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre la protéine NcMIC3. Un même champ microscopique est visualisé en lumière directe (image A) ou en fluorescence (image B).
Figure 5 : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR
5 obtenus respectivement chez la souche sauvage NC1 de N. caninum, chez la souche mutante Neo ncmic3 KO et chez la souche mutante Neo ncmic1-3 KO en utilisant les jeux d'amorces des PCR n 1 à n 12 du Tableau VII qui correspondent aux SEQ ID
NO:
7 à 16 et aux SEQ ID NO :21 à30.
10 Figure 6 : cette figure illustre l'analyse de la détection de la protéine GFP chez les souches mutantes Neo ncmic3 KO (images A et B) et Neo ncmic1-3 KO (image C
et D) par immunofluorescence, en utilisant les propriétés fluorescentes de la protéine CAT-GFP. Un même champ microscopique est visualisé en lumière directe (images hautes A
et C) ou en fluorescence (images basses B et D).
Figure 7 : cette figure représente le pourcentage de survie (en ordonnée) des souris femelles Balb/C infectées par voie intrapéritonéale avec 107 tachyzoïtes de la souche sauvage NC1 de Neospora caninum (cercles noirs) ou des souches mutantes Neo ncmic3 KO (carrés noirs) et Neo ncmic1-3 KO (triangles noirs). L'axe des abscisses représente le temps écoulé après l'injection des tachyzoïtes aux souris (en jours).
Figure 8 : cette figure représente le pourcentage de survie (en ordonnée) des souris femelles Balb/C après vaccination avec des doses croissantes de la souche mutante ncmic1-3 KO et challenge 4 mois post-vaccination, avec une dose létale de la souche sauvage NC1 de Neospora caninum. Six lots de souris sont représentés sur l'axe des abscisses :
Lot i : les souris femelles Balb/C de ce lot ont été vaccinées par voie intrapéritonéale avec 5x106 tachyzoïtes de la souche mutante Neo ncmic1-3 KO
puis challengées par voie intrapéritonéale avec 2x107 tachyzoïtes de la souche sauvage NC1 de Neospora caninum.
Lot ii : les souris femelles Balb/C de ce lot ont été vaccinées par voie intrapéritonéale avec 107 tachyzoïtes de la souche mutante Neo ncmic1-3 KO
puis challengées par voie intrapéritonéale avec 2x107 tachyzoïtes de la souche sauvage NC1 de Neospora caninum.
Lot iii : les souris femelles Balb/C de ce lot ont été vaccinées par voie intrapéritonéale avec une première dose de 107 tachyzoïtes de la souche mutante Neo ncmicl-3 KO, puis un mois plus tard une seconde dose de 107 tachyzoïtes de la souche mutante Neo ncmicl-3 KO, puis challengées par voie intrapéritonéale avec 2x107 tachyzoïtes de la souche sauvage NC1 de Neospora caninum.
Lot iv : les souris femelles Balb/C de ce lot ont été vaccinées par voie intrapéritonéale avec 5x107 tachyzoïtes de la souche mutante Neo ncmicl-3 KO
puis challengées par voie intrapéritonéale avec 2x107 tachyzoïtes de la souche sauvage NC1 de Neospora caninum.
Lot v : les souris femelles Balb/C de ce lot ont été vaccinées par voie intrapéritonéale avec 108 tachyzoïtes de la souche mutante Neo ncmicl-3 KO
puis challengées par voie intrapéritonéale avec 2x107 tachyzoïtes de la souche sauvage NC1 de Neospora caninum.
Lot vi : les souris femelles Balb/C de ce lot n'ont pas été vaccinées avec les tachyzoïtes de la souche mutante Neo ncmicl-3 KO mais challengées par voie intrapéritonéale avec 2x107 tachyzoïtes de la souche sauvage NC1 de Neospora caninum.
Figure 9 : cette figure illustre la position des amorces nucléiques utilisées dans la présente invention pour détecter la présence des quatre gènes ncmic3, dhfr, ncmicl, cat-gfp dans les souches sauvages et/ou des souches mutantes de Neo ncmicl KO
et/ou Neo ncmic3 KO et/ou Neo ncmicl-3 KO de Neospora caninum. Les chiffres représentent la numérotation des séquences d'amorces définies dans la présente demande.
Figure 10 : cette figure représente les résultats des tests ELISA réalisés pour doser les anticorps IgG anti-N. caninum (densité optique à 405 nm en ordonnées), présents dans les sérums des souris vaccinées 30 jours au préalable par la souche Neo ncmicl-3 KO ou non vaccinées. Quatre lots de souris sont représentés sur l'axe des abscisses :
Lot i : les souris femelles de ce lot ont été vaccinées avec les tachyzoïtes de la souche mutante Neo ncmicl-3 KO.

Lot ii : les souris femelles de ce lot n'ont pas été vaccinées et sont donc naïves vis-à-vis de la néosporose.
T+: une souris infectée par N. caninum et présentant des anticorps IgG anti-N. caninum dans son sérum. Cette souris sert de témoin positif.
T- : une souris naïve ne présentant pas d'anticorps IgG anti-N. caninum dans son sérum. Cette souris sert de témoin négatif.
Figure 11: cette figure représente les résultats des tests ELISA réalisés pour doser les anticorps IgG1 (histogramme gris foncé) et IgG2A (histogramme gris clair) anti-N. caninum (densité optique à 405 nm en ordonnées), présents dans les sérums des souris vaccinées 30 jours au préalable par la souche Neo ncmic1-3 KO (12 souris incluses dans cette analyse) ou non (2 souris incluses dans cette analyse).
Deux lots de souris sont représentés sur l'axe des abscisses :
Lot i : les souris femelles de ce lot ont été vaccinées avec les tachyzoïtes de la souche mutante Neo ncmic1-3 KO.
Lot ii : les souris femelles de ce lot n'ont pas été vaccinées et sont donc naïves vis-à-vis de la néosporose.
Figure 12-A : cette figure représente l'évolution de la température rectale moyenne en degré celcius (en ordonnée) des brebis de J-5 à J14 post-vaccination (en abscisse). Quatre lots sont représentés sur cette figure :
Lot i : (courbe grise discontinue ¨ rond gris) les brebis femelles de ce lot n'ont pas été vaccinées avec les tachyzoïtes de la souche mutante Neo ncmic1-3 KO
mais ont été fécondées, puis challengées à mi-gestation, par voie sous-cutanée avec 107 tachyzoïtes de la souche sauvage NC1 de Neospora caninum.
Lot ii (courbe noire continue ¨ carré noir) : les brebis femelles de ce lot ont été
vaccinées par voie sous-cutanée avec une première dose de 107 tachyzoïtes de la souche mutante Neo ncmic1-3 KO, puis un mois plus tard une seconde dose de 107 tachyzoïtes de la souche mutante Neo ncmic1-3 KO. Les brebis ont été fécondées 2 mois après la première vaccination, puis challengées, à mi-gestation, par voie sous-cutanée avec 107 tachyzoïtes de la souche sauvage NC1 de Neospora caninum.
Lot iii (courbe grise continue ¨ triangle gris) : les brebis femelles de ce lot ont été vaccinées par voie sous-cutanée avec une dose de 108 tachyzoïtes de la souche mutante Neo ncmic1-3 KO. Les brebis ont été fécondées 2 mois après la vaccination, puis challengées, à mi-gestation, par voie sous-cutanée avec 107 tachyzoïtes de la souche sauvage NC1 de Neospora caninum.
Lot iv (courbe noire discontinue ¨ croix noire) : les brebis femelles de ce lot n'ont été ni vaccinées avec les tachyzoïtes de la souche mutante Neo ncmic1-3 KO ni challengées avec 107 tachyzoïtes de la souche sauvage NC1 de Neospora caninum.
Elles ont été fécondées en même temps que les brebis du lot (i), (ii) et (iii).
Figure 12-B : cette figure représente l'évolution de la température rectale moyenne en degré celcius (en ordonnée) des brebis de J-1 à J9 post-challenge (en abscisse). Quatre lots sont représentés sur cette figure :
Lot i : (courbe grise discontinue ¨ rond gris) les brebis femelles de ce lot n'ont pas été vaccinées avec les tachyzoïtes de la souche mutante Neo ncmic1-3 KO
mais ont été fécondées, puis challengées à mi-gestation, par voie sous-cutanée avec 107 tachyzoïtes de la souche sauvage NC1 de Neospora caninum.
Lot ii (courbe noire continue ¨ carré noir) : les brebis femelles de ce lot ont été
vaccinées par voie sous-cutanée avec une première dose de 107 tachyzoïtes de la souche mutante Neo ncmic1-3 KO, puis un mois plus tard une seconde dose de 107 tachyzoïtes de la souche mutante Neo ncmic1-3 KO. Les brebis ont été fécondées 2 mois après la première vaccination, puis challengées, à mi-gestation, par voie sous-cutanée avec 107 tachyzoïtes de la souche sauvage NC1 de Neospora caninum.
Lot iii (courbe grise continue ¨ triangle gris) : les brebis femelles de ce lot ont été vaccinées par voie sous-cutanée avec une dose de 108 tachyzoïtes de la souche mutante Neo ncmic1-3 KO. Les brebis ont été fécondées 2 mois après la vaccination, puis challengées, à mi-gestation, par voie sous-cutanée avec 107 tachyzoïtes de la souche sauvage NC1 de Neospora caninum.
Lot iv (courbe noire discontinue ¨ croix noire) : les brebis femelles de ce lot n'ont été ni vaccinées avec les tachyzoïtes de la souche mutante Neo ncmic1-3 KO ni challengées avec 107 tachyzoïtes de la souche sauvage NC1 de Neospora caninum.
Elles ont été fécondées en même temps que les brebis du lot (i), (ii) et (iii).
Figure 13 : cette figure représente les moyennes des résultats des tests ELISA

