CA3007797C - Agents complexants hydrosolubles a base de triazapyridinophane et complexes de lanthanide fluorescents correspondants - Google Patents

Abstract

L'invention concerne des agents complexants de formule (I). L'invention concerne egalement des complexes de lanthanides obtenus a partir de ces agents complexants et de leur utilisation pour marquer des molecules biologiques. (voir formule I)

Description

Agents complexants hydrosolubles a base de triazapyrldinophane et complexes de lanthanide fluorescents correspondants La presente invention a pour objet de nouveaux agents complexant hydrosolubles bases sur des macrocycles de type triazapyrldinophane, des complexes de lanthanides fluorescents obtenus a partir de ces agents complexants, et ('utilisation de ces complexes de lanthanides fluorescents pour marquer des molecules et les detecter par des techniques de fluorescence en temps resolu. Etat de la technique Les complexes d’europium et de terbium sont desormais acceptes par I’ensemble de la communaute scientifique pour etre des sondes fluorescentes de choix (Inorganic Chemistry 2014, 53, 1854, Chemical Review 2010, 110, 2729). En effet grace a leurs proprietes photo-physiques tres specifiques, ces molecules ont ete largement utilisees dans I’industrie et etudies par les laboratoires universitaires dans Ie domaine des sciences de la vie. Ces composes fluorescents sont particulierement appropries pour etre utilises en conjonction avec des fluorophores compatibles pour effectuer des mesures de FRET (acronyme de I’expression anglaise « Forster Resonnance Energy Transfer »), dont l’application pour etudier les interactions entre biomolecules est exploitee de maniere commerciale par plusieurs societes, dont Cisbio Bioassays et sa gamme de produits HTRF®. La duree de vie d'emission relativement longue des complexes de lanthanides permet egalement d’effectuer des mesures de fluorescence en temps resolu, c'est-a-dire avec un delai apres excitation des fluorophores, ce qui permet de limiter les interferences de fluorescence dues au milieu de mesure. Cette derniere caracteristique est d’autant plus utile que Ie milieu de mesure se rapproche d’un milieu biologique, qui comprend de nombreuses proteines dont la fluorescence pourrait interferer avec celle des composes studies. De nombreux complexes de lanthanides ont ete divulgues et certains sont exploites de maniere commercials: on peut citer en particuller les cryptates macropolycycliques de lanthanides (EP 0 180 492, EP 0 321 353, EP 0 601 113 , WO 2001/96877, WO2008/063721), les complexes de lanthanides comportant un motif derive de la coumarine lie e un motif diethylenetriamine pentaacide (US 5,622,821), et ceux comprenant des derives de pyridine (US 4,920,195, US 4,761,481), de bipyridine (US 5,216,134), ou de terpyridine (US 4,859,777, US 5,202,423, US 5,324,825). Le brevet US 5,385,893 decrit des derives de triazapyridinophanes dont les trois azotes sont substitues par des groupes acides (carboxyliques ou phosphoniques), et des complexes de ces composes avec un atome de gadolinium, de manganese ou de fer. Les complexes decrits ne sont pas fluorescents et peuvent etre utilises comme agents de contrasts. Les triazapyridinophanes selon US 5,385,893 sont tres peu adaptes a la preparation de complexes fluorescents du fait de la taille de la cage macrocyclique qui permet les echanges de molecules d’eau assez facilement. La synthese de ce macrocycle triazapyrldinophane a ete realises avec un rendement de 2%. L’obtention de ce compose n’est pas directe et passe obligatoirement par I'utilisation d’un5 10 15 20 25 30 35 CA 03007797 2018-06-07 2 WO 2017/098180 PCT/FR2016/053296 intermediaire dont les trois atomes d'azote appartenant au macrocycle sont proteges par des groupements tosyles. Ces derniers sont eiimines en fin de synthese dans des conditions drastiques. Un peu plus tard ('amelioration de la synthese a ete rapportee par Lee et al. (Journal Organic Chemistry 1996, 61, 8304) qui obtiennent de meilleurs rendements. Le compose macrocyclique est obtenu selon une synthese convergente comportant 8 etapes dont la derniere consiste e deproteger les groupements tosyles, la encore en milieu fortement acide. Ces macrocycles ne sont pas utilises coniine ligands complexants. En 2008 Nolan et al. ont tente de reproduire le procede de synthese decrit par Lee mais ont echoue, ce qui les a conduit e developper une nouvelle strategic de synthese convergente (Tetrahedron Letters 2008, 49, 1993). L’etape finale de deprotection des tosyles est realises encore une fols en milieu tres acide. Recemment les travaux de Castro et al. sur les systemes macrocycliques de type triazapyridinophane (Inorganic Chemistry 2015, 54, 1671 et Inorganic Chemistry 2013, 52, 6062 ont permis de caracteriser les complexes de lanthanides correspondants par diffraction des rayons X. Cependant la methode de synthese utilisee est la meme que celle decrite precedemment par Lee et al. Les macrocycles triazapyridinophanes de I’art anterieur ne sont pas adaptes a une utilisation pour des dosages biologique en FRET : • Les macrocycles triazapyridinophanes complexes avec un atome d’europium ou de terbium decrits precedemment presentent des longueurs d’onde d'absorption optimales a 267 nm ce qui est redhibitoire pour une utilisation comme composes fluorescents donneurs pour des mesures de FRET. En effet, d’une part les sources laser utilisees dans les dosages biologiques pour exciter les fluorophores donneurs emettent a differentes longueur d’ondes : 337 nm (laser £ azote), 355 nm (laser Nd : YAG), 349 nm (Nd : YLF) et d’autre part les lampes flash qui permettent I’excitation entre 310 et 350 nm : les composes de I’art anterieur, absorbant de maniere optimale a 267 nm, ne peuvent pas etre excites par ces dispositifs. • Les macrocycles triazapyridinophanes de I’art anterieur sont relativement hydrophobes, ce qui est un probldme pour leur utilisation dans des dosages biologiques en milieu aqueux, et peut entraTner un important signal non-sp6cifique dans les mesures de FRET. De plus les complexes peu solubles dans les milieux aqueux ne sont tout simplement pas utllisables. • Les methodes de synthese de ces macrocycles comprennent plusieurs etapes dont la derniere necessite des conditions experimentales tres drastiques pour la liberation des5 10 15 20 25 30 35 40 CA 03007797 2018-06-07 3 WO 2017/098180 PCT/FR2016/053296 fonctions amines secondaires protegees par des groupements tosyles, a savoir plusieurs heures de reaction dans de l’acide sulfurique concentre a 120°C. Ceci est un veritable obstacle pour la synthese de molecules plus elaborees utilisables comme fluorophore dans des dosages biologiques de type FRET, puisque ces conditions ne sont pas compatibles avec l'ajout de fonctions sensibles a ces conditions. • II est par ailleurs important de noter que les methodes de synthese de triazapyridlnophanes decrites dans la litterature ne permettent d’acceder qu’a des composes de symetrie C3 et done ne permettent pas de dlfferencier les substituants portes par les trois noyaux pyridines pour obtenir des composes adaptes a une utilisation comme fluorophore dans des dosages biologique en FRET. Finalement, les macrocycles triazapyridlnophanes de Part anterieur ne sont non seulement pas adaptes a une utilisation comme fluorophore dans des dosages biologiques de type FRET, du fait de leur proprietes spectroscopique et de leur hydrophobie, mais en plus les methodes decrites pour leurs syntheses rendent impossible toute adaptation de ces molecules b cette application (molecules de symetrie C3, conditions trop drastlques de deprotection des amines). II existe done un besoin pour des macrocycles triazapyridlnophanes et des complexes de lanthanides correspondants utilisables dans des dosages biologiques de type FRET. La presente invention vise a pallier aux inconvdnients des composes de Part anterieur, et a fournir des complexes de lanthanides fluorescents presentant une meilleure brillance que les composes de Part anterieur lorsqu’ils sont excites entre 310 et 350 nm, si possible une bonne solubilite en milieu aqueux, un spectre d’emission adapte a leur utilisation dans des experiences de FRET, ainsi qu’une bonne praticite pour Ie marquage de biomolecules. Description de I’invention Les inventeurs ont depasse Ie prejuge technique selon lequel les triazapyridlnophanes sont tres peu adaptes a la preparation de complexes fluorescents du fait de la tattle de la cage macrocyclique qui permet les echanges de motecules d’eau assez facilement. Les problemes mentionnes precedemment ont ete resolus grace a Pelaboration d'un protocole de synthese permettant la preparation d’agents complexants constitues d’un macrocycle triazapyridinophane, dont les pyridines sont substituees par des groupements paramethoxyphenylacetylenes ou 2,4,6- trimethoxypttenyles, ces groupements portant eux-memes des groupes susceptibles d’augmenter I'hydrosolubilite des macrocycles, et eventuellement un groupement permettant la conjugaison des macrocycles avec d’autres motecules, notamment des motecules biologiques que I’on souhaite marquer avec un compose fluorescent. L’invention a done pour objet des agents complexants bases sur un macrocycle triazapyridinophane, des complexes de lanthanides fluorescents constitues d’un atome de4 lanthanide complexe par un agent complexant selon I’invention, et des molecules organiques d’interets marquees par un complexe selon I’invention. D’autres aspects de I’invention sont decrits en reference a I’une quelconque des realisations preferees [1] a [16] ci-apres definies.

[1] Un agent complexant de formule (I) dans laquelle : - les groupes Ri sont identiques et representent -CO2H, ou -PO(OH)R, R etant un groupe phenyle, phenyle substitue par un groupe -SO3H, benzyle, methyle, ethyle, propyle, n-butyle, sec-butyle, isobutyle, ou fe/t-butyle; - les groupes Ai et A2, identiques ou differents, representent: un groupe de formule -L1-E ; dans laquelle Li et E sont tels que definis ci-apres, un groupe de formule (II) Date Refue/Date Received 2023-11-294a dans laquelle L2 et E sont tels que definis ci-apres, ou un groupe de formule (II’) dans laquelle L2 et E sont tels que definis ci-apres; Ie groupe A3 represente : un groupe de formule -O-L3-G, dans laquelle L3 et G sont tels que ci-apres definis, un groupe de formule (II) dans laquelle L2 et E sont tels que ci-apres definis, un groupe de formule (II’) dans laquelle L2 et E sont tels que ci-apres definis, un groupe de formule (III) (HI) dans laquelle L3 et G sont tels que ci-apres definis, ou Date Refue/Date Received 2023-11-294b un groupe de formule (III’) dans laquelle L3 et G sent tels que ci-apres definis, - Li, l_2 et L3, identiques ou differents, represented un groupe alkylene lineaire ou ramifie en C1-C20, un groupe alkylene lineaire ou ramifie en C1-C20 contenant une ou plusieurs doubles ou triples liaisons; un groupe cycloalkylene en Cs-Cs ou un groupe arylene en C6-C14, lesdits groupes alkylene, cycloalkylene ou arylene contenant ou non un ou plusieurs heteroatomes choisis dans Ie groupe constitue par I’oxygene, I’azote, Ie soufre et Ie phosphore, ou un ou plusieurs groupe(s) carbamoyle ou carboxamido, et lesdits groupes alkylene, cycloalkylene ou arylene etant non substitues ou substitues par un ou des groupes alkyle en Ci-Cs, aryle en Ce-Cu, sulfonate ou oxo ; ou representent un groupe de formules: —— 1 . — (C^ - Date Refue/Date Received 2023-11-294c h h n h OU dans lesquelles n, m, p, q sont des nombres entiers de 1 a 5 ; - E est un groupe qui rend I’agent complexant hydrosoluble, et est choisi dans Ie groupe constitue par -SO3H, -PO(OH)2, -CO2H, -N+AlkiAlk2Alk3, avec Alki, Alk2 et Aiks tels que defini ci-apres, un residu carbohydrate, une sulfobetaTne, et un groupe PEG ; - G est un groupe reactif representant un acrylamide, un ester active, un aldehyde, un halogenure d’alkyle, un anhydride, une aniline, un azide, une aziridine, un acide carboxylique, un diazoalcane, un haloacetamide, une halotriazine, la Date Refue/Date Received 2023-11-294d dichlorotriazine, une hydrazine, un imido ester, un isocyanate, un isothiocyanate, un maleimide, un halogenure de sulfonyle, un thiol, une cetone, une amine, un halogenure d’acide, un ester de succinimidyle, un ester d’hydroxysuccinimidyle, un ester d’hydroxysulfosuccinimidyle, un azidonitrophenyle, un azidophenyle, un glyoxal, une triazine, un groupe acetylenique, ou representant un groupe de formule: Date Refue/Date Received 2023-11-294e dans lesquels w varie de 0 a 8 et v est egal a 0 ou 1, et Ar lorsque present est un heterocycle a 5 ou 6 chamons sature ou insature, comprenant 1 a 3 heteroatomes, non substitue ou substitue par un atome d'halogene ; et - Alki, Alk2 et Alka, identiques ou differents, representent un (CiCe)alkyle.

[2] L’agent complexant selon la realisation [1], caracterise en ce que Ai et A2 sont identiques et sont un groupe de formule (II) telle que definie a la realisation [1] et A3 est un groupe de formule (III) telle que definie a la realisation [1].

[3] L’agent complexant selon la realisation [1], caracterise en ce que Ai est un groupe de formule (II) telle que definie a la realisation [1], A2 est un groupe de formule -Li-E dans laquelle Li et E sont tels que definis a la realisation [1], et As est un groupe de formule (III) telle que definie a la realisation [1],

[4] L’agent complexant selon la realisation [1], caracterise en ce que Ai et A2 sont identiques et sont des groupes de formule (II) telle que definie a la realisation [1], et A3 est un groupe de formule -O-L3-G dans laquelle L3 et G sont tels que definis a la realisation [1].

[5] L’agent complexant selon la realisation [1], caracterise en ce que Ai et Az sont identiques et sont des groupes de formule -Li-E dans laquelle Li et E sont tels que definis a la realisation [1], et A3 est un groupe de formule (III) telle que definie a la realisation [1].

[6] L’agent complexant selon la realisation [1], caracterise en ce que Ai et Az sont identiques et sont des groupes de formule (II’) telle que definie a la realisation [1], et A3 est un groupe de formule (III’) telle que definie a la realisation [1].

[7] L’agent complexant selon la realisation [1], caracterise en ce que Ai est un groupe de formule (II’) telle que definie a la realisation [1], A2 Date Refue/Date Received 2023-11-29est un groupe de formule -L-E dans laquelle L et E sont tels que definis a la realisation [1], et A3 est un groupe de formule (III’) telle que definie a la realisation [1],

[8] L’agent complexant selon la realisation [1], caracterise en ce que Ai et A2 sont identiques et sont des groupes de formule (II’) telle que definie a la realisation [1], et A3 est un groupe de formule -O-L3-G dans laquelle L3 et G sont tels que definis a la realisation [1],

[9] L’agent complexant selon la realisation [1], caracterise en ce que Ai et A2 sont identiques et sont des groupes de formule -L1-E dans laquelle Li et E sont tels que definis a la realisation [1], et A3 est un groupe de formule (III’) telle que definie a la realisation [1].

[10] L’agent complexant selon I’une quelconque des realisations [1] a [9], caracterise en ce que Ie groupe de formule -L3-G, lorsqu’il est present, est constitue (i) d’un groupement reactif G representant un acide carboxylique, une amine, un ester de succinimidyle, un haloacetamide, une hydrazine, un isothiocyanate, ou un groupe maleimide, et (ii) d’un bras d’espacement L3 constitue d’un groupe alkylene comprenant de 1 a 5 atomes de carbone.

[11] L’agent complexant selon I’une quelconque des realisations [1] a [10], caracterise en ce que Li, lorsqu’il est present, est un groupe divalent de formule : o ou n est un nombre entier de 1 a 5.

[12] L’agent complexant selon I’une quelconque des realisations [1] a [11], caracterise en ce que L2, lorsqu’il est present, est un groupe divalent de formule : Date Refue/Date Received 2023-11-294g o ou n et m sont des nombres entiers de 1 a 5.

[13] L’agent complexant selon I’une quelconque des realisations [1] a [12], caracterise en ce que U, lorsqu’il est present, est un groupe divalent de formule : — (ch2)— ou n est un nombre entier de 1 a 5.

[14] Un complexe de lanthanide fluorescent comprenant un agent complexant selon I’une quelconque des realisations [1] a [13], et un lanthanide choisi dans Ie groupe constitue par Eu3+, Sm3+, et Tb3+.

