CA2992149C - Biomasse de thraustochytrides enrichie en huiles et en proteines, procede de culture et utilisations - Google Patents

Abstract

L'invention se place le domaine des cultures de microalgues particulièrement des Thraustochytrides. Elle a pour objet une biomasse de Thraustochytrides riche en protéines et contenant des acides gras polyinsaturés tel que du DHA, son procédé d'obtention et ses utilisations.

Description

1 Biomasse de Thraustochytrides enrichie en huiles et en proteines, procede de culture et utilisations 5 DOMAINE DE L'INVENTION L'invention se place dans le domaine des cultures de microalgues particulierement des Thraustochytrides.

Elle a pour objet une biomasse de Thraustochytrides riche en proteines et en lipides, et eventuellement comprenant des caroteno"ides, son procede d'obtention et ses utilisations dans l'alimentation. 10 ETAT DE LA TECHNIQUE On connait plusieurs sources de proteines et des sources de lipides d'origine vegetale pour leur utilisation dans l'alimentation humaine ou animale, directement ou comme complements alimentaires, pour apporter aux animaux et humains des acides amines necessaires a leur metabolisme.

Par "sources de proteines", on entend des sources d'acides 15 amines disponibles pour les animaux ou humains une fois les aliments ingeres.

Les lipides, en particulier les acides gras polyinsatures ("polyunsaturated fatty acids en anglais" ou PUFAs), ont un interet en tant que source d'energie, ainsi que pour leurs proprietes therapeutiques.

Parmi les acides gras polyinsatures, certains hautement insatures (AGHI) de la serie des omega-3 (PUFA-w3), en particulier, l'acide eicosapentaeno"ique (EPA ou C20 20 :5 w3) et l'acide docosahexaeno"ique (DHA ou C22 :6 w3), et de la serie des omega-6 (PUFA-w6), en particulier, l'acide arachidonique (ARA ou AA ou encore acide eicosatetraeno"ique C20 :4 w6) ont une importance nutritionnelle reconnue et presentent de fortes potentialites en terme d'applications therapeutiques. II serait done souhaitable de pouvoir fournir des nouvelles sources de proteines et de PUFAs pour leur utilisation dans 25 l'alimentation animale et humaine.

Des sources qui contiennent des proteines ainsi que des lipides, en particulier, des PUFAs, presenteraient des avantages considerables.

Comme sources de proteines, on connait la farine de poissons, sous-produit de la peche, relativement riche en proteines mais pauvre en lipides (on peut citer des teneurs d'environ 8% en matiere seche) 30 La plus connue des sources de proteines vegetales employee dans l'alimentation animale est le soja, generalement employe sous forme de tourteaux, residu solide restant apres extraction de l'huile.

Toutefois, l'emploi de tourteaux de soja presente plusieurs inconvenients associes a leur origine, notamment de varietes de soja genetiquement modifiees (OGM),.

En outre, le soja, comme de nombreuses sources de proteines vegetales, 35 n'est pas une source de lipides tels que des PUFAs.

On connait d'autres sources de proteines vegetales, notamment la spiruline ou la chlorelle, employees comme complements alimentaires chez l'homme. 2 La spiruline, comme la chlorelle, presentent toutefois !'inconvenient d'une faible productivite en proteine qui ne permet pas le passage a une culture en fermenteur a rendement eleve.

Leur culture ne permet pas de repondre a un objectif de production industrielle plus large, economiquement viable, d'une source de proteines alimentaires dont 5 les qualites lui permettront de remplacer les sources usuelles comme le soja dans l'alimentation des animaux et de l'homme.

De plus, la chlorelle et la spiruline ont un contenu tres faible en PUFAs.

Comme les proteines et les lipides, les caroteno"ides presentent egalement un interet dans les nutritions animale et humaine. 10 Souvent, la production de ces pigments a grande echelle demande une main d'reuvre intensive et de grandes surfaces de production ..

Par ailleurs aujourd'hui, aucune des sources de proteines, ni d'acides gras citees, ne contient des quantites importantes de caroteno"ides.

De nouvelles sources de caroteno"ides, notamment de luteine, de fucoxanthine, 15 d'astaxanthine, de zeaxanthine, de cantaxanthine, d'echinenone, de beta-carotenes et de phoenicoxanthine doivent done etre recherchees afin de repondre a la demande croissante du marche pour ces molecules.

Les protistes connus pour repondre a une capacite de production industrielle en fermenteurs, sont employes depuis longtemps pour la production de matieres grasses riches 20 en acides gras polyinsatures comme le DHA ou l'EPA, par exemple WO 97/37032, WO 2015/004402 ou WO 2012/17027.

Certains protistes sont capables, sous certaines conditions, de produire des caroteno"ides.

Cependant, les biomasses obtenues jusqu'a maintenant, y compris apres extraction des matieres grasses, ne contenaient pas de teneurs suffisantes en proteines pour permettre leur usage comme source de proteines dans 25 l'alimentation, pour le moins sans etapes additionnelles d'enrichissement en proteines economiquement co0teuses.

L'un des buts que vise !'invention est de fournir une nouvelle source de proteines et de lipides, en particulier des PUFAs pour l'alimentation animale ou humaine repondant a un objectif de production industrielle large, economiquement viable.

Cette source de proteines 30 et de PUFAs peut egalement comprendre des caroteno"ides, en particulier, des carotenes (a, 13, £, y, o ou ~-carotene, lycopene et phytoene) et les xanthophylles (astaxanthine, antheraxanthine, citranaxanthine, cryptoxanthine, canthaxanthine, diadinoxanthine, diatoxanthine, flavoxanthine, fucoxanthine, luteine, neoxanthine, phoenicoxanthine, rhodoxanthine, rubixanthine, siphonaxanthine, violaxanthine, zeaxanthine ). 35 L'invention montre que dans certaines conditions de culture, les Thraustochytrides, connus pour leur utilisation dans la production d'huiles a fortes teneurs en acides gras polyinsatures (DHA et EPA, notamment) sont des microorganismes aptes a produire une 3 grande quantite de proteines, pour l'alimentation animale et une source proteique de haute valeur pour la nutrition humaine.

Les inventeurs, ont pu determiner des conditions de culture permettant l'obtention d'une forte teneur en proteines tout en gardant une teneur en lipides d'au moins 20% (par rapport a la matiere seche), dont 25-60%, de PUFAs. lls ont aussi pu 5 determiner des conditions de culture permettant d'orienter des cellules vers la production des caroteno"ides en plus des proteines et des PUFAs.

EXPOSE DE L'INVENTION Ainsi, !'invention a pour objet premier une biomasse de Thraustochytrides pouvant comprendre, en poids par rapport au poids de la matiere seche, au moins 20% de proteines, 10 preferentiellement au moins 30% de proteines, pouvant aller jusqu'a plus de 40% de proteines, voire plus de 60% de proteines en poids par rapport au poids de la matiere seche.

La biomasse peut contenir, de maniere generale, entre 35% et 65% de proteines, en particulier, de 45% a 55% de proteines par rapport au poids de la matiere seche.

Les pourcentages en poids en proteines peuvent etre exprimes tant par rapport aux 15 proteines elles-memes que par rapport aux acides amines contenus dans lesdites proteines.

Les pourcentages indiques ici sont calcules par la somme des acides amines totaux contenus dans la biomasse (norme ISO 13903 :2005) et non pas a partir de l'azote total.

Par exemple, un analyseur d'acides amines peut etre utilise pour mesurer les acides amines totaux.

Le tryptophane est dose a part, sa valeur est ensuite additionnee a la somme des 20 autres acides amines pour obtenir la somme des acides amines totaux.

En outre, ladite biomasse peut comprendre, en poids par rapport au poids de la matiere seche, au moins 20% de matiere grasse, preferentiellement au moins 30% de matiere grasse.

Cette matiere grasse peut contenir entre 25% et 60%, de preference, entre 40% et 60% de PUFAs, tels que de l'ARA, du DHA et/ou de l'EPA.

Selon un mode de realisation de 25 !'invention, le DHA peut etre le PUFA prefere.

Selon certains modes de realisation de !'invention, ladite biomasse peut comprendre egalement entre 5 et 250 ppm (ng/mg de matiere seche), de preference entre 150 et 200 ppm de caroteno"ides.

L'invention concerne egalement un procede de production d'une biomasse telle que 30 definie ci-dessus et ci-apres, caracterise en ce qu'il comprend : a. une premiere etape de culture des Thraustochytrides dans des conditions de heterotrophie ou mixotrophie dans un milieu de culture approprie, a une temperature comprise entre environ 24 °C et 35°C et dans des conditions pouvant favoriser la production de proteines a une teneur d'au moins 35% de proteines en poids par rapport au poids de la 35 matiere seche ; b. une deuxieme etape de culture dans des conditions d'heterotrophie ou de mixotrophie a une temperature comprise entre environ 18°C et 25°C et inferieure a celle de l'etape a) 4 dans des conditions pouvant favoriser !'accumulation de matiere grasse jusqu'a au moins 20%, de preference au moins 30%, et pouvant favoriser !'accumulation du DHA au sein de la matiere grasse jusqu'a au moins 25%, de preference au moins 35% de la matiere grasse jusqu'a l'obtention d'une densite de culture d'au moins 40 g/L en matiere seche, 5 preferentiellement au moins 60 g/L, plus preferentiellement au moins 80 g/L ; c. une troisieme etape de recuperation de la biomasse obtenue a la deuxieme etape par separation de ladite biomasse du milieu de culture (la recolte) ; cette etape peut etre suivie d'une homogeneisation et, le cas echeant d. une quatrieme etape de sechage de la biomasse recuperee a la troisieme etape. 10 Le temps de culture peut-etre, de maniere generale, compris entre 40 et 100 heures, de preference entre 65 et 96 heures, par exemple, 70, 84 ou 96 heures.

La methode de culture objet de !'invention peut permettre de maniere generale d'atteindre une concentration en biomasse superieure a 100 g/L, voire 120 g/L.

Dans la premiere etape a), les cellules peuvent etre cultivees pendant environ 18-30 15 heures, de preference pendant 24h.

Apres cette premiere etape de culture, par exemple, a partir d'environ 24h de culture, la temperature peut etre abaissee a environ 18-24°C (pour demarrer l'etape b)).

Cette baisse en temperature peut favoriser la production des acides gras et eventuellement des caroteno"ides.

La culture a basse temperature peut etre en general poursuivie jusqu'a entre environ 50 et 70 heures de culture, et en tout cas de 20 preference, jusqu'a la fin de la culture.

