5 10 15 20 25 30 Date Regue/Date Received 2023-10-02 1 PROCEDE DE PRODUCTION DU CELASTROL ET DE DERIVES TRITERPENIQUES PENTACYCLIQUES La presente invention concerne un procede de production d'un extrait brut enrichi en triterpenes pentacycliques, notamment en Celastrol, a partir d'une culture de cellules vegetales (CCV) en suspension d'une plante de la famille des Celastraceae. Tripterygium wilfordii est une plante medicinale, appartenant a la famille des Celastraceae, utilisee depuis des siecles en Asie du Sud-Est (dont la Chine) pour soigner les troubles inflammatoires, les maladies auto-immunes, et plus recemment Ie cancer. Les terpenes sont parmi les composants les plus actifs de la plante et sont localises majoritairement dans les racines de la plante. Parmi eux, un triterpene pentacyclique de type norfriedelane, Ie Celastrol, est evalue pour son efficacite dans Ie traitement de I'obesite, de I'arthrite rhumatoide, de la maladie de Crohn et du cancer de la prostate. Les besoins en approvisionnement en Celastrol sont done en constante augmentation. La dermatose inflammatoire, notamment Ie psoriasis ou la dermatite atopique, a des origines ou des causes multifactorielles. Les raisons de ces maladies dites auto-immunes ne sont pas encore completement elucidees mais seraient liees a une deregulation du systeme immunitaire notamment au niveau des reponses cellulaires. On peut classer les reponses cellulaires en 3 categories : Th1, Th2 et recemment Th17. Bien que Ie psoriasis et la dermatite atopique presentent des differences au niveau des signes cliniques, elles presenteraient des ressemblances notamment au niveau de I'expression d'IL17 et IL22 caracteristiques de la reponse Th17 (Miyagaki et al. 2015). IL17 et IL22 seraient done des cibles interessantes pour traiter ces maladies. Ainsi des anticorps monoclonaux diriges contre IL17, IL17R, IL22, IL23, TNF alpha ont ete developpes pour bloquer la voie Th17 (Lowes et al. 2014). Ces molecules sont efficaces pour Ie traitement du psoriasis, mais presentent de nombreux effets secondaires et induisent un cout de traitement exorbitant.5 10 15 20 25 30 CA 03023192 2018-11-02 WO 2017/194757 PCT/EP2017/061504 2 Par ailleurs, il est egalement connu que la vole Th17 estfortement activee dans les lesions de patients presentant de I’acne (Kelhala et al. 2014). Le Celastrol est couramment obtenu par des procedes d’extraction vegetale a partir des plantes de la famille de Celastraceae impliquant I’utilisation de solvants. Ces modes de biosynthese impliquent des cycles de huit a dix ans pour qu’une jeune pousse de plante atteigne la maturite necessaire pour etre sacrifiee. En outre, I’utilisation de produits phytosanitaires rend le processus couteux : des contaminants externes (metaux lourds) peuvent s’accumuler et I’extrait brut genere contient de multiples metabolites necessitant plusieurs etapes de purification de cet extrait vegetal afin d’isoler la fraction triterpenique. Par ailleurs, ces procedes ont des rendements faibles en Celastrol. La synthese chimique totale du Celastrol est possible (Camelio etal. 2015) mais necessite une vingtaine d’etapes, ce qui augmente considerablement le cout final d’obtention du produit. Une solution alternative a ete d’obtenir du Celastrol a partir de cultures cellulaires en suspension de cellules souches generees a partir des racines ou desfeuilles de la plante. Recemment, I’equipede Coppede (Coppede etal. 2014) a pu obtenir a partir d’une culture de cellules de M. ilicifolia une quantite de Celastrol superieure a celle obtenue par extraction classique a partir de la plante (0,304 mg de Celastrol par g de matieres seches, concentration maximale obtenue au bout de 8 jours de culture, soit 8,85 fois meilleure que par la methode d’extraction classique). L’equipe de Liu etal. (Liu etal. 2016) a par ailleurs montre qu’en ajoutant du MeJa (jasmonate de methyle) (de I’ordre de 50 pM) dans une culture de cellules vegetales de T. wilfordii, la quantite de Celastrol se trouve augmentee de 4,82 fois par rapport a celle d’une culture sans MeJa : la concentration en mg de Celastrol par g de matiere seche est de 0,752 mg/g (culture avec MeJa) versus 0,154 mg/g (culture sans MeJa). Ces procedes permettent d’obtenir des rendements en Celastrol ameliores. Cependant il existe toujours un veritable besoin de procedes viables economiquement et permettant d’obtenir rapidement du Celastrol en grande quantite.5 10 15 20 25 30 CA 03023192 2018-11-02 WO 2017/194757 PCT/EP2017/061504 3 La presente invention fournit un procede de production d’un extrait brut enrichi en Celastrol a partir de cellules vegetales d’une plante de la famille des Celastraceae. En effet, les inventeurs ont mis au point un procede permettant d’augmenter de maniere surprenante Ie rendement en Celastrol dans la culture de cellules vegetales d’une lignee de T. wilfordii en utilisant et en comparant diverses combinaisons d’eliciteurs. Les inventeurs ont en effet notamment observe que la division cellulaire et la production de Celastrol ne sont pas concomitantes. De maniere surprenante, elles sont meme incompatibles. Pour resoudre ce probleme, les inventeurs ont mis au point un procede comprenant une etape de proliferation cellulaire et une etape d’elicitation avec un cocktail d’agents eliciteurs qui stoppe la division cellulaire. Les inventeurs ont en outre mis en evidence que (’utilisation de couples d’eliciteurs, notamment Ie jasmonate de methyle (MeJa) et la chitine, permet d’obtenir une concentration de 16,6 mg/g de Celastrol par poids sec en fin de culture. Le rendement en Celastrol de cette culture elicitee est alors 22 fois plus eleve par rapport a celui obtenu par Liu et al. (op. cit.). Le