UTILISATION D’UN TRIPEPTIDE CYCLIQUE POUR AMELIORER LE METABOLISME ENERGETIQUE CELLULAIRE La presente invention concerns le domainc de 1’assistance medicale a la procreation (AMP) et plus generalement toutes les applications medicales, veterinaires ou autres dans lesquelles une stimulation de 1’activite mitochondriale, ou plus generalement energetique, des cellules est souhaitee, en particulier lors de protocoles comportant une dtape de culture cellulaire ou de maintien de cellules ex vivo. Plus de 15% des couples ont recours a 1’Assistance Medicale h la Procreation au cours de leur vie genitale. Lorsque que le sperme est alterc, il est frequent de recourir aux techniques de microinjection pour obtenir des fecondations. Cette technique est tres invasive pour1’ovocyte. Par ailleurs, lors de fecondations in vitro (FIV) avecsperme normal, on retrouve regulierement 3 a 5% d’echoes de f&ondation inexpliques. Dans une demande de brevet anterieure (WO 2005/051799 A2), 1’equipe des inventeurs a decrit un tripeptide cyclique (Phe, Ac GIu, Ac Glu) de formule C-S-F-E-E-C (SEQ ID No : 1) avec une liaison de cyclisation entre les deux cystdines terminales (FEEc), ainsi que son action augmentant les capacitds fecondantes des gametes bumains. Il existe des equivalents de la molecule dans les differentes especes animales ayant les memes proprietes et egalement dccrits dans ce document. Poursuivant lews recherches, les inventeurs ont mis en evidence que la molecule FEEc a un impact sur les spermatozoides (exemple 1 ci-dessous). En particulier, elle ameliore les parametres du mouvement spermatique tels qu’analysds par CASA (Computer Aided Sperm Analysis). Ainsi, par exemple, la vitesse lineaire et l’amplitude du debattement lateral de la tete sont respectivement augmentes de 7 et 8 % (P<0,05 et P<0.002) (Exemple 1). Il en resulte une augmentation de pres de 30% du pourcentage de spermatozoides hyperactives (P<0,009). Ce sont ces spermatozoides hyperactives qui sont les spermatozoides fecondants. Pour que le spemiatozoide augmente sa vitesse de progression, il est logique de penser qu’il augmente sa consommation d’ATP ou du moins que son metabolisms energetique est ameliore, puisque son mouvement est cree par des liaisons de bras de dyneines aux tubules voisins de Paxondme. Les dyneines sont des ATPases. En etudiant le metabolisme mitochondrial des spermatozoides exposes au FEEc, les inventeurs ont dmis 1’hypothdse que celui-ci induit une augmentation du potentiel de membrane mitochondrial, temoin soit d’une augmentation de la synthase d’ATP par les mitochondries, soit d’une moindre consommation. Ainsi, le FEEc ameliore le metabolisme energetique mitochondrial ou plus generalement le metabolisme energetique cellulaire des spermatozoides, soit en ameliorant la production d’ATP, soit en rationnalisant son utilisation par la cellule.5 10 15 20 25 30 35 CA 02998747 2018-03-15 WO 2017/050854 PCT/EP2016/072476 2 La presente invention porte done, de maniere generale, sur Lutilisation d’un peptide cyclique comprenant le tripeptide reproduisant un site de liaison de la Fertiline beta a I’integnne de1’ovocyte ou d’un tripeptide de formule EEP (SEQ ID No : 2), pour son utilisation comme medicament pour ameliorer 1‘activite mitochondriale ou plus generalement pour ameliorer le metabolisme energetique cellulaire. Les applications d’un tel peptide sont ici illustrdes sur deux types cellulaires differents que sont Ie spermatozoide et 1’ovocyte et sur Ie developpement d’un organisms multicellulaire qu’est un embryon. Les resultats presentes dans la partie expbrimentale supportent le fait de pouvoir utiliser ce peptide dans d’autres applications dans lesquelles une amelioration du metabolisme energetique cellulaire est souhaitce. En particulier, ce peptide peut etre utile pour ameliorer le rendement des cultures cellulaires, notamment des lyniphocyles, Dans un mode de mise en oeuvre particulier, le peptide est vectorise, e’esria-dire administre en association avcc un agent, une molecule, une composition ou tout autre type de vecteur qui facilite son entree dans les cellules, Plus generalement, la vectorisation sert a moduler et controlcr la distribution d’un principe actif vers une cible en1'associant a un vecteur. Dans ce qui precede, le "peptide cyclique comprenant le tripeptide reproduisant un site de liaison de la fertiline beta A I’integnne de I’ovocyte" correspond au peptide decrit dans la demande de brevet WO 2005/051799 A2 mentionnee ci-dessus. Comme mentionne dans cette demande anterieure, notamment dans le Tableau 1, le tripeptide varie selon les especes. II peut etre cyclist par tout moyen connu de1’homme du metier, en particulier par rintermbdiaire de deux residua cysteines situes de part et d’autre du tripeptide. De maniere generale, toutes les declinaisons decritcs dans la demande WO 2005/051799 A2 sont considdrees comme repondant a la definition du "peptide cyclique comprenant le tripeptide formant un site de liaison de la fertiline beta a I’integnne de 1’ovocyte" au sens de la presente invention. Pour faciliter la lecturedu present texte, ce peptidecyclique, ainsi quele medicament le contenant & titre de principe actif, seront designe ici par la formule "FEEc". L’homme du metier comprendra parfaitement que cette notation couvre egalement les formes utilisables chez d’autres especes que Thomme, telles que, par exemple, le tripeptide cyclique TDE qui devrait etre utilise chez les bovins. On comprendra & la lecture de la description detaillde de 1’invention qui suit ainsi que des exemples, que la portee de la presente invention ne se limite pas aux applications en procreation medicalement assistees mais qu’elleouvre de reelles perspectives dans beaucoup d’autres domaines. Ainsi, l’mvention conceme plus generalement (’utilisation du FEEc dans les applications medicales ou non medicales dans lesquelles une stimulation du metabolisme energetique cellulaire est souhaifoe.5 10 15 20 25 30 35 CA 02998747 2018-03-15 WO 2017/050854 PCT/EP2016/072476 3 Action sur les spermatozoides en Insemination Intra Uterine En ameliorant les parametres du mouvcment spermatique, Ie FEEc est egLement susceptible d’ameliorer les taux de grossesses en Insemination Intra Uterine (HU). Scion un premier aspect particulier de 1’invention, Ie FEEc est utilise pour augmenter la vitesse de progression des spermatozoides dans un protocole de procreation medicalement assistee (PMA). Toujours dans le cadre d’une AMP, le FEEc peut etre utilise pour ameliorer les parametres du mouvement des spennatozoi'des et augmenter le taux de spermatozoides hyperactives. Aussi, Fulilisation du FEEc est particuli&rement interessante dans un protocole d’insemination intra uterine (IIU), tant chez 1’homme que chez des mammiferes non humains. Lors de la mise en oeuvre de cet aspect de I’invention, les spermatozoides sont de preference incubes pendant une minute a 3 heures en presence de 10 a 100 pM de peptide puis laves avant 1’insemination intra uterine. Action sur la maturation deVovocyte in vitro La molecule est egalement efficace sur les ovocytes. La maturation in vitro des ovocytes humains bloques en vesicule germinale passe de 37.71 & 59,30% (P<5,7 10 