On peut eventuellement induire la production des caroteno"ides pendant la culture, de preference, pendant l'etape b).

Pour cela, des conditions mixotrophiques avec une lumiere, de preference, bleue a environ 435-475nm, de preference 455 nm, peuvent etre appliquees.

Des caroteno"ides tels que l'astaxanthine, la canthaxanthine, le beta-carotene et la 25 phoenicoxanthine, peuvent etre produits avec ces longueurs d'onde.

La lumiere peut etre, de maniere generale, appliquee pour au moins 18 heures, de preference pour au moins 24 heures.

Selon un mode de realisation prefere de !'invention, la lumiere peut etre appliquee a la culture a partir de 24 a 50 heures, plus preferentiellement, a partir de 45 heures de culture et 30 jusqu'a la fin de la culture.

L'invention concerne aussi !'utilisation d'une biomasse telle que ci-dessus ou ci-apres, dans les domaines de l'alimentation humaine ou animale, notamment en aquaculture.

L'invention concerne aussi !'utilisation d'une biomasse telle que ci-dessus ou ci-apres, pour !'amelioration de la performance des animaux.

Ladite performance peut etre evaluee par la 35 mesure de l'indice de consommation, du gain de poids ou encore du "Feed Conversion Ratio", tous connus a l'homme de metier.

L'invention concerne aussi un aliment comprenant une telle biomasse qui permet a la fois d'augmenter sa valeur et sa densite nutritionnelle.

L'invention concerne egalement la biomasse selon !'invention pour son utilisation en therapie, notamment dans le traitement et dans la prevention de la malnutrition. 5 Elle concerne egalement des compositions cosmetique ou pharmaceutique pour l'homme ou les animaux et des aliments, ou compositions alimentaires pour l'homme ou les animaux, qui comprennent une biomasse selon !'invention.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Par "mutants", on entend un organisme derive de la souche originelle dont le patrimoine 10 genetique a ete modifie soit par un processus naturel, soit par des methodes physicochimiques connues par l'homme de l'art pouvant generer des mutations aleatoires (UV etc.), soit par des methodes de genie genetique.

Par "conditions de mixotrophie" ou par "en mode mixotrophe", on entend une culture avec un apport de lumiere et un apport en substrat carbone organique et dans l'obscurite. 15 Par "conditions de mixotrophie a dominante heterotrophe", on entend des conditions d'illumination dans lequel la majeure partie de l'energie pour la croissance des cellules est fourni par une source de carbone organique, mais dans lequel la lumiere a un impact sur la croissance et/ ou la composition des cellules.

Cette lumiere peut etre fournie soit en continu, avec ou sans variations d'intensite, ou de fac;on discontinue avec des periodes d'obscurite 20 entre les periodes d'eclairage, dans la mesure ou ii y a un effet sur le metabolisme des cellules exposees a ladite illumination.

La periodicite de la variation de l'intensite ou de discontinuites peut etre reguliere au cours du temps, ou peut etre modifie avec les differentes phases de la croissance cellulaire.

La mixotrophie a dominante heterotrophe permet de produire des molecules d'interet en couplant a la fois les avantages de 25 l'autotrophie et de l'heterotrophie.

Sous ces conditions, comme en heterotrophie, le substrat organique nourrit les microalgues pour produire de grandes quantites de biomasse, mais le chloroplaste et les autres organites capteurs d'energie lumineuse de la cellule sont actives.

La lumiere agit comme signal pouvant induire une reponse du metabolisme, par exemple la synthese de pigments. 30 Le terme "de caroteno"ide" regroupe les carotenes (a, 13, £, y, o ou ~-carotene, lycopene et phytoene) et les xanthophylles (astaxanthine, antheraxanthine, citranaxanthine, cryptoxanthine, canthaxanthine, diadinoxanthine, diatoxanthine, flavoxanthine, fucoxanthine, luteine, neoxanthine, rhodoxanthine, rubixanthine, siphonaxanthine, violaxanthine, zeaxanthine). 35 On entend avantageusement par "biomasse" selon !'invention, un ensemble de cellules de Thraustochytrides produites par la culture desdits protistes, et presentant les teneurs en 6 proteines, en acides gras, et eventuellement en caroteno'ides, decrites dans le present texte, cellules qui peuvent avoir conserve ou non leur integrite physique.

On comprend done que ladite biomasse peut comprendre une quantite de cellules de Thraustochytrides degradees allant de 0% a 100%.

Par "degrade", on entend que lesdites 5 cellules de Thraustochytrides peuvent avoir vu leur structure et/ou leur composition modifiees.

Par exemple, elles peuvent avoir subi une etape de sechage ou alors une etape de recolte de leur huile, !'important etant que la biomasse comprenant ces cellules presente les teneurs en proteines, en acides gras, et eventuellement en caroteno'ides, decrites dans le present texte. 10 Selon un mode prefere de realisation de !'invention, la biomasse n'a pas subi de traitements qui modifient sa composition en acides amines au cours ou apres recolte, c'est a dire que les traitements que peut subir cette biomasse apres recolte ne viennent pas en alterer la composition en acides amines.

En particulier, la biomasse n'a pas subi d'etape d'enrichissement en proteines et en acides amines.

Ces derniers proviennent de la 15 croissance de cellules dans leur milieu de culture. C'est une biomasse dite « sans proteines ajoutees ».

Selon un mode plus prefere de !'invention, la biomasse n'a pas subi de traitements qui modifient sa composition en acides amines et en matiere grasse, et le cas echeant en caroteno'ides, c'est a dire que les traitements que subit cette biomasse apres recolte ne 20 viennent pas en alterer la composition en acides amines et en matieres grasses, et eventuellement en caroteno'ides.

En particulier, la composition relative des acides amines par rapport a la matiere grasse reste substantiellement constante.

Les acides gras, comme les proteines, proviennent de la seule culture des cellules dans leur milieu de culture.

Sans enrichissement en acides gras, la biomasse est dite egalement « sans acides gras ajoutes ». 25 II a ete observe dans certains cas que les Thraustochytrides non degrades dans la biomasse selon !'invention peuvent presenter de meilleures proprietes de conservation et de digestibilite que des Thraustochytrides degrades.

Une des formes preferees de !'invention est une biomasse comprenant une quantite substantiellement majoritaire de Thraustochytrides qui ne sont pas degrades. 30 Par "degrade", on entend selon !'invention des Thraustochytrides dont l'integrite structurelle et/ou chimique a pu etre alteree comme par exemple des Thraustochytrides lyses, resultant par exemple d'un procede d'homogeneisation.

II n'en demeure pas moins evident qu'une fois produite, ladite biomasse pourra etre utilisee brute, sechee ou non, ou alors subir tout traitement necessaire a son utilisation, 35 notamment homogeneisee.

Selon !'invention, ladite biomasse peut presenter, en poids par rapport au poids de la matiere seche, un taux d'humidite de 1 % a 95%. 7 Preferentiellement selon un mode de realisation de !'invention, ladite biomasse peut presenter, en poids par rapport au poids de la matiere seche, un taux d'humidite de 70% a 90%, preferentiellement 80% a 85%.

Preferentiellement encore selon un deuxieme mode de realisation de !'invention, ladite 5 biomasse peut presenter, en poids par rapport au poids de la matiere seche, un taux d'humidite de 1 % a 10%, preferentiellement de 2% a 7%.

Selon !'invention, lesdits Thraustochytrides peuvent etre de l'ordre des Thraustochytriales, preferentiellement de la sous-classe des Thraustochytriaceae, encore plus preferentiellement d'un genre pouvant etre choisi dans le groupe comprenant les genres 10 Aurantiochytrium, Aplanochytrium, Botryochytrium, Japonochytrium, Oblongichytrium, Parietichytrium, Schizochytrium, Sicyoidochytrium, Thraustochytrium et Ulkenia.

Les Thraustochytrides sont des microorganismes non genetiquement modifies ou aussi des microorganismes genetiquement modifies.

Dans l'eventualite ou des Thraustochytrides genetiquement modifies seraient employes, ils ne contiennent pas de genes codant pour une 15 ou plusieurs enzymes qui permettent de degrader ou digerer la biomasse en vue de son utilisation comme aliment.

Avantageusement, lesdits Thraustochytrides peuvent etre choisis parmi les especes Aplanochytrium kerguelense ; Aplanochytrium minuta Aplanochytrium stocchinoi ; Aplanochytrium sp. PR24-1 ; Aurantiochytrium limacinum ; Aurantiochytrium limacinum 20 AB022107 ; Aurantiochytrium limacinum HM042909 ; Aurantiochytrium limacinum JN986842 ; Aurantiochytrium limacinum SL 1101 JN986842 ; Aurantiochytrium mangrovei Aurantiochytrium mangrovei DO323157 ; Aurantiochytrium mangrovei DO356659 Aurantiochytrium mangrovei DO367049 ; Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/2 Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/3 Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/4 25 Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/5 Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/6 Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/1 Aurantiochytrium sp. AB052555 Aurantiochytrium sp. AB073308 ; Aurantiochytrium sp. ATCC PRA276 DO836628 Aurantiochytrium sp. BL 10 FJ821477; Aurantiochytrium sp. LY 2012 PKU Mn5 JX847361 Aurantiochytrium sp. L Y2012 JX847370 ; Aurantiochytrium sp. N1-27; Aurantiochytrium sp. 30 SD116; Aurantiochytrium sp. SEK209 AB290574; Aurantiochytrium sp. SEK217 AB290572 ; Aurantiochytrium sp. SEK 218 AB290573; Aurantiochytrium sp. 18W-13a; Botryochytrium radiatum ; Botryochytrium radiatum Raghukumar 16 ; Botryochytrium radiatum SEK353 ; Botryochytrium sp. ; Botryochytrium sp. BUTRBC 143 ; Botryochytrium sp.

Raghukumar 29 ; Oblongichytrium minutum ; Oblongichytrium multirudimentalis ; Oblongichytrium sp. ; 35 Oblongichytrium sp. SEK347 ; Parieticytrium sarkarianum ; Parieticytrium sarkarianum SEK351 ; Parieticytrium sarkarianum SEK364 ; Parieticytrium sp. ; Parieticytrium sp. F3-1 ; Parieticytrium sp. H1-14 ; Parieticytrium sp. NBRC102984 ; Phytophthora infestans ; 8 Schizochytrium aggregatum D0323159 ; Schizochytrium aggregatum D0356661 ; Schizochytrium aggregatum ; Schizochytrium limacinum ; Schizochytrium limacinum OUC166 HM042907 ; Schizochytrium mangrovei ; Schizochytrium mangrovei FB1 ; Schizochytrium mangrovei FB3 ; Schizochytrium mangrovei FB5 ; Schizochytrium minutum ; 5 Schizochytrium sp. ATCC20888 D0367050 ; Schizochytrium sp. KGS2 KC297137 ; Schizochytrium sp. SKA 10 JQ248009 ; Schizochytrium sp. ATCC 20111 ; Schizochytrium sp.