rendement par le procede selon I’invention est par ailleurs 57 fois plus eleve que celui obtenu par Coppede et al. (op. cit.) sans elicitation. Le procede selon (’invention permet en outre d’enrichir en derives du Celastrol, notamment de type tripterpene pentacyclique, tels que la Tingenine A (encore appelee Tingenone ou Maytenine), la Tingenine B (encore appelee 22betaHydroxy-tingenone), la Pristimerine et la Tripterygone. Par ailleurs, les inventeurs ont montre de fapon surprenante qu’un extrait brut enrichi en triterpenes pentacycliques obtenu par ce procede inhibe avec un effet dose les interleukines specifiques du Th17 induites dans des cellules TCD4+ humaines. La presente invention concerne done un procede de production d’un extrait brut enrichi en triterpenes pentacycliques comprenant les etapes suivantes : (i) une phase de proliferation de cellules d’une plante de la famille des Celastraceae dans un milieu de proliferation,CA 03023192 2018-11-02 WO 2017/194757 4 PCT/EP2017/061504 (ii) une phase d’elicitation par ajout d’un cocktail d’elicitation a la culture cellulaire obtenue a I’etape (i), ledit cocktail d’elicitation comprenant au moins un eliciteur de type compose monocarboxylique et au moins un eliciteur biotique, et (iii) la preparation d’un extrait brut enrichi en tripterpenes pentacycliques 5 a partir de la culture cellulaire obtenue a I’etape (ii). Par ailleurs, la presente invention concerne un extrait susceptible d’etre obtenu par Ie procede selon I’invention, ainsi que ses utilisations. Par « triterpenes pentacycliques » selon I’invention, on entend les triterpenes pentacycliques naturellement produits par les cellules d’une plante de io la famille des Celastraceae et notamment Ie Celastrol (de formule I), la Tingenine A (encore appelee Tingenone ou Maytenine) (de formule II), la Tingenine B (encore appelee 22beta-Hydroxy-tingenone) (de formule III), la Pristimerine (de formule IV) et la Tripterygone (de formule V), notamment Ie Celastrol, la Tingenine A et la Tingenine B, notamment Ie Celastrol. (I) CELASTROL (IV) PRISTIMERINE5 10 15 20 CA 03023192 2018-11-02 WO 2017/194757 PCT/EP2017/061504 5 (V) TRYPTERYGONE Par « extrait brut enrichi en triterpenes pentacycliques » selon I’invention, on entend un extrait brut enrichi comprenant une quantite de triterpenes pentacycliques au moins 2 fois, notamment au moins 5 fois, notamment au moins 10 fois, notamment entre 10 et 100 fois superieure a celle obtenue par un procede en I’absence d’une phase d’elicitation selon I’invention. Par « extrait brut enrichi en Celastrol » selon (’invention, on entend un extrait brut enrichi comprenant une quantite de Celastrol au moins 2 fois, notamment au moins 5 fois, notamment au moins 10 fois, notamment entre 10 et 60 fois, notamment entre 10 et 20 fois superieure a celle obtenue par un procede en I’absence d’une phase d’elicitation selon I’invention. Par « plante de la famille des Celastraceae » selon I’invention, on entend I’ensemble des plantes appartenant a cette famille, et notamment les plantes du genre Tripterygium, Bhesa, Kokkona, Catha, Euonymus, Orthosphenia, Dicarpellum, Celastrus, Maytenus, Peritassa et Rzedowskia, notamment Tripterygium et Celastrus. Parmi Ie genre Tripterygium, on pourra notamment citer les especes Tripterygium wilfordii, Tripterygium regeli, Tripterygium hypoglaucum ou Tripterygium articulate, notamment Tripterygium wilfordii. Par « cellules d’une plante de la famille des Celastraceae » selon I’invention, on entend les cellules de n’importe quelle partie de la plante : graines, racines, parties aeriennes, et notamment des parties aeriennes. Par « parties aeriennes » selon I’invention, on entend les parties de la plante situees au-dessus du sol, par exemple, les feuilles, les tiges, les petioles et/ou les inflorescences, notamment les feuilles.5 10 15 20 25 CA 03023192 2018-11-02 WO 2017/194757 PCT/EP2017/061504 6 Par « phase de proliferation de cellules d’une plante de la famille des Celastraceae », on entend selon I’invention une phase dans laquelle les cellules d’une plante de la famille des Celastraceae sont en suspension dans un milieu de proliferation et dans des conditions adaptees a leur proliferation. Ces cellules pourront notamment etre obtenues a partir de cals avant leur mise en suspension. Si necessaire, les suspensions cellulaires pourront etre regulierement reensemencees afin de les maintenir dans des conditions de proliferation. Par « cal » selon I’invention, on entend un amas de cellules dedifferenciees, egalement appelees cellules souches ou cellules meristematiques. L’induction de cals pourra etre obtenue par toute methode connue de I’homme du metier. Les cals selon I’invention pourront notamment etre obtenues de la maniere decrite ci-apres. L’induction de cals a partir d’un explant de tissu de partie de plante, notamment une partie aerienne, de la famille des Celastraceae, par exemple de Tripterygium wilfordii, est bien connue de I’homme du metier. L’induction de cals pourra notamment etre realisee par : - obtention d’un explant de tissu de la plante, par exemple un morceau de feuille de taille de 1 cm2 environ, - mise en culture de I’explant sur un milieu de proliferation selon I’invention gelose (par exemple par ajout de 4 a 12 g/L d’agar, par exemple environ 8 g/L d’agar, au milieu de proliferation selon I’invention), - incubation, notamment a I’obscurite, a une temperature d’environ 25-30°C, par exemple a environ 27°C a 28°C.5 10 15 20 25 CA 03023192 2018-11-02 WO 2017/194757 PCT/EP2017/061504 7 Etape (i) : phase de proliferation de cellules L’homme du metier connaissant les cultures de cellules d’une plante de la famille des Celatraceae pourra