5) en presence de FEEc (exempts 2). Chez les patientes agees de 37 ans et plus, ce taux passe de 36,96% a 68,29%,(P<0,003) ce qui montre que la molecule est particulierement efficace dans cette tranche d’age. Les ovocytes des femmes de 37 a 40 ans sont aneuploides dans an moins 50% et plus generalement dans environ 80% des cas du fait d’une chute de leur activity mitochondriale. La molecule est done susceptible d’ameliorer la plo'idie des ovocytes et par la meme celle des embryons dont 1c potentiel de developpement et la capacite implantatoire depend egalement de 1’activite mitochondriale de I’ovocyte qui a ete feconde. L’augmentation significative des taux de grossesse chez les femmes de moins de 37 ans, dans 1c cadre de1’etude clinique « Fertiline » decrite ci-dessous, montre que cet effet benefique a lieu sur tout ovocyte et notamment lors de sa fdcondation et du developpement embryonnaire prccoce. L’hypothese trapres ces resultats et que la fertiline est & meme d’amcliorcr la ploidie ovocytaire. La supplementation des milieux de culture et des milieux de fecundation in vitro, et des milieux d’incubation des embryons, avec la molecule permet done d’ameliorer la maturation ovocytaire et embryonnaire (notamment pour les femmes moins de 30 ans et de 37 ans et plus) et le taux de fecondation en FIV classique, ainsi qu’en FIV avec ICSI (injection intracytoplasmique de spermatozoide). La supplementation des milieux de culture lors de la fecondation in vitro,avec ou sans micromanipulation, avec la molecule FEEc permet done d’ameliorer le taux de grossesse et d’enfants nes, en particulier chez les femmes demoins de 37 ans dans les conditions exptomentales mises en oeuvre.5 10 15 20 25 30 35 WO 2017/050854 CA 02998747 2018-03-15 4 PCT/EP2016/072476 Action dans les protocoles de Maturation In Vitro de I’ovocyte (MIV) La molecule FEEc est aussi susceptible d’etre efficace dans les protocoles de maturation in vitro des ovocytes pour la preservation de la fertility (MIV). Dans un protocole de fecondation in vitro, la maturation de l’ovocyte est en general achevee lors du recueil des ovocytes. Toutefois, il arrive que des ovocytes soient encore immatures. En outre, certaines femmes presentent des anomalies de la fonction ovarienne ou un etat clinique qui rendent les stimulations difficiles. Les ponctions ont alors volontairement lieu a un stade immature pour une maturation in vitro. Le peptide pourrait efficacement aider A cette maturation (maturation in vitro pour la preservation de la fertilite). L’ovocyte totalement immature presente un grand noyau appele vesiculc germinale (VG). L’ovocyte mature se caracterise par la presence du Ier globule polaire (GP) dans 1’espace perivitelkn (entre la surface de l’ovocyte et la zone pellucide). SenIs les ovocytes matures sont fecondables. Les inventeurs ont mis en evidence que le FEEc pemiet d’ameliorer la maturation des ovocytes in vitro. Ceci s’explique par Feffet du tripeptide sur l’aclivite mitochondriale ou sur le metabolisms eneraetique de I’ovocyte. En effet, l’activite mitochondriale ou plus generalement le metabolisms energetique diminue avec Page, et la maturation de l’ovocyte comporte plusieurs etapes tres consommatrices d’energie ; - Rupture de la Vesicules Germinale - Condensation des Chromosomes - Formation de la plaque Metaphasique - Formation du Fuseau - Synthese des protdines de Check-Point - Telophase - Expulsion du GP. Or ces troubles de la maturation ovocytaire qui s’aggravent avec Page sont corriges par la microinjection de mitochondries provenant de cellules jeunes (ovocytes de donneuses jeunes ou cellules souches ovogoniales). Cela renforce la probabilite scion laquelle le FEEc corrige effectivement le defaut cellulaire lid a une insuffisance mitochondriale ou plus generalement energetique. Seion un autre de ses aspects, la presente invention porte done sur I’utilisation du FEEc pour anidliorer la maturation in vitro d’un ovocyte. L’amelioration de la qualite de la meiose est probablement a Forigine de la baisse du taux de fausses couches observec dgalement chez des femmes plus jeunes, si bien que cet aspect de Pinvention est egalement interessant pour ameliorer la maturation in vitro des ovocytes de femmes de moins de 37 ans, voire de moins de 30 ans. Dans la mise en oeuvre de cet aspect de Finvention, I’ovocyte est incube5 10 15 20 25 30 35 CA 02998747 2018-03-15 WO 2017/050854 PCT/EP2016/072476 5 pendant une duree comprise entre 1 heure et 4 jours, en particulier jusqu’a 3 jours ou 24 heures, et en presence de 10 a 100 pM de peptide. Action sur 1’activation de I’ovocyte feconde Les inventeurs ont egalement mis en evidence une augmentation de la decondensation de la tete des spermatozoides apres fecondation. Cela traduit une amelioration de l’activation de I’ovocyte lors de la fecondation. Celle-ci est d’ailleurs lice A l’activitd mitochondriale de I’ovocyte. Action sur la blastoformation Les inventeurs ont egalement mis en evidence (chez la souris) que le FEEc permet une amelioration de la blastoformation. Ceci pent egalement ctre attribue a 1’effet du tripeptide sur I’activite mitochondriale ou plus generalement sur le metabolisme de la cellule. En effet, il est connu qu’il n’y a pas de replication d’ADN mitochondrial pendant 1’embryogenese preimplantatoire. Pendant la premiere semaine de developpement, le zygote (ou osuf) se divise par mitoses successives en commenqant par 2, puis 4 cellules, en passant par le stade de morula jusqu’a atteindre le stade de blastocyste, en utilisant preferentiellcment les mitochondries initialement presentes dans I’ovocyte. Un deficit mitochondrial (en nombre ou en rcndcment) peut done etre a 1’origine d’une instabilite chromosomique des blastomeres lors de la meiose et des mitoses, et conduire a un arrfit de revolution du zygote, de 1’embryon, voire de la grossesse. Ceci est une cause frequente de fausse couche spontanee apres fecondation naturelie ou apres transfert des embryons lors d’une FIV. La presente invention porte done egalement sur 1’utilisation du FEEc pour ameliorer la ploidie des blastomeres pendant la premiere semaine de developpement du zygote. De ce fait, 1’invention conceme 1’utilisation de FEEc pour diminuer le nombre de fausses couches. L’invention conceme aussi 1’utilisation de FEEc pour diminuer le risque d’aneuploi'die, en particulier de trisomic. Dans la mise en oeuvre de cet aspect de l’invention, 1’embryon est incube pendant une duree comprise entre 24 heures et 6 ou 7 jours en presence de 10 a 100 pM de peptide. Les utilisations decrites ci-dessus sont particulierement utiles dans un protocole de fecondation in vitro (FIV). Chez Fhumain, elles permettent a des femmes de tout age, d’avoir des enfants par AMP avec leurs propres ovocytes sans recourir aux injections de mitochondries dderites dans la literature (effet majeur le plus documente jusqu’a present).5 10 15 20 25 30 35 CA 02998747 2018-03-15 WO 2017/050854 PCT/EP2016/072476 6 Diminution des risques de fausses couches La presente invention porte egalement sur I’utilisation du FEEc pour diminuer les risques de fausse couche, comme cela a etc nientionr.ee pr&ddemment et est illustre dans la partie experimentale