(densité optique à 405 nm en ordonnées), réalisés à partir des sérums des brebis le jour de la vaccination du lot (ii) et (iii) (JO), le jour du boost du lot (ii) (J22), 57 jours après la première vaccination (J57), 107 jours après la première vaccination (J107), le jour du challenge (JO Chal), 29 jours après challenge (J29 Chal) et 62 jours après challenge (J62 Chal). Quatre lots sont représentés en abscisse sur cette figure :
Lot i: les brebis femelles de ce lot n'ont pas été vaccinées avec les tachyzoïtes de la souche mutante Neo ncmic1-3 KO mais ont été fécondées, puis challengées à mi-gestation, par voie sous-cutanée avec 107 tachyzoïtes de la souche sauvage NC1 de Neospora caninum.
Lot ii : les brebis femelles de ce lot ont été vaccinées par voie sous-cutanée avec une première dose de 107 tachyzoïtes de la souche mutante Neo ncmic1-3 KO, puis un mois plus tard une seconde dose de 107 tachyzoïtes de la souche mutante Neo ncmicl-3 KO. Les brebis ont été fécondées 2 mois après la première vaccination, puis challengées, à mi-gestation, par voie sous-cutanée avec 107 tachyzoïtes de la souche sauvage NC1 de Neospora caninum.
Lot iii: les brebis femelles de ce lot ont été vaccinées par voie sous-cutanée avec une dose de 108 tachyzoïtes de la souche mutante Neo ncmic1-3 KO. Les brebis ont été fécondées 2 mois après la vaccination, puis challengées, à mi-gestation, par voie sous-cutanée avec 107 tachyzoïtes de la souche sauvage NC1 de Neospora caninum.
Lot iv : les brebis femelles de ce lot n'ont été ni vaccinées avec les tachyzoïtes de la souche mutante Neo ncmic1-3 KO ni challengées avec 107 tachyzoïtes de la souche sauvage NC1 de Neospora caninum. Elles ont été fécondées en même temps que les brebis du lot (i), (ii) et (iii).
Figure 14 : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus respectivement à partir de cerveaux de souris infectées par Neospora caninum ou à partir de cerveaux de souris vaccinées avec la souche Neo ncmic3 KO, en utilisant les jeux d'amorces des PCR n 1 (SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO: 8), n 2 (SEQ ID
NO: 9 et SEQ ID NO: 10), n 3 (SEQ ID NO: 39 et SEQ ID NO: 25) ou n 4 (SEQ ID
NO: 49 et SEQ ID NO: 42) définies dans le Tableau XVI.
Exemples Afin d'élaborer la souche de N. caninum invalidée pour les gènes ncmicl et ncmic3, deux étapes de recombinaison homologue ont été effectuées. La première étape de recombinaison homologue permet l'obtention d'un simple mutant KO (souche Neo ncmic3 KO). La deuxième étape de recombinaison homologue se fait dans la souche Neo ncmic3 KO pour obtenir une souche doublement délétée (Neo ncmic1-3 KO) (Figure 1).

Exemple 1: Construction de la souche mutante Neo ncmic3 KO
L'haploïdie du génome de Neospora caninum lors de la phase proliférative permet l'invalidation d'un gène en une seule recombinaison homologue.
Tous les tachyzoïtes de la souche NC1 de Neospora caninum utilisés ont été
10 produits en fibroblastes humains (HFF) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (FCS), 2 mM glutamine, 50 U/mL de pénicilline et 50 itg de streptomycine. Ils ont été récoltés après lyse mécanique des cellules hôtes et 3 passages en seringue 25G.
15 a) Construction du plasmide pNcMic3KO-DHFR
Le plasmide pNcMic3KO-DHFR (Figure 2-A) contient le gène de sélection DHFR (dihydrofolate reductase) conférant une résistance à la pyriméthamine (Donald et al., PNAS, 1993, 90(24):11703-11707). Le gène de sélection DHFR est placé sous le contrôle du promoteur tgdhfr de Toxoplasma gondii (promoteur tgdhfr) pour permettre 20 l'expression du gène dans le parasite. L'efficacité de ce promoteur hétérologue a été
démontrée préalablement chez N. caninum. Cette cassette est encadrée par les régions homologues (5HR-NcMic3 et 3HR-NcMic3) des séquences flanquant le gène ncmic3.
La cassette de sélection DHFR permet d'effectuer une sélection à la pyriméthamine.
La région 5'UTR du gène ncmic3 a été amplifiée par PCR à partir de l'ADN
25 génomique de la souche NC1 de Neospora caninum. Pour l'amplification, les amorces 5 HR NCmic3 F KpnI et 5 HR NCmic3 R ClaI (SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 2) permettent l'amplification de la région 5'UTR du gène ncmic3 et la création de deux sites de restriction qui ont été utilisés pour cloner le fragment 5HR en amont de la cassette de sélection DHFR dans le plasmide pT230 DHFR (KpnI en 5' et ClaI en 3' du fragment de
30 PCR).
La région 3'UTR du gène ncmic3 a été amplifiée par PCR à partir de l'ADN
génomique de la souche NC1 de Neospora caninum. Pour l'amplification, les amorces 3 HR NCmic3 F XbaI et 3 HR NCmic3 R NotI (SEQ ID NO: 3 et SEQ ID NO: 4) permettent l'amplification de la région 3'UTR du gène ncmic3 et la création de deux sites de restriction qui ont été utilisés pour cloner le fragment 3HR en aval de la cassette de sélection DHFR dans le plasmide pT230 5HR-NcMic3-DHFR (XbaI en 5' et NotI en 3' du fragment de PCR). Les séquences des amorces figurent dans le Tableau I ci-dessous.
Tableau I : Liste des amorces servant à l'intégration des séquences 5'UTR et 3'UTR du gène ncmic3. Les séquences des sites de restrictions sont soulignées.
n de Nom de l'amorce Séquence 5' ¨> 3' séquence SEQ ID
5 HR NCmic3 F KpnI CGCGGTACCCATGTGAATATGCTTTAACCGTGAC NO: 1 SEQ ID
5 HR NCmic3 R ClaI CGCATCGATGAGCTATAACCCTTGGAAATGACTC NO: 2 SEQ ID
3 HR NCmic3 F XbaI CGCTCTAGACATGCTGATGAAGAAGGGAAGT NO:

SEQ ID
3 HR NCmic3 R NotI CGCGCGGCCGCTCTCTCCTGAAGTCTTCGAGACC NO: 4 b) Conditions d'électroporation et de sélection 50 itg du plasmide pNcMic3KO-DHFR purifié puis linéarisé par NotI ont été
ajoutés à 5x107 tachyzoïtes NC1 de Neospora caninum mis en suspension dans le milieu d'électroporation CYTOMIX contenant de l'ATP (3 mM) et du Glutathion (3 mM) (Van den Hoff et al., Nucleic Acid Research, Jun 11; 20(11):2902), et l'électroporation a été
réalisée en cuvette d'écart 4 mm, dans un volume de 800 ILLL sur un appareil BioRad (Paramètres : 2000 V, 50 ohms, 25 iff, avec deux chocs électriques).
Après électroporation, les tachyzoïtes ont été déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé
et supplémenté par l'agent de sélection (pyriméthamine 2 LM), 24h après l'électroporation. Trois passages en culture sont effectués dans ce milieu.
Après 16 jours de sélection, les parasites résistants sont clonés par dilution limite dans les puits de plaques de 96 puits de cellules HFF. Après amplification, les plages de lyse provoquées par le parasite sont recherchées. Les parasites sont repiqués et leur ADN génomique est extrait pour des analyses PCR. Ces analyses PCR doivent confirmer l'intégration du transgène mais doivent également permettre de différencier les parasites ayant intégré le transgène de manière aléatoire des parasites d'intérêt dont le gène ncmic3 a été effectivement supprimé par recombinaison homologue.

c) Analyse PCR
A partir de l'ADN génomique, des PCR ont été réalisées pour :
= étudier la taille du fragment d'ADN amplifié avec un jeu d'amorces de la PCR n 1: HR NCmic3 F (SEQ ID NO: 5) et HR NCmic3 R (SEQ ID NO: 6), présentes sur les séquences homologues. Avec une intégration aléatoire du transgène, deux fragments d'ADN de 2163 pb et de 3824 pb sont amplifiés alors qu'avec recombinaison homologue, seul un fragment de 3824 pb est amplifié. Avec les souches sauvages, seul un fragment de 2163 pb est amplifié.
= vérifier la présence / l'absence du gène ncmic3 avec le jeu d'amorces de la PCR n 2: ORF NCmic3 F (SEQ ID NO: 7) et ORF NCmic3 R (SEQ ID NO: 8).
= et/ou vérifier la présence / l'absence de la cassette DHFR avec le jeu d'amorce de la PCR n 3: ORF DHFR F (SEQ ID NO: 9) et ORF DHFR R (SEQ ID NO:
10).
Les séquences des amorces et la taille des amplicons issus des différentes PCR
figurent respectivement dans le Tableau II et le Tableau III ci-dessous.
Tableau II: Liste des amorces ayant servi aux différentes PCR de validation de la construction de la souche mutante Neo ncmic3 KO.
Nom de n de l'amorce Séquence 5' ¨> 3' n de séquence PCR
HR NCmic3 F GTCATCGACCGCCGGAACTAGTAGT SEQ ID NO: 5 1 HR NCmic3 R GCAGAGGTTCTGCGTATCTAACACGG SEQ ID NO: 6 1 ORF NCmic3 F TTTCCCTTCTAAACACAGTCG SEQ ID NO: 7 2 ORF NCmic3 R CCTTCAGTGGTTCTCCATGAGT SEQ ID NO: 8 2 ORF DHFR F CCTTCTCAGACAACGGGGTA SEQ ID NO: 9 3 ORF DHFR R AGATCTTCACGCCCTTCTCA SEQ ID NO: 10 3 Integ NCmic3 F GAAAGTGTCAGTGGTAGAGACTGC SEQ ID NO: 11 4 et 6 ORF NCmic3 R2 CCTTCACTCGAGATCGCGCAAATGAGC SEQ ID NO: 12 4 ORF DHFR R2 GGACCTCTGTACGAGACATGCCG SEQ ID NO: 13 6 Integ NCmic3 R TGTTTACAGGTGATCCAGAAAAGG SEQ ID NO: 14 5 et 7 ORF NCmic3 F2 GAATTTTGGGACAGGGGAAT SEQ ID NO: 15 5 ORF DHFR F2 GTCTCTCGTTTTCCTCTCTTTTCGG SEQ ID NO: 16 7 Tableau III : Taille des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction de la souche mutante Neo ncmic3 KO.