facilement determiner la composition du milieu de proliferation necessaire a leur proliferation. Preferentiellement, ce milieu de proliferation permettra la proliferation des cellules sous formes dedifferenciees, c’est-a-dire sous formes totipotentes. Le maintien sous forme dedifferenciee pourra notamment etre obtenu par I’utilisation de ratios particuliers cytokinines/auxines dans le milieu de proliferation. Le « milieu de proliferation » selon I’invention pourra notamment comprendre : - au moins un macroelement, notamment choisi parmi NH4NO3, KNO3, CaCl2.2H2O, MgSO4.7H2O, KH2PO4 et un melange de ceux-ci, par exemple a une concentration en macroelements totale comprise entre 1000 et 9000 mg/L, par exemple entre 3000 et 8000 mg/L de milieu de proliferation : lors de la phase de proliferation, la concentration en macroelements totale du milieu de proliferation sera notamment comprise entre 3000 et 5500 mg/L de milieu proliferation ; - au moins un microelement, notamment choisi parmi KI, H3BO3, MnSO4.4H2O, ZnSO4.H2O, Na2MoO4.2H2O, CuSO4.5H2O, CoCI2.6H2O, FeSO4-7H2O, Na2EDTA.2H2O et un melange de ceux-ci, par exemple a une concentration en microelements totale comprise entre 10 et 200 mg/L, notamment entre 50 et 150 mg/L de milieu proliferation ; - au moins une vitamine, notamment choisie parmi le myo-inositol, I’acide nicotinique, la pyridoxine-HCI, la thiamine-HCI et un melange de ceux-ci, par exemple a une concentration en vitamines totale pouvant aller de 0,01 a 3 g/L, notamment de 0,05 a 1 g/L de milieu de proliferation ; - au moins un acide amine, notamment la glycine, par exemple a une concentration en acide amines totale pouvant aller de 0,15 a 5 mg/L, notamment entre 1 et 4 mg/L de milieu de proliferation : lors de la phase de proliferation, la5 10 15 20 25 30 CA 03023192 2018-11-02 WO 2017/194757 PCT/EP2017/061504 8 concentration en acide amines du milieu de proliferation sera notamment comprise entre 1 et 2,5 mg/L de milieu proliferation ; - au moins une source de carbone, notamment du saccharose, par exemple a une concentration totale en source de carbone de 10 a 70 g/L de milieu de proliferation, par exemple a environ 30 g/L ; - au moins une hormone vegetale (encore appelee hormone de croissance vegetale ou facteur de croissance vegetale ou regulateur de croissance vegetale) notamment choisie parmi une ou plusieurs cytokinine, notamment la kinetine et/ou la 6-furfurylaminopurine, une ou plusieurs auxines, notamment I’acide 2,4-dichlorophenoxyacetique (2,4D) et/ou I’acide naphthalene acetique (NAA), et un melange de celles-ci. Lors de la phase de prolferation Ie milieu de proliferation comprendra notamment au moins une cytokinine et au moins une auxine. Les hormones de croissance vegetale seront notamment ajoutees au milieu de proliferation a une concentration et a un ratio permettant la proliferation des cellules sous formes dedifferenciees. Elles seront notamment choisies parmi la kinetine, la 6-furfurylaminopurine, I’acide 2,4-dichlorophenoxyacetique (2,4D), I’acide naphthalene acetique (NAA) et un melange de ceux-ci ; notamment choisies parmi la kinetine, I’acide 2,4-dichlorophenoxyacetique (2,4D), I’acide naphthalene acetique (NAA) et un melange de ceux-ci. II pourra s’agir en particulier d’un melange de kinetine, acide 2,4-dichlorophenoxyacetique (2,4D) et acide naphthalene acetique. La concentration en auxines selon I’invention sera notamment comprise entre 0,001 et 10 mg/L de milieu de proliferation, par exemple entre 0,1 et 3 mg/L de milieu de proliferation. La concentration en cytokinines selon I’invention sera notamment comprise entre 0,01 et 0,5 mg/L de milieu de proliferation, notamment entre 0,05 et 0,15 mg/L. Dans un mode de realisation, Ie ratio hormonal auxines / cytokinines sera compris entre 0,2 a 2,5/0,01 a 0,5, notamment entre 1 a 2/ 0,05 a 0,2 notamment sera d’environ 1,5/0,1.5 10 15 20 25 30 CA 03023192 2018-11-02 WO 2017/194757 PCT/EP2017/061504 9 Notamment Ie milieu de de proliferation selon I’invention pourra comprendre 1,5 mg/L d’auxine, notamment d’acide 2,4-dichlorophenoxyacetique (2,4D) et d’acide naphthalene acetique (NAA), et 0,1 mg/L de cytokinine, notamment de kinetine. Le milieu de proliferation sera sterile et preferentiellement a un pH proche de la neutralite. Un exemple de milieu de proliferation adapte a la proliferation des cellules d’une plante de la famille des Celastraceae selon I’invention est notamment decrit par Murashige & Skoog (1962) ou dans les exemples de la presente demande. Ce milieu de proliferation peut par exemple avoir la composition suivante (les concentrations sont exprimees par rapport au volume de milieu de proliferation sans cellule): Macroelements: NH4NO3 a 1650 mg/L, KNO3 a 1900 mg/L, CaCl2.2H2O a 440 mg/L, MgSO4.7H2O a 370 mg/L, KH2PO4 a 170 mg/L ; Microelements : KI a 0,83 mg/L, H3BO3 a 6,2 mg/L, MnSO4.4H2O a 22,3 mg/L, ZnSO4.H2O a 6,6 mg/L, Na2MoO4.2H2O a 0,25 mg/L, CUSO4.5H2O a 0,025 mg/L, COCI2 6H2O a 0,025 mg/L, FeSO4.7H2O a 27,8 mg/L, Na2EDTA.2H2O a 37,3 mg/L ; Vitamines : myo-inositol a 100 mg/L, acide nicotinique a 0,5 mg/L, pyridoxine-HCI a 0,5 mg/L, thiamine-HCI a 0,5 mg/L ; Acides amines : glycine a 2 mg/L ; Source de carbone : saccharose a 30 g/L ; et Hormones vegetales : acide naphtalene acetique a 1 mg/L, acide 2,4-dichlorophenoxyacetique a 0,5 mg/L, kinetine a 0,1 mg/L, le tout ajuste a pH 6 avant sterilisation (par exemple par autoclavage de 20 min a 121°C ou par filtration sur filtre de 0,2 pm). Alternativement, le milieu de proliferation peut avoir la composition suivante : (les concentrations sont exprimees par rapport au volume de milieu de proliferation sans cellule) : Macroelements : NH4NO3 a 1650 mg/L, KNO3 a 2500 