ATCC 20888 ; Schizochytrium sp. ATCC 20111 D0323158* ; Schizochytrium sp. ATCC 20888 D0356660 ; Schizochytrium sp. ATCC 20889 ; Schizochytrium sp. ATCC 26185 ; Schizochytrium sp. BR2.1.2 ; Schizochytrium sp. BUCAAA 032 ; Schizochytrium sp. 10 BUCAAA 093 ; Schizochytrium sp. BUCACD 152 ; Schizochytrium sp. BUCARA 021 ; Schizochytrium sp. BUCHAO 113 ; Schizochytrium sp. BURABQ 133 ; Schizochytrium sp.

BURARM 801 ; Schizochytrium sp. BURARM 802 ; Schizochytrium sp. CCAP 4087/3 ; Schizochytrium sp. CCAP 4087 /1 ; Schizochytrium sp. CCAP 4087 /4 ; Schizochytrium sp.

CCAP 4087/5 ;Schizochytrium sp. FJU-512; Schizochytrium sp. KH105 ; Schizochytrium sp. 15 KK17-3; Schizochytrium sp. KR-5; Schizochytrium sp. PJ10.4; Schizochytrium sp. SEK 210 ; Schizochytrium sp. SEK 345 ; Schizochytrium sp. SEK 346 ; Schizochytrium sp. SR21 ; Schizochytrium sp. TI001 ; Sicyoidochytrium minutum SEK354 ; Sicyoidochytrium minutum NBRC 102975Sicyoidochytrium minutum NBRC 102979 Thraustochytriidae sp.

BURABG162 D0100295 ; Thraustochytriidae sp. CG9 ; Thraustochytriidae sp. LY2012 20 JX847378 ; Thraustochytriidae sp. MBIC11093 AB183664 ; Thraustochytriidae sp. NIOS1 AY705769; Thraustochytriidae sp. #32 D0323161 ; Thraustochytriidae sp. #32 D0356663; Thraustochytriidae sp. RT49 D0323167 ; Thraustochytriidae sp. RT49 D0356669 ; Thraustochytriidae sp. RT49 ; Thraustochytriidae sp.

Thel2 D0323162 ; Thraustochytriidae sp.

Thel2 ; Thraustochytrium aggregatum ; Thraustochytrium aggregatum D0356662 ; 25 Thraustochytrium aureum ; Thraustochytrium aureum D0356666 ; Thraustochytrium gaertnerium Thraustochytrium kinnei Thraustochytrium kinnei D0323165 Thraustochytrium motivum ; Thraustochytrium multirudimentale ; Thraustochytrium pachydermum ; Thraustochytrium roseum ; Thraustochytrium sp. 13A4.1 ; Thraustochytrium sp. ATCC 26185 ; Thraustochytrium sp. BL 13 ; Thraustochytrium sp. BL 14 30 Thraustochytrium sp. BL2 Thraustochytrium sp. BL3 Thraustochytrium sp. BL4 Thraustochytrium sp. BL5 Thraustochytrium sp. BL6 Thraustochytrium sp. BL 7 Thraustochytrium sp. BL8 ; Thraustochytrium sp. BL9 ; Thraustochytrium sp. BP3.2.2 Thraustochytrium sp. BP3.3.3 ; Thraustochytrium sp. caudivorum ; Thraustochytrium sp.

CHN-1 ; Thraustochytrium sp. FJN-10 ; Thraustochytrium sp. HK1 ; Thraustochytrium sp. 35 HK10; Thraustochytrium sp. HK5; Thraustochytrium sp. HK8 ; Thraustochytrium sp. HK8a; Thraustochytrium sp. KK17-3 ; Thraustochytrium sp. KL 1 ; Thraustochytrium sp. KL2 ; Thraustochytrium sp. KL2a; Thraustochytrium sp. ONC-T18 ; Thraustochytrium sp. PJA 10.2 9 ; Thraustochytrium sp. TR 1.4 ; Thraustochytrium sp. TRR2 ; Thraustochytrium striatum ; Thraustochytrium stria tum A TCC244 73 Thraustochytrium striatum DO323163 Thraustochytrium striatum DO356665 ; Thraustochytrium visurgense ; Ulkenia amoeboidea SEK 214 ; Ulkenia profunda ; Ulkenia profunda BUTRBG 111 ; Ulkenia sp ; Ulkenia sp. 5 ATCC 28207; Ulkenia visurgensis; Ulkenia visurgensis BURAAA 141 ; Ulkenia visurgensis ATCC 28208.

Preferentiellement selon !'invention les Thraustochytrides peuvent etre choisis parmi les genres Aurantiochytrium et Schyzochitrium, preferentiellement parmi les especes Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/2 deposee le 20 mai 2014 a la CCAP, 10 Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/3 deposee le 20 mai 2014 a la CCAP, Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/4 deposee le 20 mai 2014 a la CCAP, Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/5 deposee le 20 mai 2014 a la CCAP, Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/6 deposee le 20 mai 2014 a la CCAP, Aurantiochytrium CCAP 4062/1 deposee le 21 juin 2013 a la CCAP, 15 Schizochytrium sp. CCAP 4087/3 deposee le 20 mai 2014 a la CCAP, Schizochytrium sp. CCAP 4087/1 deposee le 28 fevrier 2012 a la CCAP, Schizochytrium sp. CCAP 4087/4 deposee le 20 mai 2014 a la CCAP et Schizochytrium sp. CCAP 4087/5 deposee le 20 mai 2014 a la CCAP.

Tous les depots ont ete faits a la CCAP (CULTURE COLLECTION OF ALGAE AND 20 PROTOZOA (CCAP), SAMS Research Services Ltd., Scottish Marine Institute, OBAN, Argyl PA37 1 QA United Kingdom) selon les dispositions du traite de Budapest.

Selon des modes de realisation preferes de !'invention, la biomasse peut avoir une teneur en proteines, en poids par rapport au poids de la matiere seche, d'au moins 30%, de preference d'au moins 40%, tres preferentiellement de 35% a 55%.

Selon des modes de 25 realisation preferes de !'invention la biomasse peut avoir une teneur en proteines, en poids par rapport au poids de la matiere seche comprise entre 35% et 65%.

Selon des modes de realisation preferes de !'invention, la biomasse peut avoir une teneur en matiere grasse, en poids par rapport au poids de la matiere seche, d'au moins 20%, preferentiellement d'au moins 30%, dont 25% a 60%, de preference, 40% a 60% de 30 PUFAs.

En particulier, le rapport DHA : proteines (en poids par rapport au poids de la matiere seche) peut etre compris entre 1 : 1,5 et 1 : 9, de preference entre 1 : 2 et 1 : 7, plus preferentiellement entre 1 : 5 et 1 : 6.

Selon certains des modes de realisation preferes de !'invention, la biomasse peut avoir eventuellement une teneur en caroteno"ides, comprise entre 5 et 250 ppm par rapport au 35 poids de la matiere seche, de preference entre 150 et 200 ppm.

La teneur en caroteno"ides peut dependre des conditions d'eclairage mais aussi du milieu de culture et de la conduite du procede.

Par consequent, une meme souche de micro-algue peut produire des quantites de pigments differentes en fonction des conditions de culture.

Selon des modes de realisation preferes de !'invention, ladite biomasse peut etre une biomasse: 5 de Thraustochytrides pouvant etre choisis parmi les genres Aurantiochytrium et Schizochytrium, preferentiellement parmi les especes Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/2 Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/3 Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/4 Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/5 Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/6 ; Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/1 ; Schizochytrium sp. CCAP 4087 /3 ; 10 Schizochytrium sp. CCAP 4087 /1 ; Schizochytrium sp. CCAP 4087 /4 ; Schizochytrium sp.

CCAP 4087/5 ; et pouvant presenter: - une teneur en proteines, en poids par rapport au poids de la matiere seche, d'au moins 30%, de preference d'au moins 40%, tres preferentiellement de 35% a 55%, ou 45% a 55%; 15 - une teneur en matiere grasse, en poids par rapport au poids de la matiere seche, d'au moins 20%, preferentiellement d'au moins 30%, dont 25 a 60%, de preference, 40 a 60% de PUFAs; - eventuellement une teneur en caroteno"ides, comprise entre 5 et 250 ppm par rapport au poids de la matiere seche, de preference entre 150 et 200 ppm ; et 20 - un taux d'humidite avant sechage compris entre 70% et 90%, preferentiellement entre 80% et 85% ou un taux d'humidite apres sechage compris entre 1 % et 10%, preferentiellement entre 2% et 7%.

Les teneurs et types de caroteno"ides obtenus peuvent etre controles par le choix de la longueur d'onde de la lumiere incidente, ainsi que par les conditions d'illumination.

Les 25 caroteno"ides tels que la luteine, la fucoxanthine, l'astaxanthine, la zeaxanthine, la canthaxanthine, l'echinenone, le beta-carotene et la phoenicoxanthine peuvent etre produits selon des modes de realisation de !'invention.

Pour induire la production des caroteno"ides choisis parmi l'astaxanthine, la canthaxanthine, le beta-carotene et la phoenicoxanthine, la culture est exposee a une lumiere bleue (environ 435-475 mn, de preference 455 nm).

Selon 30 un mode de realisation, les caroteno"ides peuvent avoir une teneur par rapport a la matiere grasse en astaxanthine entre 5% et 30%, une teneur en phoenicoxanthine entre 15% et 30% et une teneur en beta-carotenes entre 0% et 30%.