ci-dessous. Diminution des risques de trisomie La presente invention porte egalement sur I’utilisationdu FEEc pour diminuer les risques de trisomie, ou plus generalement d’aneuploidie, lors d’une FIV, chez toutes les femmes, notammcnt chez des femmes de 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 ans et plus. Amelioration de la cinetique de developpement de I’embryon in vitro La presente invention conceme egalement I’utilisation du FEEc pour ameliorer le developpement embryoimaire pre-implantatoire in vitro. Dans un mode de realisation particulier, ledeveloppement prd-implantatoire est obtenu en en condition de culture proIongee. L’amelioration de la cinetique du developpement de 1’embryon permet d’ameliorer le taux de naissance. Action en reproduction naturelle Bien que les effets du FEEc sur1’ovocyte et le zygote aient ete demontres par les inventeurs dans un contextc de FIV, il est evident que ces effets pourraient etre obtenus egalement lors des fecundations naturelies, par exemple par administration, au moment de 1’ovulation, de FEEc par voie vaginale, le tripeptide etant couple a des moyens aptes a le vectoriser jusqu’a 1’ovocyte. Action lors de la cryopreservation des gametes et des embryons 11 a egalement ete mootre que le taux de survic des ovocytes cryopreserves depend entre autre de leur activite mitochondriale. 11 est probable qu’il en soit de meme pour les embryons. Le peptide FEEc est done susceptible d’ameliorer les taux de survie et/ou la qualite des gametes et embryons cryopreserves lors de leur decongelation. Action sur d^utres types cellulaires Le tripeptide cyclique a ete fabrique pour se lier a I’integrine a6pl sur 1'ovocyte. 11 est capable de se lier a la membrane cytoplasmique de difSrents autres types cellulaires car cette integrine est Ires ubiquitaire. Cette molecule est done vraisemblablement capable d’augmenter l’activite energetique de nombreux types cellulaires. Elle est done susceptible d’utilisations multiples en dehors de la FIV. Le mode d’action de la molecule se faisant probablement par1’intermediaire de I’integrine a6pi, le FEEc est susceptible d’avoir des effets sur beaucoup d’autres types5 10 15 20 25 30 35 CA 02998747 2018-03-15 WO 2017/050854 PCT/EP2016/072476 cellulaires. Cette molecule pourrait etre utilisee pour amcliorer le rendement de toute culture cellulaire, Comme mentionne plus haut le FEEc agit possiblement par rintermediaire de 1’intcgrine a6pi ou d’un autre recepteur, present sur de nombreux types cellulaires. Il peut done etre utilise pour ameliorer l’activite mitochondriale ou le metabolisme energetique de toute cellule porteuse de cette integrine ou de cet autre recepteur. Une application immediate de cette propriety est 1’amelioration du rendement de toute culture cellulaire. La presente invention porte done egalement sur un procede d’amelioration de l’activite mitochondriale ou plus generalement energetique de cellules in vitro, comportant une elape de mise en presence des cellules en question avec le FEEc. Ce proccdd peut avantageusement etre mis en oeuvre sur des cellules primaires cultiv6cs ex vivo dans 1’optique d’etre administrees a un patient dans le cadre d’une therapie cellulaire. A titre d’exemples non limitatifs de cultures cellulaires susceptibles de bencfwicr de ce procede, on peut citer les cultures de peau en vue de greffes de peau, les cultures de lymphocytes en vue d'immunotherapies cellulaires, etc. L’invention conceme1’utilisation d’un peptide FEEc dans le but de favoriser la culture ex vivo de tous types cellulaires exprimant un recepteur au FEEc, dans des applications mddicales (comme la therapie cellulaire) ou non mMicales (comme le maintien de cellules en culture a but experimental ou de production proteique). Action dans le monde animal des mammiferes La molecule presents une specificite d'espece, Ses isoformes sont declinable® pour une utilisation chez tous les animaux domestiques, ou non, y compris les animaux de ferme dont certaines especes se reproduisent difficilement (chevaux de course, vache Holstein). Action sur les pathologies mitochondriales et centre le vieillissement Les proprietes du FEEc comme molecule stimulant l’activite mitochondriale ou plus generalement le metabolisme energetique peuvent egalement etre utilisees in vivo dans tout type de pathologie liee a un defaut d’activite mitochondriale. A ce titre, on peut citer, de faqon generate, les pathologies du vieillissement. La relation entre une dysfunction des mitochondries et les maladies neurodegdneratives, par exemple, a eth etablie par plusieurs equipes. Aussi, le FEEc pourrait etre utilise comme medicament pour traiter les maladies neurodegeneratives telles que la maladie d’Alzheimer ou la maladie de Parkinson. 11 a Egalement ete montre une relation entre la longueur des telomeres des chromosomes et l’activite mitochondriale de la cellule. Or le raccourcissement des telomeres est lie aux processus de vieillissement II est done possible qu’en stimulant l’activite mitochondriale ou energetique de la cellule on soit a meme de retarder les effets du vieillissement. Les maladies mitochondriales presentent un tableau varie mais associent frequemment des manifestations oculaires a type de retinites pigmentaires ou d’ophtalmoplegie.5 10 15 20 25 30 35 CA 02998747 2018-03-15 WO 2017/050854 8 PCT/EP2016/072476 Pour ces demidres, une administration topique du FEEc dans Fod!, par exemple dans un collyre, pourrait ameliorer les symptomes lies a Finsuffisance mitochondriale ou energetique. Un autre objet de 1’invention est done un collyre comprenant un peptide cycliquc comprenant le tripeptide capable de former un site de liaison de la fcrtilinc beta a 1’integrine de 1’ovocyte. Un tel collyre pent comprendre, outre1c FEEc, un autre agent tel qu’un agent epaississant, un agent antiseptique, un antibiotique ou tout autre compose utilisable pom- ce genre de produit. Les milieux decrits dans la demande WO 2005/051799 A2 sont bien entendu exclus de la definition du tenne "collyre” au sens de la presente invention. Action en cosmetique La presente invention porte egalement sur 1’utilisation du FEEc, dans une composition cosmetique ou therapeutique destinee a une application topique. A titre d’exemples, on peut citer1’utilisation du FEEc pour stimuler les fibroblastes pour la production de coilagene, ou pour stimuler les follicules pileux pour favoriser la croissance des cheveux, par exemple pour prevenir ou ralentir 1’alopecie. La presente invention porte done egalement sur une composition cosmetique ou dermatologique comprenant du FEEc a titre de principe actif. Par "composition cosmetique ou dermatologique", on entend ici une composition qui, outre le FEEc, comprend des ingredients usuellement utilises dans le domaine de la cosm&ologie. Scion 1'invention, la composition cosmetique ou dermatologique peut se presenter sous toute forme connue de 1'homme du metier. Il peut s'agir, par exemple, d'une emulsion huile-dans-l'eau, eau-dans-l'huile, eau dans silicone, d’une emulsion multiple, d’une microemulsion, d'une nano-emulsion, d'une emulsion solide, d'un gel aqueux ou hydroalcoolique, d'une creme, d’un lait, d'une lotion, d’une pommade, d'une