[15] Un complexe de lanthanide fluorescent de formule (IV), (V), (VI) ou (VII) suivante : NH2 (IV) Date Refue/Date Received 2023-11-294h (V) dans lesquelles : Ln3+ est choisi dans Ie groupe constitue par Eu3+, Tb3+, et Sm3+ ; et Date Refue/Date Received 2023-11-294i R3 est choisi dans Ie groupe constitue par OH ; s°3 ;

[16] Un conjugue fluorescent d’une molecule d’interet, ladite molecule d’interet etant un acide amine, un peptide, une proteine, un anticorps, un sucre, une chame glucidique, un nucleoside, un nucleotide, un oligonucleotide, ou un substrat d’enzyme, ledit conjugue etant obtenu par la mise en contact d’un complexe de lanthanide fluorescent selon la realisation [14], ledit complexe comprenant Ie groupe reactif G, avec ladite molecule d’interet. Agents complexants Les agents complexants selon (’invention sont les composes de formule (I) : dans laquelle : - les groupes Ri sont identiques et sont choisis parmi : -CO2H, -PO(OH)R, R etant choisi parmi les groupes: phenyle, phenyle substitue par un groupe -SO3H, de preference en position ortho ou para, benzyle, methyle, ethyle, propyle, n-butyle, sec-butyle, isobutyle, tert-butyle; - les groupes Ai, A2 sont identiques ou differents et sont choisis parmi : un groupe de formule -L1-E ; un groupe de formule (II) ou (II’) ; Date Refue/Date Received 2023-11-29- Ie groupe A3 est choisi parmi : un groupe de formule -O-L3-G, un groupe de formule (II), (II’), (III) ou (III’) ; - Li, L2 et L3 sent identiques ou differents et represented un groupe de liaison divalent ; - E est un groupe qui rend I’agent complexant hydrosoluble, choisi parmi : -SO3H, - PO(OH)2, -CO2H, -N+AlkiAlk2Alk3, un residu carbohydrate; une sulfobetaine; un groupe PEG ; - G est un groupe reactif ; - Alki, AIIq, Alka, qui peuvent etre identiques ou differents, represented un (C1- C6)alkyle. Par carbohydrate, on entend : un residu glucose sous forme cyclique ou lineaire, ou bien un groupe de formule -(CHOH)k-CH2OH, k etant un nombre entier allant de 3 a 12, de preference, egal a 4. Date Refue/Date Received 2023-11-295 10 15 20 25 30 35 WO 2017/098180 GA 03007797 2018-06-07 5 PCT/FR2016/053296 Par sulfobetaTne on entend un groupe choisi parmi : । q \— q r2 avec R2 qui represents un groupe alkyle de 1 a 6 atomes de carbone, et de preference un methyle ou ethyle, et q qui est egal a 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, et de preference qui est egal a 1 ou 2, la sulfobdtaTne de formule -(CH3)2N*-(CH2)3-SO3' etant preferee. En fonction du pH, les groupes -SO3H, -CO2H et -PO(OH)2 sont sous forme deprotonee ou pas. Ces groupes designent done dans la suite du texte egalement les groupes -SO3', -CO2 et -PO(OH)O", et vice-versa. Par groupe PEG on entend un groupe polyethylene glycol de formule -CH2-(CH2OCH2)y-CH2OCH3, y etant un nombre entier allant de 1 a 5. Les groupes (II), (II'), (III) et (III’) contrlbuent a la formation d'antennes qui contribuent aux proprietes spectroscopiques des fluorophores. Les groupes -Ln-E, (II) et (II’) portent des groupements E qui rendent les agents complexants hydrosolubles, et les groupes -O-L3-G, (III) et (III’) portent un groupe reactif G permettant de conjuguer les complexes fluorescents selon I’invention avec une molecule d'interet que I'on souhaite marquer. Selon I’invention, les antennes comportent des groupes 2,4,6-methoxyphenyles (II’), (III’) ou paramethoxyphenylacetylenes (II), (III), ces demiers etant preferes. Par ailleurs les composes selon I’invention peuvent comporter 1, 2 ou 3 antennes, et les agents complexants selon (’invention peuvent ainsi §tre subdivises selon les sous-familles preferees suivantes, a base d’antennes paramethoxyphenylacetylenes : • Agents complexants a 3 antennes, comportant 2 groupes solubilisants et un groupe reactif, correspondants aux composes de formule (I) dans lesquels A3 et A2 sont identiques et sont des groupes de formule (II) et A3 est un groupe de formule (III). • Agents complexants a 2 antennes comportant 2 groupes solubilisants et un groupe reactif, correspondants aux composes de formule (I) dans lesquels A-i est un groupe de formule (II), A2 est un groupe -LVE et A3 est un groupe de formule (III). • Agents complexants a 2 antennes comportant 2 groupes solubilisants et un groupe reactif, correspondants aux composes de formule (I) dans lesquels A, et A2 sont identiques et sont des groupes de formule (II), et A3 est un groupe de formule -O-L3-G. • Agents complexants a 1 antenne, comportant 2 groupes solubilisants et un groupe reactif, correspondants aux composes de formule (I) dans lesquels A3 et A2 sont identiques et sont des groupes de formule -L^E et A3 est un groupe de formule (III).5 10 15 20 25 30 35 WO 2017/098180 CA 03007797 2018-06-07 6 PCT/FR2016/053296 On distingue les memes sous-familles a base d'antennes paramethoxyphenyles en remplagant les groupes de formule (II) et (III) par les groupes de formule (II’) et (III’), respectivement, a savoir : • Agents complexants a 3 antennes, comportant 2 groupes solubilisants et un groupe reactif, correspondents aux composes de formule (I) dans lesquels A! et A2 sont identiques et sont des groupes de formule (II’) et A3 est un groupe de formule (III’). • Agents complexants a 2 antennes comportant 2 groupes solubilisants et un groupe reactif, correspondants aux composes de formule (I) dans lesquels Ai est un groupe de formule (II’), A2 est un groupe -Li-E et A3 est un groupe de formule (III’). • Agents complexants a 2 antennes comportant 2 groupes solubilisants et un groupe reactif, correspondants aux composes de formule (I) dans lesquels Ai et A2 sont identiques et sont des groupes de formule (II’), et A3 est un groupe de formule -O-L3-G. • Agents complexants a 1 antenne, comportant 2 groupes solubilisants et un groupe reactif, correspondants aux composes de formule (I) dans lesquels Ai et A2 sont identiques et sont des groupes de formule -U-E et A3 est un groupe de formule (III’). Pour chacune de ces sous-familles, les groupes R! qui participent & la complexation du lanthanide peuvent etre soit un carboxylate -CO2H soit un phosphinate -PO(OH)R tel que d6fini ci-dessus (et de preference dans ce dernier cas un methylphosphinate). Pour chacune de ces sous-familles, les composes dont les groupes E sont soit des groupes -SO3\ soit un residu glucose, soit un ammonium -N+(CH3)3ou soit une sulfobetaine de formule cidessous sont preferes R2 -N+'»'~'SO3 r2 q Les composes dont les groupes E sont soit des groupes -SO3", soit un residu glucose, ou soit une sulfobetaine de formule ci-dessus, sont particulierement preferes. Le groupe reactif G portE par un bras d’espacement L3, permet de coupler les composes selon I’invention avec une espece que I’on souhaite rendre fluorescente, par exemple une molecule organique, un peptide ou une proteine. Les techniques de conjugaison de deux molecules organiques sont basees sur I'utiiisation de groupes reactifs et relevant des connaissances generales de I’homme du metier. Ces techniques classiques sont decrites par exemple dans Bioconjugate Techniques, G.T. Hermanson, AcademicPress, Second Edition 2008, p. 169-211. Typiquement, le groupe reactif est un groupe Electrophile, nucleophile, diEne ou dienophile qui peut former une liaison covalente lorsqu’il est mis en presence d'un groupe nucleophile,WO 2017/098180 CA 03007797 2018-06-07 7 PCT/FR2016/053296 Electrophile, dienophile ou diene approprie, respectivement. La reaction de conjugaison entre un compose selon I’invention comportant un groupe reactif et une molecule organique, un peptide ou une protEine portant un groupe fonctionnel entraine la formation d’une liaison covalente comportant un ou plusieurs atomes du groupe reactif. 5 De preference, Ie groupement reactif G est un groupe derive d’un des composes ci-apres : un acrylamide, une amine activEe (par exemple une cadaverine ou une ethylenediamine), un ester active, un aldehyde, un halogenure d’alkyle, un anhydride, une aniline, un azide, une aziridine, un acide carboxylique, un diazoalcane, un haloacetamide, une halotriazine, telle que la 10 monochlorotriazine, la dichlorotriazine, une hydrazine (y compris les hydrazides), un imido ester, un isocyanate, un isothiocyanate, un maleimide, un halogEnure de sulfonyle, un thiol, une cEtone, une amine, un halogenure d'acide, un ester de succinimldyle, un ester d’hydroxysuccinimidyle, un ester d’hydroxysulfosuccinimidyle, un azidonitrophEnyle, un azidophEnyle, un glyoxal, une triazine, un groupe acEtylEnique, et les groupes de formule:5 10 15 20 25 30 CA 03007797 2018-06-07 8 WO 2017/098180 PCT/FR2016/053296 dans lesquels w varie de 0 a 8 et v est Egal a 0 ou 1, et Ar est un heterocycle E 5 ou 6 chainons sature ou insature, comprenant 1 a 3 hEtEroatomes, eventuellement substitue par un atome d’halogene. De maniere preferee, Ie groupe reactif G est un acide carboxylique, une amine, de preference une amine aliphatique (eventuellement protegee sous forme -NHBoc), un ester de succinimidyle, un haloacetamide, une hydrazine, un isothiocyanate, un groupe malEimide, ou un acide carboxylique (eventuellement protEgE sous la forme d'un groupe -CO2Me, -CO2tBu). Dans ce dernier cas, I'acide devra etre active sous forme d’ester pour pouvoir reagir avec une espece nucleophile Une molecule organique, un peptide ou une protEine susceptible d’etre marquee par un composE selon I'invention comprendra done un groupe fonctionnel avec lequel reagira Ie groupe rEactif du complexe de lanthanide ou de I’agent complexant. Par exemple, la molecule organique, la proteine ou Ie peptide comporte un des groupes suivants: amine, amide, thiol, alcool, aldehyde, cetone, hydrazine, hydroxylamine, amine secondaire, halogEnure, epoxyde, ester (carboxylate d’alkyle), acide carboxylique, des groupes comportant des doubles liaisons ou une combinaison de ces groupes fonctionnels. Les groupes amines ou thiols presents naturellement sur les proteines sont souvent utilises pour proceder au marquage de ces molecules. Le groupe reactif et les groupes solubilisants E sont lies a I’agent complexant via un bras d'espacement (L^ L2, L3) constitue de maniere avantageuse par un radical organique bivalent, choisi parmi un groupe alkylene lineaire ou ramifie en Ci-C20, contenant eventuellement une ou plusieurs doubles ou triples liaisons; un groupe cycloalkylene en C5-C8 ou un groupe arylene en C6-Cu, lesdits groupes alkylene, cycloalkylene ou arylene contenant eventuellement un ou plusieurs heteroatomes, tels que I'oxygene, I'azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe(s) carbamoyle ou carboxamido, et lesdits groupes alkylene, cycloalkylene ou arylene etant Eventuellement substituEs par des groupes alkyle en C^Cg, aryle en C6-C14, sulfonate ou oxo. un groupe choisi parmi les groupes divalents de formules suivantes:WO 2017/098180 CA 03007797 2018-06-07 9 PCT/FR2016/053296 (CH2)n • (CH2)n—O—(CH2)ri7-O— (CH2)p— ; H || (CH2)n—O— (CH2)^-O—(CH2)p—N-U— (CH2)q O 11 || — (CH2)n—N— ; — (CH2)—N-U— (CH2)— ; o H — (CH2)-N o o y—, V^S— (CH2)p (CH2)n—N-U—CCH^ (CH2)p . H —(CH2)-N H H 9 — (CH2)n-N- . — (CH2)n—N— (CH2)s- . —U— (CH2) — ; II H || H (CH2)n—LN— (CH2)m— ; —““N—(CH2)n— ; dans lesquels n, m, p, q sont des nombres entiers de 1 & 16, de preference de 1 a 5. De maniere preferee, Ie groupe -L3G est constitue d’un groupement reactif G choisi parmi : un 5 acide carboxylique (eventuellement protege sous la forme d’un groupe -CO2Me, -CO2tBu), une amine, de preference une amine aliphatique (eventuellement protegee sous forme -NHBoc), un ester de succinimidyle, un haloacetamide, une hydrazine, un isothiocyanate, un groupe mateimide, et d’un bras d'espacement L3 constitue d'une chatne alkylene comprenant de 1 a 5 atomes de carbone. De manidre encore plus preferee, Ie groupe -L3G est une amine portee par une chaine 10 alkylene comprenant de 1 a 5 atomes de carbone.5 10 15 20 25 30 WO 2017/098180 CA 03007797 2018-06-07 10 PCT/FR2016/053296 En ce qui concern© L1r Ie group© divalent suivant est prefer© : O o£i n est un nombre entier de 1 a 16, de preference de 1 a 5 En ce qui concerne L2, Ie groupe divalent suivant est pr6fer6 : oil n et m sont des nombres entiers de 1 a 16, de preference de 1 & 5 En ce qui concerne L3, Ie groupe divalent suivant est prefere: ou n est un nombre entier del a 16, de preference de 1 a 5 L, est Ie groupe divalent L2 est Ie groupe divalent de formule et L3 est Ie groupe divalent sont egalement preferees. Ces complexes sont prepares en mettant en contact les agents complexants selon I’invention et un sei de lanthanide. Ainsi la reaction entre un equivalent d'agent complexant et 1 a 5 equivalents de sei de lanthanide (europium, terbium ou samarium sous forme par exemple de chlorures) dans un milieu aqueux a pH 6 conduit apfes plusieurs heures voire quelques jours de reaction a temperature ambiante au complexe correspondant. Les sous-familles dans lesquelles, a la fois, O (CH2)- — (CH2) — de formule n de formule : H , et O Complexes L’invention concerne Egalement les complexes de lanthanides fluorescents constitues d’un atome de lanthanide complex^ par un agent complexant tel que decrit ci-dessus. De preference, Ie lanthanide est Tb3*, Eu3* ou Sm3+ et de maniere encore plus preferee Eu3+.WO 2017/098180 CA 03007797 2018-06-07 11 PCT/FR2016/053296 Comme indique precedemment, les complexes fluorescents obtenus presented d’excellentes proprietes photo-physiques, en particulier en ce qui concerns leur rendement quantique, la duree de vie de leur luminescence et leur spectre d’excitation qui est tres bien adapte a une excitation laser a environ 337 nm. De plus la repartition des bandes de leurs spectres d’emission est centres 5 autour de 620 nm conferant ainsi aux complexes des proprietes exceptionnelles et tres favorables dans une utilisation de FRET avec des accepteurs de type cyanine ou allophycocyanine (telle que la XL665 commercialises par Cisbio Bioassays). 