L'invention a aussi pour objet une procede de production d'une biomasse telle que decrite precedemment qui comprend : 35 a. une premiere etape de culture en heterotrophie ou en mixotrophie des Thraustochytrides dans un milieu de culture approprie, a une temperature comprise entre environ 24°C et 35°C et dans des conditions pouvant favoriser la production de proteines a 11 une teneur d'au moins 35% de proteines en poids par rapport au poids de la matiere seche en conditions ; b. une deuxieme etape de culture en heterotrophie ou en mixotrophie a une temperature entre environ 18°C et 25°C et inferieure a celle de l'etape a) dans des conditions pouvant 5 favoriser !'accumulation de matiere grasse jusqu'a au moins 20%, de preference au moins 30%, et pouvant favoriser !'accumulation des acides gras polyinsatures (PUFAs), de preference du DHA, et/ou de l'EPA, et/ou de l'ARA, au sein de la matiere grasse jusqu'a au moins 25%, de preference au moins 35% de la matiere grasse, et eventuellement favorisant la production des caroteno"ides, jusqu'a l'obtention d'une densite de culture d'au moins 40 10 g/L en matiere seche, preferentiellement au moins 60 g/L, plus preferentiellement au moins 80 g/L; c. une troisieme etape de recuperation de la biomasse obtenue a la deuxieme etape par separation de ladite biomasse du milieu de culture (la recolte); et, le cas echeant d. une quatrieme etape de sechage de la biomasse recuperee a la troisieme etape. 15 De maniere preferentielle, l'etape a) de culture des Thraustochytrides peut etre mise en reuvre dans un milieu de culture et dans des conditions appropriees pour favoriser la production de proteines.

De maniere generale, ledit milieu de culture approprie peut etre un milieu de culture connu de l'homme de metier pour la culture des Thraustochytrides, en l'adaptant pour les 20 cellules qui ne se trouvent pas en carence d'azote durant l'etape a).

On peut citer en tant qu'exemple les milieux a base de sels marins complementes avec une source de carbone.

On peut citer par exemple le milieu de type Verduyn modifie (sels marins 15 g/L, (NH4)2SO4 3g/L , KH2PO4 1 g/L, MgSO4 7H20, 0,5 g/L, Na2EDTA 24 mg/L, ZnSO4·?H2O 3 mg/L, MnCl2·2H2O 3 mg/L, Na2MoO4·2H2O 0,04 mg/L, FeSO4·?H2O 10mg/L, pantothenate 25 3,2 mg/L, hydrochlorure de thiamine 9,5 mg/L, vitamine B 12 0, 15 mg/L).

On peut egalement citer des milieux de culture de type, ATCC790 MB2216 ou F/2.

Selon un mode de realisation de !'invention, ledit milieu de culture approprie peut etre, de preference, un milieu de culture chimiquement defini qui peut comprendre une source de carbone, une source d'azote, une source de phosphore et des sels. 30 Par "milieu de culture chimiquement defini", on entend selon !'invention un milieu de culture dans lequel la teneur de chaque element est connue.

Precisement, !'invention vise un milieu pouvant ne pas comporter de matieres organiques riches ou complexes.

Par matieres organiques riches ou complexes, on entend des matieres organiques non purifiees, se presentant sous la forme de melanges pour lesquels la composition exacte et les 35 concentrations des divers composants du melange ne sont pas connues avec exactitude, pas maitrisees, et peuvent presenter une variabilite significative d'un lot a un autre.

Comme exemple de matiere organique riche ou complexe, on peut citer les extraits de levure ou les 12 peptones qui sont des produits d'une reaction d'hydrolyse de proteines ou encore les matieres minerales riches comme par exemple les sels mineraux marins ou autres agents de croissance complexes, n'ayant pas de concentration fixe de chacun de leurs composants.

Selon !'invention, ledit milieu defini peut comprendre des sels choisis parmi les sels de 5 calcium, de cobalt, de manganese, de magnesium, de zinc, de nickel, de cuivre, de potassium, de fer, de sodium, et leurs melanges.

Avantageusement, lesdits sels peuvent etre choisis parmi le chlorure de calcium, le chlorure de cobalt, le chlorure de manganese, le sulfate de magnesium, le sulfate de zinc, le sulfate de nickel, le sulfate de cuivre, le sulfate de potassium, le sulfate ferreux, le sulfate de 10 potassium, le molybdate de sodium, le selenite de sodium, le chlorure de sodium et leurs melanges.

Selon un mode de realisation de !'invention et selon les souches employees, le milieu peut egalement comprendre du chlorure de sodium (NaCl), notamment pour certaines souches d'origine marine. 15 Selon ce mode de realisation, on peut citer a titre d'exemple de souches marines pouvant admettre un milieu de culture pouvant comprendre du chlorure de sodium, les souches de Schizochytrium sp., en particulier Schizochytrium sp. CCAP 4062/3 et CCAP4087/4.

Selon un autre mode de realisation de !'invention et selon les souches employees, le 20 milieu peut ne pas comprendre du chlorure de sodium (NaCl), a tout le moins comprendre une quantite de chlorure de sodium tres faible, ayant moins de 3,5 g/L, de preference moins de 1 g/L, plus preferentiellement mo ins de 1 0 mg/L d'ions de sodium et moins de 1 g/L, de preference moins de 500 mg/L, plus preferentiellement 200 mg/L d'ions de chlorure.

Selon ce mode de realisation, on peut citer a titre d'exemple de souches pouvant 25 admettre un milieu de culture pouvant ne pas comprendre du chlorure de sodium (NaCl), a tout le moins comprendre une quantite de chlorure de sodium tres faible, les souches d'Aurantiochytrium mangrovei, en particulier les souches Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/4 et CCAP 4062/1.

Selon un mode de realisation de !'invention, la source de carbone dudit milieu defini peut 30 etre un (ou des) glucide(s), un (ou des) acetate(s), un ou des alcools, une ou des molecules complexes, ou tout melange, en toute proportion d'au moins deux de ces sources.

Par tout melange, en toute proportion d'au moins deux de ces sources, on entend au moins l'un des melanges suivants, en toute proportion : un (ou des) glucide(s) et un (ou des) acetate(s), un (ou des) glucide(s) et un (ou des) alcool(s), un (ou des) glucide(s) et une (ou 35 des) molecule(s) complexe(s), un (ou des) acetate(s) et un (ou des) alcool(s), un (ou des) acetate(s) et une (ou des) molecule(s) complexe(s) et un (ou des) alcool(s) et une (ou des) molecule(s) complexe(s), un (ou des) glucide(s) et un (ou des) acetate(s) et un (ou des) 13 alcool(s), un (ou des) glucide(s) et un (ou des) acetate(s) et une (ou des) molecule(s) complexe(s), un (ou des) glucide(s) et un (ou des) acetate(s) et un (ou des) alcool(s) et une (ou des) molecule(s) complexe(s).

Selon !'invention, ladite source d'azote dudit milieu defini peut-etre choisie parmi un (ou 5 des) sel(s) de nitrate, un (ou des) sel(s) de glutamate, un (ou des) sel(s) d'ammonium, l'uree, l'ammoniaque ou tout melange, en toute proportion d'au moins deux de ces sources.

Par tout melange, en toute proportion d'au moins deux de ces sources, on entend au moins l'un des melanges suivants, en toute proportion : un (ou des) sel(s) de nitrate et un (ou des) sel(s) de glutamate et un (ou des) sel(s) d'ammonium et de l'uree et de l'ammoniaque ; 10 un (ou des) sel(s) de nitrate et un (ou des) sel(s) de glutamate et un (ou des) sel(s) d'ammonium et de l'uree ; un (ou des) sel(s) de nitrate et un (ou des) sel(s) de glutamate et un (ou des) sel(s) d'ammonium et de l'ammoniaque ; un (ou des) sel(s) de nitrate et un (ou des) sel(s) de glutamate et de l'uree et de l'ammoniaque ; un (ou des) sel(s) de nitrate et un (ou des) sel(s) d'ammonium et de l'uree et de l'ammoniaque; un (ou des) sel(s) de nitrate et 15 un (ou des) sel(s) de glutamate et un (ou des) sel(s) d'ammonium ; un (ou des) sel(s) de nitrate et un (ou des) sel(s) de glutamate et de l'uree ; un (ou des) sel(s) de nitrate et un (ou des) sel(s) de glutamate et de l'ammoniaque ; un (ou des) sel(s) de nitrate et un (ou des) sel(s) d'ammonium et de l'uree ; un (ou des) sel(s) de nitrate et un (ou des) sel(s) d'ammonium et de l'ammoniaque ; un (ou des) sel(s) de nitrate et de l'uree et de 20 l'ammoniaque; un (ou des) sel(s) de glutamate et un (ou des) sel(s) d'ammonium et de l'uree et de l'ammoniaque ; un (ou des) sel(s) de glutamate et un (ou des) sel(s) d'ammonium et de l'uree ; un (ou des) sel(s) de glutamate et un (ou des) sel(s) d'ammonium et de l'ammoniaque ; un (ou des) sel(s) de glutamate et de l'uree et de l'ammoniaque ; un (ou des) sel(s) d'ammonium et de l'uree et de l'ammoniaque ; un (ou des) sel(s) de nitrate et un (ou des) 25 sel(s) de glutamate ; un (ou des) sel(s) de nitrate et un (ou des) sel(s) d'ammonium ; un (ou des) sel(s) de nitrate et de l'uree; Selon un mode de realisation de !'invention, la source de phosphore dudit milieu defini peut etre choisie parmi l'acide phosphorique, les sels de phosphate, avantageusement de l'hydrogenophosphate de sodium (Na2HP04), ou du dihydrogenophosphate de sodium 30 (NaH2P04), ou du dihydrogenophosphate de potassium (KH2P04), ou de l'hydrogenophosphate de potassium (K2HP04), ou tout melange, en toute proportion d'au moins deux de ces sources.

Selon un mode de realisation de !'invention, ledit milieu de culture pourra comprendre du chlorure de magnesium, avantageusement sous forme de tetrahydrate (MgCl2 4H20) ; du 35 chlorure de calcium, avantageusement sous forme de dihydrate (CaCl2 2H20) ; du chlorure de cobalt hexahydrate (CoCl2 6H20) ; du chlorure de manganese (II) tetrahydrate (MnCl2 4H20) ; du sulfate de magnesium heptahydrate (MgS04, 7H20) ; du sulfate de zinc 14 heptahydrate (ZnSO4, 7H2O) ; du sulfate de nickel hexahydrate (NiSO4 6H2O) ; du sulfate de cuivre pentahydrate (CuSO4 5H2O) ; du sulfate de potassium (K2SO4) ; du sulfate ferreux heptahydrate (FeSO4, 7H2O) ; de l'acide borique (H38O3) ; de l'acide ethylene diamine tetraacetique sous forme disodique dihydrate (Na2EDTA, 2H2O) ; du molybdate de sodium 5 dihydrate, (Na2MoO4, 2H2O) ; du selenite de sodium, (Na2SeO3) ; a titre de vitamine de la thiamine, de la cobalamine ou vitamine B12, du panthotenate ou vitamine B5; une source de carbone ; une source d'azote ; une source de phosphore.