n de PCR Neo ncmic3 KO Neospora caninum (NC1) Les profils électrophorétiques des produits PCR sont présentés sur la Figure 3-A.
Parmi les clones étudiés, certains clones présentaient une bande spécifique de DHFR
(PCR 3) mais pas de bande spécifique de ncmic3 (PCR 2). La PCR n 1 réalisée sur ces 5 clones a mis en évidence une bande de 3824 pb spécifique d'un clone Neo ncmic3 KO.
De nouvelles analyses PCR ont été effectuées sur ces clones d'intérêt avec de nouveaux jeux d'amorces. Ces PCR, dites d'intégration, permettent de valider le KO
génétique en utilisant une amorce présente sur le génome en amont ou en aval des séquences flanquant le gène ncmic3 et une deuxième amorce présente dans la cassette de sélection (gène dhfr) ou dans le gène d'intérêt (ncmic3) (Figure 3-B).
Dans la Figure 3-B, les PCR n 4 et n 5 permettent de montrer la présence de ncmic3 au locus de ncmic3. La PCR n 4 est réalisée avec le jeu d'amorce Integ NCmic3 F (SEQ ID NO: 11) et ORF NCmic3 R2 (SEQ ID NO: 12). La PCR n 5 est réalisée avec le jeu d'amorce Integ NCmic3 R (SEQ ID NO: 14) et ORF NCmic3 F2 (SEQ ID NO:
15).
On observe la présence de bandes pour la souche sauvage NC1 de Neospora caninum et l'absence de ces bandes pour la souche mutante Neo ncmic3 KO. Dans la Figure 3-B, les PCR n 6 et n 7 permettent de montrer la présence de DHFR au locus de ncmic3.
La PCR
n 6 est réalisée avec le jeu d'amorce Integ NCmic3 (SEQ ID NO: 11) et ORF DHFR

(SEQ ID NO: 13). La PCR n 7 est réalisée avec le jeu d'amorce Integ NCmic3 R
(SEQ
ID NO: 14) et ORF DHFR F2 (SEQ ID NO: 16). On constate l'absence de bandes pour la souche sauvage NC1 de Neospora caninum et présence de bandes pour la souche Neo ncmic3 KO. Il faut noter la présence d'une bande aspécifique pour la PCR n 6 à
environ 1000 pb.
L'ensemble des résultats de PCR démontre que la recombinaison homologue a bien eu lieu et que la souche mutante Neo ncmic3 KO est bien délétée du gène ncmic3.
d) Analyse en immunofluoresence L'analyse en immunofluorescence a été réalisée. 24h avant l'analyse en immunofluorescence, 5x105 parasites sont déposés dans un puits de p24 contentant un coverslip recouvert d'un tapis cellulaire de cellules HFF.
Les cellules infectées par les parasites sont lavées 2 fois au PBS 1X puis fixées au paraformaldéhyde (3,7% dans du PBS 1X) pendant 30 min. Après 3 lavages au PBS
1X, les cellules sont perméabilisées avec une solution de Triton (0.1% dans du PBS
1X) pendant 5 minutes. Après 3 lavages au PBS 1X, une étape de saturation est effectuée avec une solution de PBS 1X/SVF 10% pendant 30 min. Les cellules sont ensuite incubées avec l'anticorps primaire dilué dans une solution de PBS/SVF 2%
pendant 1 heure, lavées 3 fois puis incubées avec l'anticorps secondaire dilué dans une solution de PBS/SVF 2% pendant 1 heure. Après 2 lavages au PBS 1X, les coverslips sont montés sur lame avec de l'immumount et observés au microscope à fluorescence.
L'anticorps primaire utilisé est un anticorps qui permet de détecter l'expression de la protéine NcMIC3 dans le parasite (anticorps primaire : anticorps de lapin anti-mic3 et anticorps secondaire commercial : Alexa fluor 594 chèvre anti-lapin, Life technologies réf. A-11012).
Pour la souche sauvage NC1 de Neospora caninum, on observe une fluorescence rouge au pole apical du parasite révélant la présence de la protéine NcMIC3 (Figure 4A), alors que pour la souche mutante Neo ncmic3 KO, on n'observe pas de fluorescence au pole apical du parasite démontrant l'absence de la protéine NcMIC3 (Figure 4B).
Exemple 2 : Construction de la souche mutante Neo ncmicl KO
a) Construction du plasmide pNc miclKO-CAT-GFP
Le plasmide pNcMiclKO-CAT-GFP (Figure 2-B) contient une cassette de sélection CAT-GFP codant pour une protéine de fusion permettant à la fois la résistance au chloramphénicol (CAT) et une fluorescence verte (GFP : Green Fluorescent Protein).
Celle-ci est placée sous le contrôle du promoteur de l'a-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. De part et d'autre de la cassette, les régions homologues des séquences flanquant le gène ncmicl ont été clonées.
La région 3'UTR du gène ncmicl a été amplifiée par PCR à partir de l'ADN
génomique de la souche NC1 de Neospora caninum. Pour l'amplification, les amorces 3 HR NCmicl F KpnI et 3 HR NCmicl R HindIII (SEQ ID NO: 17 et SEQ ID NO: 18) permettent l'amplification de la région 3'UTR du gène ncmicl et la création de deux sites de restriction qui ont été utilisés pour cloner le fragment 3HR en amont de la cassette de sélection CAT-GFP dans le plasmide pT230 CAT-GFP (KpnI en 5' et HindIII en 3' du fragment de PCR).
5 La région 5'UTR du gène ncmicl a été amplifiée par PCR à partir de l'ADN
génomique de la souche NC1 de Neospora caninum. Pour l'amplification, les amorces 5 HR
NCmicl F BamHI et 5 HR NCmicl R NotI (SEQ ID NO: 19 et SEQ ID NO: 20) permettent l'amplification de la région 5'UTR du gène ncmicl et la création de deux sites de restriction qui ont été utilisés pour cloner le fragment 5HR en aval de la cassette de 10 sélection CAT-GFP dans le plasmide pT230 3HRNcMic1CAT-GFP (BamHI en 5' et NotI en 3' du fragment de PCR). Les séquences des amorces figurent dans le Tableau IV
ci-dessous.
Tableau IV : Liste des amorces servant à l'intégration des séquences 5'UTR et 3'UTR du 15 gène ncmic 1. Les séquences des sites de restrictions sont soulignées.
Nom de l'amorce Séquence 5' ¨> 3' n de séquence 3 HR NCmicl F KpnI CGCGGTACCAGGCAGAAGTAAAGA SEQ ID NO: 17 AGGTTCCTC
3 HR NCmicl R HindIII CGCAAGCTTTGATCACGCAAGAAA SEQ ID NO: 18 AGAAGC
5 HR NCmic 1 F BamHI CGCGGATCCCATTTGTAGATACGGT SEQ ID NO: 19 TGCACAC
5 HR NCmicl R NotI CGCGCGGCCGCACATTCAGACGGC SEQ ID NO: 20 AGAACTCTG
b) Conditions d'électroporation et de sélection ug du plasmide pNcMiclKO-CAT-GFP purifié puis linéarisé par KpnI
doivent être ajoutés à 5x107 tachyzoïtes NC1 mis en suspension dans le milieu 20 d'électroporation CYTOMIX contenant de l'ATP (3 mM) et du Glutathion (3 mM) (Van den Hoff et al., Nucleic Acid Research, Jun 11; 20(11):2902), et l'électroporation doit être réalisée en cuvette d'écart 4 mm, dans un volume de 800 uL sur un appareil BioRad (Paramètres : 2000 V, 50 ohms, 25 ILLF, avec deux chocs électriques).
Après électroporation, les tachyzoïtes seront déposés sur une monocouche de 25 cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture sera remplacé
et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphénicol 50ILLM), 24h après l'électroporation. Trois passages en culture doivent être effectués dans ce milieu.

Après 15 jours de sélection, les parasites résistants seront clonés par dilution limite dans les puits de plaques de 96 puits de cellules HFF. Après amplification, les plages de lyse provoquées par le parasite seront recherchées. Les parasites seront repiqués et leur ADN génomique sera extrait pour des analyses PCR.
c) Analyse PCR
Les séquences des amorces et la taille attendue des amplicons issus des différentes PCR figurent respectivement dans le Tableau V et le Tableau VI ci-dessous.
Tableau V: Liste des amorces servant aux différentes PCR de validation de la construction des souches mutantes Neo ncmicl KO.
Nom de l'amorce Séquence 5' ¨> 3' n de séquence n de PCR
Integ NCmicl F CCGAGCAAGTTAGCAAGTCC SEQ ID NO: 21 1 et 3 ORF CATGFP R CCGTTTGGTGGATGTCTTCT SEQ ID NO: 22 1 ORF CATGFP F GCATCGACTTCAAGGAGGAC SEQ ID NO: 23 2 Integ NCmicl R CTTGTCCGTCACATCGTTTG SEQ ID NO: 24 2 et 4 ORF NCmicl R TTCTCCAGGCACTCACCTCT SEQ ID NO: 25 3 ORF NCmicl F AGCTTCCAACAACGAGAGGA SEQ ID NO: 26 4 ORF NCmicl F2 CCCAGGATATCGTTTGTTGC SEQ ID NO: 27 5 ORF NCmicl R2 CTTCTGATGCACGGAACTGA SEQ ID NO: 28 5 ORF CATGFP F2 CCTGAAGTTCATCTGCACCA SEQ ID NO: 29 6 ORFCATGFP R2 GTAGTGGTTGTCGGGCAGCA SEQ ID NO: 30 6 Tableau VI: Taille des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction de la souche mutante Neo ncmicl KO.
n de PCR Neo ncmic1K0 Neospora caninum (NC1) 3 _ 3746 Exemple 3 : Construction de la souche mutante Neo ncmicl-3 KO
a) Construction du plasmide pNc mic1K0 CAT-GFP
La construction du plasmide pNcMiclKO-CAT-GFP est décrite dans l'exemple 2 (2a).
b) Conditions d'électroporation et de sélection 50 iug du plasmide pNcMiclKO-CAT-GFP purifié puis linéarisé par KpnI ont été ajoutés à 5x107 tachyzoïtes Neo ncmic3 KO mis en suspension dans le milieu d'électroporation CYTOMIX contenant de l'ATP (3 mM) et du Glutathion (3 mM) (Van den Hoff et al., Nucleic Acid Research, Jun 11; 20(11):2902), et l'électroporation a été
réalisée en cuvette d'écart 4 mm, dans un volume de 800 ILLL sur un appareil BioRad (Paramètres : 2000 V, 50 ohms, 25 ILLF, avec deux chocs éléctriques).
Après électroporation, les tachyzoïtes ont été déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé
et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphénicol 50ILLM), 24h après l'électroporation. Trois passages en culture sont effectués dans ce milieu.
Après 15 jours de sélection, les parasites résistants sont clonés par dilution limite dans les puits de plaques de 96 puits de cellules HFF. Après amplification, les plages de lyse provoquées par le parasite sont recherchées. Les parasites sont repiqués et leur ADN génomique est extrait pour des analyses PCR.
c) Analyse PCR
Les séquences des amorces et la taille des amplicons issus des différentes PCR