huile, d'un baume, d'un onguent, d'un masque, d’une poudre, d'un support imbibe, par exemple un patch transdermique, d'une lotion aqueuse ou hydroalcoolique et/ou une cire, d'un produit de maquillage, parexemple un fond de teint, d'un shampooing, d'un apres-shampooing, d'un masque, d’un serum pour application topique, d’une lotion capillaire. Les milieux decrits dans la demande WO 2005/051799 A2 sont bien entendu exclus de la definition des compositions cosmetiques ou dermatologiques au sens de la presente invention. Selon 1'invention, la composition cosmetique ou dermatologique peut etre, par exemple une composition pour le soin du visage, du corps, des cheveux, par exemple des compositions pour le visage et/ou le corps et/ou les cheveux. Les exemples suivants illustrent 1’invention sans toutefois limiter son etendue.CA 02998747 2018-03-15 WO 2017/050854 PCT/EP2016/072476 9 Legendes des figures Figure 1 : Variation du potentiel de membrane mitochondrial en presence du FEEc (a droite) versus peptide temoin "scramble" (a gauche). Noter I’augmemation du potentiel de membrane 5 chez les spermatozoi'des exposes chez la majority des patients. Figure 2 : Comptage apres excitation aux UV des spermatozoi’des humains fusionads avec des ovocytes humains depellucides, incubds en 1’absence (A) ou en presence de FEEc a lOOpM (B). Noter Faugmentation du nombre de spermatozoi’des fusionnes et la decondensation plus rapide de leurtete. 10 Figure 3 : Proportion d’ovocytes matures a JI de Maturation In Vitro (MIV). Representation schematique des proportions d’ovocytcs humains en metaphase II (Mil) a partir du stade VG apres MIV dans 1c milieu temoin ou supplements en FEEc a 100pM.*p=0,02. ** p=0,003. Jl=24hdcMIV. Figure 4 : Proportion d’ovocytes atretiques a JI de Maturation In Vitro (MIV), Representation 15 schematique des proportions d’ovocytes humains atretiques. Resultats observes a JI a partir du stade VG apr&s maturation in vitro (MIV) dans le milieu temoin ou supplements en FEEc a lOOpM. Jl=24hde MIV. Figure 5 : Marquage du foseau meiotique obtenu sur un ovocyte humain cn Mil apres MIV dans le milieu standard (24h). Marquage du foseau par un anticorps anti-a-tubuline et des 20 chromosomes au DAPI. Image obtenue au microscope confocale. A ; ovocyte entier. B ; agrandissement de la plaque mdtaphasique. Figure 6 : Comparaison du taux de fecundation a JI entre les souris jeunes et agees,enpresence ou en 1’absence de fertiline, qui correspond au peptide QDEc. Jeunes : souris B6CBAF1 de 7 semaines ; Agees : souris B6CBAF1 de 7 mois 25 Figure 7 : Comparaison des pourcentages moyens d’embryons clives a J2 et a J4 entre les souris jeunes et agees, en presence ou en 1’absence du peptide QDEc. Jeunes : souris B6CBAF1 de 7 semaines (n=108 ovocytes, 56 temoins, 52 QDEc) ; Agees : souris B6CBAF1 de 7 mois (n=128 ovocytes, 65 temoins, 63 QDEc),*; p=0,02. **p=0,008. ***p=0,01. 30 Figure 8 ; Comparaison des pourcentages moyens d’atresie (ATR) a J2 entre les souris jeunes et agees, en presence ou en Fabsence du peptide QDEc. Jeunes : souris B6CBAF1 de 7 semaines (n=108 ovocytes, 56 temoins, 52 QDEc) ; Agees : souris B6CBAF1 de 7 mois (n=128 ovocytes, 65 temoins, 63 QDEc). Figure 9 : Representation schematique de la methodologie de 1’etude clinique rdalisde dans 35 1’exemple 5. Figure 10: Resultats preliminaries des criteres de jugement principal et secondarie dans le cadre de 1’etude clinique. Taux de grossesse par transfert d’embryon frais ou congele (groupe temoin, n=17 transferts/groupe FEEc, n=T3 transferts). Pourcentage de « top embryon »CA 02998747 2018-03-15 WO 2017/050854 PCT/EP2016/072476 10 (groupe temoin, n=75 embryons clives/groupe FEEc, n-72). Taux de fecondation (groupe temoin, n=259 MH/groupe FEEc, n=246 Mil) Figure 11 : Taux de grossesse obtenus dans le cadre de 1’etude Clinique. Figure 12 : Amelioration du taux de maturation des ovocytes bioques en VG aprcs incubation 5 en presence du FEEc. Cette etude a ete realisee en considerant un ovocyte par femme et en incubant celui-ci en presence du FEEc ou du peptide controle. Figure 13 : Effets de FEEc sur la maturation des ovocytes humains bioques en VG par tranche d'age. Figure 14 : Stimulation du ddveloppement embryonnaire pre-implantatoirc chez la souris jeune 10 par le QDEc. (*P<0,00532; **P< 0,00374; ***P< 0,00913; ****P<0,068; ( ) nombre d’embryons) Materiels et Methodes 15 Les cxcmples expcrimentaux presents ci-dessous ont ete obtenus en utilisant les matcncls et methodes suivants ; Observation des parameres du mouvement spermatique 20 Les spermes studies ont chacun etc diviscs en 2 aliquotes dont1’une a etc incubee avec le FEEc et 1’autre avec un peptide « scramble » nontenant les memos acides amines mais dans un ordre aleatoire. Les inventeurs ont incube pendant 3h a 37°C, des spermatozoides de 1’espece humaine en presence de 100 pM du peptide FEEc ou du peptide scramble puis ont observe les parametres du mouvement spermatique selon une analyse automatisee (Computed Assisted 25 Sperm Analysis, CASA). Les parametres spermatiques testes sont les suivants : la VAP lissee, la VSL, la VCL et l’ALII. Ils correspondent respectivement h la vitesse selon la trajectoire moyenne, la vitesse en ligne droite (Straight Line Velocity), la vitesse curviligne et le deplacement lateral de la tete. L’etude a montre une augmentation significative du pourcentage de spermatozoides hyperactive (selon 30 les cnteres de Mortimer et al.). Cela est de nature a expliquer 1’augmentation des taux de fecondation observe en presence du peptide. Mesure du potentie! de membrane mitochondrial Les inventeurs ont meube pendant 3h a 37°C, des spermatozoides de 1’espece humaine en 35 presence soit du peptide FEEc, soit du peptide ’'scramble1’ qui comprend les memes acides amines dans un ordre aldatoire ct constitue ainsi le groupe temoin. Apres lavage, les spermatozoides sont marques grace a un colorant lipophile fluorescent, le DIOC6.CA 02998747 2018-03-15 WO 2017/050854 PCT/EP2016/072476 11 Le potential de membrane mitochondrial (gradient protonique an niveau de la membrane interne de la mitochondrie) a ensuite ete mesure par cytometrie en flux. Il se trouve augmente dans les spemiatozoides apres exposition au FEEc. 5 Mesure de I’index de fecondation Des ovocytes humains depellucides ont ete incubes avec des spemiatozoides humains en l’absence ou en presence de FEEc a lOOpM. Les spemiatozoides fusionncs ont ete decomptes apres excitation UV. Les spemiatozoides ont ete considers fosionnes lorsque le noyau etait marque au HOECHST 33342, De plus, les totes des spemiatozoides ayant pdnetre 1’ovocyte en 10 presence du peptide FEEc sont non seulement plus nombreuses mais presentent egalement un aspect floute temoin de la decondensation de leur fete spennatique. Cette decondensation est une des premieres etapes de 1’activation ovocytaire apres la penetration du spermatozoi’de. Nous pouvons done en conclure que le FEEc non seulement amel tore la feoondancc du spermatozoi’de mais qu’il active Egalement 1’ovocyte feconde, 15 Collecte des ovocytes humains en vue de la Maturation In Vitro (MIV) Des ovocytes humains immatures donnas a la recherche ont ete collectes au sem du laboratoire de