10 De maniere avantageuse, I’invention concerns les complexes sulvants : nh2 (IV)WO 2017/098180 CA 03007797 2018-06-07 12 PCT/FR2016/053296 dans lesquelles : Ln3* est choisi parmi: Eu3*, Tb3*, Sm3’; R3 est choisi parmi les groupes suivants : OH ; Coniuques Les agents complexants et complexes selon I’invention comportant un groupe reactif sont 10 particulierement adaptes au marquage de molecules organiques ou biologiques comportant un groupe fonctionnel susceptible de reagir avec Ie groupe reactif pour former une liaison covalente. Ainsi I’invention concerne aussi I'utilisation de complexes pour Ie marquage de molecules biologiques (proteines, anticorps, enzymes, hormones etc...). 15 L'invention concerne egalement les molecules marquees par un complexe selon i’invention. Toutes les molecules organiques ou biologiques peuvent etre conjuguees avec un complexe selon I’invention si elles possedent un groupe fonctionnel susceptible de reagir avec Ie groupe reactif. En5 10 15 20 WO 2017/098180 CA 03007797 2018-06-07 13 PCT/FR2016/053296 particulier, les conjugues selon ('invention comportent un complexe selon I’invention et une molecule choisie parmi : un acide amine, un peptide, une proteine, un anticorps, un sucre, une chaTne glucidique, un nucleoside, un nucleotide, un oligonucleotide, un substrat d’enzyme (en particulier un substrat d’enzyme suicide telle qu'une benzylguanine ou une benzylcytosine (substrats des enzymes commercialisees sous les denominations SNAP-tag® et CLIP-tag®), un chloroalcane (substrat de I’enzyme commercialisee sous la denomination Halo-tag), Ie coenzyme A (substrat de I’enzyme commercialisee sous Ie nom ACP-tag ou MCP-tag). Les conjugues de I’invention sent obtenus par mise en contact d’un complexe de lanthanide selon I’invention, comprenant un groupe reactif G, avec une molecule d’interet. Syntheses La preparation des agents complexants et des complexes de lanthanides selon I’invention est decrite de maniere schematique ci-apres, et de maniere plus detaillee dans la partie experimentale. Synthase svstemes tri-antennes (Dvridvl-acetvlene-4-O-Dhenvl} La synthese des complexes comportant 3 antennes, 2 groupes solubilisants et 1 groupe reactif est decrite dans les schemas 1-4 et s’appuie sur une synthese convergente. Les composes comportant d'autres groupes solubilisants / groupes reactifs peuvent etre prepares de maniere similaire a partir de I'interm&diaire 24.WO 2017/098180 CA 03007797 2018-06-07 14 PCT7FR2016/053296 Br^^COjMe K2CO31 Me2CO 50*C, 12h 97% 65% 7MS CO2Me p^pp^ cui THF, EtjN. 6S’C. 12 h CO2Me K2CO3 DCM.MeOH O*C-T amb, 1p II 83% TMS 3 4 OH Cl HOjC CO2H CO2Me 70% NaBH4. MeOH T amb, 12 h i) SOC!2. DMF reflux. 24 h ii) MeOH reflux. 24 h i) Nai. MeCN Ultrasons, 20 min ii)AcCI Ultrasons. 3 h 75% MeO2C COjMe 90,6 MeOjC OH OH 5 L’introduction de la fonction ester permettant ulterieurement la fixation d'une fonction solubilisante de type sulfonate, sulfo-betaine, ammonium ou derives de sucres est realises par une reaction 5 d’alkylation sur Ie 4-iodo-phenoL Une reaction de couplage de type Sonogashira entre Ie derive 2 et Ie trimethylsilyl acetylene permet d'obtenir Ie compose 3. Le groupe protecteur (trimethylsilyl) est supprime en utilisant un melange de solvants mdthanol-dichloromdthane en presence de carbonate de potassium. Ces conditions permettent d’epargner la fonction ester methylique qui est relativement sensible a I’hydrolyse. Le diol 8 est obtenu a partir de I’acide chelidamique en 3 10 Stapes comme d6crit dans la litt^rature (Tetrahedron 2005, 61, 1755; Tetrahedron 2008, 64, 399. European Journal of Organic Chemistry 2002, 21, 3680). La reaction de monotosylation est realises en presence de seis d'argent. Ces conditions ont ete developpees sur ('analogue nonhalogdnd. (Tetrahedron 2004, 49, 11117; et Angewandte Chemie, International Edition 2014, 53, 5872). La reaction de condensation permet d'obtenir le motif di-pyridinyle 10 sur lequel est realises 15 une double reaction de Sonogashira conduisant au squelette du premier synthon cle. Les fonctions diols sont activees par ('introduction des groupements tosyles dans des conditions assez similaires a cedes de la monotosylation.WO 2017/098180 CA 03007797 2018-06-07 15 PCT/FR2016/053296 HBrH2N'^x^Br 13 Boc?O. EtaN. DCM O’C •T an*. 24 h 94% BocHN -^Br 14 BocHN 14 Cs2CO3. Nai. MeCN. 60‘C, 24 h 85% = 'SiMea Pd(PPh3)CI2. Cui Et3N, THF, p-cndes. 30 min 99% NsCI. DCM.EhN. O"C- T an*. 12 h HjN^CO^Bu *■ 94% 98% K2CO3. MeOH O’C- T amb, 24 h TMS 16 17 WS'^WBu N& A NsO=S=O TsCI. NaOH.H2O.THF 0eC - T amb. 20 h NHBoc IBuOaC^N^ ^N^CO2tBu HS^VOn 22, X= Ns DBU. MeCN. 55% T amb. 45 min 23, X= H Schema 2 La synthese du deuxieme synthon cle 23 est decrite dans Ie schema 2. Ce synthon portera une 5 fonction amine masquee (groupement protecteur Boc) permettant par exemple une reaction de bioconjugaison avec un anticorps ou une biomolecule. Le compose 17 a ete prepare selon les procedures decrites dans la litterature (WO 2014/111661). Le diol 8 est activ6 sous forme de ditosylate puis condense avec le compost 19 conduisant au compose 21 avec un bon rendement. La reaction de Sonogashira suivie de la deprotection du groupement nosyle permet I’obtention du 10 synthon 23.WO 2017/098180 CA 03007797 2018-06-07 16 PCT/FR2016/053296 Schema 3 L’etape la plus delicate est representee dans Ie schema 3. II s’agit de l’etape de macrocyclisation qui apres optimisation a conduit au ligand 24 avec un rendement tres convenable. Get 5 intermediaire constitue une plateforme pour realiser des series de complexes de lanthanides (europium, terbium et samarium) portant differents groupes solubilisants comme decrit dans Ie schema 4.WO 2017/098180 CA 03007797 20i8-06-07 17 PCT/FR2016/053296 Schema 4 5 En utilisant une strategie analogue les complexes de pyridinophane mono et di-antennes peuvent etre prepares. Les schemas de synthese sont decrits ci-apres NHBoc 10 Synthese svstemes mono antenne (Dvridinvl-acetvlene-4-O-phenvl) La synthese de ces syst^mes est decrite dans les schemas 5-7.WO 2017/098180 CA 03007797 2018-06-07 18 PCT/FR2016/053296 COjMe (NH«)S2O6, HjSO<cat MeOH/HjO reflux, 20 h 28% 27 PPh3. CCU CHCI3. Iamb. 20 h 28% 18 Na2CO3. CH3CN reflux. 20 h TsCl.AgjO KI. DCM -5'0’amb. 20h 71% Schema 5 L’isonicotinate de methyle traite dans des conditions oxydantes conduit au diol 28 avec un rendement de 28% ; Bien que ce rendement soit mediocre, cette reaction permet d'introduire 5 simultanement deux groupements hydroxy-methylene en position 2 et 6 du noyau pyridinyle et ceci en une seule etape. La mono-chloration du diol permet d’obtenir Ie compost 29 qui reagit ensuite avec Ie compose 18 conduisant au squelette di-pyridinyle 30. Les fonctions alcools sont activees sous forme de tosylate puis I'etape de macrocyclisation est effectuee comme decrit prdcedemment sur les systemes tri-antennes et conduit a I’intermediaire cle 32. 10 Schema 6WO 2017/098180 CA 03007797 2018-06-07 19 PCT/FR2016/053296 i) TFA. OCM T amb. 30 min- 5 h ii) LnCIg. Hopes. T amb. 18 h - 5 j C4b, Ln= Eu, 83% C5b, Ln® Sm, C4c, Ln- Eu, C5c, Ln=Sm, C4d, Ln= Eu. 19% R® 1 C5d, Ln® Sm, R= | C4o, Ln=Eu, R»OH C5c, Ln® Sm, R® OH 35c. R= 35b, 59% Ra 35d, 55% R= Schema 7 L’hydrolyse des deux fonctions ester mdthylique conduit au compose di-aclde 34 sur lequel sont 5 greffees deux fonctions hydrosolubilisantes (de nature anionique 35a, zwitterionique 35b, neutre 35c, ou cationique 35d). La deprotection des esters butyliques et du groupement protecteur Boc est realisee en presence d’acide trifluoroacetique pur. L'atome de lanthanide est complexe dans la cavite du ligand lorsque ce dernier est tralte dans un tampon hepes en presence d’une solution aqueuse de chlorure d'europium ou de samarium. 10 Synthase des svstemes di-antennes (PYridinvl-acetvlene-4-O-Dhenvl) La synthese de ces systemes est decrite dans les schemas 8-10.WO 2017/098180 CA 03007797 2018-06-07 20 PCT/FR2016/053296 OH OH HOOC COOH 63% EtOOC COOEt 99% 36 37 38 76% NH 0' tBuO^C CO^tBu 79% OTs 41 79% 42 Schema 8 H2SO4. EtOH Reflux. 16 h NaBHj EtOH. Reflux. 2 h THF, DIAD. PPh3 70*C. 16 h TsCI, NaOH H2O. THF O’C - T amb - 16 h NH Boo EtOOC N COOEt HN^CO2iBu NH Boc C^COj.DMF Boc Tamb.40h tBuOjC^NH Ns. /\ N CO2IBu H 19 As. boc O'^^'NH X. Boc 96% r N । OH OH 39 OTs 40 ✓X^OH HS DBU, MeCN T amb, 30 min v En ce qui concerns les systemes di-antennes, la synthese commence par une reaction 5 d'esterification sur I'acide chelidamique 36 qui est disponible commercialement (procedure d^crite dans Inorganic Chemistry 2000, 39, 4678). Le bras servant de lien entre Ie complexe et la biomolecule est introduit a ce niveau de la synthese en utilisant une reaction de Mitsunobu (procedure decrite dans Organic Biomolecular Chemistry 2012, 10, 9183). Le diol 39 est obtenu par une double reaction de reduction en utilisant du borohydrure de sodium dans l’6thanol, puis ce 10 dernier est ensuite active sous forme ditosylee (procedure decrite dans Organic & Biomolecular Chemistry 2012, 10, 9183). Le synthon 42 est prepare comme precedemment (systeme triantennes) en condensant 19 avec 40 (prepare selon la procedure decrite dans Organic & Biomolecular Chemistry 2012, 10, 9183) puis en deprotegeant les groupements protecteurs nosyles. Les deux composes 12 et 42 sont utilises pour la preparation de I’intermediaire cle 43 15 constituant la base des systemes di-antennes (schemas 9 et 10).WO 2017/098180 CA 03007797 2018-06-07 21 PCT/FR2016/053296 NHBoc Schema 9 i)TFA T amb, 30 min C6d, Ln»Eu, R= | C7d, Ln=Sm, Rs J । HATU, DIPEA DMSO. NHrR T amb, 2 h 5 Schema 10WO 2017/098180 CA 03007797 2018-06-07 22 PCT/FR2016/053296 Les fonctions esters sont hydrolysees et les fonctions hydrosolubilisantes sent introduites comme precedemment mais cette fois sur les antennes directement. La suite de la synthese est identique a ce qui a ete decrit pour les tri et mono-antennes. 5 Ces sondes fluorescentes peuvent etre activees en introduisant les fonctions classiques : ester de NHS, azido, maleimide ou isothiocyanate. Un exemple decrit I’activation sous forme de maleimide permettant la bioconjugaison sur des proteines, soit sur des messagers secondaires de type cAMP. Les sch6mas 11 et 12 decrivent deux exemples de ces molecules. 15WO 2017/098180 CA 03007797 2018-06-07 23 PCTZFR2016/053296 Synthase svstemes tri-antennes fpyridinvl-2.4.5-O-Dhenvl) Les systemes pyridinyl trimethoxyphenyl sont egalement des chromophores compatibles avec la technologie FRET. Les schemas 13-15 indiquent la mdthodologie qui a suivie pour I’obtention 5 des complexes correspondants (serie C8-C10). Les procedures sont identiques a celles decrites precedemment ou sont disponibles dans la litterature. Les details sont donnes dans la partie experimentale. 10 DCM. DMAP TEA T amb. 5 h 99% 1) THF. n-BuLi •iB’C - T amb. 5 h 2) THF, -78*C •T amb. 3 h Pd(OAc)2. SPhos K3PO4. PhMe. H2O 60“C, 17 h 80% Schema 13WO 2017/098180 CA 03007797 2018-06-07 24 PCT/FR2016/053296 OMe BocHN‘^^‘0 MeO OMe MeO OMe OTs OH OTs OTs 56 53 1 ’ K2CO3, MeCN reflux. 72 h TsCl.AgjO KI. DCM •20°C -T amb, 16 h K2CO3, MeCN 60°C.2Qh TsCL NaOH H2O. THF O’C - T amb, 20h Nsx N CO2!Bu H 19 H2N CO2tBu IB HSx^OH DBU. MeCN T amb. 45 mtn 57 TsCl, AgjO KI,DCM -5X-Tamb, 16h Schema 14 5WO 2017/098180 CA 03007797 2018-06-07 25 PCT7FR2016/053296 O2Me MeO OMe MeO OMe IBuOjC COsIBu tBuOjzC N N OMe N OMe N OMe o NHBoc 59 60 NHBOC R MeO OMe N N MeO Me Ln3' N N N tBuO2C OMe O OMe N OMe NH2 cioa, Ln* Sm, OMe O 80s" NHBoc 61a Ra soy 61b. '80s” Sic. R= 61d Ra N CM, Ln= Eu, CM, Ln« Tb, CIOc,Ln» Sm, C8b, Ln= Eu, CSb, Ln= Tib C10b, Ln« Sm, R» R» Ra LiOH(1 M). MeCN T amb. 1h R» R= Ra R= Ra Ra Ra R= R» CM, Ln= Eu, CM Ln» Tb, CICd, Lna Sm, CBa, C9a, Lns Eu, Ln= Tb, MeOaC O N" XO2- HO2C o COaBu MeO 2®U MeO co2iau MeO i)TFA,Tamb,1 h «)LnCI3.Tamb. 12 h < N COjtBu N CO2®u "CO2* MeO HATU, DIPEA OMSO,NRrR T amb,10-40nun H% Schema 15 55 10 15 20 25 30 35 40 CA 03007797 2018-06-07 WO 2017/098180 PCT/FR2016/053296 Partie Experimentale Informations generales Abreviations utilisees Boc: tert-Butyloxycarbonyle Boc-Osu: N-(fert-butoxycarbonyloxy)succinimide cAMP: adenosylmonophosphate cyclique CCM : chromatographie en couche mince m-CPBA: acide metachloroperbenzoique DBU : 1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene DCC : dicyclohexyluree DCM : dichloromethane 3: deplacement chimique DIAD : diisopropyl azodicarboxylate DIPEA : diisopropylethylamine DMF : dimethylformamide DMSO : dimethyl sulfoxyde EP : ether de petrole EtOH : ethanol ESI : ionisation par electronebulisation h:heure HATU :1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium-3-oxyde hexafluorophosphate HEPES : acide (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine ethane sulfonique) HPLC : chromatographie liquid© a haute performance HRMS: spectroscopie de masse a haute resolution HTRF: Fluorescence Homogdne en Temps R&solu Hz : Hertz j Jour MeCN: acetonitrile MeOH: methanol min : minute Mops : acide 3-(N-morpholino)propanesulfonique Ms : mesyle NBS : N-bromosuccinimide NHS : N-hydroxysuccinimide NIS : N-iodosuccinimide Ns : nosyle PEG : polyethylene glycol Ph : phenyle ppm : partie par million27 PtF : point de fusion RMN : resonance magnetique nucldaire SM : spectrometrie de masse SMPH : hexanoate 6-((beta-mal£imidopropionamido) de succinimidyle) Sphos: 2-Di<^clohexylphosphino-2',6'-dimethoxybiphenyl TA ou T amb:temperature ambiante TEA ou EtsN: triethylamine TFA :acide trifluoroacetique THF : tetrahydrofurane TMS : trim&thylsilyle TsCI : chlorure de tosyle TSTU: tetrafluoroborate de O-(N-Succinimidyl)-1J,3,3-t6tram6thyluronium Chromatographie Les chromatographies sur couches minces ont ete effectuees sur des plaques de gel de silice Merck 60 F254 sur feuille d’aluminium ou sur des plaques d’oxyde d’aluminium neutre Merck 60 F254 (type E) sur feuille d’aluminium. Les chromatographies liquides a haute performance (HPLC) analytiques et preparatives ont ete effectuees sur deux appareils : - HPLC Analytique : ThermoScientific, pompe quaternaire P4000, Detecteur UV 1000 & lampe au deuterium (190-350 nm), colonne analytique Waters XBridge™ C18, 3.5 pm, 4.6 x WO mm. - HPLC Preparative : Shimadzu, 2 pompes LC-8A, detecteur UV e