mg/L, CaCI2.2H2O a 440 mg/L, MgSO4.7H2O a 370 mg/L, KH2PO4 a 130 mg/L ; Microelements : KI a 0,41 mg/L, H3BO3 a 6,2 mg/L, MnSO4.4H2O a 22,3 mg/L, ZnSO4.H2O a 7,5 mg/L, Na2MoO4.2H2O a 0,25 mg/L, CuSO4.5H2O a 0,025 mg/L, COCI2.6H2O a 0,025 mg/L, FeSO4.7H2O a 19,85 mg/L, Na2EDTA.2H2O a 26,64 mg/L ; Vitamines : myo-inositol a 50 mg/L, acide5 10 15 20 25 30 CA 03023192 2018-11-02 WO 2017/194757 PCT/EP2017/061504 10 nicotinique a 0,25 mg/L, pyridoxine-HCI a 0,25 mg/L, thiamine-HCI a 0,25 mg/L ; Source de carbone : saccharose a 30 g/L ; et Hormones vegetales : kinetine a 0,083 mg/L, acide 2,4-dichlorophenoxyacetique (2,4D) a 0,575 mg/L, acide naphthalene acetique (NAA) a 0,350 mg/L. Alternativement, Ie milieu de proliferation selon (’invention peut avoir la composition suivante (les concentrations sont exprimees par rapport au volume de milieu de proliferation sans cellule): NH4NO3 a 20 mM, KNO3 a 19 mM, CaCI2.2H2O a 3 mM, MgSO4.7H2O a 1,50 mM, KH2PO4 a 1,2 mM, KI a 0,005 mM, H3BO3 a 0,1 mM, MnSO4.4H2O a 0,1 mM, ZnSO4.H2O a 0,04 mM, Na2MoO4.2H2O a 0,001 mM CuSO4.5H2O a 0,0001 mM, CoCI2.6H2O a 0,0001 mM, FeSO4.7H2O a 0,1 mM, Na2EDTA.2H2O a 0,1 mM, myo-inositol 0,5 mM, acide nicotinique a 0,004 mM, pyridoxine-HCI a 0,002 mM, thiamine-HCI a 0,0015 mM, glycine a 0,03 mM, saccharose a 87,6 mM, acide naphtalene acetique a 0,005 mM, acide 2,4-dichlorophenoxyacetique a 0,002 mM, et kinetine a 0,0005 mM. L’ensemencement du milieu de proliferation pourra etre realise a partir de la mise en suspension de cellules de cals a une concentration comprise entre 20 et 300 g dans 1 L de milieu de proliferation et preferentiellement entre 100 et 200 g dans 1L de milieu de proliferation, par exemple environ 150 g dans 1 L de milieu de proliferation. La phase de proliferation aura lieu dans des conditions de multiplication de la biomasse. Par « conditions de multiplication de la biomasse » selon I’invention, on entend notamment les conditions de temperature, de duree, d’agitation, et de luminosite necessaires a la proliferation des cellules en suspension. L’homme du metier connaissant les cultures de cellules d’une plante de la famille de Celatraceae pourra facilement determiner les conditions de multiplication de la biomasse. Dans un mode de realisation selon I’invention, I’etape de proliferation de la biomasse se fera a I’obscurite, a une temperature comprise entre 20 et 35°C, notamment entre 27 et 28°C, notamment a environ 27 ou 28°C, en particulier sous une agitation comprise entre 100 et 200 rpm,5 10 15 20 25 30 CA 03023192 2018-11-02 WO 2017/194757 PCT/EP2017/061504 11 notamment a environ 125 rpm (orbitale de 22,5 mm) et pendant une duree comprise entre 10 et 30 jours, notamment 15 jours de culture. Au cours de cette etape, les cellules peuvent etre « repiquees » ou propagees, par exemple tous les 7 a 15 jours. Le repiquage des cellules est bien connu par I’homme du metier, il pourra notamment consister a diluer une partie de la culture cellulaire dans du milieu neuf concentre. Par exemple, 1/5®me de la culture est remise en suspension dans un volume de milieu neuf correspondant au volume de la culture initiale. II permet I’entretien de la lignee cellulaire en milieu liquide dans un etat de proliferation. Etaoe (ii) - phase d’elicitation Apres la phase de proliferation, les cellules obtenues dans la phase (i) sont elicitees par ajout d’un cocktail d’elicitation. Le milieu de proliferation auquel a ete ajoute le cocktail d’elicitation sera nomme « milieu d’elicitation » selon la presente invention. La phase d’elicitation est la phase dans laquelle les cellules sont maintenues dans un etat physiologique favorisant la biosynthese de metabolites secondaires tels que les triterpenes pentacycliques. La production de triterpenes pentacycliques, notamment de Celastrol, a lieu, au cours de la phase d’elicitation, dans le cytosol de la cellule et peut diffuser en partie dans le milieu d’elicitation. La phase d’elicitation au sens de la presente invention correspond done a la phase de production (biosynthese) du Celastrol et de ses derives (triterpenes pentacycliques). L’elicitation se fera preferentiellement apres une phase de proliferation de 7 a 21 jours, notamment 12 a 20 jours, notamment 15, 16 ou 17 jours (notamment sans repiquage). Alternativement I’ajout du cocktail d’elicitation pourra se faire lorsque la concentration en cellules obtenue lors de la phase de proliferation est double, notamment superieure au double, par rapport a la concentration initiale en cellules dans le milieu de proliferation. L’ajout du cocktail d’elicitation pourra notamment se faire lorsque la concentration en cellule est superieure a 200 g/L,5 10 15 20 25 30 CA 03023192 2018-11-02 WO 2017/194757 PCT/EP2017/061504 12 par example entre 200 et 400 g/L, notamment environ 300 g/L (en quantite de cellules par litre de milieu de proliferation). Dans un mode de realisation, I’ajout du cocktail d’elicitation se fera dans une culture dont la concentration en cellules est passee de 150 a 200 g/L lors du debut de la phase de proliferation a une concentration comprise entre 300 et 400 g/L lors de la fin de la phase de proliferation. A la suite de la phase de proliferation, les cellules vegetales ont consomme la plupart des, voire tous les elements contenus dans Ie milieu de proliferation, et en particulier les sources de carbone telles que Ie saccharose. II peut done etre necessaire de retablir la composition du milieu avant ou en meme temps que I’ajout du cocktail d’elicitation. Pour retablir la composition du milieu, on peut notamment concentrer la culture cellulaire obtenue apres I’etape de proliferation, par example par decantation ou filtration puis ajouter du milieu de