Fecondation In Vitro (FIV) du Centre d!Assistance Medicale a la Procreation (AMP) de I’hopital Cochin (Paris, France), Deux heures apres la ponction ovocytaire, les ovocytes 20 destines etre microinjectes ont 6t6 decoronises par la hyaluronidase (ORIGIO, Limonest, France). Apres observation au microscope inverse (Hoffman), les ovocytes immatures au stade vesicule germinative (VG) ont ete retenus pour la suite des experiences. Maturation In Vitro (MIV) des ovocytes humains immatures 25 Les ovocytes humains immatures au stade VG ont ete randomises, soit dans le milieu de culture temoin (Global, JCD, La Mulatiere, France) (n=203) soit dans le meme milieu supplements avec 100 pM de FEEc (n=193). Les ovocytes humains immatures ont ete classes en deux groupes : ceux appartenant aux femmes agees de moins de 37 ans et ceux appartenant a celles agees de 37 ans et plus. Le jour de la ponction folliculaire, les deux groupes d’ovocytes au stade 30 VG ont incubbs dans des gouttes de 20p1 recouvertes d’huile, et maintenus 4 37°C sous 5% de CO2 pour etre observes au microscope inverse (Hoffman) a J1 (24h d’incubation) et J2 (48h d!incubation). Les ovocytes etaient classes en metaphase II (ler globule polaire dans 1’espace perivitellin), vesicule germinative (VG), metaphase I (rupture de la vesicule germinative sans expulsion du globule polaire) ou atretiques. 35 Collecte des ovocytes murins en vue de la Maturation In Vitro (MIV) Des femelles B6CBAF1 (agees entre 5 et 8 semaines) fournies par le laboratoire Charles River (L’Arbresie, France) ont ete stimulees par injection de PMSG {Pregnant Mare Serum5 10 15 20 25 30 35 CA 02998747 2018-03-15 WO 2017/050854 PCT/EP2016/072476 12 Gonadotrophin) a 1 OUI (SIGMA-ALDRICH, Saint-Quentin Fallavier, France) sans declenchement de 1’ovulation. Les ovocytes immatures ont ete recueillis dans les ovaires 48h apres cette derniere injection, puis denudes de leurs cumulus grace a la hyaluronidase et laves a trois reprises dans du milieu de culture M2. Seuls Ies ovocytes classes en VG ont et6 retenus pour la suite des experiences. Maturation In Vitro (MIV) des ovocytes de souris immatures Les ovocytes de souris ont ete incubes de manicrc randomisee entre le milieu standard d’une part et Ie milieu supplement^ en QDEc 100 pM d’autre part. Les boites de culture ont etd prepardes la veille et incubees a 37°C sous 5% de COj. Les ovocytes ont ete observes a JO (8h post-sacrifice) et JI (24h). Immunofluorescence Les ovocytes humains issus de MIV ont ete fixes dans le paraformaldehyde (PFA) 2% pendant 1h a temperature ambiante puis laves dans le PBS nontenant 0,5% de BSA. La permeabilisation a et^ assurde par incubation des ovocytes dans une solution contenant 0,5% de BSA, 0,1% de Triton X-100, 0,05% de Twccn-20 et 5% de serum normal de chcvrc. Puis les ovocytes ont ete laves dans le PBS-BSA 0,5% avant d’etre incubes toute la nuit dans une dilution au 1/200 d’anticorps anti-a tubuline humaine (SIGMA-ALDRICH) dans du PBS contenant 0,5% de BSA. Les ovocytes ont ensuite etc incubes lb en presence de 1’anticorps secondaire de type IgG conjugue a l’Alexa Fluor (LIFE TECHNOLOGIES, Alfortville, France). Apres une etape de lavage, les ovocytes ont etd incubes 10 min dans du DAPI (dilue au 1/1000) avant d’etre months sur lame et observes en microscopic confocale dans 1’obscurite. Pour l’analyse du fuseau, les ovocytes avec des fibres de microtubules distincts et bien organises associes a un alignement parfait des chromosomes au niveau de la plaque metaphasique sont identifies comme normaux. Stimulation et accouplements des souris Des femelles B6CBAF1 "jeunes" agues de 7 semaines et "agees" de 7 mois ont etc accouplces avec des miles C57N apres superovulation, cette demidre consistant a injecter la PMSG a 10UI (SIGMA-ALDRICH) suivi du declenchement de 1’ovulation par administration d’hCG (Human Chorionic Gonadotrophin) a 10 UI (SIGMA-ALDRICH), 46-48h apres. Le lendemain de l’accouplement, les souris presentant un bouchon vaginal ont dtd sacrifices. Les ovocytes ont ete recueillis dans les oviductcs 15-16h apres I’injection d’hCG et le taux de fecondation a ete cvalue par la presence du second globule polaire dans 1’espace perivitellin. Incubation des ovocytes fecondes de souris Les ovocytes de souris fecondes apres accouplement et recueillis ont ete randomises en 4CA 029987« 2018-03-15 WO 2017/050854 PCT/EP2016/072476 13 groupes (Jeunes «exposees an peptide QDE cyclique (QDEc),Jeunes controles, agees exposees au QDEc, agees controles) et disposes dans des gouttes de milieu de culture (KSOM) de 20uL pour les temoins et suppIEmentes avec 100pM de QDEc pour les exposEs. L’exposition a dure de JI a J4 apres I’accouplement. in vivo (JO). Le QDEc est equivalent au FEEc humain. 5 L’incubation des boites de culture est rEalisee a 37°C sous 5% de COa et dies sont recouvertes d’huile minerale. Les ovocytes ont EtE observes tous les jours & la loupe binoculaire pour apprdcier Ies signes de ddveloppement embryonnaire. La cinetique de developpement normale correspond au minimum, a J2, a un embryon clive a 2 cellules et a J5 un embryon au stade morula ou 10 blastocyste. Etude prospective randomisee en FIV humaine Un essai clinique a debute au sein du laboratoire de FIV du Centre d’AMP de Cochin, le 08/09/2014, sur 66 couples, la moyenne d’dge etant de 34,3± 4,2 ans pour les femmes et 37,0= 15 5,2 pour lews partenaires. Il s’agit d’une etude prospective, monocentrique randomisee, des FEcondation In Vitro (FIV) rEalisEes en presence ou en 1’absence de FEEc. Les ovocytes, reeupErd dans leurs cumulus, ont ete repartis en deux groupes altemativement dans Fun puis dans l’autre en fonction de leur ordre de recuperation. Lorsque tous les ovocytes ont ete recuperes, un technicien n’ayant pas participe au recueil des cumulus determinait par 20 randomisation lequel des deux groupes etait insemine en prEsence de FEEc et lequel servait de temoin. Une partie des ovocytes est incubee dans Ie milieu de culture standard (Global, JCD), l’autre partie dans ce meme milieu supplemente en FEEc lOOpM. La mdthodologie de cette Etude, schEmatisEe a la figure 9, est presentee ci-dessous. Des ovocytes humains provenant de femmes agees de 18 a 43 ans ont ete rEcuperds parponction 25 des ovaires apres stimulation hormonale par les gynecologues. Ils ont Ete repartis de maniere randomisee en 2 groupes : les ovocytes incubes en presence d’un milieu de culture standard supplemente en FEEc a 100 pM ou d’un milieu de culture standard (Global, JCD) puis places dans un incubateur a 37° sous une atmosphere de 5% de CO2. Les spermatozoides du conjoint ont ete recupdrds au laboratoire et les plus mobiles, sdlectionnees selon une preparation standard 30 des centres d’AMP. La FIV consiste en la mise en presence des spermatozoides et des ovocytes dans le milieu d’insemination a raison d’une concentration de 105 spermatozoides selectionnes /ml dans des gouttes de 20 microlitres sous huile. L’insemination a lieu dans un incubateur a 37°C sous 5% de CO2 pendant 18 heures. 