Selon une forme preferee de !'invention, dans ledit milieu de culture le chlorure de magnesium peut etre a une concentration comprise entre 0,008 et 0,012 g/L, 10 avantageusement entre 0,009 et 0,011 g/L ; le chlorure de calcium peut etre a une concentration comprise entre 0,40 et 0, 70 g/L, avantageusement entre 0,50 et 0,60 g/L ; le chlorure de cobalt hexahydrate peut etre a une concentration comprise entre 0,00008 et 0,00013 g/L, avantageusement entre 0,00009 et 0,00012 g/L ; le chlorure de manganese (II) tetrahydrate peut etre a une concentration comprise entre 0,008 et 0,013, avantageusement 15 entre 0,009 et 0,012 g/L ; le sulfate de magnesium heptahydrate peut etre a une concentration comprise entre 6 et 10 g/L, avantageusement entre 7 et 9 g/L ; le sulfate de zinc heptahydrate peut etre a une concentration comprise entre 0,008 et 0,013, avantageusement 0,009 et 0,012 g/L ; le sulfate de nickel hexahydrate peut etre a une concentration comprise entre 0,004 et 0,007 g/L, avantageusement 0,005 et 0,006 g/L ; le 20 sulfate de cuivre pentahydrate peut etre a une concentration comprise entre 0,005 et 0,009 g/L, avantageusement entre 0,006 et 0,008 g/L ; le sulfate de potassium peut etre a une concentration comprise entre 0,5 et 3,5 g/L, avantageusement entre 1 et 3 g/L ; le sulfate ferreux heptahydrate peut etre a une concentration comprise entre 0,03 et 0,05 g/L, avantageusement entre 0,035 et 0,045 g/L ; l'acide borique peut etre a une concentration 25 comprise entre 0,0155 et 0,0195 g/L, avantageusement entre 0,0165 et 0,0185 g/L ; l'acide ethylene diamine tetraacetique sous forme disodique dihydrate peut etre a une concentration comprise entre 0, 10 et 0, 14 g/L, avantageusement entre 0, 11 et 0, 13 g/L ; le molybdate de sodium dihydrate peut etre a une concentration comprise entre 0,00001 et 0,0003 g/L, avantageusement entre 0,00005 et 0,0002 g/L ; le selenite de sodium peut etre a une 30 concentration comprise entre 0,00000015 et 0,000019 g/L, avantageusement entre 0,00000016 et 0,00000018 g/L ; la thiamine peut etre a une concentration comprise entre 0,015 et 0,05 g/L, avantageusement entre 0,025 et 0,04 g/L ; la cobalamine ou vitamine B 12 peut etre a une concentration comprise entre 0,0004 et 0,00065 g/L, avantageusement entre 0,00045 et 0,00060 g/L ; le panthotenate ou vitamine B5 peut etre a une concentration 35 comprise entre 0,008 et 0,013, avantageusement entre 0,009 et 0,012 g/L ; la source de carbone peut etre a une concentration comprise entre 45 et 65 g/L, avantageusement entre 50 et 60 g/L ; la source d'azote peut etre a une concentration comprise entre 7 et 11 g/L, avantageusement entre 8 et 10 g/L ; la source de phosphore peut etre a une concentration comprise entre 2 et 6 g/L, avantageusement entre 3 et 5 g/L.

Tres preferentiellement selon !'invention, dans ledit milieu de culture le chlorure de magnesium est a une concentration de 0,0108 g/L, le chlorure de calcium est a une 5 concentration de 0,55 g/L ; le chlorure de cobalt hexahydrate (CoCl2 6H20) est a une concentration de 0,000108 g/L ; le chlorure de manganese (II) tetrahydrate est a une concentration de 0,0108 g/L ; le sulfate de magnesium heptahydrate est a une concentration de 8,01 g/L ; le sulfate de zinc heptahydrate est a une concentration de 0,0108 g/L ; le sulfate de nickel hexahydrate est a une concentration de 0,0056 g/L ; le sulfate de cuivre 10 pentahydrate est a une concentration de 0,0072 g/L ; le sulfate de potassium est a une concentration de 2,09 g/L ; le sulfate ferreux heptahydrate est a une concentration de 0,04 g :I ; l'acide borique est a une concentration comprise entre 0,0155 et 0,0195 g/L de 0,0175g/L ; l'acide ethylene diamine tetraacetique sous forme disodique dihydrate est a une concentration de 0, 12 g/L ; le molybdate de sodium di hydrate, est a une concentration de 15 0,000108 g/L ; le selenite de sodium, est a une concentration de 0,000000173 g/L ; la thiamine est a une concentration de 0,032 g/L ; la cobalamine ou vitamine B 12 est a une concentration de 0,00052 g/L ; le panthotenate ou vitamine B5 est a une concentration de 0,0108 g/L ; la source de carbone est a une concentration de 55 g/L ; la source d'azote est a une concentration de 9 g/L ; la source de phosphore est a une concentration de 4 g/L. 20 Selon !'invention, la premiere etape a) de culture du procede peut etre realisee en mode discontinu dit "batch", en mode semi-continu dit "fed batch" ou en mode d'alimentation continu.

Selon un mode particulier de realisation de !'invention, la premiere etape est divisee en 2 sous-etapes, une premiere sous-etape a1) de croissance dans le milieu de culture approprie 25 suivie d'une deuxieme sous-etape a2) de production dans laquelle on peut ajouter au milieu de culture, simultanement ou successivement, une ou plusieurs solution(s) d'enrichissement en source de carbone, en source d'azote et/ou en source de phosphore de maniere a maintenir dans le milieu de culture des teneurs en azote et en phosphore non limitantes pour la croissance. 30 Selon un mode prefere de realisation, la sous-etape a1) de croissance est mise en reuvre jusqu'd'une concentration en source de carbone, particulierement en glucose, inferieure a 20 g/L.

Selon un autre mode de realisation, la sous-etape a 1) de croissance est mise en reuvre jusqu'a l'obtention d'une densite de culture d'au moins 20 g/L, preferentiellement d'au moins 35 40 g/L, plus preferentiellement au moins 60 g/L, encore plus preferentiellement au moins 80 g/L. 16 La teneur en source d'azote non limitante dans l'etape a2) est avantageusement comprise entre 0,5 et 5 g/L, preferentiellement entre 0,5 et 2 g/L et la teneur en source de phosphore non limitante est avantageusement comprise entre 0,5 et 5 g/L, preferentiellement 0,5 et 2 g/L.

La teneur en source de carbone recherchee pour cette etape 5 a2) pourra etre comprise entre O et 200 g/L, notamment entre 5 voire 10 et 50 g/L.

De maniere preferentielle la teneur en source de carbone dans la sous-etape a2) est comprise entre O et 50 g/L, plus preferentiellement entre O et 1 O g/L.

De maniere preferentielle, la culture dont la premiere etape a) est divisee en deux sousetapes a 1) et a2) tell es que definies ci-dessus est realisee en mode semi-continu dit "fed 10 batch".

De maniere generale, les sous etapes a 1) et a2) sont effectuees a une temperature entre 24 et 35°C, de preference entre 25 et 30°C.

La deuxieme etape du procede b) commence en general a partir d'environ 24h apres le debut de la culture.

Elle est en general effectuee a une temperature entre 18 et 25°C.

Cette 15 baisse en temperature oriente la production vers des acides gras polyinsatures de longues chaines (PUFAs), notamment de DHA, ARA, et EPA, au lieu des proteines.

Le profil d'acide(s) gras produit(s) depend, generalement, de la souche mise en culture.

Pendant l'etape b) de maniere generale, comme on fait pour l'etape a2), on peut ajouter au milieu de culture, simultanement ou successivement, une ou plusieurs solution(s) 20 d'enrichissement en source de carbone, et/ou en source d'azote et/ou en source de phosphore, de maniere a maintenir dans le milieu de culture une teneur en source de carbone comprise entre 5 et 200 g/L, preferentiellement entre 10 et 50 g/L, une teneur en source d'azote comprise entre 0,5 et 5 g/L, preferentiellement entre 0,5 et 2 g/L et une teneur en source de phosphore comprise entre 0,5 et 5 g/L, preferentiellement 0,5 et 2 g/L. 25 La culture est arretee, de maniere generale, entre 50 et 70 heures apres le debut de la culture.

On peut eventuellement induire la production des caroteno"ides pendant la culture, de preference, pendant l'etape b) mais on peut le faire pendant la duree de la culture aussi.

Pour induire la production des caroteno"ides, des conditions mixotrophiques avec une 30 lumiere, de preference, bleue a environ 435-475 nm, de preference 455 nm, sont appliquees.

La culture est ainsi en mode mixotrophe.

Des caroteno"ides tels que l'astaxanthine, la canthaxanthine, des beta-carotenes et la phoenicoxanthine, sont produits avec ces longueurs d'onde.

La lumiere est de maniere generale appliquee pour au moins 18 heures, de preference pour au moins 24 heures.

Selon un mode de realisation prefere de !'invention, 35 la lumiere est appliquee a la culture a partir de 24 a 50 heures, plus preferentiellement, a partir de 45 heures de culture.

Cet eclairement se poursuit, de maniere generale, de preference, jusqu'a la fin de la culture. II est aussi possible d'arreter l'eclairement peu de 17 temps avant la fin de la culture (par exemple, un quart d'heure, un demi -heure, trois quarts heures ou une heure avant la fin).

Selon certains modes de realisation de !'invention la culture est exposee a la lumiere, en general, pour au moins 18 heures, de preference au moins 24 heures avant la fin de la 5 culture.

Selon un mode de realisation de !'invention, la culture est eclairee des le depart, c'est-a-dire pendant les etapes a) et b) de culture.

Selon un mode de realisation prefere de !'invention, la culture est eclairee a partir du moment ou l'etape b) commence.

Selon un mode de realisation prefere de !'invention, la culture est eclairee pendant au moins les dernieres 18 heures de culture, de preference pendant au moins les dernieres 24 heures de 10 culture.

On peut utiliser la lumiere blanche, mais les inventeurs ont constate des teneurs en caroteno"ides plus elevees en utilisant la lumiere bleue, a une longueur d'onde d'environ 435- 475 nm, de preference 455 nm.

En general, la culture est exposee a la lumiere a partir de 40 a 50 heures de culture (c'est-a-dire, a partir de 40 a 50 heures apres le debut de la de 15 culture), de preference, a partir de 45 heures de culture et jusqu'a la fin de la culture (entre 50 et 70 heures).

Dans ces conditions, on obtient une teneur en caroteno"ides d'environ 150- 250 ppm (ng/mg), de preference 180 a 200 ppm (matiere seche).