figurent respectivement dans le Tableau VII et le Tableau VIII ci-dessous.
Tableau VII : Liste des amorces ayant servi aux différentes PCR de validation de la construction des souches mutantes Neo ncmic3 KO et Neo ncmic1-3 KO.
Nom de n de l'amorce Séquence 5' ¨> 3' n de séquence PCR
Integ NCmicl F CCGAGCAAGTTAGCAAGTCC SEQ ID NO: 21 1 et 3 ORF CATGFP R CCGTTTGGTGGATGTCTTCT SEQ ID NO: 22 1 ORF CATGFP F GCATCGACTTCAAGGAGGAC SEQ ID NO: 23 2 Integ NCmicl R CTTGTCCGTCACATCGTTTG SEQ ID NO: 24 2 et 4 ORF NCmicl R TTCTCCAGGCACTCACCTCT SEQ ID NO: 25 3 ORF NCmicl F AGCTTCCAACAACGAGAGGA SEQ ID NO: 26 4 Integ NCmic3 F GAAAGTGTCAGTGGTAGAGACTGC SEQ ID NO: 11 5 et 7 ORF NCmic3 R2 CCTTCACTCGAGATCGCGCAAATGAGC SEQ ID NO: 12 5 ORF DHFR R2 GGACCTCTGTACGAGACATGCCG SEQ ID NO: 13 7 Integ NCmic3 R TGTTTACAGGTGATCCAGAAAAGG SEQ ID NO: 14 6 et 8 ORF NCmic3 F2 GAATTTTGGGACAGGGGAAT SEQ ID NO: 15 6 ORF DHFR F2 GTCTCTCGTTTTCCTCTCTTTTCGG SEQ ID NO: 16 8 ORF NCmicl F2 CCCAGGATATCGTTTGTTGC SEQ ID NO: 27 9 Nom de n de l'amorce Séquence 5' ¨> 3' n de séquence PCR
ORF NCmicl R2 CTTCTGATGCACGGAACTGA SEQ ID NO: 28 9 ORF CATGFP
F2 CCTGAAGTTCATCTGCACCA SEQ ID NO: 29 10 ORFCATGFP R2 GTAGTGGTTGTCGGGCAGCA SEQ ID NO: 30 10 ORF NCmic3 F TTTCCCTTCTAAACACAGTCG SEQ ID NO: 7 11 ORF NCmic3 R CCTTCAGTGGTTCTCCATGAGT SEQ ID NO: 8 11 ORF DHFR F CCTTCTCAGACAACGGGGTA SEQ ID NO: 9 12 ORF DHFR R AGATCTTCACGCCCTTCTCA SEQ ID NO: 10 12 Tableau VIII : Taille des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction des souches mutante Neo ncmic3 KO et Neo ncmic1-3 KO.
n de PCR Neo ncmic1-3 KO Neospora caninumNeo ncmic3 KO
(NC1) 5 Dans la Figure 5, la PCR n 1 est réalisée avec le jeu d'amorces Integ NCmicl F(SEQ ID NO: 21) et ORF CATGFP R (SEQ ID NO: 22). Le PCR 2 est réalisé avec le jeu d'amorces ORF CATGFP F (SEQ ID NO: 23) et Integ NCmicl R (SEQ ID NO: 24).
La PCR n 3 est réalisée avec le jeu d'amorces Integ NCmicl F (SEQ ID NO: 21) et ORF
NCmicl R (SEQ ID NO: 25). La PCR n 4 est réalisée avec le jeu d'amorces Integ 10 NCmicl R (SEQ ID NO: 24) et ORF NCmicl F (SEQ ID NO: 26). La PCR n 5 est réalisée avec le jeu d'amorces Integ NCmic3 F (SEQ ID NO: 11) et ORF NCmic3 R2 (SEQ ID NO: 12). La PCR n 6 est réalisée avec le jeu d'amorces Integ NCmic3 R
(SEQ
ID NO: 14) et ORF NCmic3 F2 (SEQ ID NO: 15). La PCR n 7 est réalisée avec le jeu d'amorces Integ NCmic3 F (SEQ ID NO: 11) et ORF DHFR R2 (SEQ ID NO: 13). La PCR n 8 est réalisée avec le jeu d'amorces Integ NCmic3 R (SEQ ID NO: 14) et ORF
DHFR F2 (SEQ ID NO: 16). La PCR n 9 est réalisée avec le jeu d'amorces ORF
NCmicl F2 (SEQ ID NO: 27) et ORF NCmicl R2 (SEQ ID NO: 28). La PCR n 10 est réalisée avec le jeu d'amorces ORF CATGFP F2 (SEQ ID NO: 29) et ORF CATGFP R2 (SEQ ID NO: 30). La PCR n 11 est réalisée avec le jeu d'amorces ORF NCmic3 F
(SEQ
ID NO: 7) et ORF NCmic3 R (SEQ ID NO: 8). La PCR n 12 est réalisée avec le jeu d'amorces ORF DHFR F (SEQ ID NO: 9) et ORF DHFR R (SEQ ID NO: 10).
Les analyses électrophorétiques des produits de PCR montrent que la souche Neo ncmicl-3 KO ne possède plus les gènes ncmicl et ncmic3 (puits 3, 4, 5, 6, 9 et 11, Figure 5) et possède bien les gènes dhfr et cat-gfp (puits 1, 2, 7, 8, 10 et 12, Figure 5) validant ainsi l'obtention de la souche Neo ncmicl-3 KO. L'ensemble des résultats de PCR démontre que la recombinaison homologue a bien eu lieu et que la souche Neo ncmicl-3 KO est bien délétée des gènes ncmicl et ncmic3.
d) Analyse en immunofluoresence L'analyse en immuno fluorescence a uniquement été réalisée par observation directe de la fluorescence du parasite (Figure 6).
Les parasites des deux souches mutantes sont visualisés en lumière directe (images A et C). Un même champ microscopique est visualisé en fluorescence. La fluorescence verte, due à l'expression de la protéine recombinante chimérique CAT-GFP
n'est détectée que dans la souche mutante Neo ncmicl-3 KO (image D) suite à
l'insertion de la cassette CAT-GFP. A l'inverse, la souche Neo ncmic3 KO, qui ne possède pas de cassette CAT-GFP, n'exprime pas la protéine CAT-GFP et par conséquent ne présente pas de fluorescence (image B).
Exemple 4: Effets de l'inactivation de la protéine NcMIC3 ou des protéines NcMIC1 et NcMIC3 sur les propriétés infectieuses de Neospora caninum Les souches mutantes Neo ncmic3 KO et Neo ncmicl-3 KO décrits dans les exemples 1 et 3 ont été entretenues par passages réguliers sur cellules HFF
cultivées en milieu DMEM supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (FCS), 2 mM glutamine, 50 U/mL de pénicilline et 50 iLtg/mL de streptomycine. Les passages sur cellules HFF
réduisant la virulence des parasites (Baszler et al., Clin. Diagn. Lab.
Immunol., 2000, Nov ;7(6)893-898 and Bartley et al., Parasitology, 2006, Oct ;133(4):421-32), le nombre de passages sur cellules HFF est volontairement limité à 20.