barrette de diodes VarianProStar, colonne preparative Waters XBridge prep. C18, 5 pm: 19 x 100 mm ou 50 x 150 mm. Date Re?ue/Date Received 2023-04-1227a Les chromatographies sur colonne de silice ont ete realisees sur gel de silice Merck 60 (0.040-0.063 mm). Les chromatographies sur colonne d’alumine ont ete realisees sur oxyde d’aluminium Sigma-Aldrich, neutre, active, Brochmann I. Gradient A : Colonne Waters Xbridge Cis, 300 A, 3,5 pm, 4,6 x 100 mm, A/ eau 0,1 % acide formique- B/ acetonitrile 0,1 % acide formique, t = 0 min, 5 % B -1= 15 min 100 % B - 1 mL.min-1. Gradient B : Colonne Waters XBridge Cis, 5 pm, 19 x 100 mm, A / eau 0,1 % acide formique B I acetonitrile t = 0 min, 50 % B-1= 17 min, 100 % B - 20 mL.min-1. Gradient C : Colonne Waters XBridge Cis, 5 pm, 50 x 150 mm, A / eau 0,1 % acide formique B / acetonitrile t = 0 min, 15 % B -1= 2 min, 15 % B-1= 20 min, 100 % B - 100 rnLmin-1. Gradient D Colonne Waters XBridge Cis, 5 pm, 19 x 100 mm, A / eau 0,1 % acide formique B / acetonitrile t = 0 min, 15 % B -1= 2 min 15 % B-1= 20 min 100 % B - 20 mL.min-1. Date Re?ue/Date Received 2023-04-125 10 15 20 25 30 35 CA 03007797 2018-06-07 28 WO 2017/098180 PCT/FR2016/053296 Gradient E Colonne Waters Xbridge C18, 300 A, 3,5 pm, 4,6 x 100 mm, A/ H2O 5 mM acetate d'ammonium pH 6,5- Bl acetonitrile-1= 0 min 2 % B - 1= 15 min 40 % B. 1 mL.min'1. Gradient F Colonne Waters XBridge C18, 5 pm, 50 x 150 mm, A / eau 25 mM acetate de tridthylammonium B / acetonitrile t =0 min 2 % B - B — t = 17 min 40 % B - 100 mL.min'1. Gradient G Colonne Waters XBridge Ci8, 5 pm, 19 x 100 mm, A / eau 25 mM acetate de trtethylammonium B / acetonitrile t =0 min 5%B-B-t = 17 min 40 % B - 20 mL.min'1. Gradient H Colonne Waters XBridge C18, 300 A, 5 pm, 10 x 100 mm - eau 25 mM acetate de triethylammonium B / acetonitrile t = 0 min 2%B-B-t = 19 min 40 % B - 5 mL.min'1 Gradient I Colonne Waters Acquity C18, 300 A, 1,7 pm, 2,1 x 50 mm - A / eau 0,1% acide formique B / acetonitrile 0,1% acide formique t = 0 min 5 % B - t = 0,2 min 5 % B - 1 = 5 min 100 % B - 0,6 mL.min'1 Gradient J Colonne Waters Xbridge C18, 5 pm, 50 x 150 mm- A / eau 25 mM TEAAc pH 7 B / acetonitrile t = 0 min 50 % B- t = 20 min 100 % B-100 mL.min'1 Gradient K Colonne Waters Xbridge C18, 5 pm, 50 x 150 mm- A / eau 25 mM TEAAc pH 7 B / acetonitrile t = 0 min 15 % B- t = 19 min 80 % B- 80 mL.min'1 Gradient L Colonne Waters Xbridge C18300 A, 5 pm, 19 x 100 mm - A / eau 25 mM TEAAc pH 7 B / acetonitrile t =0 min 20 % B- t = 19 min 80 % B- 100 mL.min'1 Gradient M Colonne Waters Xbridge C18, 5 pm, 50 x 150 mm- A / eau 25 mM TEAAc pH 7 B / acetonitrile t = 0 min 2 % B - t = 18 min 40 % B- 80 mL.min'1 Gradient N Colonne Waters Acquity C18, 300 A, 1,7 pm, 2,1 x 50 mm- A / eau 5 mM acetate d’ammonium pH 5 B / acetonitrile t = 0 min 2 % B-1= 0,2 min 2 % B - 1= 5 min 40 % B- 0,6 mL.min'1 Gradient O Colonne Waters Xbridge C18, 5 pm, 50 x 150 mm- A / eau 0,1 % acide formique B / acetonitrile t = 0 min 40 % B- t = 20 min 100 % B-100 mL.min'1 Spectroscople a. Resonance magnetique nucldaire Les spectres RMN (1H, 13C et 31P) ont ete realises a I’aide d’un spectrometre Bruker Avance 400 MHz NanoBay (aimant de 9,4 Teslas), muni d’une sonde de mesure BBFO, multi noyaux de5 10 15 20 25 30 35 40 WO 2017/098180 CA 03007797 2018-06-07 29 PCT7FR2016/053296 diametre de 5 mm, de gradient Z et de lock2H. Les d6placements chimiques (6) sont exprimes en partie par million (ppm). Les abreviations suivantes sont utilisdes : s : singulet, se: singulet elargi, d : doublet, t : triplet, q : quadruplet, m : multiplet, dd : doublet dedouble, td:triplet dddoublS, qd : quadruplet d£doubl&, ddd : doublet de doublet dedouble. b. Spectrometrie de masse Les spectres de masse (LC-MS) ont ete realises a I’aide d'un spectrometre Waters ZQ 2000 simple quadipOle a source multimode ESI/APCI 6quip6 de colonne Waters XBridge C16, 3.5pm, 4.6 x 100 mm. c. Spectrometrie de masse haute resolution Les analyses ont ete effectuees avec un spectrometre de masse QStar Elite (AppliedBiosystems SCIEX) equipe d'une source d’ionisation a pression atmosph^rique (API) assistee pneumatiquement. L’echantillon a ete ionise en mode electrospray positif dans les conditions suivantes : tension electrospray (ISV) : 5500 V ; tension d’orifice (OR) : 20 V ; pression du gaz de n^bulisation (air) : 20 psi. Le spectre de masse haute resolution (MS) a ete obtenu avec un analyseur temps de vol (TOF). La mesure de masse exacte a ete effectuee en triplicat avec un double etalonnage interne. Divers Appareil a point de fusion: les points de fusion ont ete realises en utilisant un appareil BUCHI melting point B-540. Compose1: disponible commercialement. Compose 2:le compose 2 a ete prepare selon la procedure decrite dans WO 2004/094386. Compose 3: le compose 3 a ete prepare selon la procedure decrite dans I’article : Journal of Medicinal Chemistry 2013, 56,4990. Compose 4 A une solution du compose 3 (20 g, 38,1 mmol) dans du DCM anhydre (20 mL) ont 6t6 ajout^s successivement a 0°C du MeOH anhydre (30 mL) et du carbonate de potassium anhydre (15,8 g, 114 mmol). La suspension a ete agitee a 0°C pendant 15 min puis a TA pendant 1 h puis a ete filtree et concentree sous pression reduite. Le residu a ete dilue avec du DCM (100 mL) et ensuite a ete ajoute de I’eau (80 mL). La phase organique a ete separee et la phase aqueuse a ete extraite avec du DCM (2 x 60 mL). Les phases organiques ont 6t6 reunies, sechees sur sulfate de sodium, filtrees et concentrees sous pression reduite pour conduire au compose 4 (12 g, 83%) comme un solide I6g$rement marron qui a ete utilise dans la suite de la synthese sans purification supplementaire. RMN 1H (CDCI3, 400 MHz) 3 7.45 (d, J = 8Hz, 2H), 6.86 (d, J= 8 Hz, 2H), 4.65 (s, 2H), 3.82 (s, 3H), 3.03 (s, 1H); RMN 13C (CDCI3, 100 MHz) 5 168.9, 158.0, 133.6, 115.4, 114.6, 83.3, 76.3, 65.1, 52.3. LRMS (ESI+) : calcutee pour CnHnOa [M+Hf, m/z 191.07, trouv&e 191.70. Compose 5: disponible commercialement. Compost 6: le compose 6 a ete prepare selon la procedure decrite dans ('article : Tetrahedron 2005, 61, 1755.30 Compost 7: Ie compose 7 a ete prepare selon la procedure decrite dans l’article : Tetrahedron 2008, 64, 399. Compose 8: Ie compose 8 a ete prepare selon la procedure decrite dans l’article : European Journal of Organic Chemistry 2002, 21, 3680. Compose 9 A une suspension du compose 8 (3 g, 11.3 mmol) dans du DCM anhydre (50 mL) refroidie a -20 °C ont ete ajoutes de I’oxyde d’argent (3,93 g, 17,0 mmol), de I’iodure de potassium (0,37 g, 2,2 mmol) puis par petites portions du TsCI (2,37 g, 12,5 mmol). Le melange a ete agite a TA pendant 16 h puis filtre sur CeliteMC. Le filtrat a ete concentre sous pression reduite et I’huile residuelie a ete purifiee par chromatograph!e sur colonne de silice en utilisant du DCM comme eluant pour conduire a un solide blanc correspondant au compose 9 (2,1 g, 44%). Pt de fusion : 97-98°C. RMN 1H (CDCI3, 400 MHz) 6 7.84 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.64 (s, 1H), 7.62 (s, 1H), 7.38 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 5.10 (s, 2H), 4.67 (s, 2H), 3.20 (bs, 1H), 2.48 (s, 3H); RMN 13C (CDCI3, 100 MHz) 6 160.0, 153.4, 145.4, 132.6, 130.0, 129.4, 129.3, 128.0, 106.9, 70.5, 63.4, 21.7. HRMS (ESI+) : calcuiee pour Ci4H15NO4IS [M+H]+, m/z 419.9766, trouvee 419.9759. Compose 10 A une suspension d’hydrochlorure de glycinate de fe/t-butyle (0,76 g, 4,5 mmol) dans MeCN anhydre (76 mL) a ete ajoute du carbonate de potassium anhydre (1,88 g, 13,6 mmol) et ce melange a ete chauffe a 55°C pendant 30 min puis refroidi a TA. A cette suspension a ete ajoute le compose 9 (4,0 g, 9 mmol) puis le melange a ete chauffe a 60°C pendant 20 h. Lorsque le melange est revenu a TA, le melange a ete filtre et le filtrat a ete concentre sous pression reduite et le residu a ete purifie par chromatographie sur colonne de silice en utilisant un gradient de solvant AcOEt - MeOH 97/3 jusqu’a 90/10 par increment de 1% pour conduire au compose 10 (2,5 g, 90%) sous forme de mousse. RMN 1H (CDCI3, 400 MHz) 6 7.79 (s, 2H), 7.53 (s, 2H), 4.70 (s, 4H), 3.96 (s, 4H), 3.86 (bs, 2H), 3.40 (s, 2H), 1.53 (s, 9H); RMN 13C (CDCh, 100 MHz) 5 170.1, 159.6, 158.8, 131.0, 128.3, 106.8, 81.6, 63.6, 59.2, 56.7, 38.2. HRMS (ESI+) : calcuiee pour C20H26N3O4I [M+H]+, m/z 626.0013, trouvee 626.0015. Date Re?ue/Date Received 2023-04-1230a Compost 11 Une solution de compose 10 (1,64 g, 2,62 mmol) et de compose 4 (1,5 g, 7,87 mmol) dans un melange THF (7,5 mL) et TEA (7,5 mL) a 6t6 degazee par un courant d’argon pendant 15 min. Puis a ce melange ont ete ajoutes du 1,1'- bis(diphenylphosphino)ferrocene]dichloropalladium(ll) (0,64 g, 0,78 mmol) et de I’iodure de cuivre (0,3 g, 1,57 mmol). Ce melange a 6t& irradi^ sous microondes (100 W) pendant 30 min puis refroidi a TA et enfin filtre sur un lit de Celite. Le filtrat a ete concents sous pression r^duite et le r^sidu a ete purifiS par chromatographie sur colonne de silice en utilisant un gradient de solvant DCM/AcOEt/MeOH de 1/0/0, 5/5/0, 0/1/0 jusqu’a 0/9/1 par increment de 5% pour conduire au compose 11 souhaite (1,39 g, 71%). RMN 1H (CDCI3, 400 MHz) 6 7.51 (s, 2H), 7.48 (d, J = 8.7 Hz, 4H), 7.19 (s, 2H), 6.87 (d, J = 8.7 Hz, 4H), 4.75 (s, 4H), 4.68 (s, 4H), 4.16 (bs, 2H), 4.03 (s, 4H), 3.84 (s, 6H), 3.43 (s, 2H), 1.53 (s, 9H); RMN 13C (CDCI3, 100 MHz) 6 170.4, 168.9, 158.5, 158.3, 158.0, 133.6, 132.6, 123.7, 120.5, 115.3, 114.7, 93.6, 86.2, 81.4, Date Re?ue/Date Received 2023-04-125 10 15 20 25 30 35 40 CA 03007797 2018-06-07 31 WO 2017/098180 PCT/FR2016/053296 65.1, 63.9, 59.5, 56.4, 52.3, 28.2. HRMS (ESI+) : calculee pour C42H44N3O10 [M+H]*, m/z 750.3027, trouvee 750.3022. Compose 12 A une solution de diol 11 (250 mg, 0,33 mmol) dans du DCM (8 mL) ont ete ajoutes de Piodure de potassium (22 mg, 0,14 mmol) et de I'oxyde d'argent (231 mg, 1 mmol). A ce melange refroidi a - 5°C a ete ajoute en une fois du TsCI (190 mg, 1 mmol). Le melange a ete ensuite agite a TA pendant 16 h. L’avancement de la reaction a 6t6 suivi par CCM. Aprds cette p^riode, le solvant a 6t6 elimine sous pression et le residu a ete purifie par chromatographie sur colonne de silice en utilisant un gradient d’eluant DCM-MeOH de 99/1 jusqu’a 98/2 par increment de 0,2 % pour condulre a une huile beige (300 mg, 88%). RMN 1H (CDCI3; 300 MHz) 6 1.46 (s, 9H); 2.4 (s, 6H), 3.32 (s, 2H), 3.80 (s, 6H), 3.87 (s, 4H), 4.65 (s, 4H), 5.07 (s, 4H), 6.83 (d, J = 8.9 Hz, 4H), 7.28 (s, 2H), 7.29 (d, J = 8.3 Hz, 4H), 7.44 (d, J = 8.9 Hz, 4H), 7.52 (s, 2H), 7.79 (d, J = 8.3 Hz, 4H). RMN 13C (CDCI3 ; 75 MHz) 6 170.0, 168.8, 159.0, 158.3, 153.1, 145.0, 133.5, 133.0, 132.6, 129.8, 128.0, 124.2, 121.6, 115.1, 114.7, 94.1, 85.9, 81.2, 71.3, 65.0, 59.5, 56.0, 52.3, 28.1, 21.5. HRMS (ESI+): calculee pour CseHgeNsO^Sa [M+H]+, m/z 1058.3204, trouvee 1058.3241. Compost 13:disponible commercialement. Compose 14: disponible commerclalement. Compose 15: le compose 15 a ete prepare selon la procedure decrite dans Particle: Organic Letters 2006, 8, 4251. Compose 16: le compost 16 a ete prepare selon la procedure decrite dans Particle : Organic Letters. 2006, 8, 4251. Compose 17 : le compose 17 a ete prepare selon la procedure decrite dans la demande WO 2014/111661. Compost 18:disponible commerclalement. Compose 19 : le compost 19 a ete prepare selon la procedure decrite dans Particle : Organic Letters 2007, 9, 1635. Compost 20 A une solution de compose 8 (3,0 g, 11,3 mmol) dans du THF (10 mL) a ete ajoutee une solution aqueuse de soude (1,36 g, 34 mmol dissous dans 10 mL d’eau) a TA. A ce melange refroidi a 0°C a 6t6 additionne une solution de TsCI (6,47 g, 34 mmol) dans du THF (10 mL) et a et6 agite pendant 20 h a TA. A cette suspension ont ete ajoutes du DCM (100 mL) et une solution saturee de saumure (50 mL). Apres decantation, la phase aqueuse a ete extraite par du DCM (2 x 100 mL). Les phases organiques ont ete reunies, sech^es sur sulfate de sodium, filtrdes et concentrees sous pression r^duite. Le produit brut a ete purifie par chromatographie sur colonne de silice avec un gradient d'eluant cyclohexane/DCM de 50/50 jusqu'd 0/100 pour conduire au compose 20 (5,41 g, 84%) comme un solide blanc. Pt de fusion : 143.5-144.5°C. RMN ’H (CDCI3, 400 MHz) 6 7.81 (d, J = 8.2 Hz, 4H), 7.64 (s, 2H), 7.36 (d, J = 8.2 Hz, 4H), 5.01 (s, 4H), 2.47 (s, 6H); RMN 13C (CDCI3, 100 MHz) 6 154.1, 145.3, 132.6, 130.3, 130.0, 128.0, 106.9, 70.38, 21.72. HRMS (ESI+): calculee pour C2-.H21NO6IS2 [M+Hf, m/z 573.9855, trouvee 573.9854.5 10 15 20 25 30 35 40 WO 2017/098180 CA 03007797 2018-06-07 32 PCT/FR2016/053296 Compose 21 A une solution de compose 19 (1,83 g, 5,75 mmol) dans MeCN anhydre (36 mL) a ete additionne du carbonate de sodium (2,77 g, 26,2 mmol) puis la suspension a ete agitee a 80°C pendant 1 h. A cette suspension refroidie e TA a ete ajoute Ie compose 20 (1,5 g, 2,62 mmol) et Ie melange a ete agite a 80°C pendant 72 h. Apres cette periode, Ie melange reactionnel a ete refroidi a TA, filtre et Ie filtrat a et6 concentre sous pression reduite. Le residu ete purifie par chromatographie sur colonne de sillce en utilisant un gradient d’eiuant AcOEt/MeOH de 98/2 Jusqu’e 95/5 par increment de 0,5% pour conduire au compose 21 (2,0 g, 89%) comme une huile jaunatre. RMN 1H (CDCI3, 400 MHz) 6 8.08 (dd, J = 7.6 Hz, 1.6 Hz, 2H), 7.75-7.66 (m, 6H), 7.60 (s, 2H), 4.63 (s, 4H), 4.15 (s, 4H), 1.39 (s, 18H); RMN 13C (CDCI3, 100 MHz) 5 167.3, 156.3, 147.7, 133.7, 133.5, 131.7, 130.8, 130.4, 124.2, 107.3, 82.6, 52.8, 49.2, 28.0. HRMS (ESI+) : calculee pour C3iH37N5O12IS2 [M+Hf, m/z 862.0925, trouvee 862.0927. Compose 22 A une solution de compose 17 (2,58 g, 9,4 mmol) et de compose 21 (8,2 g, 8,54 mmol) dans un melange de TEA (42 mL) et de THF anhydre (42 mL) a ete degazee sous un courant d’argon pendant 15 min. Puis a ce melange ont ete ajoute du 1,1'-bis(diphenylphosphino)ferrocdne] dichloropalladium(ll) (1,39 g, 1,70 mmol) et de I’iodure de cuivre (0,49 g, 1,57 mmol) et a ete chauffe a 60*C sous agitation pendant 20 h. Ce melange a ete