Selon un mode de realisation, des caroteno"ides ont une teneur en astaxanthine entre 5 et 30%.

Selon un mode de realisation, des caroteno"ides ont une teneur en phoenicoxanthine entre 15 et 30%.

Selon 20 un mode de realisation, des caroteno"ides ont une teneur en beta-carotenes entre O et 30%.

De maniere generale, les etapes a) et b) du procede peuvent etre effectuees en conditions heterotrophiques et/ou en conditions mixotrophiques.

Pour obtenir des caroteno"ides, dans l'etape b) la culture est effectuee en mixotrophie pour au moins 24 heures avant la fin de la culture. 25 Selon un mode de !'invention, par exemple quand on ne produit pas de caroteno"ides, la culture est menee entierement en conditions d'heterotrophie.

En general, !'utilisation des conditions de mixotrophie lors de la culture a un effet positif sur la production des lipides, notamment des PUFAs, ainsi que sur la production des caroteno"ides, et permet d'augmenter le rendement en biomasse, en acides gras, notamment en PUFAs, en particulier en DHA et 30 en caroteno"ides.

Des etapes a1 ), a2) et b) peuvent etre effectuees independamment en conditions d'heterotrophie ou en conditions de mixotrophie.

Selon un mode de realisation de !'invention, les etapes a1) et a2) sont menees en conditions d'heterotrophie, puis l'etape b), entierement ou en partie, en conditions de mixotrophie.

Selon un mode de realisation prefere de 35 !'invention, l'etape a1) est menee en conditions d'heterotrophie et l'etape a2) en conditions de mixotrophie. 18 Selon un autre mode de realisation de !'invention, pendant l'etape b) la culture est exposee, en conditions de mixotrophie, a une lumiere blanche.

Selon un autre mode de realisation de !'invention, pendant l'etape b) la culture est exposee, en conditions de mixotrophie, a une lumiere blanche, jusqu'a 40 a 50, de preference 45 heures de culture, 5 puis la culture est exposee a une lumiere bleue avec une longueur d'onde d'environ 435-475 nm, de preference 455 nm pour au moins 24 heures.

Selon un mode de realisation de !'invention, dans la mise en reuvre d'une culture en mode mixotrophe, l'eclairement est variable et/ou discontinu.

Un eclairement sous formes de flashs est particulierement favorable sur le developpement des protistes et permet 10 d'accroitre la productivite de ceux-ci, notamment en ce qui concerne leur production de lipides et de caroteno"ides.

Par "eclairement discontinu", ii faut entendre un eclairement ponctue par des periodes d'obscurite.

Les periodes d'obscurite peuvent occuper plus d'un quart du temps, de preference la moitie du temps ou plus, durant lequel les algues sont cultivees. 15 Selon un aspect prefere de !'invention, l'eclairement est discontinu et plus preferentiellement sous forme de flashs.

Un flash, au sens de !'invention, est un eclairement lumineux de courte duree, c'est-a-dire de moins de 30 minutes.

La duree peut etre de moins de 15 minutes, de preference de moins de 5 minutes ou plus preferentiellement encore de moins de 1 minute.

Selon certains modes de realisation de !'invention, la duree du flash peut 20 etre de moins d'une seconde.

Par exemple, le duree du flash peut etre 1/10 d'une seconde, ou 2/10 d'une seconde, ou 3/10 d'une seconde, ou 4/10 d'une seconde, ou 5/10 d'une seconde, ou 6/10 d'une seconde, ou 7/10 d'une seconde, ou 8/10 d'une seconde, ou 9/10 d'une seconde. L'eclairement lumineux, ou le flash, est generalement d'une duree superieure a 15 secondes.

Elle est generalement comprise entre 5 second es et 1 0 minutes, 25 de preference entre 1 0 secondes et 2 minutes, plus preferentiellement entre 20 secondes et 1 minute.

Ces durees de flash sont appropriees pour des apports de lumiere de "basse frequence".

Selon ce dernier mode de realisation ou le regime d'illumination (l'apport de la lumiere) est de "basse frequence", le nombre de flashs peut etre compris entre environ 2 et 3600 par 30 heure. II peut etre, par exemple, compris entre 100 et 3600 flashs par heure. II peut etre egalement compris entre 120 et 3000, ou entre 400 et 2500, ou entre 600 et 2000, ou entre 800 et 1500 flashs par heure. II peut etre egalement compris entre 2 et 200, preferentiellement entre 1 0 et 150, plus preferentiellement entre 15 et 100, et plus preferentiellement encore entre 20 et 50 par heure. 35 Selon un mode de realisation, un flash peut avoir une duree entre 1 /150000 seconde et 1/1000 seconde.

Ces durees de flash sont appropriees pour des regimes d'illumination de 19 "haute frequence" c'est-a-dire avec des frequences de flash de 150kHz a 1 kHz respectivement.

Selon ce mode de realisation ou le regime d'illumination (l'apport de la lumiere) est de "haute frequence", les flashs peuvent avoir lieu entre 3,6 x105 et 5,4 x 109 fois par heure. 5 Dans ce cas, la variation de la lumiere a une frequence entre 1 kHz et 150 kHz, c'est-a-dire entre 1000 et 150 000 flashes par seconde. L'apport de lumiere selon ce dernier mode de realisation de !'invention est nomme "haute frequence".

Le nombre de flashs par heure peut etre choisi en fonction de l'intensite et de la duree des flashs (voir ci-dessous).

En general, l'intensite de la lumiere apportee sous forme de 10 flashs peut etre comprise entre 5 et 1000 μmol.m-2 . s-1 , de preference entre 5 et 500 μmol. m- 2 . s-1, ou 50 et 400 μmol. m-2 . s-1, et plus preferentiellement entre 150 et 300 μmol. m-2 . s-1 . 1 μmol. m-2 . s-1 correspond a 1 μE m-2 . s-1 (Einstein), unite souvent utilisee dans la litterature.

Selon un autre mode de !'invention, l'eclairement peut etre variable, ce qui signifie que l'eclairement n'est pas interrompu par des phases d'obscurite, mais que l'intensite lumineuse 15 varie au cours du temps.

Cette variation de l'intensite de lumiere peut etre reguliere et peut etre periodique ou cyclique.

Selon !'invention, on peut aussi proceder a un apport lumineux alliant des phases d'eclairement continues et discontinues.

Selon un mode de realisation prefere de !'invention, des conditions de mixotrophie a dominante heterotrophe sont utilisees.

Les thraustochytrides ne possedent pas de 20 chloropastes.

Par consequent, la majorite de l'energie utilisee pour la croissance vient de la source de carbone du milieu de culture.

Dans ce cas, la lumiere induit certaines voies metaboliques dans la cellule mais ne permet pas de fixer le carbone par la photosynthese.

Selon un mode de realisation prefere, l'eclairage des cultures peut etre assure par un dispositif d'illumination interne au fermenteur.

Ainsi, l'efficacite de !'illumination est meilleure 25 par rapport a une configuration ou la lumiere penetre par des hublots a partir de sources disposees a l'exterieur.

Les dispositifs d'illumination peuvent etre disposes sur !'ensemble tournant muni de pales ou sur des pieces tubulaires plongeant dans la masse a traiter, ou encore au fond ou au plafond de la cuve.

Selon un mode de realisation prefere de !'invention, le dispositif d'illumination peut etre situe sur les contre-pales a l'interieur du fermenteur.

Un 30 tel dispositif est decrit dans la demande de brevet franc;ais Ne0 1353641.

Le fermenteur peut etre ainsi muni d'une pluralite de sources d'illumination portees par des contre-pales, ces dernieres ayant pour fonction d'empecher la formation d'un vortex au sein de la biomasse sous l'action de !'ensemble tournant de brassage.

Ces sources d'illumination sont de preference encapsulees, partiellement ou completement dans au moins une partie de ces 35 contre pales, dans une matiere compatible avec la biomasse et en une epaisseur permettant de diffuser ladite lumiere vers l'interieur de la cuve.

Selon !'invention, la culture peut etre realisee par toute technique de culture connue, par exemple en fioles ou en reacteur, mais aussi en fermenteurs ou encore dans tout contenant apte a la croissance de protistes, particulierement de Thraustochytrides, comme par exemple des bassins de type "raceway", a condition que ladite technique permette de mettre 5 en reuvre les conditions de culture requises.

De maniere preferentielle, la culture peut etre realisee en fermenteurs selon les methodes connues de culture des protistes en fermenteurs.

Selon !'invention, la troisieme etape c) du procede permettant la recuperation de ladite biomasse peut etre realisee dans des conditions appropriees pour obtenir une biomasse 10 pouvant presenter le taux d'humidite recherche.

Ladite recuperation des protistes peut etre realisee par toute technique permettant la recuperation de la biomasse, notamment les methodes de filtration, gravimetrique ou sous pression reduite, de centrifugation, de decantation, ou bien encore des methodes de precipitation suivie d'une filtration gravimetrique. 15 L'invention a aussi pour objet une biomasse susceptible d'etre obtenue par le procede selon !'invention tel que decrit precedemment dans toutes ses variantes.

L'invention a encore pour objet !'utilisation d'une biomasse telle que decrite precedemment dans les domaines cosmetiques, pharmaceutiques, alimentaires (alimentation humaine ou animale). 20 On pourra distinguer dans l'alimentation animale, l'alimentation des animaux d'elevage, en particulier en elevage industriel et celle des animaux domestiques ou encore des animaux de compagnie ou des animaux dits de "loisir", comme les poissons d'aquarium ou les oiseaux de voliere ou en cage.

Par "animal d'elevage" on entend notamment les animaux de pacage (notamment les 25 bovins eleves pour la viande, le lait, le fromage et le cuir ; les ovins eleves pour la viande, la laine et le fromage ; les caprins), les porcins, les lapins, les volailles (les poulets, les poules, les dindes, les canards, les oies et autres), les equides (poneys, chevaux, poulains), destines a supporter des activites humaines (transport, loisirs) ou leur alimentation, les animaux aquatiques (par exemple les poissons, les crevettes, les huitres et les moules).

On 30 pourra toutefois distinguer l'alimentation des poissons jusqu'au stade d'alevins, et celle des poissons eleves, y compris les aliments et compositions alimentaires qui leur sont destinees.

On les distinguera des animaux domestiques, animaux de compagnie ou animaux de loisir. lls comprennent egalement des mammiferes, ruminants ou non, des oiseaux ou des poissons. lls comprennent en particulier les chiens et les chats. 35 L'invention a aussi pour objet un aliment, ou composition alimentaire, pour l'homme ou les animaux, pouvant comprendre une biomasse selon !'invention telle que decrite 21 precedemment.