Entre 60 et 80% des souris femelles Balb/C meurent généralement entre 8 et 11 jours après une infection par voie intrapéritonéale par 107 tachyzoïtes de la souche NC1 de Neospora caninum.
L'étude de la virulence des mutants Neo ncmic3 KO et Neo ncmic1-3 KO a été
5 étudiée sur un lot minimal de 10 souris femelles Balb/C par injection intrapéritonéale de 107 tachyzoïtes/souris. Les contrôles ont été réalisés dans les mêmes conditions sur des lots de 10 souris femelles Balb/C en utilisant la souche NC1 de Neospora caninum.
La Figure 7 montre que 70% des souris infectées avec 107 tachyzoïtes de la 10 souche NC1 de Neospora caninum sont mortes 11 jours après l'infection (ronds noirs).
Les souris infectées par la souche mutante Neo ncmic3 KO (carrés noirs) présentent un retard dans la mortalité (mort des souris entre 9 jours et 17 jours après l'infection) et une atténuation significative de la virulence du parasite (30% de mortalité contre 70% avec la souche sauvage 29 jours après l'infection). De plus, dans le cas des souris infectées par la 15 souche mutante Neo ncmic1-3 KO (triangles noirs), on observe 100% de survie 29 jours après l'infection.
Les souris ont également été infectées avec des quantités croissantes de la souche NC1 de Neospora caninum et les souches mutantes Neo ncmic3 KO et Neo ncmic1-3 KO. La dose nécessaire pour provoquer 50% de mortalité (DL50) est de 20 6x106 tachyzoïtespour la souche sauvage NC1 de Neospora caninum et de 22x106 tachyzoïtes pour la souche Neo ncmic3 KO. Pour la souche Neo ncmic1-3 KO, la DL50 est très largement supérieure à 108 tachyzoïtes soit 17 fois la DL50 de la souche sauvage NC1 de Neospora caninum. En effet, aucune mortalité n'est observée à
cette dose avec la souche mutante Neo ncmic1-3 KO.
Exemple 5: Efficacité de la souche Neo nen/ici-3 KO dans la prévention de la néosporose dans un modèle murin de néosporose létale La souche mutante Neo ncmic1-3 KO décrite à l'Exemple 3 a été entretenue par passages réguliers sur cellules HFF cultivées en milieu DMEM supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (FCS), 2 mM glutamine, 50 U/mL de pénicilline et 50 iLtg/mL de streptomycine. Les passages sur cellules HFF réduisant la virulence des parasites (Baszler et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol., 2000, Nov ;7(6)893-898 and Bartley et al., Parasitology, 2006, Oct ;133(4):421-32), le nombre de passage sur cellules HFF
est volontairement limité à 20.
Des souris Balb/C femelles ont été séparées en 6 lots distincts : (i) un lot vacciné
par voie intrapéritonéale avec 5x106 tachyzoïtes de la souche mutante Neo ncmic1-3 KO, (ii) un lot vacciné par voie intrapéritonéale avec 107tachyzoïtes de la souche mutante Neo ncmic1-3 KO, (iii) un lot vacciné par voie intrapéritonéale avec 107tachyzoïtes de la souche mutante Neo ncmic1-3 KO et boosté 1 mois après la première injection par 107 tachyzoïtes de la souche mutante Neo ncmic1-3 KO, (iv) un lot vacciné par voie intrapéritonéale avec 5x107 tachyzoïtes de la souche mutante Neo ncmic1-3 KO, (v) un lot vacciné par voie intrapéritonéale avec 108 tachyzoïtes de la souche mutante Neo ncmic1-3 KO et (vi) un lot témoin non vacciné.
Quatre mois après la vaccination, toutes les souris ont été challengées par voie intrapéritonéale avec 2x107 tachyzoïtes de la souche sauvage NC1 de Neospora caninum.
La souche sauvage NC1 de Neospora caninum a été entretenue par passages réguliers sur cellules HFF cultivées en milieu DMEM supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (FCS), 2 mM glutamine, 50 U/mL de pénicilline et 50 iLtg/mL de streptomycine.
Les passages sur cellules HFF réduisant la virulence des parasites (Baszler et al., Clin. Diagn.
Lab. Immunol., 2000, Nov ;7(6)893-898 and Bartley et al., Parasitology, 2006, Oct ;133(4):421-32), le nombre de passages sur cellules HFF est volontairement limité à
20. La dose utilisée pour le challenge est suffisante pour entraîner 100% de mortalité
chez les souris challengées. La survie des souris est ensuite suivie pendant une durée d'un mois.
La Figure 8 montre que les souris vaccinées des lots (i) à (iv) sont totalement protégées d'une réinfection par une souche virulente sauvage NC1 de Neospora caninum provoquant 100% de mortalité chez les souris du lot témoin (vi) qui meurent toutes au 6' jour après le challenge. Les souris vaccinées avec la plus forte dose de la souche Neo ncmic1-3 KO (lot (v)) présentent une mortalité intermédiaire (50%).
Contrairement aux souris du lot témoin (vi), la mortalité des souris de ce lot intervient de manière plus précoce (4,5 jours en moyenne). Cette observation pourrait s'expliquer par une réponse inflammatoire forte générée par ce groupe de souris au moment du challenge.
Exemple 6 : Efficacité de la souche mutante Neo nemic1-3 KO dans la prévention de la néosporose dans un modèle murin de néosporose congénitale - Expérience 1 La souche mutante Neo ncmic1-3 KO décrite à l'Exemple 3 a été entretenue par passages réguliers sur cellules HFF cultivées en milieu DMEM supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (FCS), 2 mM glutamine, 50 U/mL de pénicilline et 50 iLtg/mL de streptomycine. Les passages sur cellules HFF réduisant la virulence des parasites (Baszler et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol., 2000, Nov ;7(6)893-898 and Bartley et al., Parasitology, 2006, Oct ;133(4):421-32), le nombre de passages sur cellules HFF est volontairement limité à 20.
Des souris OF1 femelles ont été séparées en 2 lots distincts : (i) un lot vacciné
par voie intrapéritonéale avec 107tachyzoïtes de la souche mutante Neo ncmic1-3 KO, (ii) un lot témoin non vacciné.
Deux mois après vaccination, les souris ont été mises au mâle (JO) à raison de trois souris femelles pour un mâle. Les souris gestantes sont diagnostiquées par pesée et sont soumises au dixième jour de gestation à un challenge infectieux par voie intrapéritonéale avec 2x106 tachyzoïtes de la souche sauvage NC1 de Neospora caninum.
La souche sauvage NC1 de Neospora caninum a été entretenue par passages réguliers sur cellules HFF cultivées en milieu DMEM supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (FCS), 2 mM glutamine, 50 U/mL de pénicilline et 50 iLtg/mL de streptomycine.
Les passages sur cellules HFF réduisant la virulence des parasites (Baszler et al., Clin. Diagn.
Lab. Immunol., 2000, Nov ;7(6)893-898 and Bartley et al., Parasitology, 2006, Oct ;133(4):421-32), le nombre de passages sur cellules HFF est volontairement limité à
20.
Un jour avant la mise bas, les souris femelles ont été sacrifiées. Les placentas et les foetus ont été isolés et l'ADN est extrait. Une PCR nichée est réalisée à
partir de la région du gène NC5 de N. caninum (Yamage et al., J.Parasito1,1996 Apr,82(2):
272-9, Baszler et al.,J Clin Microbiol, 1999 Dec,37(12): 4059-64). Pour la PCR
primaire, le couple d'amorces NC5 FA (SEQ ID NO : 31) et NC5 RA (SEQ ID NO : 32) est utilisé et le couple d'amorces NC5 FB (SEQ ID NO : 33) et NC5 RB (SEQ ID NO : 34) est utilisé
pour la PCR secondaire. Les séquences des amorces figurent dans le Tableau IX
ci-dessous.
Tableau IX : Liste des amorces utilisées pour les PCR de recherche de la présence du parasite N. caninum dans les tissus.

Nom de l'amorce Séquence 5' ¨> 3' n de séquence n de PCR

CCCAGTGCGTCCAATCCTGTAAC SEQ ID NO: 31 Primaire CTCGCCAGTCAACCTACGTCTTCT SEQ ID NO: 32 Primaire NC5 FB TAATCTCCCCCGTCATCAGT SEQ ID NO: 33 Secondaire NC5 RB GGGTGAACCGAGGGAGTTG SEQ ID NO: 34 Secondaire Pour chaque placenta et foetus, trois PCR indépendantes sont réalisées. Les placentas et les foetus sont considérés positifs lorsque Neospora caninum est détecté pour au moins une PCR. Les résultats sont présentés dans le Tableau X ci-dessous.
Tableau X : Recherche de Neospora caninum dans les tissus placentaires et foetaux de souris vaccinées avec la souche Neo ncmic1-3 KO et challengées avec la souche sauvage NC1 (lot (i)) en comparaison avec des souris témoin non vaccinées et challengées avec la souche sauvage NC1 (lot (ii)).
Recherche de Neospora caninum dans les placentas Lot (i) Nombre de placentas Nombre de placentas % de placentas Souris vaccinées avec étudiés positifs positifs 107 tachyzoïtes de la souche Neo nemiel-106 47 44,3%
3 KO et challengées Recherche de Neospora caninum dans les foetus avec 2.106 tachyzoïtes de la souche sauvage Nombre de foetus Nombre de foetus % de foetus NC1 étudiés positifs positifs 109 23 21,1%
Recherche de Neospora caninum dans les placentas Lot (ii) Nombre de placentas Nombre de placentas % de placentas étudiés positifs positifs Souris non vaccinées 37 37 100%
et challengées avec 2.106 tachyzoïtes de la Recherche de Neospora caninum dans les foetus souche sauvage NC1 Nombre de foetus Nombre de foetus % de foetus étudiés positifs positifs 36 27 75%
Ces résultats démontrent que la vaccination avec la souche mutante atténuée Neo ncmic1-3 KO réduit considérablement la transmission materno-foetale du parasite, validant ainsi l'efficacité de la souche Neo ncmic1-3 KO à prévenir des effets délétères de la néosporose dans un modèle murin de néosporose congénitale endogène.