proliferation neuf aux cellules ainsi obtenues. Dans ce cas, les cellules seront re-suspendues dans Ie milieu de proliferation neuf de maniere a obtenir une concentration comprise entre 200 g/L et 400 g/L, par exemple entre 250 et 350 g/L, notamment d’environ 300 g/L (en quantite de cellules par litre de milieu de proliferation). Alternativement, on peut ajouter dans la culture cellulaire un melange concentre permettant de retablir les concentrations des elements du milieu de proliferation. Le melange concentre sera notamment ajoute juste avant, juste apres ou en meme temps que le cocktail d’elicitation. Par exemple on peut remplacer 1/5®me de la culture cellulaire par un volume equivalent du milieu de proliferation concentre 5 fois. On considere que la concentration en elements du milieu de proliferation est proche ou equivalente a zero apres 14, 15 ou 16 jours de phase de proliferation. En particulier on considere que la concentration en elements mineraux (plus particulierement les macroelements et les microelements) et carbones (plus particulierement les sources de carbone) est proche de ou equivalente a zero apres 14, 15 ou 16 jours de phase de proliferation.5 10 15 20 25 CA 03023192 2018-11-02 WO 2017/194757 PCT/EP2017/061504 13 Dans un mode de realisation, Ie milieu de proliferation selon I’invention au debut de la phase d’elicitation comprendra entre autres : - au moins un macroelement, notamment choisi parmi NH4NO3, KNO3, CaCl2.2H2O, MgSO4.7H2O, KH2PO4 et un melange de ceux-ci, par exemple a une concentration de macroelements totale comprise entre 5000 et 8000 mg/L, preferentiellement superieure a 6000 mg/L de milieu de proliferation, avantageusement entre 6000 et 8000 mg/L ; - au moins un microelement, notamment choisi parmi KI, H3BO3, MnSO4.4H2O, ZnSO4.H2O, Na2MoO4.2H2O, CuSO4.5H2O, CoCI2.6H2O, FeSO4.7H2O, Na2EDTA.2H2O et un melange de ceux-ci, par exemple a une concentration en microelements totale comprise entre 10 et 200 mg/L, notamment entre 50 et 150 mg/L de milieu proliferation ; - au moins une vitamine, notamment choisie parmi Ie myo-inositol, I’acide nicotinique, la pyridoxine-HCI, la thiamine-HCI et un melange de ceux-ci, par exemple a une concentration en vitamines totale pouvant aller de 0,01 a 3 g/L, notamment de 0,05 a 1 g/L de milieu de proliferation ; - au moins un acide amine, notamment la glycine, par exemple a une concentration dans Ie milieu de proliferation comprise entre 3 et 4 mg/L de milieu de proliferation ; - au moins une source de carbone, notamment du saccharose, par exemple a une concentration totale en source de carbone de 10 a 70 g/L de milieu de proliferation, par exemple a environ 30 g/L ; Dans un mode de realisation Ie milieu de proliferation au debut de la phase d’elicitation ne comprendra pas, ou comprendra une quantite negligeable, notamment moins de 0,001 g/ml, de cytokinine et d’auxine. Le milieu de proliferation lors de la phase d’elicitation sera avantageusement sterile et preferentiellement a un pH proche de la neutralite. Le milieu de proliferation lors de la phase d’elicitation pourra notamment avoir la composition suivante : Macroelements : NH4NO3 a 2,8 g/L, KNO3 a 3 g/L,5 10 15 20 25 30 CA 03023192 2018-11-02 WO 2017/194757 PCT/EP2017/061504 14 CaCI2.2H2O a 0,45 g/L, MgSO4.7H2O a 74 mg/L, KH2PO4 a 34 mg/L ; Microelements : KI a 0,16 mg/L, H3BO3 a 6.2 mg/L, MnSO4.4H2O a 18,5 mg/L, ZnSO4.H2O a 6,6 mg/L, Na2MoO4.2H2O a 0,25 mg/L, CuSO4.5H2O a 0,025 mg/L, CoCI2.6H2O a 0,025 mg/L, FeSO4.7H2O a 28 mg/L, Na2EDTA.2H2O a 37 mg/L ; Vitamines : myo-inositol a 250 mg/L, acide nicotinique a 1,7 mg/L, pyridoxine-HCI a 1 mg/L, thiamine-HCI a 1 mg/L ; Acide amine : glycine a 4 mg/L ; Source de carbone : saccharose a 30 g/L. Par « cocktail d’elicitation » selon I’invention, on entend un cocktail permettant de stopper la division cellulaire. Ce cocktail d’elicitation comprend au moins un eliciteur de type compose monocarboxylique et au moins un eliciteur biotique. Le cocktail d’elicitation est introduit, par exemple, a I’aide de solutions meres concentrees dans le milieu de culture. Par « eliciteur de type compose monocarboxylique » selon [’invention, on entend plus particulierement un eliciteur choisi dans le groupe comprenant, de preference constitue par, I’acide 5-chloro salicylique (5-Chloro SA), I’acide salicylique (SA), I’acide acetyl-salicylique (ASA), un ester de methyle, notamment le jasmonate de methyle (MeJa), et un melange de ceux-ci. Dans un mode de realisation selon I’invention, l’eliciteur de type compose monocarboxylique est le jasmonate de methyle, I’acide salicylique et/ou I’acide 5-chloro salicylique, notamment le jasmonate de methyle. L’eliciteur de type compose monocarboxylique sera notamment ajoute de fagon a obtenir une concentration finale comprise entre 0,005 et 0,1 g/L, notamment 0,01 et 0,05 g/L de milieu d’elicitation, notamment de 0,002 et 0,004 g/L de milieu d’elicitation. Par « eliciteur biotique » selon I’invention, on entend plus particulierement un eliciteur biotique choisi dans le groupe comprenant, de preference constitue par, une N-acetylaminoglucosamine, notamment la chitine, le chitosan, les extraits de microorganismes ou de champignons, les oligosaccharides (polysaccharides, pectines, cellulose). Dans un mode de realisation, l’eliciteur biotique est la chitine. La chitine est un polymere lineaire de motif repetitif : beta- 1,4 N-acetyl D-glucosamine. L’eliciteur biotique sera notamment ajoute de fagon a obtenir une concentration finale comprise entre 0,05 et 50 g/L de milieu5 10 15 20 25 30 CA 03023192 2018-11-02 WO 2017/194757 PCT/EP2017/061504 15 d’elicitation, parexemple de 0,1 a 10 g/L, par exemple de 0,5 a 7 g/L, notamment de 1 a 