18h apres Pinsemination (JI), la dEcoronisation des ovocytes est effectuee. Les ovocytes fecondes sont laves et transferes dans 35 une autre goutte de milieu et mis en culture pour 24h supplementaires. Lors du transfertin utero, i1s sont laves trois fois, puis mis dans un milieu de transfert ct places dans la cavite uterine. Les embryons sont transferes selon leur qualite apparente sans se soucier du groups d’origine. Un, ou plusieurs embryons sont transferes en fonction de 1’agc, de Findication de la FIV, du rangCA 02998747 2018-03-15 WO 2017/050854 PCT/EP2016/072476 14 de la tentative et de la qualite des embryons obtenus, et avec 1’accord des couples. Certains embryons peuvent etre mis en culture proIongee sur 5 jours (au stade blastocyste) soit d’emblee, soil apres transfert d’embryons a J2. Le critere d’evaluation principal est le taux de grossesse clinique par transfert d’embryon frais 5 ou congele et le taux de fausse couche en tenant compte des 3 groupes : transferts homogenes (temoins et traites) et mixtes (melange des deux). Les critdres secondaires sont : Les taux de fecondation, i.e., le rapport du nombre de zygotes ayant deux pronucleus dans le cytoplasme, 18 heures apres insemination rapporte au nombre d’ovocytes 10 en metaphase 2 dans la cohortc. Le pourcentage d’embryon de bonne qualite i.e., des embryons dont la sequence de clivage correspond a la sequence ideale soit : 4 a 5 cellules i J2 et 8 & 9 cellules a J3 et dont la fragmentation des blastomeres est de type A (lorsque le volume occupe par les fragments est inferieur A 10% du volume embryonnaire) ou B (lorsque le volume occupe par les fragments 15 est compris entre 10% et 30% du volume total de 1’embryon). Ainsi ces embryons dit « Top » correspondent au rapport du nombre d’embryons de chaque type rapporte au nombre d’embryons total pour chaque groupe. Ce protocole a requ l’avis favorable du Comite de Protection des Personnes (CPP) Quest VI le 13/12/2012. L’etude a obtenue I’autorisation de 1’Agence de la Biomedecine le 08/07/2013. La 20 FIV est effectuee dans le strict respect des Bonnes Pratiques Cliniques. Chaque couple acceptant de participer a l’etude a signe un consentement libre et ecIairC Analyse statistique Les variables quantitatives ont ete etudiees par leurs effectifs, moyenne et ecart-type, Les 25 donnees ont ete comparees entre le groupe expose et non expose a l’aide d’un test approprie (test de Student ou test de Wilcoxon) pour les variables quantitatives. Les comparaisons de pourcentages ont etc effectives grace a un test de Chi-2 (%2) ou un test exact de Fisher. Les differences entre les donnees comparees ont ete considerees comme statistiquement significatives lorsque la valeur de p (seuil de significativitd) dtait inferieure & 0,05. 30 Exemple 1: Amelioration des parametres du mouvement des spermatozoides et du pourcentage de spermatozoides hyperactives chez FHomme Des experiences preliminaires ont montre que dans un test de survie sur 18 heures de spermes incubes en presence du peptide FEE, la survie est significativement amdlioree dans le groupe 35 traite par 1c FEE a la concentration de lOOpM compare au temoin. Exemple la : Analyse automatisee des parametres du mouvement spermatique apres incubation en presence de FEEc et d’un peptide scramble pour temoin.5 10 15 20 25 30 CA 02998747 2018-03-15 WO 2017/050854 PCT/EP2016/072476 Les resultats presentes dans le tableau 1 ci-dessous montrent une augmentation de la VAP lissee (p=0,008), de la VSL (p=0.048), de la VCL (p<0,0001), de l’ALH (p=0,002), resultant en une augmentation de 29% des spermatozoi'des hyperactiv& (p=0,009) par rapport au groupe temoin. Cette amelioration du pourcentage des spermatozoi’des hyperactive explique Famelioration de leur capacite fusiogene et 1’augmentation des taux de fdcondation enregistres chez la souris sur des complexes cumulo ovocytaire intacts. M.b- 10.8 8c .s'11n. 0,008 7% VSL (pm s) 67,31 16.7 71.81 1*3 0,048 7% 137,51 US.6 t 26» : ’ - o.oooi 8% ALH (p.m) 6,1±1.3 6.6±L3 0,002 8% 33»i-3^: ; SFR(%) 85.8111.4 NS I.IKP- j 5 1 I I ' 5 'J ' id ? \S 15.9 3-11.6 Tableau 1 : Analyse automatisfee des parametres du mouvement spermatique comparee entre les groupes temoin et apres incubation en presence de FEEc. Exemplc lb : Mesure du potentiel de membrane mitochondrial Le potentiel de membrane mitochondrial s’avcrc etre augmente de 21% en presence du peptide FEEc par rapport au peptide « scramble » (p<0.001) (Figure 1). Le FEEc ameliore done les parametres du mouvement spermatique par augmentation du potentiel de membrane mitochondrial spermatique. Exemple 1c : Etude de I’index de fecondation Les resultats presentes a la figure 2 montrent que, non seulement un plus grand nombre de spermatozoides est fusionne avec les ovocytes ddpellucides en presence du peptide FEEc, mats ces demiers sont egalcmcnt decondenses contrairement a ceux du groupe temoin. Sur les ovocytes temoins, on denombre une moyenne de 19,0 ± 4,6 spermatozoi'des dans le cytoplasme alors qu’une augmentation avec 36,9 ± 11,7 spermatozoi’des fusiormSs par ovocytes, est rapportee apres incubation avec le FEEc a 100 pM (p<0,001). Ce phenomene suggere une amelioration de la fecondance des spermatozoi’des et une activation ovocytaire mediee par le peptide FEEc.5 10 15 20 25 30 35 WO 2017/050854 CA 02998747 2018-03-15 16 PCT/EP2016/072476 Les parametres du mouvement des spennes de 37 patients out ete analyses en presence ou en absence de FEEc (Incubation de 3 heures). II. y a une augmentation significative du pourcentage de spermatozoides hyperactives selon les criteres de Mortimer, ce qui explique 1’augmentation de leur fecondance (voir Tableau 1 ci-dessus). Exemple 2 : Amelioration des pourcentages de maturation in vitro des ovocytes humains inimatures Une augmentation significative de la maturation ovocytaire sous FEEc a ete mise en evidence a 11, pour 1’ensemble des ovocytes humains testSs. Les resultats obtenus sont les suivants: 42,3% (69/163) d’ovocytes en metaphase II (Mil) sous FEEc versus 30,0% (52/173) dans le groupe temoin, p-0,02 (Figure 3). Cette augmentation de maturation est encore plus marquee pour les ovocytes issus de femmes agces de 37 ans et plus des J1. Les resultats obtenus sont les suivants: 47,9% (23/48) d’ovocytes en Mil sous FEEc versus 20,4% (11/54) dans le groupe teirioui, (p=0,003). Bien que faible pour les ovocytes issus de femmes dont Page est inferieur a 37 ans, 1’amelioration de la MIV ovocytaire chez 1’humain est ties significative pour les ovocytes de femmes plus ag6cs puisque le meme taux de maturation que pour les ovocytes des femmes jeunes a ete obtenu (47,9% des ovocytes en metaphase II en presence de FEEc versus 20,4% dans le groupe tdmoin, p=0,003). Les resultats obtenus avec les 336 ovocytes humains au stade VG, incubds de maniere randomisfe en presence ou en l’absence du peptide FEEc, montrent que la presence du FEEc ameliore le taux de maturation des ovocytes humains. Aucune difference significative entre les taux d’atr&ie ovocytaire parmi les 2 groupes n’a ete detectee (16,5% en presence du peptide versus 16,8% pour le groupe temoin) (Figure 4). Dans 1’echantillon de femmes agees de 37 ans ct plus, on note une tendance non significative a une diminution du taux d’atrcsic en presence du peptide FEEc (16,7%, 8/48) par rapport au milieu temoin (24,1%, 13/54) p>0,05. L’etude a ete poursuivie