Exemple 7 : Efficacité de la souche mutante Neo nemic1-3 KO dans la prévention de la néosporose dans un modèle ovin de néosporose congénitale a) Déroulement de l'expérimentation La souche mutante Neo ncmic1-3 KO décrits à l'Exemple 3 a été entretenue par passages réguliers sur cellules HFF cultivées en milieu DMEM supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (FCS), 2 mM glutamine, 50 U/mL de pénicilline et 50 iLtg/mL de streptomycine. Les passages sur cellules HFF réduisant la virulence des parasites (Baszler et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol., 2000, Nov ;7(6)893-898 and Bartley et al., Parasitology, 2006, Oct ;133(4):421-32), le nombre de passages sur cellules HFF est volontairement limité à 20.
Des brebis Romanov séronégatives pour Neospora caninum et pour Toxoplasma gondii ont été séparées en 4 lots distincts : un lot composé de 14 brebis témoin non vaccinées par la souche mutante Neo ncmic1-3 KO et challengées par voie sous-cutanée avec 107 tachyzoïtes de la souche sauvage NC1 de Neospora caninum (lot i), un lot composé de 15 brebis vaccinées par voie sous-cutanée avec 107tachyzoïtes de la souche mutante Neo ncmic1-3 KO puis boostées par voie sous-cutanée 1 mois après la première injection par 107 tachyzoïtes de la souche mutante Neo ncmic1-3 KO et challengées par voie sous-cutanée avec 107 tachyzoïtes de la souche sauvage NC1 de Neospora caninum (lot ii), un lot composé de 14 brebis vaccinées par voie sous-cutanée avec 108 tachyzoïtes de la souche mutante Neo ncmic1-3 KO et challengées par voie sous-cutanée avec 107 tachyzoïtes de la souche sauvage NC1 de Neospora caninum (lot iii) et un lot composé de 5 brebis témoin non vaccinées par la souche mutante Neo ncmic1-3 KO
et non challengées par la souche sauvage NC1 de Neospora caninum (lot iv).
Deux mois après la première vaccination, les brebis ont été inséminées artificiellement. Un retour au bélier a été entrepris 3 semaines après l'insémination artificielle. Des échographies ont ensuite été réalisées et ont permis de diagnostiquer que 14 brebis sur 14 étaient gestantes dans le lot (i), 13 brebis sur 15 dans le lot (ii),13 brebis sur 14 dans le lot (iii) et 4 brebis sur 5 dans le lot (iv).
Les brebis gestantes des lots (i), (ii) et (iii) ont été soumises à mi-gestation à un challenge infectieux avec 107 tachyzoïtes de la souche sauvage NC1 de Neospora caninum. La souche sauvage NC1 de Neospora caninum a été entretenue par passages réguliers sur cellules HFF cultivées en milieu DMEM supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (FCS), 2 mM glutamine, 50 U/mL de pénicilline et 50iLtg/mL de streptomycine. Les passages sur cellules HFF réduisant la virulence des parasites (Baszler et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol., 2000, Nov ;7(6)893-898 and Bartley et al., 5 Parasitology, 2006, Oct ;133(4):421-32), le nombre de passages sur cellules HFF est volontairement limité à 20.
b) Relevé de température post-immunisation et post-challenge De 5 jours avant la vaccination à 14 jours post-vaccination, les températures rectales des brebis ont été enregistrées quotidiennement. Les moyennes des températures 10 post-immunisation des lots (i), (ii) (iii) et (iv) sont présentées dans la Figure 12-A. Les températures des lots témoins (iii) et (iv) restent physiologiques. En revanche, un pic thermique est observé pour les deux lots vaccinés (> 39,5 C). Un retour aux températures physiologiques est observé 5 jours après l'immunisation.
Le jour avant l'infection et pendant les jours suivants, la température rectale a 15 été relevée quotidiennement. Les moyennes des températures post-infection des lots (i), (ii) (iii) et (iv) sont présentés dans la Figure 12-B. Les températures du lot témoin (iv) restent physiologiques. En revanche, un pic thermique est observé pour les lots vaccinés (i), (ii) et (iii). Pour le lot témoin uniquement infecté (lot (i)), le pic fébrile a duré 3 jours avec un maximum à 40 C à J3. Pour les lots vaccinés (ii) et (iii), le pic fébrile intervient 20 dès J2, ne dure que deux jours et est moins intense (39,5 C).
c) Analyse de la réponse immunitaire humorale La réponse immunitaire a été étudiée post-immunisation et post-challenge en évaluant par ELISA la cinétique d'apparition des IgG spécifiques anti-N.
caninum dans le sérum des brebis des lots (i), (ii) (iii) et (iv). Les sérums sont prélevés avant 25 l'immunisation (JO) puis à J22, J57 et J107 post-vaccination et enfin après challenge (JO
Chal, J29 Chal, J62 Chal). Le sang est prélevé au niveau de la veine jugulaire et le prélèvement est laissé une nuit à 4 C pour permettre la formation du caillot.
Le sérum est récupéré en centrifugeant les prélèvements à 5000 g pendant 10 min. Le surnageant est récupéré et conservé à -20 C.
30 Pour analyser la réponse immunitaire humorale induite après la vaccination, un extrait de N. caninum est préparé. Pour la préparation de cet extrait parasitaire total, les tachyzoïtes de la souche NC-1 sont lavés, soniqués deux fois à 60 watts/s durant 10 min dans la glace et centrifugés à 2 000 g pendant 30 minutes à +4 C. Le surnagenant est récupéré et la concentration est détérminée par un dosage BCA qui utilise comme standard la Sérum Albumine Bovine (SAB). Les aliquots sont conservés à -80 C
jusqu'à
utilisation.
L'extrait parasitaire total de la souche NC1 est dilué dans un tampon carbonate pH9,6 pour obtenir une concentration finale de 10 iag/mL. Les plaques sont ensuite lavées trois fois avec le tampon de lavage (PBS 1X ¨ Tween 20 0,05%) puis saturées pendant 1h30 à 37 C avec une solution de PBS 1X ¨ Tween 20 0,05% complémentée avec 4% de Sérum Albumine Bovine (SAB) (Sigma). Le milieu est ensuite éliminé.
Les sera à tester sont dilués au 1/50ème dans une solution de PBS 1X ¨ Tween 20 0,05% et sont déposés en duplicate dans les puits. Après une heure d'incubation à 37 C
et une nouvelle série de lavage, l'anticorps secondaire anti-IgG de mouton couplé à
la phosphatase alcaline (Jackson ImmunoResearch 713-055147, donkey anti-Sheep IgG) et dilué au 1/5000ème est déposé à raison de 100 iaL par puits. Les échantillons sont alors incubés pendant une heure à 37 C. Après une nouvelle série de trois lavages, la révélation est faite par l'ajout dans chaque puits de 100 iaL d'une solution de paranitrophénylphosphate disodique (PnPP) (Sigma) à 1 mg/mL, dans un tampon DEA-HC1. Après 20 min d'incubation à température ambiante et à l'abri de la lumière, l'absorbance à 405 nm est mesurée grâce à un lecteur de plaque (Multiskan Wallace). Les moyennes des résultats des tests ELISA à JO, J22, J57 et J107 post-immunisation et à JO, J29, J62 post-challenge pour les sérums des différents lots de brebis dilués au 1/50eme sont représentés dans la Figure 13.
Après immunisation, les brebis des lots témoins (i) et (iv) non vaccinées n'ont pas développé de réponse humorale. En revanche, les brebis des lots (ii) et (iii) ont développé une réponse IgG anti-néosporose dès J22. Cette réponse IgG est boosté lors de la seconde vaccination du lot (ii). Elle diminue ensuite pour les deux lots (ii) et (iii).
Après challenge, les brebis du lot témoin (iv) non challengé n'ont pas développé
de réponse humorale. En revanche, les brebis des lots (i) (ii) et (iii) ont développé une réponse IgG anti-néosporose. La réponse humorale des lots vaccinées (ii) et (iii) est plus rapide que pour le lot (i) non vacciné.
d) Etude des avortements Après challenge, les brebis ont été suivies quotidiennement jusqu'à la mise-bas et les avortements et la mortinatalité ont été enregistrés.
Les résultats de cette étude sont illustrés dans le Tableau XV ci-dessous.
Nombre Nombre Nombre d'agneauxNombre de mort-Lots d'avortementd'agneaux attendus nés (%) (%) (%) vivants (%) (i) (Non vacciné / Infecté) 35 (100%) 29 (82,9%) 1(2,8%) 5 (2,8%) (ii) (vacciné puis boosté
avec 107 tachyzoïtes puis 38 (100%) 0(0%) 11(29%) 27 (71%) infecté) (iii) (vacciné avec 108 33 (100%) 3 (9,1%) 8 (24,2%) 22 (66,6%) tachyzoïtes puis infecté) (iv) (non vacciné / non 13 (100%) 0(0%) 1(7,7%) 12 (92,3%) infecté) Ces résultats démontrent que la vaccination avec la souche mutante atténuée Neo ncmic1-3 KO réduit considérablement les effets délétères d'une infection d'un ruminant, notamment un ovin, par Neospora caninum.
Exemple 8: Analyse de la réponse immunitaire humorale suite à la vaccination par la souche Neo nemic1-3 KO
La souche mutante Neo ncmic1-3 KO décrits à l'Exemple 3 a été entretenue par passages réguliers sur cellules HFF cultivées en milieu DMEM supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (FCS), 2 mM glutamine, 50 U/mL de pénicilline et 50 iLtg/mL de streptomycine. Les passages sur cellules HFF réduisant la virulence des parasites (Baszler et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol., 2000, Nov ;7(6)893-898 and Bartley et al., Parasitology, 2006, Oct ;133(4):421-32), le nombre de passages sur cellules HFF est volontairement limité à 20.
Des souris OF1 femelles ont été séparées en 2 lots distincts : (i) un lot vacciné
par voie intrapéritonéale avec 5.107tachyzoïtes de la souche mutante Neo ncmic1-3 KO, (ii) un lot témoin non vacciné mais challengé.
Un mois après la vaccination, une prise de sang sous-maxillaire est réalisée.
Le sang total est conservé 2 heures à 37 C avant d'être centrifugé à 5 000 g pendant 10 minutes afin de conserver le sérum. Le sérum est conservé à -20 C jusqu'à
utilisation.

Pour analyser la réponse immunitaire humorale induite après la vaccination, un extrait de N. caninum est préparé. Pour la préparation de cet extrait parasitaire total, les tachyzoïtes de la souche NC-1 sont lavés, soniqués deux fois à 60 watts/s durant 10 min dans la glace et centrifugés à 2 000 g pendant 30 minutes à +4 C. Le surnagenant est récupéré et la concentration est déterminée par un dosage BCA qui utilise comme standard la Sérum Albumine Bovine (SAB). Les aliquots sont conservés à -80 C
jusqu'à
utilisation.
A partir des sérums de souris vaccinés par la souche mutante Neo ncmic1-3 KO
et de souris non vaccinées, des tests ELISA sont réalisés afin de caractériser la réponse immunitaire humorale induite par la souche mutante Neo ncmic1-3 KO.
a) Recherche des IgG totales spécifiques de N. caninum L'extrait parasitaire total de la souche NC1 est dilué dans un tampon carbonate pH9,6 pour obtenir une concentration finale de 10 ug/mL. Des plaques 96 puits à fond plat sont alors sensibilisées une nuit à +4 C par un dépôt dans chaque puits de 100 uL
d'extrait total de N. caninum. Les plaques sont ensuite lavées trois fois avec le tampon de lavage (PBS 1X ¨ Tween 20 0,05%) puis saturées pendant 1h30 à 37 C avec une solution de PBS 1X ¨ Tween 20 0,05% complémentée avec 4% de Sérum Albumine Bovine (SAB) (Sigma). Le milieu est ensuite éliminé. Les sera à tester sont dilués au 1/50ème dans une solution de PBS 1X ¨ Tween 20 0,05% et sont déposés en duplicate dans les puits. Après une heure d'incubation à 37 C et une nouvelle série de lavage, l'anticorps secondaire anti-IgG de souris couplé à la phosphatase alcaline (Sigma A3562, goat anti-Mouse IgG) et dilué au 1/5000ème est déposé à raison de 100 uL par puits. Les échantillons sont alors incubés pendant une heure à 37 C. Après une nouvelle série de trois lavages, la révélation est faite par l'ajout dans chaque puits de 100 uL
d'une solution de paranitrophénylphosphate disodique (PnPP) (Sigma) à 1 mg/mL, dans un tampon DEA-HC1. Après 20 min d'incubation à température ambiante et à l'abri de la lumière, l'absorbance à 405 nm est mesurée grâce à un lecteur de plaque (Multiskan MCC340 Wallace). Les souris sont considérées comme séroconverties lorsque l'absorbance obtenue est 2,5 fois supérieure à l'absorbance obtenue avec le témoin négatif issu de sérum de souris naïves saines (Figure 10).
Les souris vaccinées du lot (i) présentent toutes une séroconversion contrairement aux souris non vaccinées du lot (ii).