5 g/L de milieu de d’elicitation. Dans un mode de realisation, Ie cocktail d’elicitation comprend du jasmonate de methyle, notamment a une concentration finale dans Ie milieu d’elicitation entre 0,002 et 0,005 g/L, et de la chitine, notamment a une concentration finale entre 1 et 4 g/L de milieu d’elicitation. Dans un mode de realisation, Ie cocktail d’elicitation selon I’invention comprendra en outre, au moins un facteur de differenciation cellulaire des cellules vegetales et/ou au moins un precurseur de la voie de synthese des terpenes. Le « facteur de differenciation cellulaire des cellules vegetales » selon I’invention pourra notamment etre choisi dans le groupe comprenant, de preference constitue par, une cytokinine, notamment la benzyl-aminopurine (BAP), I’acide abscissique, la kinetine, le thidiazuron, la 6-y,y-dimethylallylaminopurine (2iP ou isopentenyladenine) ou la zeatine, une gibberelline et un melange de celles-ci, notamment la BAP et/ou la 2iP, en particulier la 2iP. Le « precurseur de synthese des terpenes » selon (’invention pourra notamment etre choisi dans le groupe comprenant, de preference constitue par, le pyruvate de sodium ; le pyrophosphate de potassium ; I’acide mevalonique ; le geraniol ; le farnesol ; I’isopentenyle, le dimethylallyle, y compris leurs formes pyrophosphatees ; I’acetate de sodium ; I’acide pyruvique et leurs melanges, notamment le geraniol, le farnesol, le pyruvate de sodium, le pyrophosphate de potassium et leurs melanges, tel que le pyruvate de sodium et/ou le pyrophosphate de potassium. La BAP pourra notamment etre utilisee a une concentration finale dans le milieu d’elicitation comprise entre 0,01 et 5 mg/L, parexemple entre 0,5 et 5 mg/L de milieu d’elicitation. L’acide 5-chloro salicylique (5-Chloro SA) pourra notamment etre utilise a une concentration finale dans le milieu d’elicitation comprise entre 0,1 et 15 mg/L.5 10 15 20 25 CA 03023192 2018-11-02 WO 2017/194757 PCT/EP2017/061504 16 L’acide salicylique pourra notamment etre utilise a une concentration finale dans Ie milieu d’elicitation comprise entre 0,1 et 100 mg/L, par exemple entre 20 et 60 mg/L, par exemple environ 45 mg/L. Le farnesol pourra notamment etre utilise a une concentration finale dans Ie milieu d’elicitation de 1 a 100 mg/L, par exemple de 15 a 30 mg/L, par exemple a environ 30 mg/L. Le geraniol pourra notamment etre utilise a une concentration finale dans le milieu d’elicitation de 1 a 100 mg/L, par exemple de 20 a 30 mg/L. Le pyruvate de sodium pourra notamment etre utilise a une concentration finale dans le milieu d’elicitation de 100 a 5000 mg/L, par exemple de 500 a 2000 mg/L. Le pyrophosphate de potassium pourra notamment etre utilise a une concentration finale dans le milieu d’elicitation de 1 a 2000 mg/L, par exemple de 100 a 1000 mg/L de milieu d’elicitation. La 2iP pourra notamment etre utilisee a une concentration finale dans le milieu d’elicitation de 0,005 a 10mg/L, par exemple de 0,01 mg/L a 3 mg/L, par exemple de 0,1 a 2 mg/L. Dans un mode de realisation selon I’invention, le cocktail d’elicitation comprend du jasmonate de methyle, de la chitine, du pyruvate de sodium, du pyrophosphate de potassium ou un melange de ceux-ci. Dans un mode de realisation selon I’invention, le cocktail d’elicitation comprend du jasmonate de methyle, de la chitine, du pyruvate de sodium, du pyrophosphate de potassium, et eventuellement de la BAP et/ou de la 2iP. Dans un mode de realisation selon I’invention, le cocktail d’elicitation comprend ou consiste en (les concentrations donnees entre parentheses correspondent a la concentration dans le milieu d’elicitation, le cocktail initial pouvant etre plus ou moins concentre en fonction de la dilution envisagee) du pyruvate de sodium (de 500 a 2000 mg/L), du pyrophosphate de potassium (de5 10 15 20 25 30 CA 03023192 2018-11-02 WO 2017/194757 PCT/EP2017/061504 17 100 a 1000 mg/L), de la 2iP (de 0,1 a 2 mg/L), du jasmonate de methyle (de 0,002 a 0,005 g/L) et de la chitine (de 1 a 4 g/L). Dans un autre mode de realisation, Ie cocktail d’elicitation comprend ou consiste en (les concentrations donnees entre parentheses correspondent a la concentration dans Ie milieu d’elicitation, Ie cocktail initial pouvant etre plus ou moins concentre en fonction de la dilution envisagee) de la benzyl-aminopurine (BAP) (de 0,5 a 5 mg/L, notamment de 0,5 a 3 mg/L) ; de I’acide 5-chloro salicylique (5-Chloro SA) (de 2 a 6 mg/L, notamment de 3 a 5 mg/L, par exemple a environ 3 ou a environ 5 mg/L), de I’acide acetyl-salicylique (ASA) et/ou de I’acide salicylique (SA) (de 20 a 60 mg/L, notamment de 30 a 50 mg/L, notamment de 33 a 45 mg/L) ; du jasmonate de methyle (MeJA) (de 0,002 a 0,005 g/L, notamment de 10 a 40 mg/L) ; de la chitine (de 1 a 4 g/L) ; et du farnesol (F-OH) (de 19 a 40 mg/L) et/ou du geraniol (de 20 a 30 mg/L). Dans un autre mode de realisation Ie cocktail d’elicitation comprend ou consiste en (les concentrations donnees entre parentheses correspondent a la concentration dans Ie milieu d’elicitation, Ie cocktail initial pouvant etre plus ou moins concentre en fonction de la dilution envisagee) du pyruvate de sodium (de 500 a 2000 mg/L), du pyrophosphate de potassium (de 100 a 1000 mg/L), de la 2iP (de 0,1 a 1 mg/L), du jasmonate de methyle (MeJA) (de 0,002 a 0,005 g/L, notamment de 10 a 40 mg/L) et de la chitine (de 1 a 4 g/L). Dans un autre mode de realisation Ie cocktail d’elicitation comprend ou consiste en (les concentrations donnees entre parentheses correspondent a la concentration dans Ie milieu d’elicitation, Ie cocktail pouvant etre plus ou moins concentre en fonction de la dilution envisagee) du pyruvate de sodium (environ 1,5 g/L), du pyrophosphate