refroidi a TA et filtre sur un lit de Celite. Le filtrat a ete concentre sous pression reduite et le produit brut a ete purifie par chromatographie sur colonne de silice en utilisant un gradient d’eiuant cydohexane/DCM/AcOEt de 5/2/3 jusqu’a 2/5/3 pour conduire au compose 22 (4,9 g, 57%) comme une mousse jaune. RMN 1H (CDCI3, 400 MHz) 5 8.10 (dd, J = 7.6 Hz, 1.7 Hz, 2H), 7.75-7-65 (m, 6H), 7.49 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.32 (s, 2H), 6.92 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 4.76 (bs, 1H), 4.68 (s, 4H), 4.17 (s, 4H), 4.08 (t, J = 6.0Hz, 2H), 3.36 (m, 2H), 2.03 (m, 2H), 1.47 (s, 9H), 1.38 (s, 18H); RMN 13C (CDCI3, 100 MHz) 6 167.4, 159.7, 156.0, 155.8, 147.9, 133.8, 133.6, 133.6, 131.8, 130.8, 124.2, 122.7, 114.7, 113.8, 95.3, 85.5, 82.4, 79.3, 65.9, 53.0, 49.2, 37.8, 29.5, 28.4, 27.9. HRMS (ESI+): calculee pour C47HS7N6O15S2 [M+H]*, m/z 1009.3323 trouvee 1009.3322. Compose 23 A une solution de compose 22 (0,1 g, 0,099 mmol) dans MeCN (4,3 mL), ont 6te additionnes sous agitation du 2-mercaptoethanol (76 pL, 1,09 mmol) et du 1, 8 diazabicyclo [5-4-0] unde-7-ene (67 pL, 0,445 mol). La reaction a ete agitee pendant 45 min a TA. L’avancement de la reaction a ete suivi par CCM. Apres cette periode la reaction etait totale. Le solvant a ete eiimine sous pression reduite et le produit brut a ete purifie par chromatographie sur colonne de silice en utilisant comme eluant un melange AcOEt/MeOH (98/02 puis 96/04) pour conduire au compose 23 (35 mg, 55%) comme une huile beige. RMN 1H (CDCI3, 300 MHz) 6 1.46 (s, 9H), 1.49 (s, 18H), 2.01 (m, 2H), 3.33 (m, 2H), 3.40 (s, 4H), 3.94 (s, 4H), 4.06 (m, 2H), 6.89 (d, J = 8.8 Hz, 2H); 7.32 (s, 2H); 7.48 (d, J = 8.8 Hz, 2H). RMN 13C (CDCI3, 75 MHz) 6 , 171.3, 159.4,159.0, 156.0, 133.4, 132.6, 122.0, 114.6, 114.3, 93.7, 86.1, 81.2, 79.2, 65.8, 54.3, 51.1, 37.8, 29.5, 28.3, 28.1, HRMS (ESI+) : calculee pour C35H51N4O7 [M+Hf, m/z 639.3758, trouvee 639.3784.5 10 15 20 25 30 35 40 (gradient D) et a conduit au compose 26b (11.6 mg, 60%) identifie comme Ie compose souhaite. CA 03007797 2018-06-07 33 WO 2017/098180 PCT/FR2016/053296 Compose 24 A une solution de derive ditosyle 12 (312 mg, 0,295 mmol) et de derive 23 (188 mg, 0,295 mmol) dans MeCN anhydre (140 mL) ont ete additionnes du carbonate de sodium (312 mg, 2,95 mmol) et de I’iodure de sodium (4.4 mg, 0,0295 mmol). La suspension a ete agitee a reflux pendant 40 h. L’avancement de la reaction a ete suivi par CCM. Apres cette periode la reaction etait totale. Le melange reactionnel a ete refroidi a TA, filtre et le filtrat a ete concentre sous pression reduite. Le reside a ete purifie par chromatographic sur colonne d’alumine en utilisant comme 6luant un melange DCM/MeOH (98/02 puis 97/03) pour conduire au compost 24 (297 mg, 74%) comme une huile beige. RMN ’H (CDCI3, 300 MHz) 6 1.47(s, 9H), 1.52 (s, 27H), 2.02 (m, 2H), 3.37 (m, 2H), 3.43 (s, 4H), 3.45 (s, 2H), 3.84 (s, 6H), 3.90 (m, 12H), 4.02 (m, 2H), 4.62 (s, 4H), 6.69 (m, 6H), 7.22 (m, 4H), 7.25 (s, 2H), 7.35 (m, 6H). RMN 13C (CDCI3, 75 MHz) 6 170.6, 168.9, 159.1, 158.49, 158.45, 158.4, 157.8, 156.0, 133.43, 133.41, 132.0, 131.7, 123.0, 122.97, 122.8, 115.8, 114.6, 114.4, 114.3, 92.9, 92.4, 86.6, 86.4, 81.1, 79.2, 65.7, 65.0, 60.3, 60.2, 60.1, 59.0, 58.7, 52.3, 37.7, 29.4, 28.4, 28.2. HRMS (ESI+) : calculee pour C77H9oN7Ol5 [M+H]*, m/z 1352.6495, trouvee 1352.6521. Compose 25 A une solution de compost 24 (21,1 mg, 15,6 pmol) dans MeCN (2,11 mL) a 6t6 ajoute une solution aqueuse d’hydroxyde de lithium 1 M (156 pL, 156 pmol). La solution a et6 agitee a TA pendant 1 h. L’avancement de la reaction a ete suivi par LC-MS (gradient A). Apres cette periode, la reaction etait totale. La solution a et6 directement purifiee par HPLC preparative (gradient B) et a conduit au compose 25 (9,4 mg, 45%) identify comme le compose souhaite. HRMS (ESI+): calculee pour C75H86N7O15 [M+Hf, m/z 1324.6182, trouvee 1324.6185. HPLC (gradient A) Tr = 13.95 min. Compost 26a A une solution du compose 25 (34 mg, 25,7 pmol) dans du DMSO anhydre (1275 pL) out ete ajoutd de la taurine (12,85 mg, 102,7 pmol), de la DIPEA (26,4 pL, 19,9 mg, 154 pmol) et enfin du HATU (39 mg, 102,7 pmol). La solution a ete agitee a TA pendant 40 min. L’avancement de la reaction a ete suivi par LC-MS (gradient A). Apres cette periode, la reaction etait totale. La solution a ete directement purifiee par HPLC preparative (gradient C) et a conduit au compost 26a (30 mg, 76%) identifie comme le compost souhaite. HRMS (ESI+) : calcul6e pour C79H97N9Oi9S2 [M+2H]2*, m/z 769.8171, trouvee 769.8166. HPLC (gradient A) Tr = 11.33 min. Compose 26b Le 3-((2-amino6thyl)dim6thylammonio)propane-1-sulfonate a ete prepare selon la procedure decrite dans WO 2011/146595 et dans Organic & Biomolecular Chemistry 2012, 10, 1883. A une solution du compose 25 (15 mg, 11,3 pmol) dans du DMSO anhydre (562 pL) ont ete ajoute du 3-((2-amino6thyl)dim6thylammonio)propane-1-sulfonate (15 mg, 71,58 pmol), de la DIPEA (11,6 pL, 8,8 mg, 67,9 pmol) et enfin du HATU (17,2 mg, 45,3 pmol). La solution a ete agitee a TA pendant 10 min. L’avancement de la reaction a ete suivi par LC-MS (gradient A). Apres cette periode, la reaction etait totale. La solution a ete directement purifiee par HPLC preparative5 10 15 20 25 30 35 40 CA 03007797 2018-06-07 34 WO 2017/098180 PCT/FR2016/053296 HRMS (ESH-) : calculee pour CggHngNnOigSa [M+2H]2*, m/z 854.9062, trouv6e 854.9054. HPLC (gradient A) 7r= 11.14 min. Compose 26c A une solution du compost 25 (15 mg, 11,3 pmol) dans du DMSO anhydre (562 pL) ont ete ajoute de la glucosamine (9,77 mg, 45,3 pmol), de la DIPEA (11,6 pL, 8,8 mg, 67,9 pmol) et enfin du HATU (17,2 mg, 45,3 pmol). La solution a ete agitee a TA pendant 10 min. L’avancement de la reaction a ete suivi par LC-MS (gradient A). Apres cette periode, la reaction etait totale. La solution a ete directement purifiee par HPLC preparative (gradient D) et a conduit au compose 26c (16,3 mg, 87%) Identifie comme Ie compose souhaite. HRMS (ESI+) : calculee pour C87HioaNg023 [M+H]+, m/z 1646.7558, trouvee 1646.7558. HPLC (gradient A) Tr = 11.62 min. Compose 26d : ce compose a ete prepare selon la meme procedure que celle utilises pour la synthese de 26a-c en s6lectionnant l’amine correspondante. Complexes Cla- C2a-C3a Au compose 26a (30 mg, 19,5 pmol) a ete ajoute du TFA (500 pL). La solution a ete agitee a TA pendant 2 h. L’avancement de la reaction a ete suivi par LC-MS (gradient A). Apres cette periode, la reaction etait totale. Le solvant a ete elimine sous pression reduite. Le residu a ete divise en deux parties. Une partie a ete utilises pour la preparation du complexe d’europium C1a et I’autre partie pour la preparation du complexe de terbium C2a. C1a Au residu (22,2 mg, 18 pmol) ont ete ajoute de I’eau (6 mL), MeCN (2 mL) et une solution aqueuse d’hydroxyde de soude 3 M afin d’obtenir une solution pH 7. A cette solution ont ete ajoute du chlorure d’europium (26,4 mg, 72 pmol) et une solution aqueuse d’hydroxyde de soude 3 M afin d’obtenir une solution pH 6. La solution a 6t6 agitee a TA pendant une nult. L’avancement de la reaction a ete suivi par LC-MS (gradient E). Apres cette periode, la reaction etait totale. La solution a ete directement purifiee par HPLC preparative (gradient F) et a conduit au complexe C1a (9,7 mg, 38%) identifie comme le compose souhaite. HRMS (ESI+) : calculee pour C62H63NgO17S2Eu [M]3*, m/z 473.4322, trouvee 473.4319. HPLC (gradient E). C2a Au r6sidu obtenu lors de la premiere etape (1,9 mg, 1,5 pmol) ont ete ajoutes de I’eau (375 pL), du chlorure de terbium (2,24 mg, 6 pmol) et une solution aqueuse d’hydroxyde de soude 3 M afin d’obtenir une solution pH 6. La solution a ete agitee a TA pendant une nuit. L’avancement de la reaction a ete suivi par LC-MS (gradient E). Apres cette periode, la reaction etait totale. La solution a ete directement purifiee par HPLC preparative (gradient G) et a conduit au complexe C2a (107 pg, 5%) identifie comme le compose souhaite. HRMS (ESI+) : calculee pour C62H63NgO17S2Tb [M+3H]3*, m/z 476.1012, trouvee 476.1005. HPLC (gradient E). C3a : ce complexe a ete prepare selon la meme procedure que celle utilises pour la synthese de C1aetC2a. Complexes C1b- C2b - C3b Au compose 26b (11,6 mg, 7 pmol) a ete ajoute du TFA (250 pL). La solution a ete agitee a TA pendant 2 h. L’avancement de la reaction a 6te suivi par LC-MS (gradient A). Apres cette periode,CA 03007797 2018-06-07 35 WO 2017/098180 PCT/FR2016/053296 la reaction etait totale. Le solvant a ete elimine sous pression reduite. Le reside a ete divise en deux parties. Une partie a ete utilises pour la preparation du complexe d'europium C1b et l’autre partie pour la preparation du complexe de terbium C2b. C1b 5 Au residu obtenu precedemment (7,9 mg, 5,5 pmol) ont ete ajoutes de I’eau (3,15 mL), du chlorure d’europium (8,1 mg, 22 pmol) et une solution aqueuse d'hydroxyde de soude 3 M afin d’obtenir une solution pH 6. La solution a ete agitee a TA pendant une nuit. L'avancement de la reaction a ete suivi par LC-MS (gradient E). Apres cette periode, la reaction etait totale. La solution a ete directement purifiee par HPLC preparative (gradient F) et a conduit au complexe Clb (3.58 mg, 10 41%) identifie comme le compose souhaite. HRMS (ESI*): calculee pour C72H83N11O17S2Eu [M+H]3*, m/z 530.1540, trouvee 530.1580. HPLC (gradient E) Tr = 8.56 et 8.81 min (melange d'isomeres 58%-42%). C2b Au residu obtenu lors de la premiere etape (2,2 mg, 1,5 pmol) ont ete ajoutes de I’eau (857 pL), du 15 chlorure de terbium (2,24 mg, 6 pmol) et une solution aqueuse d'hydroxyde de soude 3 M afin d’obtenir une solution pH 6. La solution a ete agitee a TA pendant une nuit. L’avancement de la reaction a 6t6 sulvl par LC-MS (gradient E). Apres cette periode, la reaction etait totale. La solution a ete directement purifiee par HPLC preparative (gradient G) et a conduit au complexe C2b (231 pg, 10%) identifie comme le compose souhaite. HRMS (ESI*) : calculee pour C72Ha5N11O17S2Tb 20 [M+3H]3*, m/z 532.8273, trouvee 532.8268. HPLC (gradient E) Tr = 8.71 et 8.94 mln (melange d’isomeres 35%-65%). C3b : ce complexe a ete prepare selon la meme procedure que celle utilisee pour la synthese de C1b et C2b Complexes Cic- C2c 25 Au compose 26c (16,3 mg, 11,8 pmol) a ete ajoute du TFA (250 pL). La solution a ete agitee a TA pendant 2 h. L’avancement de la reaction a ete suivi par LC-MS (gradient A). Apres cette periode, la reaction etait totale. Le solvant a ete eiimine sous pression reduite. Au residu ont ete ajoutes de I’eau (4 mL) et une solution aqueuse d’hydroxyde de sodium 3 M pour obtenir une solution pH 7. Cette solution a ete divis6e en deux parties. Une partie a 6t6 utilisee pour la preparation du 30 complexe d'europium C1c et l’autre partie pour la preparation du complexe de terbium C2c. C1c A la solution obtenue precedemment (16,3 mg, 11,8 pmol, 3,5 mL), ont ete ajoutes du chlorure d’europium (15,1 mg, 41,2 pmol) et une solution aqueuse d’hydroxyde de soude 3 M afin d’obtenir une solution pH 6. La solution a ete agitee a TA pendant une nuit. L’avancement de la reaction a 35 ete suivi par LC-MS (gradient E). Apres cette periode, la reaction etait totale. La solution a ete directement purifiSe par HPLC preparative (gradient F) et a conduit au complexe C1c (3,25 mg, 18%) identifie comme le compose souhaite. HRMS (ESI+) : calculee pour C70H72N9O21EU [M+]2*, m/z 763.7027, trouvee 763.7093. HPLC (gradient E) Tr = 8.68 min.5 10 15 20 25 30 35 40 CA 03007797 2018-06-07 36 WO 2017/098180 PCT/FR2016/053296 C2c A la solution obtenue prectedemment (2,1 mg, 1,5 pmol, 508 pL), ont ete ajoutes de I’eau (508 pL), du chlorure de terbium (2,24 mg, 6 pmol) et une solution aqueuse d’hydroxyde de soude 3 M afin d’obtenlr une solution pH 6. La solution a ete agitee a TA pendant une nuit. L’avancement de la reaction a ete suivi par LC-MS (gradient E). Apres cette periode, la reaction etait totale. La solution a ete directement purifiee par HPLC preparative (gradient G) et a conduit au complexe C2c (184 pg, 8%) identifie comme Ie compose souhaite. HRMS (ESI+) : calcutee pour C70H74N9O21Tb [M+2H]2*, m/z 767.7126, trouvee 767.7141. HPLC (gradient E) Tr = 8.30 et 8.78 min (melange d’isomeres 25%-75%). C3c : ce complexe a ete ptepate selon la m§me procedure que celle utilises pour la synthese de C1c et C2c. C1d, C2d, C3d: ces complexes ont ete prepares selon la meme procedure que celle utilisee pour la synthese de C1c et C2c. C1a-maleimide Au complexe de pyridinophane C1a (0,56 mg, 400 nmol) ont ete ajoute une solution d’hexanoate 6-((beta-mateimidopropionamido) de succinimidyle) (0,23 mg, 600 nmol) dans du DMF anhydre (50 pL) et de la DIPEA (0,2 pL, 155 pg, 1,2 pmol). Le melange a ete agite a TA pendant 2 h. L’avancement de la reaction a ete suivi par LC-MS (gradient E) Tr = 10.64 min. Apres cette periode, la reaction etait totale. La solution a ete directement purifiee par HPLC preparative (gradient H) et a conduit au complexe C1a-maleimide (353 pg, 210 nmol, 52%) identifie comme le compose souhaite. LRMS (ESI+) : calcutee pour C75H77N11O21S2EU [M+H]*, m/z 1684.3933, trouvee 1684.65. HPLC (gradient E) Tr = 10.64 min. C1a-CAMP Au CAMP-Glu-acide (0,25 mg, 400 nmol) ont ete ajoutes du TSTU (0,13 mg, 440 nmol) en solution dans du DMF anhydre (50 pL) et de la DIPEA (0,1 pL, 77,5 pg, 600 nmol). Le m6lange a 6te agite S TA pendant 1 h. Puls a cette solution a dte ajoute le complexe C1a (0,28 mg, 200 nmol) en solution dans du tampon phosphate 50 mM pH 7 (350 pL). L’avancement de la reaction a ete suivi par LC-MS (gradient E) Tr = 9,1 min. Aprds cette periode, la reaction etait totale. La solution a ete directement purifiee par HPLC preparative (gradient H) et a conduit au complexe C1a-CAMP (303 pg, 150 nmol, 75%) identifie comme le compose souhaite. LRMS (ESI+) : calcutee pour C84H92N15O28PS2EU [M+2H]2*, m/z 1010.2329, trouvee 1010.89. HPLC (gradient E) Tr = 9.1 min. Compose 27: disponible commercialement. Compose 28: le compost 28 a ete prepare selon la procedure