b) Profil isotypique des IgG anti-N. caninum L'extrait parasitaire total de la souche NC-1 est dilué dans un tampon carbonate pH9,6 pour obtenir une concentration finale de 10 ug/mL. Des plaques 96 puits à fond plat sont alors sensibilisées une nuit à +4 C par un dépôt dans chaque puits de 100 uL
d'extrait total de N. caninum. Les plaques sont ensuite lavées trois fois avec le tampon de lavage (PBS 1X ¨ Tween 20 0,05%) puis saturées pendant 1h30 à 37 C avec une solution de PBS 1X ¨ Tween 20 0,05% complémentée avec 4% de Sérum Albumine Bovine (SAB) (Sigma). Le milieu est ensuite éliminé. Les sera à tester sont dilués au 1/100' dans une solution de PBS 1X ¨ Tween 20 0,05% et sont déposés en duplicate dans les puits. Après une heure d'incubation à 37 C et une nouvelle série de lavage, les anticorps secondaires sont déposés. Les anticorps secondaires anti-IgG1 (BD 557272, rat anti-Mouse IgG1) et anti-IgG2a (BD 553389, rat anti-Mouse IgG2a) couplés à la phosphatase alcaline et dilués au 1/1000' sont déposés à raison de 100 ILLL par puits. Les échantillons sont alors incubés pendant une heure à 37 C. Après une nouvelle série de trois lavages, la révélation est faite par l'ajout dans chaque puits de 100 uL d'une solution de paranitrophénylphosphate disodique (PnPP) (Sigma) à 1 mg/mL, dans un tampon DEA-HC1. Après 20 min d'incubation à température ambiante et à l'abri de la lumière, l'absorbance à 405 nm est mesurée grâce à un lecteur de plaque (Multiskan Wallace) (Figure 11).
Les IgG anti-N. caninum des souris vaccinées du lot (i) sont préférentiellement de type IgG2A, profil isotypique favorable à une protection contre Neospora caninum (Long et al., J. Parasitol., 1998, Apr; 84(2):316-20).
Exemple 9: Efficacité de la souche mutante Neo miel-3 KO dans la prévention de la néosporose dans un modèle murin de néosporose congénitale ¨ Expérience 2 La souche mutante Neo ncmic1-3 KO décrite à l'Exemple 3 a été entretenue par passages réguliers sur cellules HFF cultivées en milieu DMEM supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (FCS), 2 mM glutamine, 50 U/mL de pénicilline et 50 iLtg/mL de streptomycine. Les passages sur cellules HFF réduisant la virulence des parasites (Baszler et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol., 2000, Nov ;7(6)893-898 and Bartley et al., Parasitology, 2006, Oct ;133(4):421-32), le nombre de passages sur cellules HFF est volontairement limité à 20.

Des souris OF1 femelles ont été séparées en 2 lots distincts : (i) un lot de 11 souris vaccinées par voie intrapéritonéale avec 5.107 tachyzoïtes de la souche mutante Neo ncmic1-3 KO et (ii) un lot de 6 souris témoins non vaccinées.
Deux mois après vaccination, les souris ont été mises au mâle (JO) à raison de 5 trois souris femelles pour un mâle. Les souris gestantes des lots (i) et (ii) sont diagnostiquées par pesée et sont soumises au dixième jour de gestation à un challenge infectieux par voie intrapéritonéale avec 2x106 tachyzoïtes de la souche sauvage NC1 de Neospora caninum. La souche sauvage NC1 de Neospora caninum a été entretenue par passages réguliers sur cellules HFF cultivées en milieu DMEM supplémenté par 10% de 10 sérum de veau foetal (FCS), 2 mM glutamine, 50 U/mL de pénicilline et 50 iitg/mL de streptomycine. Les passages sur cellules HFF réduisant la virulence des parasites (Baszler et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol., 2000, Nov ;7(6)893-898 and Bartley et al., Parasitology, 2006, Oct ;133(4):421-32), le nombre de passages sur cellules HFF est volontairement limité à 20.
15 Un jour avant la mise bas, les souris femelles ont été sacrifiées. Les placentas et les foetus ont été isolés et l'ADN est extrait. Une PCR nichée est réalisée à
partir de la région du gène NC5 de N. caninum (Yamage et al., J.Parasito1,1996 Apr,82(2):
272-9, Baszler et al., J Clin Microbiol, 1999 Dec,37(12): 4059-64). Pour la PCR
primaire, le couple d'amorces NC5 FA (SEQ ID NO : 31) et NC5 RA (SEQ ID NO : 32) est utilisé et 20 le couple d'amorces NC5 FB (SEQ ID NO : 33) et NC5 RB (SEQ ID NO : 34) est utilisé
pour la PCR secondaire. Les séquences des amorces figurent dans le Tableau XI
ci-dessous.
Tableau XI: Liste des amorces utilisées pour les PCR de recherche de la présence du 25 parasite N. caninum dans les tissus.
Nom de l'amorce Séquence 5' ¨> 3' n de séquence n de PCR
NC5 FA CCCAGTGCGTCCAATCCTGTAAC SEQ ID NO: 31 Primaire NC5 RA CTCGCCAGTCAACCTACGTCTTCT SEQ ID NO: 32 Primaire NC5 FB TAATCTCCCCCGTCATCAGT SEQ ID NO: 33 Secondaire NC5 RB GGGTGAACCGAGGGAGTTG SEQ ID NO: 34 Secondaire Pour chaque placenta et foetus, trois PCR indépendantes sont réalisées. Les placentas et les foetus sont considérés positifs lorsque Neospora caninum est détecté pour au moins une PCR. Les résultats sont présentés dans le Tableau XII ci-dessous.

Tableau XII : Recherche de Neospora caninum dans les tissus placentaires et foetaux de souris vaccinées avec la souche Neo ncmic1-3 KO et challengées avec la souche sauvage NC1 (lot (i)) en comparaison avec des souris témoin non vaccinées et challengées avec la souche sauvage NC1 (lot (ii)).
Recherche de Neospora caninum dans les placentas Lot (i) Nombre de placentas Nombre de placentas % de placentas Souris vaccinées avec étudiés positifs positifs 5.107 tachyzoïtes de la souche Neo ncmicI-131 15 11,4%
3 KO et challengées Recherche de Neospora caninum dans les foetus avec 2.106 tachyzoïtes de la souche sauvage Nombre de foetus Nombre de foetus % de foetus NC1 étudiés positifs positifs 142 7 4,93%
Recherche de Neospora caninum dans les placentas Lot (ii) Nombre de placentas Nombre de placentas % de placentas étudiés positifs positifs Souris non vaccinées 88 82 93,2%
et challengées avec 2.106 tachyzoïtes de la Recherche de Neospora caninum dans les foetus souche sauvage NC1 Nombre de foetus Nombre de foetus % de foetus étudiés positifs positifs 87 52 59,8%
Ces résultats démontrent que la vaccination avec la souche mutante atténuée Neo ncmic1-3 KO réduit considérablement la transmission materno-foetale du parasite, validant ainsi l'efficacité de la souche Neo mic1-3 KO à prévenir des effets délétères de la néosporose dans un modèle murin de néosporose congénitale endogène.
Exemple 10: Efficacité de la souche mutante Neo ncmic1-3 KO dans la prévention de la néosporose dans un modèle murin de néosporose congénitale après infection des mères avant gestation La souche mutante Neo ncmic1-3 KO décrit à l'Exemple 3 a été entretenue par passages réguliers sur cellules HFF cultivées en milieu DMEM supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (FCS) ; 2 mM glutamine, 50 U/mL de pénicilline et 50 iag/mL de streptomycine. Les passages sur cellules HFF réduisant la virulence des parasites (Baszler et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol., 2000 Nov; 7(6)893-898 et Bartley et al., Parasitology, 2006, Oct; 133(4) :421-32), le nombre de passages sur cellules HFF est volontairement limité à 20.
Des souris OF1 femelles ont été séparées en 3 lots distincts :
= Lot (i) : lot témoin composé de 9 souris infectées par voie intra-péritonéale avec 5.106 tachyzoites de la souche NC-1, = Lot (ii) : lot composé de 9 souris infectées par voie intra-péritonéale avec 5.106 tachyzoites de la souche sauvage NC-1 puis vaccinées 58 jours plus tard avec 5.107 tachyzoïtes de la souche Neo ncmicl-3 KO par voie intra-péritonéale, = Lot (iii) : lot composé de 9 souris vaccinées par voie intra-péritonéale avec 5.107 tachyzoïtes de la souche Neo ncmic1-3 KO puis infectées, 58 jours plus tard, par voie intra-péritonéale avec 5.106 tachyzoites de la souche sauvage NC-1.
Cent sept jours après le début de l'expérimentation, les souris ont été mise au mâle à raison de 3 souris femelles pour un mâle. Les souris gestantes sont diagnostiquées par pesée.
A 18 jours de gestation, soit un jour avant les mises-bas théoriques, les souris femelles sont sacrifiées. Les foetus sont isolés et l'ADN est extrait.
Une PCR nichée est réalisée à partir de la région du gène NC5 de N. caninum (Yamage et al., J. Parasitol, 1996 Apr, 82(2): 272-9, Bazler et al., J. Clin.
Microbiol, 1999 Dec,37(12): 4059-64). Pour la PCR primaire, le couple d'amorces NC5 FA
(SEQ
ID NO : 31) et NC5 RA (SEQ ID NO : 32) est utilisé et le couple d'amorces NC5 FB
(SEQ ID NO : 33) et NC5 RB (SEQ ID NO: 34) est utilisé pour la PCR secondaire.
Les séquences des amorces figurent dans le Tableau XIII ci-dessous.
Tableau XIII : Liste des amorces utilisées pour les PCR de recherche de la présence du parasite N. caninum dans les tissus.
Nom de l'amorce Séquence 5' ¨> 3' n de séquence n de PCR
NC5 FA CCCAGTGCGTCCAATCCTGTAAC SEQ ID NO: 31 Primaire NC5 RA CTCGCCAGTCAACCTACGTCTTCT SEQ ID NO: 32 Primaire NC5 FB TAATCTCCCCCGTCATCAGT SEQ ID NO: 33 Secondaire NC5 RB GGGTGAACCGAGGGAGTTG SEQ ID NO: 34 Secondaire Pour chaque foetus, 3 PCR indépendantes sont réalisées. Le foetus est considéré
comme positif lorsque Neospora caninum est détécté pour au moins une PCR. Les résultats sont présentés dans le Tableau XIV ci-dessous.
Tableau XIV : Recherche de Neospora caninum dans les tissus placentaires et foetaux de souriceaux nés de mères infectées avant gestation (Lot (i)), de mères infectées puis vaccinées avant gestation (Lot (ii)) et de mères vaccinées puis infectées avant gestation (Lot (iii).
Recherche de Neospora caninum dans les placentas Lot (i) Nombre de placentas Nombre de placentas % de placentas étudiés positifs positifs 9 souris infectées avec 5.106 tachyzoïtes 96 28 29,2%
de la souche sauvage Recherche de Neospora caninum dans les foetus NC1 avant la mise au mâle Nombre de foetus Nombre de foetus % de foetus étudiés positifs positifs 97 32 33%
Lot (ii) Recherche de Neospora caninum dans les placentas 9 souris infectées avec 5.106 tachyzoïtes Nombre de placentas Nombre de placentas % de placentas de la souche sauvage étudiés positifs positifs NC1 puis vaccinées 110 13 11,81%
avec 5.107 tachyzoïtes de la Recherche de Neospora caninum dans les foetus souche Neo mic/-Nombre de foetus Nombre de foetus % de foetus 3 KO avant la mise au étudiés positifs positifs mâle 113 15 13,27%
Lot (ii) Recherche de Neospora caninum dans les placentas 9 souris vaccinées avec 5.107 tachyzoïtes Nombre de placentas Nombre de placentas % de plancetas de la souche étudiés positifs positifs Neo mic1-3 KO puis infectées avec 5.106 tachyzoïtes de la 88 20 22,72%
souche sauvage NC1 avant la mise au mâle Recherche de Neospora caninum dans les foetus Nombre de foetus Nombre de foetus % de foetus étudiés positifs positifs 88 13 14,7%