et des resultats complementaires ont dte obtenus. Ces resultats confirment les resultats decriis ci-dessus et mettent en evidence d’autres effets du peptide FEEc, comme decrits ci-apres. Au total 600 ovocytes ont etd mis en maturation in vitro. Pour l’analyse, seulement un ovocyte par femme a ete inclus dans 1’etude afin que Ies evenements soient tous indhpendants. En presence de la Fertiline dans le milieu, le taux de maturation est passe de 38,3% a 59,0% (P<1.65 10 15 20 25 30 35 CA 02998747 2018-03-15 WO 2017/050854 PCT/EP2016/072476 17 1q-4) ^j?jgUre 12), Quand l’analyse est faite en fonction de 1’agc de la femme dont provienncnt les ovocytes en VG, on voit que l’amelioration de la maturation est relativement modeste pour les femmes de moms de 37 ans (42,6% a 51,8%, P<0,2), mats qu’clle est beaucoup plus important chez les ovocytes provenant de femmes agees de 37 ans et plus (35.1% a 65.9% P<3.91 10'3). La Fertiline est done a meme de stimuler la maturation in vitro de 1’ovocyte decoronise et 1’expulsion du premier globule polaire. Elle le fait apparemment d’autant mieux que le deficit energetique de 1’ovocyte lie a Page est plus important. Cette etude a egalement permis de mettre en evidence une augmentation du taux de maturation plus particulierement les ovocytes en VG des femmes de plus de 37 ans et de moins de 30 ans (Figure 13). Exemple 3 : Organisation du fusean meiotique des ovocytes humains matures in vitro La figure 5 montre 1’organisation incomplete et aberrante de l’alignement des chromosomes sur la plaque m&aphasique avec des chromosomes non alignes. L’image est obtenue a partir d’un ovocyte humain en Mil apres 24h de MIV en presence du milieu controle. Exemple 4 : Amelioration du taux de fecundation et dn developpement embryonnaire precoce chez la souris A JI, le taux de fecondation reste inchange chez les souris jeunes, tandis qu’il passe de 39% a 51% chez les souris agees (p<0.03) (Figure 6). A 12 parmi les souris jeunes, 50,0% (26/52) des ovocytes sent dives dans le groupe QDEc centre 32,4 % (18/56) dans le groupe temoin (P=0,02) (Figure 7). Concemant les souris agees, il y a significativement plus d’embryons dives a J2 en presence de QDEc (58,7%, 37/63) par rapport au temoin (35,4%, 23/65), p=0,008. A J4, la proportion d’embryons dives issues de souris jeunes atteignant le stade morula ou blastocysts est de 34,6% (7/16) pour le groupe temoin centre 63,0% (17/26) pour le milieu supplements en QDEc, p<0,03. Cette proportion attaint 86,3 % (63/73) pour les souris agees en presence du peptide centre 28,3% (15/53) dans le milieu temoin, p=0,001. De maniere interessante, la blastoformation chez la souris est amelioree en presence du peptide QDEc. Les pourcentages d’embryons atretiques ne sent pas significativement differents entre les 2 groupes parmi les souris jeunes ; 17,3% (9/52) en presence de QDEc et 30,4% (17/56) pour le controle (p=0,l). Par rapport aux souris jeunes, le pourcentage d’atr&ie est plus important dans le groupe des souris agees avec des taux similaires entre les groupes QDEc (38,l%,24/63) et temoin (49,2%, 32/65) (p=0,2) (Figure 8).5 10 15 20 25 30 CA 02998747 2018-03-15 WO 2017/050854 18 PCT/EP2016/072476 Afin d’etudier plus finement le developpement embryonnaire prcimplantatoire, le protocole suivant a et6 mis en oeuvre : Des souris out dte accoupldes a JO. A JI, les ovocytes ont 6t6 recuperes par dilaceration des ampoules tubaires. Ils ont alors ete distribues cn deux groupes de fapon randomis^e et mis en culture avec ou sans QDEc, avant fecondation. Les resultats montrent une augmentation des morulas a J3, des blastocystes & J4 et parmi eux une augmentation des blastocystes expanses lorsque 1’ovocyte a ete incube en presence de QDEc (31,1% vs 45,9% P<0,009) (Figure 14). De plus, apres transfert de ces blastocystes chez des femelies pseudo gestantes, il y a une augmentation significative du nombre de progenitures obtenues par embryons transferes, surtout pour les embryons provenant de souris jeunes (Tableau 2 ci-dessous). Terne Jeunes . Ferti ?in ine H 109 132 sig figs® IK • t SHHI 57 0 05 il 46% 1 W Agees Ferti fin '■ ihSvf 58 30 * 1 10’ 3596 ' ’■ 0,61 40% : JU Total Ferti: fin me 167 162 »7 " ' ' \ 34% ? ’3 46% " ’ Tableau 2 : Taux de naissance apr^s transfert des embryons tdmoins et traitds avec QDEc chez la souris Example 5 : Augmentation des taux de grossesse Clinique en Fecondation in vitro Les resultats presentes ci-dessous ont etc obtenus dans le cadre de 1’etude « Fertiline ». Dans un premier temps, 56 couples ont etc incius La moyenne d’age est de 33,9+/-4,l ans parmi les femmes el 36,7+/-5.3 pour les partenaires. Aucune difference significative n’a ete relevee, ni entre les taux de fecondation, ni entre le pourcentage d’embryons de top qualitc parmi les 2 groupes FEEc versus temoin. Une tendance non significative a Taugmentation des taux de grossesse par transfert est relevee en presence du peptide par rapport au controle et au groupe mixte, 46,1% (6Z13) contre 29,4% (5/17) et 40% (2/5), respectivement (Figure 10 et Tableau 2 ci-dessous). Une fausse couche a ete rapportee apres transfert d’un embryon issu du groupe temoin. Aucun effet indesirable n’a 6td rapporte 4 ce jour. A ce jour 66 couples ont etc incius dans 1’etude. 54 transfects ont ete effectues, 26 avec des5 10 15 20 25 WO 2017/050854 CA 02998747 2018-03-15 19 PCT/EP2016/072476 embryons temoins, 22 avec des embryons du groups FEE, 6 avec des embryons des deux groupes (transferts mixtes). Le taux de grossesse cumulee a ete respectivement de 34,6%, 45,5% et 33,3% dans les 3 groupes. Le taux de fausses couches spontandes etait respectivement de 33,3 %, 10% et 0%. Le taux de grossesses cliniques est done respectivement de 23%, 41% et 33,3%. Fait essentiel quand le taux de grossesse clinique est rapporte a l’age des patientes, on s'apetgoit quo chez les patientes jeunes, le taux de grossesse clinique evolutive (c’est-il-dire allant jusqu’a terme) est significativement augments de 20% a 57,1% (P<0,03). Tableau 3 : Taux de grossesse par transfert (pour 66 patients) Transfert d’embryons Temoin FEEc Mixte Total Patient inclus 66 Transferts differes 21 Transferes cumulus 26 22 6 54 Taux de grossesse n (%) 9 (34,6%) 10 (45,5%) 2 (33,3%) 38,9% Fausses couches n (%) 3 (33,3%) 1 (10,0%) 0 4(19%) Les resultats montrent 6galement une augmentation de 21% de grossesses cliniques apres transfert d’un embryon issu du groupe FEEc 40,0% (8/20) contre 33,3% (8/24) dans le groupe t6moin (p>0,05). Les taux de fecondation sont de 66,2% parmi les temoins contre 67,6% dans le groupe expose au FEEc (p>0,05). Le taux de fausse couche spontande precoce aiteinl 37,5% (3/8) dans le groupe temoin contre 11,1%. (1/9) lorsque 1’embryon a ete expose au FEEc (p>0,05) (Figure 11). Pour les femmes agees de moins de 37 ans, apres exposition au FEEc, les taux de fecondation sont de 70,9% contre 68,3% dans le groupe temoin. Dans le cas ou 1’ovocyte a ete expose au FEEc, les taux de grossesse atteignent 57,1% contre 20,0% dans le groupe temoin (Tableau 4 ci-dessous).CA 02998747 2018-03-15 WO 2017/050854 20 PCT/EP2016/072476 Tableau 4 : Taux de fecondation et taux de grossesse selon 1'age de la partenaire (>37 ou < 37 