decrite dans EP-A-533131. Compose 29 A une suspension du compose 28 (2,6 g, 13,4 mmol) dans du chloroforme (265 mL) a ete ajoute de la triph6nylphosphine (4,2 g, 16,1 mmol). Le melange a ete agite a TA jusqu’d totale dissolution (30 min). A cette solution a 6te ajoute du tetrachlorure de carbone (37 mL) et le melange a ete agite pendant 20 h a TA. L’avancement de la reaction a ete suivi par CCM. Aptes cette periode, la reaction 6tait totale. Le solvant a ete elimine sous pression reduite. Le residu a ete purifte par chromatographle sur colonne de silice en utilisant une eluant cyclohexane - AcOEt 3/7 pour5 10 15 20 25 30 35 40 CA 03007797 2018-06-07 37 WO 2017/098180 PCT/FR2016/053296 conduire au compost souhaite (0,8 g, 28%) RMN 1H (CDCI3, 300 MHz) 6 7.96 (s, 1H), 7.81 (s, 1H), 4.86 (s, 2H), 4.74 (s, 2H), 3.99 (s, 3H), 3.45 (si 1H). Compose 30 A une suspension de compost 29 (0,8 g, 3,7 mmol) dans du MeCN anhydre (15 mL) ont ete additionnes du carbonate de sodium (1,25 g, 11,8 mmol) et l’amine 18 (250 pL, 1,85 mmol). Le melange heterogene a ete chauffe a reflux pendant 20 h puis refroidi a TA. A ce melange ont ete additionnes une solution aqueuse saturee de bicarbonate de sodium (20 mL), de I’eau (15 mL) puis du DCM (50 mL). La phase organique a ete separee et la phase aqueuse a ete extraite avec du DCM (2 x 50 mL). Les phases organiques ont ete reunies, sechees sur sulfate de sodium, filtrees et concentrees sous pression reduite. Le residu a ete purifie par chromatographie sur colonne de silice en utilisant un gradient d'eluant DCM- MeOH 97/3 jusqu’a 90/10 par increment de 1% pour conduire au compose 30 (0,6 g, 66%). RMN 1H RMN (CDCI3, 300 MHz) 5 7,97 (s, 2H), 7,67 (s, 2H), 4.82 (s, 2H), 4.81 (s, 2H), 4.12 (s, 4H), 4.02 (s, 2H), 3.98 (s, 6H), 3.43 (s, 2H), 1.53 (s, 9H). Compose 31 A une solution de compose diol 30 (50 mg, 102 pmol) dans du DCM (2 mL) ont ete additionne de I’iodure de potassium (7 mg, 42,5 pmol) et de I’oxyde d'argent (71 mg, 306 pmol). A ce melange refroidi a -20"C sous atmosphere inerte a ete additional du TsCI (39 mg, 204 pmol). La solution a ete rechauffee a TA puis agitee sous atmosphere inerte pendant 20 h. Apres cette pdriode, le melange reactionnel a ete purifie directement par chromatographie sur colonne de silice en utilisant un melange d’eluant DCM - AcOEt 90/10 pour conduire au derive ditosyle 31 sous forme d’une huile incolore (57 mg, 71%). RMN 5H (CDCI3) : 6 1,46 (s, 9H) ; 2,42 (s, 6H) ; 3,33 (s, 2H) ; 3,94 (s, 6H) , 3,96 (s, 4H); 5,13 (s, 4H) ; 7,31-7,33 (d, 4H, J = 8,1 Hz), 7,75 (s,2H); 7,80-7,83 (d, 4H, J = 8,4 Hz); 7,96 (s, 2H). RMN 13C (CDCI3): 6 = 21,7; 28,2; 52,8; 59,4; 56,1; 71,3; 81,4; 119,3; 122,1; 128,1; 129,9; 132,7; 138,9; 145,2; 154,4; 160,4; 165,3; 170,1. MS (ES+): m/z= 798,5 [M+H+] (100%). IR (cm’1) v 3444, 2958, 1732, 1368, 1177. Compose 32 Au compose ditosyld 31 (255 mg, 0,319 mmol) en solution dans du MeCN anhydre (160 mL) ont ete ajoutes sous argon le compose 23 (204 mg, 0,319 mmol), le carbonate de sodium (338 mg, 3,19 mmol) et I’iodure de sodium (4,8 mg, 0,0319 mmol). La suspension a 6te agitee & reflux pendant 40 h. Le melange a ete filtre, evapote sous vide et le r6sidu a ete purifie par chromatographie sur colonne d'alumine (CH2CI2 100% jusqu’a CH2CI2/MeOH 99/1 par increment de 0,5%). Les fractions recuperees, correspondant a un melange de compose sous forme libre et sous forme de complexe de sodium, ont 6t6 ensuite resolubilisees dans un minimum de DCM et lavees plusieurs fois a I’eau. Le compose souhaite 32 a ete obtenu sous forme d’une poudre jaune (208 mg, 60%). Rf= 0,18 (alumine, CH2CI2/MeOH 98/2). RMN 1H (CDCI3, 300 MHz) 6 7.58 (s, 4H), 7.44 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.16 (s, 2H), 6.86 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 4.77 (s, 1H), 4.03 (t, J= 6 Hz, 2H), 3.95 (s, 4H), 3.92 (s, 4H), 3.84 (s, 4H), 3.79 (s, 6H), 3.43 (s, 2H), 3.39 (s, 4H), 3.35-3.28 (m, 2H), 2.02-1.94 (m, 2H), 1.47 (s, 27H), 1.42 (s, 9H); RMN 13C (CDCI3, 75 MHz) 5 170.4, 165.8, 159.6, 159,3, 158.4, 155.9, 137.6, 133.3, 131.8, 122.8, 120.5, 120.3, 114.6, 114.5, 92.8, 86.3, 81.19, 81.15, 79.2, 65.8, 60.0, 59.9, 58.9, 58.7, 52.3, 37.8, 29.5, 28.3, 28.1; HRMS (ESI+): calculee pour5 10 15 20 25 30 35 40 WO 2017/098180 CA 03007797 2018-06-07 38 PCT/FR2016/053296 C59H78N7Oi3 [M+Hf, m/z 1092.5658, trouvee 1092.5636; IR (cm"1): v 3429, 2977, 2932, 2210, 1729, 1596, 1511, 1367, 1225, 1159. Compose 34 Dans un ballon de 25 mL Ie compose 32 (50,0 mg, 46 pmol) a ete solubilise dans MeCN (1 mL) pour donner une solution incolore. Au melange reactionnel a ete ajoute I'hydroxyde de lithium (11,19 mg, 458 pmol) en solution dans de I’eau (458 pL) en une seule fois. La solution a ete agitee & TA pendant 30 min. L’avancement de la reaction a 6t6 suivi par UPLC-MS (gradient I). Apres cette periode, la reaction etait totale. La solution a ete directement purifiee par HPLC preparative (gradient J) et a conduit au compose 34 (35 mg, 71%) identifie comme Ie compose souhaite. HRMS (ESI+): calcuiee pour C57H74N7O13 [M+H]*, m/z 1064.5339, trouvee 1064.5341. UPLC-MS (gradient I) 77= 3.82 min. Compose 35a Dans un ballon de 50 mL Ie compose 34 (35,0 mg, 33 pmol) a ete solubilise dans un melange DMSO (1 mL) et MeCN (4 mL) pour donner une solution incolore. Au melange reactionnel a ete ajoute la DIPEA (34 pl, 197 pmol), la taurine (12,47 mg, 99 pmol) et Ie HATU (25,8 mg, 65,8 pmol) en une seule fois. La solution a ete agitee a TA pendant 2 h. L’avancement de la reaction a ete suivi par UPLC-MS (gradient I). Apres cette periode, la reaction etait totale. La solution a ete directement purifiee par HPLC preparative (gradient K) et a conduit au compose 35a (31,7 mg, 75 %) identifie comme Ie compose souhaite. HRMS (ESI+): calcuiee pour C61H8sN9O17S2 [M+2H]2+, m/z 639.7747, trouvee 639.7747. UPLC-MS (gradient I) Tr = 3.36 min. Compose 35b Le 3-((2-aminoethyl)dimethylammonio)propane-1-sulfonate a ete prepare selon la procedure deo-ite dans WO 2011/146595 et dans Organic & Biomolecular Chemistry 2012, 10, 1883. Dans un ballon de 5 mL le 3-((2-aminoethyl)dimethylammonio)propane-1-sulfonate (10,56 mg, 50,0 pmol) et le compose 34 (10,64 mg, 10 pmol) ont ete solubilises dans du DMSO (600 pL) pour donner une solution jaune. Au melange reactionnel a ete ajoute la DIPEA (12,06 pL, 70,0 pmol) et le HATU (15,21 mg, 40,0 pmol) en une seule fois. La solution a ete agitee e TA pendant 15 min. L’avancement de la reaction a ete suivi par UPLC-MS (gradient I). Apres cette periode, la reaction etait totale. La solution a ete directement purifiee par HPLC preparative (gradient L) et a conduit au compose 35b (8,6 mg, 59%) identifie comme le compose souhaite. HRMS (ESI+) : calcuiee pour C7iH107Ni1Oi7S2 [M+2H]2+, m/z 724.8638, trouvee 724.8644. UPLC-MS (gradient I) Tr- 3.24 min. Compose 35c: ce compose a ete prepare selon la meme procedure que cede utilisee pour la synthese de 35a et 35b. Compose 35d L’hydrochlorure de 2-trimethylammonium-ethylamine a ete prepare selon la procedure decrite dans Analytical Chemistry 2014, 86, 10006. Dans un ballon de 5 mL l’hydrochlorure de 2- trimethylammonium-ethylamine (6,98 mg, 50,0 pmol) et le compose 34 (10,64 mg, 10 pmol) ont 6te solubilises dans le DMSO (600 pL) pour donner une solution jaune. Au melange reactionnel a ete ajoute la DIPEA (16,68 pL, 100 pmol) et le HATU (15,21 mg, 40,0 pmol) en une seule fois. La solution a ete agitee e TA pendant 15 min. L’avancement de la reaction a ete suivi par UPLC-MS5 10 15 20 25 30 35 40 CA 03007797 2018-06-07 39 WO 2017/098180 PCT/FR2016/053296 (gradient I). Apres cette periode, la reaction etait totale. La solution a ete directement purifiee par HPLC preparative (gradient L) et a conduit au compose 35d (6,8 mg, 55%) identifie comme Ie compose souhaite. HRMS (ESI+) : calculee pour Ce/H^NnOn [M+2H]2*, m/z 616.8757, trouvee 616.8759. UPLC-MS (gradient I) Tr = 2.97 min. Complexe C4a Dans un ballon de 50 mL Ie compose 35a (31,7 mg, 25 pmol) a ete solubilise dans du TFA (200 pL) pour donner une solution jaune. La solution a ete agitee a TA pendant 30 min. L’avancement de la deprotection a ete suivi par UPLC-MS (gradient I). Apres cette periode, la deprotection etait totale. Le TFA a ete evapore sous pression reduite. Le residu a ete solubilise dans de I'eau (6 mL) et MeCN (1 mL) en ajustant le pH e 7 avec une solution de soude 3 M. Au melange reactionnel sous agitation a ete ajoute le chlorure d'europium(lll) hexahydrate (36,3 mg, 99 pmol) en une seule fois. Le pH a ete ajuste a 7 par ajout de soude 3 M. La solution a ete agitee a TA pendant 5 j. L’avancement de la reaction a ete suivi par UPLC-MS (gradient I). Apres cette periode, la reaction etait totale. La solution a ete directement purifiee par HPLC preparative (gradient M) et a conduit au complexe C4a (15,6mg, 55%) identifie comme le compose souhaite. HRMS (ESI+): calculee pour C44H5aN9O1sS2Eu [M+2H]2*, m/z 579.6028, trouvee 579.6026. UPLC-MS (gradient N), isomere 1 Tr= 1.32 min et isomere 2 Tr= 1.64 min. Complexe C5a: ce complexe a 6te prepare selon la meme procedure que celle utilisee pour la synthese de C4a. Complexe C4b Dans un ballon de 25 mL le compose 35b (8,6 mg, 5,93 pmol) a ete solubilise dans du TFA (130 pL) pour donner une solution jaune. La solution a ete agitee a TA pendant 30 min. L’avancement de la deprotection a ete suivi par UPLC-MS (gradient I). Apres cette periode, la deprotection etait totale. Le TFA a ete evapore sous pression reduite. Le residu a ete solubilise dans du tampon HEPES 50 mM pH 7,4 (2 mL). Au melange reactionnel sous agitation a ete ajoute le chlorure d'europium(lll) hexahydrate (13,03 mg, 36 pmol) en une seule fois. La solution a ete agitee a TA pendant 40 h. L’avancement de la reaction a ete suivi par UPLC-MS (gradient I). Apres cette periode, la reaction etait totale. La solution a ete directement purifiee par HPLC preparative (gradient M) et a conduit au complexe C4b (6,5 mg, 83%) identifie comme le compose souhaite. HRMS (ESI+): calculee pour C54H73N11O15S2Eu [M+3H]3+, m/z 444.1310, trouvee 444.1309. UPLC-MS (gradient \)Tr = 0.34 min. Complexe C5b: ce complexe a ete prepare selon la meme procedure que celle utilisee pour la synthese de C4b. Complexe C4c : ce complexe a ete prepare selon la meme procedure que celle utilisee pour la synthese de C4b. Complexe C5c : ce complexe a ete prepare selon la meme procedure que celle utilisee pour la synthese de C4b. Complexe C4d Dans un ballon de 25 mL le compose 35d (6,8 mg, 5,51 pmol) a 6te solubilise dans du TFA (200 pL) pour donner une solution jaune. La solution a ete agitee e TA pendant 5 h. L’avancement de la5 10 15 20 25 30 35 40 Cft 03007797 2018-06-07 40 WO 2017/098180 PCT/FR2016/053296 deprotection a ete suivi par UPLC-MS (gradient I). Apres cette periode, la deprotection etait totale. Le TFA a ete evapore sous pression reduite. Le residu a ete solubilise dans du tampon HEPES 50 mM pH 7,4 (2 mL). Au melange reactionnel sous agitation a ete ajoute le chlorure d’europium(lll) hexahydrate (12,09 mg, 33 pmol) en une seule fois. La solution a ete agitee e TA pendant 18 h. L’avancement de la reaction a ete suivi par UPLC-MS (gradient I). Apres cette periode, la reaction etait totale. La solution a ete directement purifiee par HPLC preparative (gradient M) et a conduit au complexe C4d (3 mg, 19%) identifie comme le compose souhaite. HRMS (ESI+) : calculee pour Cgt^NnOgEu [M+2H]2+, m/z 557.7048, trouvee 557.7050. UPLC-MS (gradient l)7r = 0.32 min. Complexe C5d : ce complexe a ete prepare selon la meme procedure que celle utilisee pour la synthese de C4b. Complexe C4e: ce complexe a ete prepare selon la meme procedure que celle utilisee pour la synthese de C4b. Complexe C5e: ce complexe a ete prepare selon la meme procedure que celle utilisee pour la synthese de C4b. Compose 37 Le compose 37 a ete prepare selon la procedure decrite dans I'article Chemistry - A European Journal 2008, 14, 1726. L'acide chelidamique monohydrate 5 (3 g, 15 mmol) a ete chauffe & reflux dans EtOH (60 mL) en presence d’acide sulfurique (0,6 mL) a 97% pendant 16 h. Le solvant a ete evapore sous pression reduite, le reside blanc restant a ete neutralise avec une solution aqueuse saturee de bicarbonate de sodium et extrait avec du DCM. La phase organique a ete sechee avec du sulfate de magnesium, 6vaporee a sec et le diester 37 a ete obtenu sous forme d’un solide blanc (2,27 g, 63%). Rf = 0.10 (silice, CH2CI2/MeOH 99/1) ; RMN 1H (CDCI3, 300 MHz) 6 7.31 (s, 2H), 4.46 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 1.42 (t, J = 7.1 Hz, 6H); RMN 13C (DMSO-d6, 62.5 MHz) 5 166.0, 164.3, 149.9, 115.2, 61.4, 14.1. Compose 38 Le compose 38 a ete prepate selon la procedure decrite dans I'article Organic & Biomolecular Chemistry 2012, 10, 9183. A une solution de diethyl chelidamate 37 (0,5 g, 2,09 mmol) dans du THF anhydre (50 mL) ont ete ajoutes sous argon de la triphenylphosphine (1,13 g, 4,31 mmol) et du tert-butyl-(3-hydroxypropyl) carbamate (0,77g, 4,41mmol) dilud dans du THF anhydre (10 mL). Du DIAD (0,83 mL, 4,19 mmol) a ete ensuite ajoute goutte & goutte pendant 10 mln et le milieu reactionnel a ete agite a 70°C pendant 16 h. Le milieu a ete evapore sous pression reduite et le residu visqueux jaune obtenu a 6te purifte par chromatographie flash sur colonne de silice (AcOEt/EP 50/50). Le compose 38 a ete obtenu sous forme d’une poudre blanche (0,82 g, 99%). Rf = 0,23 (silice, AcOEVEP 50/50); RMN 1H (CDCI3, 300 MHz) 6 7.77 (s, 2H), 4.68 (s, 1H), 4.47 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 4.19 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 3.39-3.28 (m, 2H), 2.10-1.99 (m, 2H), 1.45 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 1.43 (s, 9H); RMN 13C (CDCI3, 75 MHz) 6 166.8, 164.7, 156.0, 150.2, 114.3, 79.4, 66.6, 62.4, 37.5, 29.4, 28.4, 14.2. Compose 39 Le compost 39 a ete prepare selon la procedure ddcrite dans I’article Organic & Biomolecular Chemistry 2012, 10, 9183. A une solution de compost 38 (1,70 g, 4,30 mmol) dans EtOH (85 mL)5 10 15 20 25 30 