de potassium (environ 0,4 g/L), du 2iP (environ 0,4 mg/L), du jasmonate de methyle (MeJA) (environ 0,03 mg/L), de la chitine (environ 2 g/L). Pendant la phase d’elicitation, apres ajout du cocktail d’elicitation, la culture est maintenue sous agitation, notamment entre 50 et 200 rpm, notamment a environ 125 rpm, pendant une periode comprise entre 3 et 30 jours, notamment entre 10 et 25 jours, notamment de 12 a 15 jours, en particulier a une temperature5 10 15 20 25 30 CA 03023192 2018-11-02 WO 2017/194757 PCT/EP2017/061504 18 comprise entre 20 et 35°C, notamment a environ 27°C et avantageusement avec un taux d’oxygene dissout dans Ie milieu de culture de 2 a 40 %, preferentiellement a environ 16 %. Un apport en air sterile suffisamment enrichi en oxygene pourra etre fourni si necessaire notamment dans Ie volume mort du bioreacteur ou par diffusion dans Ie milieu. De preference, la phase d’elicitation (iii) est menee a I’obscurite. Lors de la phase d’elicitation, la culture cellulaire n’est preferentiellement pas repiquee. Etaoe (iii) - phase de preparation de I’extrait brut enrichi en tripteroenes pentacycliques Apres la phase d’elicitation, Ie procede selon (’invention comprend une etape de preparation d’un extrait brut enrichi en tripterpenes pentacycliques, notamment Ie Celastrol. L’extrait brut enrichi pourra notamment etre obtenu par separation de la biomasse etdu surnageant de culture. La separation pourra notamment etre faite par filtration directe (0-50 pm), par centrifugation ou par decantation des cellules. Dans un mode de realisation, l’extrait brut enrichi selon I’invention pourra consister en Ie surnageant de culture ainsi recuperee. L’extrait brut enrichi selon (’invention pourra egalement etre obtenu apres la lyse de la biomasse. Par exemple, les cellules contenues dans la biomasse recuperee pourront etre lysees par une methode physique (sonication ou broyage) ou chimique (lyse acide) puis ce lysat sera soumis a une extraction par solvant. La phase organique, comprenant notamment les triterpenes issus du cytosol, est ensuite recuperee, notamment par decantation ou centrifugation. Le solvant sera notamment un solvant de type ester, et plus particuliere un acetate d’alkyle, I’alkyle etant plus particulierement lineaire ou ramifie a 1 a 6 atomes de carbone, notamment I’acetate d’ethyle ou I’acetate d’isopropyle. Le volume de solvant utilise sera notamment de 2 volumes par poids de biomasse. Preferentiellement, l’extrait brut enrichi selon I’invention correspondra a la phase organique ainsi recuperee.5 10 15 20 25 CA 03023192 2018-11-02 WO 2017/194757 PCT/EP2017/061504 19 Altemativement, I’extrait brut enrichi selon I’invention pourra etre obtenu apres evaporation du solvant et sa substitution notamment par un support adapte au domaine d’utilisation de I’extrait (cosmetique, pharmaceutique) et notamment les huiles vegetales. L’extrait brut enrichi selon I’invention n’est pas purifie. L’extrait enrichi brut pourra eventuellement etre purifie en une etape ulterieure. Lorsque l’extrait brut enrichi est purifie, pour donner un extrait purifie, Ie procede selon I’invention comprend en outre une etape (iv) d’obtention d’un extrait purifie d’un ou plusieurs triterpenes pentacycliques a partir de l’extrait enrichi brut obtenu a I’etape (iii). L’extrait purifie selon I’invention comprendra alors plus de 90 %, notamment plus de 95 %, notamment plus de 98 % d’un ou plusieurs triterpenes pentacycliques selon I’invention. Dans un mode de realisation l’extrait purifie selon I’invention comprend plus de 90 %, notamment plus de 95 %, notamment plus de 98 % de Celastrol, notamment 100 % de Celastrol. La purification de l’extrait enrichi selon I’invention pourra notamment etre realisee par une phase de separation du ou des triterpenes pentacycliques, notamment Ie Celastrol, la Tingenine A et la Tingenine B, notamment par fractionnement HPLC (chromatographie liquide a haute performance), en particulier les pics a 426 nm comprenant Ie Celastrol, la Tingenine A et la Tingenine B sortent respectivement a 10,5 min, 8,2 min et 6,5 min. La purification du Celastrol pourra notamment etre effectuee comme decrit dans les exemples de la presente demande. La presente invention porte, en outre, sur un extrait enrichi brut susceptible d’etre obtenu par Ie procede selon I’invention. Un autre objet de I’invention concerne une composition pharmaceutique, telle que dermatologique, ou dermocosmetique comprenant un extrait enrichi brut susceptible d’etre obtenu par Ie procede selon I’invention et un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement ou dermocosmetiquement acceptables.5 10 15 20 25 CA 03023192 2018-11-02 WO 2017/194757 PCT/EP2017/061504 20 Les excipients pharmaceutiquement ou dermocosmetiquement acceptables peuvent etre tout excipient parmi ceux connus de I'homme de I'art. La composition selon I’invention sera notamment une composition topique, notamment sous forme de creme, d'une lotion, d'un gel, d'une pommade, d'une emulsion, d'une microemulsion, d'un spray, etc. La composition pharmaceutique, telle que dermatologique, ou dermocosmetique selon I’invention peut en particulier contenir des additifs et aides a la formulation, tels que des emulsionnants, des epaississants, des gelifiants, des fixateurs d’eau, des agents d’etalement, des stabilisants, des colorants, des parfums et des conservateurs. Un autre objet selon I’invention est un extrait enrichi brut obtenu par Ie procede selon I’invention, pour son utilisation en tant que medicament, notamment dans Ie traitement ou la prevention d’une dermatose inflammatoire induisant une reponse cellulaire mediee par TH17. L’homme du metier pourra facilement determiner