ans) * P<0,03) Age femme (annee) Notnbre couple (n) Taux fecondation Temoin (%) Taux fecondation FEEc (%) Taux de grossesse Temoin (%) Taux de grossesse FEEc(%) 26-36 47 68.3% 70.9% 20.0% 57.1%* 37-43 19 60.2% 60.3% 33.0% 20.0% 5 Sur les 66 premiers couples Indus dans 1’etudejusqu'a ce jour, 51 transferts ont 6te effectues, les autres etant differes et les resultats montrent que sur ces 51 transferts : - 21 ont ete realises a partir d’embryons du groupe temoin ; 18a partir du groupe en presence du FEEc ; 10 - 12 avec des embryons des deux groupes. Le taux de grossesse est plus elevc et les fausses couches sont moins nombreuses pour le groupe en presence du FEEc par comparaison avec les autres groupes (33% de fausses couches versus 9% pour les embryons en presence de FEEc) (Tableaux 5 et 6 ci-dessous). Les taux de grossesses pour les femmes jeunes passent de 20% a 57,1% (p<0.03), en presence 15 de FEEc par rapport au tcmom.CA 02998747 2018-03-15 WO 2017/050854 21 PCT/EP2016/072476 Transfer! d’embryons Temoin FEEc Mixte Total Patient inclus 66 Transferts differes 15 Patients transfcrcs 21 18 12 51 Taux de grossesse n (%) 34.6% 45.5% 33.3% Fausses couches n (%) 33% 10% 0 Taux de grossesse Evolutive (%) 23% 41% 33% Tableau 5 ; Taux de grossesse par transfer! (pour 66 patients) Tableau 6 ; Taux de grossesse par transfer!en function de Tage des femmes. Couples Taux de fecondation Taux de grossesse/transfert Age F N Temoin (%) FEE (%) Temoin (%) FEE (%) Fisher 26-36 47 68,3% 70,9% 20% (4/20) 57,1% (8/14) P=0,03 37-43 19 60,2% 60,3% 33% (2/6) 10% (1/10) P“0,5 Total 66 66,23% 67,6% 23 % (6/26) 37,5% (9/24) P=0,2 La poursuite de 1’etude Fertiline a permis d’obtenir des resukats compldmentaires. Au total 66 10 couples out ete inclus dans i’etude, Les r&ultats sont rapportes dans les tableaux ci-dessous. Les donnees globales des tentative® sont rapportees dans le tableau 7. Les taux de tocondation globaux n’ont quasiment pas ete modifies. Mais le pourcentage des tentatives pour lesquelles il y a eu une paucifecondation (moins de 20% de taux de fecondation) a chute de 37,9% a 27,3% 15 en presence de FEEc, suggerant une meilleure fecondance des gametes en presence de Fertiline. De meme la polyspermia est du mdme ordre de grandeur dans le groupe Fertiline que dans leCA 02998747 2018-03-15 WO 2017/050854 PCT/EP2016/072476 22 groupe temoin (4,0% vs 5,2%) montrant que le mecanisme normal du bloc a la polyspennie n’a pas M modifid 5 FvUil leiMin Fcinline N Couples 66 'Age homsnc 37 45,2 Age femme 34 4,2 Nwocyies 64? 325 122 10 N M2 592*91,4?,,) 302(92,9%) 2^0/00.0^1 N'3PN 3% 200 196 N3PN 30 17 13 -^uciftamdatron 25(37.9%) 18 p ? Echec de fikondauon 10 6(9j%) 4(4%%) BWoformata utite 133(33,6%) 70(35,0%) 63(32.1%) 15 Tableau 7 : Resultats globaux de 1’etude Fertiline sur 66 patients Les resultats de tous les couples ayant eu un transfect d’embryons sont rapportes dans le tableau 8. Ce tableau exclue les couples qui ont eu un cchcc de fecondation inexplique dans les deux groupes d’ovocytes avec ou sans Fertiline (n=6). 2.0 1.„1 - ' i Embryons N Taux Bbst NUsmtert Gro^eiie FCS Gtv$se« foldsSia .two - fet r) Taux "pljm ft equine na«v&ncis(nWH i : Wmoin 151 69,5« 37,1% 36(39,5«) 16 5(33,3%) 11(30,5«) (6) 2951g 1 ^Ltc 98 37,?. 34S35,4T4 13 2(15,4.) 11(32 5*4 (9) 3041g W . ! Tableau 8 : Resultats obtenus chez les 66 couples de Fetudc fertiline Comme le montre le tableau 8, pour les patientes ayant eu un transfer! d’embryon, le taux de 25 fecundation est passe de 69,5% d 78,6% ce qui est une amelioration de 13% mais qui n’atteint pas la significativite dans la cohorte prfeente. Le developpement embryonnaire jusqu’au stade blastocyste n’est pas modify, ni le taux d’implantation des embryons dans 1’uterus. Par centre le taux de fausses couches est diminue de pres de 50% dans le groupe Fertiline (15,4% vs 30,5%).5 10 15 20 25 23 Les resultats des couples ayant eu un transfert d'embryons et dont la femme a moins de 37 ans sont rapportes dans le tableau 9. Si 1'on ne considere que les couples dont la femme a moins de 37 ans (n=47) et qui correspondent a plus de 70% des patientes prises en charge, on s'aper^oit que le taux de fecondation estsignificativement ameliore de 70,9% a 83,3% (P<0,05). Le taux des fausses couches passe de 36,3%, pour les patientes ayant re^u un embryon du groupe Temoin a 9,1% soit quatre fois moins important, pour cedes ayant re?u un embryon du groupe Fertiline. De fait, le taux des grossesses evolutives donnant naissance a un enfant passe de 28,6% dans le groupe des embryons Temoins a 41,6% dans celui des embryons du groupe Fertiline. Patientes <37 ans (47 couples inclus) Embryons " 4 ldU< Blast N transfert Grossesse FCS Gross^se Poids a la transferee OVO -p de fee I Taux implant evolutive (n bebe) Temoins I 127 70,9% | 36,7% II (37,9%) 28 1 12 |I (36,3%) 4 | 8(28,6%) (7) 2894g FEEc 78 4' S3 3 % p<0 05 36 7% (44>i i (9 1%) (8) 3271g Tableau 9 : Resultats obtenus chez les couples dont la femme a moins de 37 ans dans la cadre de1'etude Fertiline. Selon certains aspects, une ou plusieurs des realisations suivantes sont decrites : 1. Utilisation in vitro d’un peptide cyclique comprenant le peptide cyclique de formule C-S-F-E-E-C (SEQ ID NO: 1) avec une liaison de cyclisation entre les deux cysteines terminales reproduisant un site de liaison de la fertiline beta a 1’integrine d’un ovocyte, pour la maturation in vitro d’ovocytes immatures. 2. L’utilisation in vitro selon la realisation 1, dans laquelle les ovocytes sont des ovocytes humains. 3. L’utilisation in vitro selon la realisation 1 ou 2, dans laquelle les ovocytes sont incubes pendant une duree comprise entre 1 minute et 4 jours en presence de 1 a 100 pM de peptide. 4. L’utilisation in vitro selon I’une quelconque des realisations 1 a 3, pour ameliorer la ploidie des ovocytes. Date Regue/Date Received 2024-01-2624 5. L’utilisation in vitro selon 1’une quelconque des realisations 1 a 4, pour augmenter les chances de grossesse et/ou diminuer les risques de fausse couche. 6. Utilisation in vitro d’un peptide cyclique comprenant le peptide cyclique de formule C-S-F-E-E-C (SEQ ID NO: 1) avec une liaison de cyclisation entre les deux cysteines terminates reproduisant 5 un site de liaison de la fertiline beta a 1’integrine d’un ovocyte, pour augmenter le taux de spermatozoides hyperactives dans un protocole de procreation medicalement assistee (PMA). 7. L’utilisation in vitro selon la realisation 6, pour augmenter la vitesse de progression desdits spermatozoides. 8. L’utilisation in vitro selon la realisation 6 ou 7, dans laquelle les spermatozoides sont incubes 10 pendant 1 minute a 3 heures en presence de 1 a 100 pM du peptide cyclique avantune insemination intra uterine. 9. Utilisation in vitro d’un peptide cyclique comprenant le peptide cyclique de formule C-S-F-E-E-C (SEQ ID NO: 1) avec une liaison de cyclisation entre les deux cysteines terminates reproduisant un site de liaison de la fertiline beta a 1’integrine d’un ovocyte, pour la cryopreservation des 15 gametes et des embryons. 10. L’utilisation invitro selon 1’une quelconque des realisations 1 a 9, dans un protocole de fecondation in vitro (FIV). Date ReQue/Date Received 2024-01-26