35 40 CA 03007797 2018-06-07 41 WO 2017/098180 PCT/FR2016/053296 a ete ajoute du borohydure de sodium (817 mg, 21,595 mmol) en petites portions. Le milieu reactionnel a ete chauffe a reflux pendant 2 h. Le melange a ete ensuite refroidi a TA et 70 mL d’eau ont ete ajoutes et I’ethanol a ete eliminS par sous pression teduite. La phase aqueuse a ete extraite avec du DCM (4 x 20 mL). La phase organique a ete Iav6e avec une solution saturee de chlorure d’ammonium (20 mL) puis avec de I'eau (20 mL), sechee avec du sulfate de magnesium, et evaporee sous pression reduite. Le compose 39 est alors obtenu sous forme d’un solide blanc (1,02 g, 76%). Rf = 0.30 (silice, CH2CI2/MeOH 90/10); RMN 1H (CDCI3, 300 MHz) 6 6.72 (s, 2H), 4.71 (s, 4H), 4.68 (s, 1H), 4.09 (t, >6.1 Hz, 2H), 3.37-3.23 (m, 2H), 2.77 (s, 2H), 2.07-1.93 (m, 2H), 1.43 (s, 9H); RMN 13C (CDCI3, 75 MHz) 5 166.5, 161.2, 156.3, 105.6, 79.4, 65.7, 64.4, 37.6, 29.4, 28.5. Compose 40 Le compose 40 a ete prepare selon la procedure decrite dans I’article Organic & Biomolecular Chemistry 2012, 10, 9183. A une solution du compose 39 (440 mg, 1,41 mmol) dans un melange THF/eau (1:1,17 mL) S 0°C sous agitation ont et6 ajoute de la soude (338 mg, 8,45 mmol) et une solution de TsCI (1,07 g, 5,64 mmol) dans du THF (23 mL). Le milieu reactionnel a ete agite a TA pendant 16 h, puis ddcante, et la phase aqueuse a ete lavee avec du DCM (10 mL). Les phases organiques rassemblees ont 6te lavees avec une solution aqueuse a 5% de bicarbonate de sodium (10 mL), sechees avec sulfate de magnesium, filtrees et evaporees a sec. Le compose 40 a ete obtenu sous forme d'une poudre blanche (841 mg, 96%). Rf = 0,40 (silice, CH2CI2/MeOH 98/2); RMN 1H (CDCI3, 300 MHz) <5 7.80 (d, J = 8.0 Hz, 4H), 7.33 (d, J = 8.0Hz, 4H), 6.81 (s, 2H), 4.98 (s, 4H), 4.68 (s, 1H), 4.03 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.36-3.23 (m, 2H), 2.44 (s, 6H), 2.06-1.91 (m, 2H), 1.45 (s, 9H); RMN 13C (CDCI3, 75 MHz) 6 166.7, 156.1, 153.3, 145.3, 132.8, 130.1, 128.2, 107.7, 79.6, 71.3, 66.1, 37.6, 29.4, 28.5, 21.8. Compost 41 A une solution du compose 19 (943 mg, 2,98 mmol) dans du DMF anhydre (26 mL) sous argon ont 6te ajoute le carbonate de cdsium (1,01 g, 3,12 mmol) et le compose 40 (844 mg, 1,36 mmol). Le milieu reactionnel a ete agite a TA pendant 40 h, filtre, evapore a sec et le produit brut obtenu a ete purifie par chromatographie sur colonne de silice (CH2CI2 100% puis CH2CI2/AcOEt 90/10) pour conduire au compose 41 sous forme d’une poudre blanche (980 mg, 79%). Rf = 0,58 (silice, CH2CI2/AcOEt 90/10); RMN 1H (CDCI3, 300 MHz) <5 8.11-8.04 (m, 2H), 7.72-7.60 (m, 6H), 6.76 (s, 2H), 4.70 (s, 1H), 4.60 (s, 4H), 4.12 (s, 4H), 4.02-3.92 (m, 2H), 3.35-3.21 (m, 2H), 2.03-1.87 (m, 2H), 1.45 (s, 9H), 1.35 (s, 18H); RMN 13C (CDCI3, 75 MHz) 6 167.4, 166.6, 157.2, 155.9, 147.9, 133.58, 133.55, 131.8, 130.9, 124.1, 107.6, 82.3, 79.4, 65.7, 53.2, 49.1, 37.5, 29.2, 28.4, 27.8; LRMS (ESI+):calculee pour CggHgaNsOisSa [M+H]', m/z 909.30, trouvee 909.30. Compose 42 A une solution de compose di-nosyte 41 (1,12 g, 1,23 mmol) dans MeCN (54 mL) ont ete ajoutes sous agitation du 2-mercaptoethanol (949 pL, 13,574 mmol) et du 1.8-diazabicyclo [5-4-0] unde-7- ene (828 pL, 5,55 mmol). Le melange a ete agite pendant 30 min a TA. Le solvant a ete elimine sous pression teduite puls du DCM (20 mL) a ete ajoute et le melange a ete lavS avec de I’eau (2 x 10 mL), seche avec du sulfate de magnesium, filtre et evapore sous pression reduite. Le produit5 10 15 20 25 30 35 40 CA 03007797 2018-06-07 42 WO 2017/098180 P( T/FR2016/053296 brut obtenu a 6te purifie par chromatographie sur colonne de silice (AcOEt/MeOH 95/5 puis 90/10) pour conduire au compost 42 sous forme d’un solide jaune (523 mg, 79%). Rf = 0,24 (silice, AcOEt/MeOH 90/10); RMN 1H (CDCI3, 300 MHz) 5 6.73 (s, 2H), 4.79-4-75 (m, 1H), 4.04 (t, J = 6 Hz, 2H), 3.84 (s, 4H), 3.73 (s, 2H), 3.34 (s, 4H), 3.31-3.25 (m, 2H), 2.00-1.92 (m, 2H), 1.44 (s, 18H), 1.42 (s, 9H); RMN 13C (CDCI3, 75 MHz) 6 171.4, 166.1, 160.5, 156.0, 106.7, 81.2, 79.3, 65.5, 54.5, 51.2, 37.6, 29.3, 28.4, 28.1; MS (ESI+) calculee pour C27H47N4O7 [M+H]+, m/z 539.3445, trouvee 539.3445. Compose 43 A une solution de compose 12 (945 mg, 0,893 mmol) dans MeCN (447 mL) ont ete ajoutes sous argon Ie compose 42 (480 mg, 0,893 mmol), du carbonate de sodium (947 mg, 8,93 mmol) et de I'iodure de sodium (13 mg, 0,0893 mmol). La suspension a ete agitee a reflux pendant 65 h. Le residu a ete filtre, evapore sous pression reduite et purifie par chromatographie sur colonne d’alumine (DCM 100% jusqu’a DCM/MeOH 95/5 par increment de 1%). Les fractions recuperees, correspondant & un melange de compose sous forme libre et sous forme de complexe de sodium, ont ete ensuite resolubilisees dans un minimum de DCM et lavees plusieurs fois a I’eau. Le compose souhaite 43 a ete obtenu sous forme d’une poudre jaune (690 mg, 62%). R< = 0,33 (alumine, DCM/MeOH 97/3); RMN 1H (CDCI3, 300 MHz) 5 7.40 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 7.24 (d, J= 1.5 Hz, 2H), 7.20 (d, J= 1.5 Hz, 2H), 6.79 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 6.64 (s, 2H), 4.71 (s, 1H), 4.64 (s, 4H), 4.01-3.96 (m, 2H), 3.86-3.83 (m, 12H), 3.81 (s, 6H), 3.39 (s, 6H), 3.17-3.08 (m, 2H), 1.82-1.70 (m, 2H), 1.48 (s, 9H), 1.46 (s, 18H), 1.41 (s, 9H); RMN 13C (CDCI3, 75 MHz) 5 170.5, 168.9, 166.2, 158.5, 158.1, 155.9, 133.4, 131.7, 123.2, 122.9, 115.6, 114.7, 107.9, 92.6, 86.6, 81.2, 81.1, 79.0, 65.8, 65.1, 60.1, 59.8, 59.6, 58.31, 58.28, 52.3, 37.5, 29.6, 28.4, 28.2. MS (ESI+): m/z 626.8 [M+2H]2 +, 42%, 645.8 [M+K+H] z+, 100%), 1252.6 ([M+H] \ 15%); HRMS (ESI+) calculee pour C69H86N7O15 [M+Hf, m/z 1252.6182, trouvee 1252.6194; IR (cm*1): v 3425, 2976, 2931, 2210, 1758, 1733, 1596, 1510, 1367, 1213, 1158. Compose 44 Dans un ballon de 5 mL le compose 43 (27,0 mg, 22 pmol) a ete solubilise dans MeCN (1 mL) pour donner une solution incolore. Au melange reactionnel a ete ajoute de I’hydroxyde de lithium (2,66 mg, 109 pmol) en solution dans de I'eau (500 pL) en une seule fois. La solution a ete agitee a TA pendant 30 min. L’avancement de la reaction a ete suivi par UPLC-MS (gradient I). Apres cette periode, la reaction etait totale. La solution a ete directement purifiee par HPLC preparative (gradient O) et a conduit au compost 44 (22,9 mg, 86%) identifie comme le compose souhaite. HRMS (ESI+): calcutee pour C67H82N7O15 [M+Hf, m/z 1224.5863, trouvee 1224.5867. UPLC-MS (gradient I) Tr = 3.87 min. Compose 45a Dans un ballon de 25 mL le compose 44 (22,90 mg, 19 pmol) a ete solubilise dans du DMSO (1 mL) pour donner une solution incolore. Au melange reactionnel ont ete ajoute la taurine (11,82 mg, 94 pmol), la DIPEA (22 pl, 131 pmol) puis le HATU (29,3 mg, 74,8 pmol) en une seule fois. La solution a ete agitee a TA pendant 2 h. L’avancement de la reaction a ete suivi par UPLC-MS (gradient I). Apres cette periode, la reaction etait totale. La solution a ete directement purifiee par5 10 15 20 25 30 35 40 WO 2017/098180 CA 03007797 2018-06-07 43 PCT/FR2016/053296 HPLC preparative (gradient K) et a conduit au compose 26a (27 mg, 70%) identifie comme Ie compose souhaite. HRMS (ESI+) : calculee pour C/iHgsNgO-jgSa [M+2H]2*, m/z 719.8009, trouvee 719.8011. UPLC-MS (gradient I ) Tr= 3.22 min. Compose 45b : ce compose a ete prepare selon la meme procedure que cede utilises pour la synthese de 45a en selectionnant I’amine correspondante. Compose 45c : ce compost a ete prepare selon la meme procedure que cede utilises pour la synthese de 45a en selectionnant I’amine correspondante. Compose 45c: ce compose a ete prepare selon la meme procedure que cede utilises pour la synthese de 45a en selectionnant I’amine correspondante. Compose 45d : ce compose a ete prepare selon la meme procedure que cede utilises pour la synthese de 45a en selectionnant I’amine correspondante. Complexe C6a : Dans un ballon de 10 mL Ie compose 45a (18,9 mg, 13 pmol) a ete solubilise dans du TFA (200 pL) pour donner une solution jaune. La solution a ete agitee a TA pendant 30 min. L’avancement de la deprotection a ete suivi par UPLC-MS (gradient I). Apres cette periode, la deprotection etait totale. Le TFA a ete eiimine sous pression reduite. Le residu a ete solubilise dans du tampon HEPES 50 mM pH 7,4 (6,2 mL). Au melange reactionnel sous agitation a ete ajoute le chlorure d’europium(lll) hexahydrate (27,5 mg, 75 pmol) en une seule fois. La solution a ete agitee a TA pendant 4 j. L’avancement de la reaction a ete suivi par UPLC-MS (gradient I). Apres cette periode, la reaction etait totale. La solution a 6te directement purifiee par HPLC preparative (gradient M) et a conduit au complexe C6a (0,89 mg, 5%) identifie comme le compose souhaite. HRMS (ESI+): calculee pour C54H58N9O17S2Eu [M+2H]2*, m/z 660.6299, trouvee 660.6299. UPLC-MS (gradient I), isomere 1 Tr= 1,5 min et isomere 2 Tr- 1,55 min. Complexe C7a : ce complexe a ete prepare selon la meme procedure que cells utilises pour la synthese de C6a. Complexe C7a : ce complexe a ete prepare selon la meme procedure que celle utilisee pour la synthese de C6a. Complexe C6b: ce complexe a ete prepare selon la meme procedure que celle utilises pour la synthese de C6a. Complexe C7b : ce complexe a ete prepare selon la meme procedure que celle utilises pour la synthese de C6a. Complexe C6c: ce complexe a ete prepare selon la meme procedure que celle utilisee pour la synthese de C6a. Complexe C6d : ce complexe a ete prepare selon la meme procedure que celle utilisee pour la synthese de C6a. Complexe C7d : ce complexe a ete prepare selon la meme procedure que celle utilises pour la synthese de C6a. Compose 46: disponible commercialement. Compose 47: le compose 47 a ete prepare selon la procedure decrite dans Journal Organic Chemistry 1987, 52, 2029.5 10 15 20 25 30 35 CA 03007797 2018-06-07 44 WO 2017/098180 PCT/FR2016/053296 Compose 48:Ie compose 48 a ete prepare selon la procedure decrite dans EP2216330. Compose 49:Ie compose 49 a ete prepare selon la procedure decrite dans EP2216330 pour un compose analogue. Compose 50:Ie compose 50 a ete prtpart selon la procedure decrite dans EP2216330 pour un compose analogue. Compose 51: ce compose a ete prepare selon la meme procedure que celle utilisee pour la synthese de 15. Compose 52:Ie compost 52 a ete prepare selon la procedure decrite dans Organic Letters 2014, 16, 1290. Compost 53: ce compose a ete prepare selon la meme procedure que celle utilisee pour la synthese de 20. Compose 54: ce compose synthese de 21. a ete prepare selon la meme procedure que celle utilisee pour la Compost 55: ce compose a ete prepart selon la meme procedure que celle utilisee pour la synthese de 23. Compose 56: ce compose synthese de 9. a ete prepare selon la meme procedure que celle utilisee pour la Compose 57: ce compose a ete prtpart selon la meme procedure que celle utilisee pour la synthese de 10. Compose 58: ce compose a ete prtpart selon la mdme procedure que celle utilisee pour la synthese de 12. Compose 59: ce compose synthese de 24. a ete prepare selon la meme procedure que celle utilisee pour la Compost 60: ce compose synthese de 25. a ete prepare selon la m§me procedure que celle utilisee pour la Compost 61a-d: ces composes ont ete prepares selon la mSme procedure que celle utilisee pour la synthase de 26a>d. Complexes C8a-d: ces complexes ont ete prepares selon la meme procedure que celle utilisee pour la synthese de C1a-d. Complexes C9a-d: ces complexes ont ete prepares selon la meme procedure que celle utilisee pour la synthese de C2a>d. Complexes C10a-d: ces complexes ont ete prepares selon la meme procedure que celle utilisee pour la synthese de C3a-d.CA 03007797 2018-06-07 WO 2017/098180 PCT/FR2016/053296 Mesures photo-physiques46 Les proprietes photophysiques de complexes representatifs de I’inverrtion ont ete reportees dans Ie tableau ci-dessous. Tableau 1 : Propri6t6s photo-physiques des complexes a : Chrom = chromophore Complexe Lanthanide (Ln) Nbre Chrom* Groupe soluble Absorption 2max (nm) Brillance ex O (H2O) Duree de vie thjP (ms) Solubilite dans H2O Pyridino¬ phane Eu 0 - 267 564 0.78 oui 62 Eu 3 320 - non 63 Tb 3 - 328 - - non Cla Eu 3 Sulfo 320 5100 0.74 oui Clb Eu 3 SulfobetaTne 320 6000 0.68 oui C1c Eu 3 Sucre 318 6000 0.70 oui C4a Eu 1 Sulfo 320 1400 0.69 oui C4b Eu 1 SulfobetaTne 321 1400 0.73 oui C4d Eu 1 Ammonium 320 1400 0.76 oui Le pyridinophane (art anterieur) de base est soluble dans I’eau (milieux biologiques et tampons) mais le chromophore (pyridine) n’est pas adapte a une excitation entre 310- 350 nm (excitation par lampe flash ou laser £ azote) puisque (’absorption maximale de ce complexe est de 267 nm. L’introduction des chromophores sur ces systemes pyridinophanes sans groupement solubilisant (compose 62, 63) rendent ces complexes compatibles avec les sources d’excitation laser ou flash (absorption 62 et 63 autour de 320-330 nm) mais ces complexes sont insolubles dans I’eau (milieux biologiques et tampons). Cette absence de solubility interdit toute utilisation de 62 et 63 dans un immunoessai de type HTRF. En revanche des que des groupements solubilisants sont introduits sur 62 et 63 correspondants aux complexes de (’invention (examples C1a-c Date Re?ue/Date Received 2023-04-1246a ou C4a-b, C4d) alors ces composes deviennent solubles dans les milieux biologiques et tampon et les complexes peuvent etre utilises dans un immunoessai de type HTRF, en microscopie ou autres applications des sciences de la vie. Breve description des dessins La description qui va suivre d’aspects preferes de (’invention sera mieux comprise en se referant aux dessins suivants : Les figures 1 et 2 montrent les spectres d’absorption et d’emission du complexe C1a. Le spectre d’absorption presente un maximum & 320 nm. Ainsi cette serie de complexes est parfaitement compatible avec une excitation laser et lampe flash. Le spectre d’emission presente un maximum a 620 nm ce qui permet d’avoir un recouvrement optimal avec un accepteur compatible. Date Re?ue/Date Received 2023-04-12