On entend par "aliment" toute composition qui peut servir a la nourriture de l'homme ou des animaux, en particulier les animaux d'elevage.

Selon un mode de realisation de !'invention, !'aliment peut etre constitue de la biomasse, sechee ou non, transformee ou non, ou de la biomasse, sechee ou non, transformee ou non, 5 melangee a tout autre additif, vehicule ou support, utilise dans le domaine de l'alimentation humaine ou animale.

On peut citer comme exemple en tant qu'additifs les conservateurs alimentaires, les colorants, les exhausteurs de go0t, les regulateurs du pH, les charges, les agents epaississants, texturants ou les agents liants.

On peut egalement citer des vitamines, des probiotiques et des prebiotiques, ou encore des additifs pharmaceutiques comme par 10 exemple des hormones de croissance, des antibiotiques.

Selon un mode de realisation de !'invention, la biomasse, sechee ou non, transformee ou non, peut etre utilisee elle-meme en tant que vehicule ou support, additif , conservateur alimentaire, colorant, exhausteur de go0t, charge, agent epaississant, texturant ou agent liant dans un produit destine a l'alimentation humaine ou animale. 15 La presente invention concerne en particulier des aliments pour animaux et plus particulierement pour les animaux d'elevage.

Ces aliments peuvent se presenter habituellement sous la forme de melanges simples, de farines, de granules, de soupe ou de fourrages (fourrage frais, ensilages, foin ... ) dans lesquels peut etre incorporee la biomasse selon !'invention.

Ces aliments peuvent etre realises par l'eleveur lui-meme ou fabriques 20 chez un professionnel de l'alimentation animale.

On entend par "aliment" tout ce qui peut servir a la nourriture des animaux.

Pour l'elevage intensif des animaux, les aliments peuvent comprendre, en plus de la biomasse algale, une base nutritionnelle et des additifs nutritionnels. L'essentiel de la ration alimentaire de l'animal peut etre alors constituee par la "base nutritionnelle" et la biomasse 25 algale.

Cette base peut etre constituee a titre d'exemple par un melange de cereales, de proteines et de matieres grasses d'origine animale et/ou vegetale.

Les bases nutritionnelles pour animaux sont adaptees a l'alimentation de ces animaux et sont bien connues de l'homme du metier.

Dans le cadre de la presente invention, ces bases nutritionnelles peuvent comprendre par exemple de la farine de poisson, des derives du 30 ma"is, du ble, des pois et du soja et autres graines.

Ces bases nutritionnelles peuvent etre adaptees aux besoins des differentes especes animales auxquelles elles sont destinees.

Ces bases nutritionnelles peuvent deja contenir des additifs nutritionnels comme des vitamines, des sels mineraux et des acides amines.

Les additifs utilises en alimentation animale peuvent etre ajoutes a la base nutritionnelle 35 ou a la biomasse algale.

Ces additifs peuvent etre ajoutes pour ameliorer certaines caracteristiques des aliments, par exemple pour en relever le go0t, pour rendre plus digestes les matieres premieres des aliments pour animaux, conserver plus efficacement les aliments 22 ou proteger les animaux. lls sont frequemment utilises dans les elevages intensifs de grande envergure.

Les additifs pouvant etre utilises en alimentation animale se declinent, notamment, dans les sous-categories suivantes (source EFSA) : 5 - additifs technologiques : par exemple, conservateurs, antioxydants, emulsifiants, stabilisateurs, regulateurs d'acidite et additifs pour !'ensilage ; - additifs sensoriels : par exemple, aromes, colorants, - additifs nutritionnels : par exemple, vitamines, acides amines, oligo-elements ; - additifs zootechniques : par exemple, ameliorateurs de digestibilite, stabilisateurs de 10 flore intestinale, tels que des probiotiques et prebiotiques ; - coccidiostatiques et histomonostatiques (antiparasitaires).

Dans un mode de realisation, !'invention concerne des aliments pour animaux d'elevage pouvant comprendre entre 1 % et 60%, de preference entre 1 et 20%, de fac;on tout a fait preferentielle entre 3% et 8% d'une biomasse sechee ou obtenue par le procede selon 15 !'invention.

Dans un autre mode de realisation, !'invention concerne des aliments pour animaux d'elevage pouvant comprendre entre 1 % et 40%, de preference entre 5 et 10% d'une biomasse non sechee obtenue par le procede de !'invention.

Selon un mode particulier de realisation de !'invention, !'aliment peut etre destine aux 20 animaux d'elevage, en particulier les bovins, les ovins, les porcins, les lapins, les volailles et les equides.

Selon un autre mode particulier de !'invention, !'aliment peut etre destine aux animaux aquatiques, en particulier aux poissons, au moins jusqu'au stade alevins, voire y compris les poissons d'elevage. L'utilisation d'une biomasse riche en proteines et PUFAs et comprenant 25 des pigments en fin de phase de croissance permet d'ameliorer la qualite de la chair (grace a la presence des PUFAs et des pigments).

Selon un autre mode particulier de realisation de !'invention, !'aliment peut etre destine aux animaux domestiques, animaux de compagnie et/ou animaux de loisirs.

Enfin, selon un autre mode de realisation de !'invention, la composition alimentaire peut 30 etre destinee a l'homme, en particulier, la composition peut etre adaptee aux enfants, adolescents, adultes ou personnes agees, L'invention a egalement pour objet une composition cosmetique ou pharmaceutique pour l'homme ou les animaux pouvant comprendre une biomasse selon !'invention telle que decrite precedemment. 35 Selon !'invention, la composition cosmetique ou pharmaceutique peut ne comprendre que de la biomasse, sechee ou non, transformee ou non, ou de la biomasse, sechee ou non, transformee ou non, melangee a tout autre additif, vehicule ou support, utilise dans le 23 domaine de la cosmetique ou de la pharmacie comme par exemple les conservateurs, les colorants, les regulateurs du pH.

L'invention a aussi pour objet !'utilisation de la biomasse telle que decrite precedemment en therapie, par exemple dans la prevention et le traitement de la malnutrition. II est connu 5 que dans le traitement de la malnutrition, la carence en proteine est la plus prejudiciable et co0teuse a traiter.

La biomasse, selon un mode de realisation de !'invention, peut constituer une solution complete de choix pour prevenir et/ou traiter la malnutrition, notamment des enfants et les seniors.

Elle peut constituer une source proteique equilibree et digestible (la carence en proteine est la plus prejudiciable et couteuse).

Sa fraction proteique peut etre 10 associee a une source de lipides de haute qualite nutritionnelle necessaires a un bon developpement sain des enfants.

La biomasse selon !'invention peut etre egalement adaptee pour utilisation par des personnes agees pour la prevention et/ou le traitement de la malnutrition, et des autres maladies liees au vieillissement.

Dans ce cadre, l'apport en caroteno"ides de la biomasse selon !'invention peut etre egalement tres benefique pour la 15 sante de ces populations, les personnes agees etant susceptibles aux maladies telles que le DMLA.

La biomasse peut done etre incorporee dans un aliment complet (sous forme humide ou de poudre destinees a etre rehydratees) un aliment de collation tels que des barres de cereales, des biscottes, des gateaux secs ou non, des confiseries, des produits de cuisson 20 tels que des cremes, des poudres en mix, des produits laitiers, des cereales ou des boissons.

La biomasse peut etre presente dans des supplements alimentaires, par exemple sous forme de poudre, pate a tartiner ou sauces a ajouter a l'alimentation quotidienne.

EXEMPLES D'autres aspects et caracteristiques de !'invention pourront apparaitre a la lecture des 25 exemples qui suivent.

Exemple 1 : Procede de culture a 25°C Les cultures d'Aurantiochytrium CCAP4062/1 ont ete realisees dans des fermenteurs (bioreacteurs) de 1 a 2 L utiles avec automates dedies et supervision par station informatique.

Le systeme a ete regule en pH via l'ajout de base (NH4OH,).

La temperature de 30 culture a ete fixee a 25°C puis descendu a 18°C a 24h de culture.

La pression d'oxygene dissous a ete regulee dans le milieu tout au long de la culture, par la vitesse d'agitation (220 - 1200 t/min), le debit d'air (0,6 - 2 vvm), voire le debit d'oxygene (0 - 2 vvm).

Les parametres de regulation, integres dans !'automate de supervision, ont permis de maintenir une pO2 constante comprise entre 5% et 30%.

Le temps de culture a ete de 72 heures. 35 La composition du milieu de culture utilise pendant la culture est donnee dans le tableau: 24 Solution principale Concentration g/L KCI 0,36 H3BO3 0,175 MqSO4,7H20 6,750 CaCl2,2H20 0,55 KNO3 0,04667 KH2PO4, 7H2O 0,30940 Na2EDT A,2H2O 3,094.1 o-;; ZnSO4,7H2O 7,3.10-::, CoCl2,6H2O 1,6.10-::, MnCl2,4H2O 5,4.10-4 Na2MoO4,2H2O 1,48.10-0 Na2SeO3 1,73.10-0 NiSO4,6H2O 2,98.10-0 CuSO4,5H20 9,8.10-0 EDT A-Fe 0,03 Carbone g/L Glucose 55 Azote g/L (NH4)2SO4 7 Ajout apres autoclave Vitamines !:!IL Thiamine 8.10-.j Vitamine B12 1,3.10-4 Panthothenate 2,7.10-.j Solution d'ajout 1 Concentration g/L K2SO4 31,9 MgSO4,7H20 25,8 KH2PO4, 7H2O 61,38 FeSO4,7H20 0,61 (NH4hSO4 * 138,24 MnCl2 4H2O 0,165 ZnSO4,7H2O 0,165 CoCl2,6H2O 1,6.10-.j Na2MoO4,2H2O 1,6.10-.j CuSO4,5H2O 0, 11 NiSO4,6H2O 8,6.10-L Na2EDTA,2H2O 1,81 Thiamine 0,49 Vitamine B12 8.10-.j Panthothenate 0,1656 Solution d'ajout 2 Concentration g/L Glucose 750 KH2P04 6,4 (NH4)2S04* 34 Des ajouts de glucoses ont ete faits sous forme des solutions d'enrichissement ayant un ratio molaire de carbone a phosphore (C :P) de 530 :1.

Des precultures ont ete realisees sur une table d'agitation (140 t/min) en enceinte a s temperature controlee (26°C), une premiere de 24h puis de 70h.