Ces résultats démontrent que la vaccination avec la souche mutante atténuée Neo ncmicl-3 KO réduit significativement (Test de Chi2, p<0,05) la transmission materno-foetale du parasite lorsque les mères sont infectées avant la gestation validant ainsi l'efficacité
prophylactique et thérapeutique de la souche Neo ncmic1-3 KO à prévenir des effets délétères de la néosporose dans un modèle murin de néosporose congénitale avec infection de la mère avant la gestation.
Exemple 11: Test diagnostic permettant de différencier la souche vaccinale Neo miel-3 KO de la souche sauvage NC1 après injection à des souris.
La souche mutante Neo ncmic1-3 KO décrite à l'Exemple 3 a été entretenue par passages réguliers sur cellules HFF cultivées en milieu DMEM supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (FCS) ; 2 mM glutamine, 50 U/mL de pénicilline et 50 iag/mL de streptomycine. Les passages sur cellules HFF réduisant la virulence des parasites (Baszler et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol., 2000 Nov; 7(6)893-898 et Bartley et al., Parasitology, 2006, Oct; 133(4) :421-32), le nombre de passages sur cellules HFF est volontairement limité à 20.
Des souris Balb/c femelles ont été séparées en 2 lots distincts :
= un lot injecté par voie intrapéritonéale avec 5.107tachyzoïtes de la souche mutante Neo ncmic1-3 KO, = et un lot injecté par voie intrapéritonéale avec 107 tachyzoïtes de la souche sauvage NC1 de Neospora caninum.
Les souris ont été sacrifiées. Le cerveau des souris est ensuite prélevé et broyé
dans un milieu RPMI à l'aide d'un Potter. Une partie du broyat est ensuite déposé sur cellules HFF en milieu DMEM supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (FCS), 2 mM glutamine, 50 U/mL de pénicilline et 50 iLtg/mL de streptomycine. Les parasites sont ensuite récoltés et leur ADN génomique est extrait.
A partir de l'ADN génomique, des PCR ont été réalisées pour :
= vérifier la présence ou l'absence du gène ncmic3 avec le jeu d'amorces de la PCR n 1: ORF NCmic3 F (SEQ ID NO: 7) et ORF NCmic3 R (SEQ
ID NO: 8).

= vérifier la présence ou l'absence de la cassette DHFR avec le jeu d'amorce de la PCR n 2: ORF DHFR F (SEQ ID NO: 9) et ORF DHFR R (SEQ
ID NO: 10).
= vérifier la présence ou l'absence du gène ncmicl avec le jeu d'amorces de 5 la PCR n 3: stop Ncmicl (SEQ ID NO: 39) et ORF NCmicl R (SEQ ID
NO: 25).
= vérifier la présence ou l'absence de la cassette CATGFP avec le jeu d'amorce de la PCR n 4: ORF CATGFP F3 (SEQ ID NO: 49) et stop CATGFP (SEQ ID NO: 42).
10 Les séquences des amorces et la taille des amplicons issus des différentes PCR
figurent respectivement dans les Tableaux XVI et XVII ci-dessous.
Tableaux XVI : Liste des amorces ayant servi à diagnostiquer les souris vaccinées par la souche Neo ncmic1-3 KO et les souris infectées par la souche NC-1 de N.
caninum.
Nom de l'amorce Séquence 5' ¨> 3' n de séquence n de PCR
ORF NCmic3 F TTTCCCTTCTAAACACAGTCG SEQ ID NO: 7 1 CCTTCAGTGGTTCTCCATGAG SEQ ID NO: 8 1 ORF NCmic3 R T
ORF DHFR F
CCTTCTCAGACAACGGGGTA SEQ ID NO: 9 2 ORF DHFR R
AGATCTTCACGCCCTTCTCA SEQ ID NO: 10 2 stop Ncmicl TTACAATTCAGATTCACCCG SEQ ID NO: 39 3 ORF NCmicl R TTCTCCAGGCACTCACCT SEQ ID NO:

ORF CATGFP F3 TTCATCATGCCGTTTGTGAT SEQ ID NO: 49 4 stop CATGFP
TTAATCGAGCGGGTCCTGGT SEQ ID NO: 42 4 Tableaux XVII : Taille des amplicons obtenus en paires de bases des différentes PCR permettant le diagnostic différentiel entre des souris vaccinées par la souche Neo ncmic1-3 KO et les souris infectées par la souche NC-1 de N. caninum.

n de PCR Neo ncmicl-3 KO Neospora caninum (NC-1) Les amplicons obtenus par PCR à partir des échantillons issus de souris vaccinées et ceux obtenus à partir des échantillons issus de souris challengées par la souche NC-1 (Figure 14) sont conformes aux profils attendus et mettent en évidence :
= l'absence des gènes ncmic3 et ncmicl et la présence des cassettes DHFR
et CATGFP pour les échantillons issus de souris vaccinées avec la souche mutante Neo ncmicl-3 KO
= la présence des gènes ncmic3 et ncmicl et l'absence des cassettes DHFR
et CATGFP pour les échantillons issus de souris infectés avec la souche NC-1 de N. caninum.
Ces résultats confirment la possibilité de différencier les animaux vaccinés des animaux infectés.

Claims (13)

REVENDICATIONS
1. Souche mutante de Neospora spp, dans laquelle la fonction de la protéine NcMIC3 et, éventuellement, la fonction de la protéine NcMIC1, est supprimée.
2. Souche mutante de Neospora spp selon la revendication 1, dans laquelle la fonction de la protéine NcMIC3 et la fonction de la protéine NcMIC1 sont supprimées.
3. Souche mutante de Neospora spp selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans laquelle la fonction de la protéine NcMIC3 est supprimée par :
- une mutation, une délétion ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans la séquence nucléotidique du gène ncmic3 ou dans une séquence nucléotidique qui conditionne l'expression de la protéine NcMIC3 ou, - une déstabilisation de l'ARN messager résultant de la transcription du gène ncmic3 ou, - une inhibition de la traduction de l'ARN messager du gène ncmic3 ou d'une séquence nucléotidique qui conditionne l'expression de la protéine NcMIC3.
4. Souche mutante de Neospora spp selon l'une quelconque des revendications 1 à
3, dans laquelle :
- la fonction de la protéine NcMIC3 est supprimée par une mutation, une délétion ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans la séquence nucléotidique du gène ncmic3 et, éventuellement, - la fonction de la protéine NcMIC1 est supprimée par une mutation, une délétion ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans la séquence nucléotidique du gène ncmic 1 .
5. Souche mutante de Neospora spp selon la revendication 4, dans laquelle :
- la fonction de la protéine NcMIC3 est supprimée par une mutation, une délétion ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans la séquence nucléotidique du gène ncmic3 et, - la fonction de la protéine NcMIC1 est supprimée par une mutation, une délétion ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans la séquence nucléotidique du gène ncmic1.
6. Souche mutante de Neospora spp selon la revendication 4, dans laquelle :
- la fonction de la protéine NcMIC3 est supprimée par la délétion de tout ou partie du gène ncmic3 ou de sa région promotrice et, éventuellement, - la fonction de la protéine NcMIC1 est supprimée par la délétion de tout ou partie du gène ncmic1 ou de sa région promotrice.
7. Souche mutante de Neospora spp selon la revendication 6, dans laquelle :
- la fonction de la protéine NcMIC3 est supprimée par la délétion de tout ou partie du gène ncmic3 ou de sa région promotrice et, - la fonction de la protéine NcMIC1 est supprimée par la délétion de tout ou partie du gène ncmic1 ou de sa région promotrice.
8. Souche mutante de Neospora spp selon l'une quelconque des revendications 1 à
3, dans laquelle :
- la fonction de la protéine NcMIC3 est supprimée par une mutation, une délétion ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans une séquence nucléotidique qui conditionne l'expression de la protéine NcMIC3 et, éventuellement, - la fonction de la protéine NcMIC1 est supprimée par une mutation, une délétion ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans une séquence nucléotidique qui conditionne l'expression de la protéine NcMIC1, et, notamment, dans laquelle :
- la fonction de la protéine NcMIC3 est supprimée par une mutation, une délétion ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans une séquence nucléotidique qui conditionne l'expression de la protéine NcMIC3, et - la fonction de la protéine NcMIC1 est supprimée par une mutation, une délétion ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans une séquence nucléotidique qui conditionne l'expression de la protéine NcMIC1.
9. Souche mutante de Neospora spp selon l'une quelconque des revendications 1 à
8, ladite souche mutante étant une souche mutante de Neospora caninum.
10. Composition pharmaceutique comprenant une souche mutante selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
11. Composition pharmaceutique selon la revendication 10, laquelle est administrée en une dose unitaire variant de 102 à 109 tachyzoïtes d'une souche mutante telle que définie selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.
12. Composition vaccinale comprenant une souche mutante telle que définie selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour le traitement de la néosporose chez les animaux de compagnie, tels que les chiens et les chevaux et les animaux de rentes, tels que les ovins, les caprins, les bovins, les porcins, les camélidés et les cervidés.
13. Procédé in vitro de diagnostic différentiel pour discriminer un mammifère vacciné
par les compositions telles que définies selon les revendications 10 à 12 d'un mammifère non vacciné, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :
i) détermination de la concentration en anticorps anti-NcMIC1 et/ou anti-NcMIC3 et/ou anti-DHFR et/ou anti-CAT-GFP, et/ou, détermination de la concentration en antigène NcMIC1 et/ou NcMIC3 et/ou DHFR et/ou CAT-GFP, ii) détermination du niveau d'expression des gènes ncmic1, ncmic3, dhfr et/ou cat-gfp, et/ou, détermination de la présence ou de l'absence des gènes ncmicl, ncmic3, dhfr et/ou cat-ep, dans un échantillon biologique du susdit mammifère.
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