Claims (16)

1. Revendications 1. Un agent complexant de formule (I) dans laquelle : - les groupes Ri sont identiques et representent -CO2H, ou -PO(OH)R, R etant un groupe phenyle, phenyle substitue par un groupe -SO3H, benzyle, methyle, ethyle, propyle, n-butyle, sec-butyle, isobutyle, ou te/t-butyle; - les groupes Ai et A2, identiques ou differents, representent: un groupe de formule -L1-E ; dans laquelle Li et E sont tels que definis ci-apres, un groupe de formule (II) dans laquelle L2 et E sont tels que definis ci-apres, ou un groupe de formule (II’) o-l2-e Date Refue/Date Received 2023-11-2948 o-l2-e och3 O L3-G H3CO' och3 dans laquelle L3 et G sent tels que ci-apres definis, dans laquelle L2 et E sent tels que definis ci-apres; Ie groupe A3 represente : un groupe de formule H3CO' o-l2-e -0-L3-G, dans laquelle L3 et G sont tels que ci-apres definis, un groupe de formule (II) (H) dans laquelle L2 et E sont tels que ci-apres definis, un groupe de formule (II’) (HI) dans laquelle L3 et G sont tels que ci-apres definis, ou un groupe de formule (III’) dans laquelle L2 et E sont tels que ci-apres definis, un groupe de formule (III) o-l3-g Date Refue/Date Received 2023-11-2949 - Li, L2 et h, identiques ou differents, representent un groupe alkylene lineaire ou ramifie en C1-C20, un groupe alkylene lineaire ou ramifie en C1-C20 contenant une ou plusieurs doubles ou triples liaisons; un groupe cycloalkylene en Cs-Cs ou un groupe arylene en Ce-Cu, lesdits groupes alkylene, cycloalkylene ou arylene contenant ou non un ou plusieurs heteroatomes choisis dans Ie groupe constitue par I’oxygene, I’azote, Ie soufre et Ie phosphore, ou un ou plusieurs groupe(s) carbamoyle ou carboxamide, et lesdits groupes alkylene, cycloalkylene ou arylene etant non substitues ou substitues par un ou des groupes alkyle en Ci-Cs, aryle en Ce-Cu, sulfonate ou oxo ; ou representent un groupe de formules: -—(CHjJn—- . —— (CH2)n—0—(CHzIm-O—(CHaJp ; — (CHjJn—O—(CH^J^O— 0 O U u o —(CH^-N-U—^CHaKir HI ° O O o Jl-CCH^S O — N Date Refue/Date Received 2023-11-2950 III H —(CH^-U-N-CCHa^— ; ou 0 u III HN—(CHaJn „„, » ; dans lesquelles n, m, p, q sont des nombres entiers de 1 a 5 ; - E est un groupe qui rend I’agent complexant hydrosoluble, et est choisi dans Ie groupe constitue par -SO3H, -PO(OH)2, -CO2H, -N+AlkiAlk2Alk3, avec Alki, Alk2 et Aiks tels que defini ci-apres, un residu carbohydrate, une sulfobetaTne, et un groupe PEG ; - G est un groupe reactif representant un acrylamide, un ester active, un aldehyde, un halogenure d’alkyle, un anhydride, une aniline, un azide, une aziridine, un acide carboxylique, un diazoalcane, un haloacetamide, une halotriazine, la dichlorotriazine, une hydrazine, un imido ester, un isocyanate, un isothiocyanate, un maleimide, un halogenure de sulfonyle, un thiol, une cetone, une amine, un halogenure d’acide, un ester de succinimidyle, un ester d’hydroxysuccinimidyle, un ester d’hydroxysulfosuccinimidyle, un Date Refue/Date Received 2023-11-2951 azidonitrophenyle, un azidophenyle, un glyoxal, une triazine, un groupe acetylenique, ou representant un groupe de formule: Cl ;dans lesquels w varie de 0 a 8 et v est egal a 0 ou 1, et Ar lorsque present est un heterocycle a 5 ou 6 chainons sature ou insature, comprenant 1 a 3 heteroatomes, non substitue ou substitue par un atome d'halogene ; et - Alki, Alka et Aiks, identiques ou differents, representent un (Ci-Ce)alkyle.
2. 2. L’agent complexant selon la revendication 1, caracterise en ce que Ai et A2 sont identiques et sont un groupe de formule (II) telle que definie a la revendication 1 et A3 est un groupe de formule (III) telle que definie a la revendication 1. Date Refue/Date Received 2023-11-2952
3. 3. L’agent complexant selon la revendication 1, caracterise en ce que Ai est un groupe de formule (II) telle que definie a la revendication 1, A2 est un groupe de formule -L1-E dans laquelle Li et E sont tels que definis a la revendication 1, et A3 est un groupe de formule (III) telle que definie a la revendication 1.
4. 4. L’agent complexant selon la revendication 1, caracterise en ce que Ai et A2 sont identiques et sont des groupes de formule (II) telle que definie a la revendication 1, et A3 est un groupe de formule -O-L3-G dans laquelle L3 et G sont tels que definis a la revendication 1.
5. 5. L’agent complexant selon la revendication 1, caracterise en ce que Ai et A2 sont identiques et sont des groupes de formule -L1-E dans laquelle Li et E sont tels que definis a la revendication 1, et A3 est un groupe de formule (III) telle que definie a la revendication 1.
6. 6. L’agent complexant selon la revendication 1, caracterise en ce que Ai et A2 sont identiques et sont des groupes de formule (II’) telle que definie a la revendication 1, et A3 est un groupe de formule (III’) telle que definie a la revendication 1.
7. 7. L’agent complexant selon la revendication 1, caracterise en ce que Ai est un groupe de formule (II’) telle que definie a la revendication 1, A2 est un groupe de formule -L-E dans laquelle L et E sont tels que definis a la revendication 1, et A3 est un groupe de formule (III’) telle que definie a la revendication 1.
8. 8. L’agent complexant selon la revendication 1, caracterise en ce que Ai et A? sont identiques et sont des groupes de formule (II’) telle que definie a la revendication 1, et A3 est un groupe de formule -O-L3-G dans laquelle L3 et G sont tels que definis a la revendication 1.
9. 9. L’agent complexant selon la revendication 1, caracterise en ce que Ai et A2 sont identiques et sont des groupes de formule -L1-E dans laquelle Li et E sont tels que definis a la revendication 1, et A3 est un groupe de formule (III’) telle que definie a la revendication 1.
10. 10. L’agent complexant selon I’une quelconque des revendications 1 a 9, caracterise en ce que Ie groupe de formule -L3-G, lorsqu’il est present, est constitue (i) d’un Date Refue/Date Received 2023-11-2953 groupement reactif G representant un acide carboxylique, une amine, un ester de succinimidyle, un haloacetamide, une hydrazine, un isothiocyanate, ou un groupe maleimide, et (ii) d’un bras d’espacement L3 constitue d’un groupe alkylene comprenant de 1 a 5 atomes de carbone.
11. 11. L’agent complexant selon I’une quelconque des revendications 1 a 10, caracterise en ce que Li, lorsqu’il est present, est un groupe divalent de formule : o ou n est un nombre entier de 1 a 5.
12. 12. L’agent complexant selon I’une quelconque des revendications 1 a 11, caracterise en ce que L2, lorsqu’il est present, est un groupe divalent de formule : o ou n et m sont des nombres entiers de 1 a 5.
13. 13. L’agent complexant selon I’une quelconque des revendications 1 a 12, caracterise en ce que L3, lorsqu’il est present, est un groupe divalent de formule : (ch2)- ou n est un nombre entier de 1 a 5.
14. 14. Un complexe de lanthanide fluorescent comprenant un agent complexant selon I’une quelconque des revendications 1 a 13, et un lanthanide choisi dans Ie groupe constitue par Eu3+, Sm3+, et Tb3+.
15. 15. Un complexe de lanthanide fluorescent de formule (IV), (V), (VI) ou (VII) suivante : Date Refue/Date Received 2023-11-2954 Date Refue/Date Received 2023-11-2955 dans lesquelles : Ln3* est choisi dans Ie groupe constitue par Eu3+, Tb3+, et Sm3+ ; et R3 est choisi dans Ie groupe constitue par OH ;
16. 16. Un conjugue fluorescent d’une molecule d’interet, ladite molecule d’interet etant un acide amine, un peptide, une proteine, un anticorps, un sucre, une chame Date Refue/Date Received 2023-11-2956 glucidique, un nucleoside, un nucleotide, un oligonucleotide, ou un substrat d’enzyme, ledit conjugue etant obtenu par la mise en contact d’un complexe de lanthanide fluorescent selon la revendication 14, ledit complexe comprenant Ie groupe reactif G, avec ladite molecule d’interet. Date Refue/Date Received 2023-11-29