Suivi des cultures : La concentration en biomasse totale a ete suivie par mesure de la masse seche (filtration sur filtre GF/F, Whatman, puis sechage en etuve, a 105°C, pendant 24 h minimum avant pesee). L'aspect de la biomasse est beige clair. 5 Les analyses en contenus lipidiques totaux et des acides gras ont ete realisees selon les methodes classiquement decrites dans la litterature [Folch J, et al., A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 1957 May ; 226(1) :497-509].

Resultats: Reference Essai Temps culture MS (g/L) % MG/MS % AA/MS % DHA/MG EssaiA 71h 95 25,8 44,6 29 Essai B 71h 105 27,9 45,2 32 Exemple 2 : Procede de culture avec etape a) a 30°C Les cultures d'Aurantiochytrium CCAP4062/4 ont ete realisees dans des fermenteurs (bioreacteurs) de 1 a 2 L utiles avec automates dedies et supervision par station informatique.

Le systeme a ete regule a pH 6 via l'ajout de base (NH4OH).

La temperature de culture a ete fixee a 30°C puis descendu a 18°C a 24h de culture.

La pression d'oxygene 15 dissous a ete regulee dans le milieu tout au long de la culture, par la vitesse d'agitation (220 - 1200 t/min), le debit d'air (0,3 - 1 vvm), voire le debit d'oxygene (0 - 1 vvm).

Les parametres de regulation, integres dans !'automate de supervision, ont permis de maintenir une pO2 constante comprise entre 5% et 30%.

Le temps de culture a ete compris entre 40 et 100 heures (essai A: 69 heures, essai B : 51 heures) 20 Le milieu de culture est le meme que celui de l'exemple 1.

Des ajouts de glucose sous forme d'une solution d'enrichissement ayant un ratio molaire de carbone : azote : phosphore (CNP) de 190,5 : 7,3 : 1 ont ete faits pour l'essai A.

Pour l'essai B la solution d'enrichissement et avait un ratio molaire CNP de 95,3 : 3,2 : 1 Un chainage de preculture a ete realise sur table d'agitation (140 t/min) en enceinte a 25 temperature controlee (26°C), une premiere de 24h puis de 70h.

Suivi des cultures : La concentration en biomasse totale a ete suivie par mesure de la masse seche (filtration sur filtre GF/F, Whatman, puis sechage en etuve, a 105°C, pendant 24 h minimum avant pesee). L'aspect de la biomasse est beige clair. 30 Les analyses en contenus lipidiques totaux et des acides gras ont ete realisees selon les methodes classiquement decrites dans la litterature [Folch J, et al., A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 1957 May ; 226(1) :497-509].

Reference Essai Temps culture MS (q/L) % MG/MS %AA %DHA/MG EssaiA 69h 128 22 48 37 Essai B 51h 130 24 40 33 26 Exemple 3 : Procede de culture avec eclairage en lumiere bleue pendant les derniers 25 heures de l'etape b) Les cultures d'Aurantiochytrium CCAP4062/4 ont ete realisees dans des fermenteurs (bioreacteurs) de 5 L utiles avec automates dedies et supervision par station informatique. 5 Le systeme a ete regule a pH 5 via l'ajout de base (NaOH).

La temperature de culture a ete fixee a 30°C puis descendu a 18°C a 24h de culture.

Les parametres de regulation, integres dans !'automate de supervision, ont permis de maintenir une pO2 constante comprise entre 5% et 30%.

Le temps de culture a ete de 70 heures.

La culture a ete exposee a lumiere bleue (longueur d'onde 455 nm) a partir de 45h de culture.

Les sources de lumieres sont en 10 forme de LEDs (ou DELs en franc;ais, pour diode electroluminescente) ont etes mantes sur deux contre-pales dans le bioreacteur.

Le milieu de culture est le meme que celui de l'Exemple 1.

Des ajouts de glucose sous forme d'une solution d'enrichissement avec un ratio molaire CNP de 37 : 4 : 1 ont ete faits. 15 Un chainage de preculture a ete realise sur table d'agitation (140 t/min) en enceinte a temperature controlee (26°C), une premiere de 24h puis de 70h.

Cela etait suivi d'une preculture en fermenteur de 24h.

Suivi des cultures : La concentration en biomasse totale a ete suivie par mesure de la masse seche 20 (filtration sur filtre GF/F, Whatman, puis sechage en etuve, a 105°C, pendant 24 h minimum avant pesee).

Les analyses en contenus lipidiques totaux ont ete realisees selon les methodes classiquement decrites dans la litterature [Folch J, et al., A simple method for the isolation and purification of total lipid es from animal tissues. J Biol Chem. 1957 May ; 226(1) :497- 25 509].

Reference Essai Temps culture MS /L % MG/MS % AA % DHA/MG Essai L.A ?Oh 130 23 51 30 L'aspect de la biomasse est jaune/orange.

La difference de couleur par rapport les Exemples 1 et 2 qui ont donne une biomasse de couleur blanc/creme claire est due a la presence de caroteno"ides (principalement beta-carotenes, cantaxanthine, phoenicoxanthine et astaxanthine) dans le flacon de gauche. 30 Caroteno"ides mesure dans l'essai A : 199 ppm.

Astaxanthine Phenicoxanthine Canthaxanthine ppm* 32 50,9 116 % de caroteno"ides totaux 16% 26% 58% * Ppm= ng/mg de MS.

Claims

27 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d’une biomasse de Thraustochytrides dont une quantité substantiellement majoritaire n’est pas dégradée, comprenant des protéines et des acides gras, comprenant en poids par rapport au poids de la matière sèche, au moins 40% de protéines et au moins 20% de matière grasse, la matière grasse ayant une teneur de 25 à 60% en acides gras polyinsaturés choisi parmi l’acide arachidonique (AA), l’acide docosahexaénoïque (DHA) et l’acide éicosapentaénoïque (EPA), sans protéines ni acides gras ajoutés, comprenant : a) une première étape de culture des Thraustochytrides réalisée en mode dit "batch", en mode dit "fed batch" ou en mode continu dans des conditions de hétérotrophie ou de mixotrophie dans un milieu de culture chimiquement défini comprenant une source de carbone, une source d’azote, une source de phosphore et des sels, à une température comprise entre environ 24°C et 35°C et dans des conditions pour favoriser la production de protéines à une teneur d’au moins 40% de protéines en poids par rapport au poids de la matière sèche, l’étape a) étant divisée en deux sous-étapes, une première sous-étape a1) de croissance dans le milieu de culture approprié jusqu’à obtenir des teneurs en source de carbone dans le milieu inférieure à 20 g/L, suivie d’une deuxième sous-étape a2) de production dans laquelle on ajoute au milieu de culture, simultanément ou successivement, une ou plusieurs solution(s) d'enrichissement en source de carbone, en source d'azote et en source de phosphore, la teneur en source de carbone étant en dessous de ou égale à 50 g/L, la teneur en source d’azote est maintenue entre 0,5 et 5 g/L, et la teneur en source de phosphore est maintenue entre 0,5 et 5 g/L ; b) une deuxième étape de culture dans des conditions d’hétérotrophie ou de mixotrophie à une température entre environ 18°C et 25°C et inférieure à celle de l’étape a) dans des conditions pour favoriser l’accumulation de matière grasse jusqu’à au moins 20% en poids par rapport au poids de la matière sèche, et jusqu’à l’obtention d’une densité de culture d’au moins 40 g/L en matière sèche ; c) une troisième étape de récupération de la biomasse obtenue à la deuxième étape par séparation de ladite biomasse du milieu de culture ; et d) une quatrième étape de séchage de la biomasse récupérée à la troisième étape. 28 2. Le procédé selon la revendication 1, dans lequel la culture est éclairée, avec une lumière de longueur d’onde entre 435 et 475 nm. 3. Le procédé selon la revendication 2, dans lequel la culture est éclairée pendant au moins les dernières 18 heures de culture. 4. Le procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel la biomasse comprend au moins 45% de protéines. 5. Le procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, comprenant au moins 30% de matière grasse. 6. Le procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel les Thraustochytrides sont d'un genre choisi dans le groupe comprenant Aurantiochytrium, Aplanochytrium, Botryochytrium, Japonochytrium, Oblongichytrium, Parietichytrium, Schizochytrium, Sicyoidochytrium, Thraustochytrium et Ulkenia. 7. Le procédé selon la revendication 6, dans lequel les Thraustochytrides sont choisis parmi les espèces Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/2 ; Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/3 ; Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/4 ; Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/5 ; Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/6 ; Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/1 ; Schizochytrium sp. CCAP 4087/3 ; Schizochytrium sp. CCAP 4087/1 ; Schizochytrium sp. CCAP 4087/4 ; et Schizochytrium sp. CCAP 4087/5. 8. Biomasse de Thraustochytrides comprenant en poids par rapport au poids de la matière sèche, au moins 40% de protéines et au moins 20% de matière grasse, la matière grasse ayant une teneur de 25 à 60% en acides gras polyinsaturés choisi parmi l’acide arachidonique (AA), l’acide docosahexaénoïque (DHA) et l’acide éicosapentaénoïque (EPA), sans protéines ni acides gras ajoutés obtenue par le procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, à l'exclusion d'une biomasse des souches CNCM I-4469 et CNCM I-4702 déposées à la Collection Nationale de Culture de Microorganismes de l'Institut pasteur. 9. La biomasse selon la revendication 8, comprenant au moins 45% de protéines. 10. La biomasse selon la revendication 8 ou 9, comprenant au moins 30% de matière grasse. 29 11. La biomasse selon l’une quelconque des revendications 8 à 10, comprenant entre 5 et 250 ppm de caroténoïdes. 12. La biomasse selon l’une quelconque des revendications 8 à 10, dans laquelle les Thraustochytrides sont d'un genre choisi dans le groupe comprenant Aurantiochytrium, Aplanochytrium, Botryochytrium, Japonochytrium, Oblongichytrium, Parietichytrium, Schizochytrium, Sicyoidochytrium, Thraustochytrium et Ulkenia. 13. La biomasse selon la revendication 12, dans laquelle les Thraustochytrides sont choisis parmi les espèces Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/2 ; Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/3 ; Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/4 ; Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/5 ; Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/6 ; Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/1 ; Schizochytrium sp. CCAP 4087/3 ; Schizochytrium sp. CCAP 4087/1 ; Schizochytrium sp. CCAP 4087/4 ; et Schizochytrium sp. CCAP 4087/5. 14. Utilisation de la biomasse selon l’une quelconque des revendications 8 à 13 et obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 dans l’alimentation humaine ou animale. 15. La biomasse selon l’une quelconque des revendications 8 à 13 et obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 pour son utilisation en thérapie.