les dermatoses inflammatoires induisant une reponse cellulaire mediee par TH17. L’homme du metier pourra notamment mesurer Ie niveau d’expression d’IL-22, d’IL-17 et/ou de TNF-a d’une zone lesee par rapport a un echantillon temoin. La dermatose inflammatoire selon I’invention pourra notamment etre selectionnee dans Ie groupe comprenant, de preference constitue par, Ie psoriasis, la dermatite atopique et I’acne. La presente invention est illustree par les figures et exemples non limitatifs detailles ci-apres. FIGURES : FIGURE 1 : Courbe de croissance (trait continu) d’une culture de cellule de Trypterigium wilfordii en g/L de biomasse humide (FW) en fonction du temps en jours et concentration en Celastrol (trait en pointille) en mg de Celastrol par L de suspension cellulaire en fonction du temps en jours.5 10 15 20 25 CA 03023192 2018-11-02 WO 2017/194757 PCT/EP2017/061504 21 FIGURE 2 : Chromatogramme HPLC (A =426 nm) de I’extrait brut enrichi de Tripterygium wilfordii obtenu a J33. FIGURE 3 : Pourcentage d’induction de la synthese d’IL-17A par des lymphocytes T CD4+ apres incubation avec les echantillons 2, 3, 4 et 5 par rapport au temoin negatif incube avec I’echantillon 1 suivie d’une stimulation avec des anticorps anti-CD3 et anti-CD28 (*** valeur p<0,001). FIGURE 4 : Pourcentage d’induction de la synthese d’INF-Y par des lymphocytes T CD4+ apres incubation avec les echantillons 2, 3, 4 et 5 par rapport au temoin negatif incube avec I’echantillon 1 suivie d’une stimulation avec des anticorps anti-CD3 et anti-CD28 (*** valeur p<0,001). FIGURE 5 : Pourcentage d’induction de la synthese d’IL-22 par des lymphocytes T CD4+ apres incubation avec les echantillons 2, 3, 4 et 5 par rapport au temoin negatif incube avec I’echantillon 1 suivie d’une stimulation avec des anticorps anti-CD3 et anti-CD28 (*** valeur p<0,001). FIGURE 6 : Pourcentage d’induction de la synthese de TNF-a par des lymphocytes T CD4+ apres incubation avec les echantillons 2, 3, 4 et 5 par rapport au temoin negatif incube avec I’echantillon 1 suivie d’une stimulation avec des anticorps anti-CD3 et anti-CD28 (*** valeur p<0,001). FIGURE 7 : Pourcentage d’induction de la synthese d’IL-6 par des lymphocytes T CD4+ apres incubation avec les echantillons 2, 3, 4 et 5 par rapport au temoin negatif incube avec I’echantillon 1 suivie d’une stimulation avec des anticorps anti-CD3 et anti-CD28 (*** valeur p<0,001). EXEMPLES : Example 1 : Protocole de dedifferenciation cellulaire Les cals sont obtenues a partir d’explants de feuilles de Tripterygium wilfordii.5 10 15 20 25 CA 03023192 2018-11-02 WO 2017/194757 PCT/EP2017/061504 22 Les explants sont sterilises a I’ethanol a 70 % puis a I’hypochlorite de sodium a 2,5 % de chlore actif, puis rinces a I’eau demineralisee sterile. Optionnellement, un lavage avec du peroxyde d’hydrogene a 7 % avant Ie ringage par I’eau demineralisee sterile est possible. Les feuilles sont decoupees en morceaux, par exemple en carres d’environ 8-10 mm de cote. Les explants foliaires sont deposes sur un milieu gelose de proliferation. La composition du milieu de proliferation est la suivante : Macroelements : NH4NO3 a 1650 mg/L, KNO3 a 1900 mg/L, CaCI2.2H2O a 440 mg/L, MgSO4.7H2O a 370 mg/L, KH2PO4 a 170 mg/L, Microelements : KI a 0,83 mg/L, H3BO3 a 6,2 mg/L, MnSO4.4H2O a 22,3 mg/L, ZnSO4.H2O a 6,61 mg/L, Na2MoO4.2H2O a 0,25 mg/L, CuSO4.5H2O a 0,025 mg/L, CoCI2.6H2O a 0,025 mg/L, FeSO4.7H2O a 27,8 mg/L, Na2EDTA.2H2O a 37,3 mg/L, Vitamines : myo-inositol a 100 mg/L, acide nicotinique a 0,5 mg/L, pyridoxine-HCI a 0,5 mg/L, thiamine-HCI a 0,5 mg/L, Acide amine : glycine a 2 g/L, Source de carbone : saccharose a 30 g/L, Hormones vegetales : kinetine a 0,1 mg/L, acide 2,4-dichloro-phenoxyacetique (2,4D) a 0,5 mg/L, acide naphthalene acetique (NAA) a 1 mg/L. Le milieu de proliferation est gelifie par addition d’agar a 8-12 g/L, son pH est ajuste a pH 6 ± 0,5 (avec du KOH, 1M) avant un autoclavage de 20 min a 121°C. Les boTtes de petri contenant les explants sont incubees a I’obscurite a 27-28°C. Le repiquage des cals est realise tous les mois sur le meme milieu gelose. Pour cela les cals obtenues sont detachees de I’explant foliaire et deposees sur de nouvelles geloses de milieu de proliferation.5 10 15 20 25 CA 03023192 2018-11-02 WO 2017/194757 PCT/EP2017/061504 23 Exemple 2 : Formulation des milieux de culture et de propagation (phase de proliferation) Apres quelques mois de repiquage, des cals friables sont obtenues et sont transferees dans du milieu de proliferation liquide. Le milieu de proliferation a, par exemple, la composition indiquee cidessous : Macroelements : NH4NO3 a 1650 mg/L, KNO3 a 2500 mg/L, CaCI2.2H2O a 440 mg/L, MgSO4.7H2O a 370 mg/L, KH2PO4 a 130 mg/L, Microelements : KI a 0,41 mg/L, H3BO3 a 6,2 mg/L, MnSO4.4H2O a 22,3 mg/L, ZnSO4.H2O a 7,5 mg/L, Na2MoO4.2H2O a 0,25 mg/L, CuSO4.5H2O a 0,025 mg/L, CoCI2.6H2O a 0,025 mg/L, FeSO4.7H2O a 19,85 mg/L, Na2EDTA.2H2O a 26,64 mg/L, Vitamines : myo-inositol a 50 mg/L, acide nicotinique a 0,25 mg/L, pyridoxine-HCI a 0,25 mg/L, thiamine-HCI a 0,25 mg/L, Sources de carbone : saccharose a 30 g/L, Hormones vegetales : kinetine a 0,083 mg/L, acide 2,4-dichloro-phenoxyacetique (2,4D) a 0,575 mg/L, acide naphthalene acetique (NAA) a 0,350 mg/L. Le pH du milieu est ajuste a pH 6 ± 0,5 (par ajout de KOH, 1M) avant un traitement de sterilisation approprie, par exemple autoclave a 121°C pour une duree minimale de 20 minutes ou par filtration sterilisante sur 0,2 pm. La mise en suspension cellulaire est realisee en deposant environ 40 g de cals friables dans un Erlenmeyer de 200 ml contenant le milieu de propagation, incubation pendant une semaine sur une table d’agitation a 100 RPM (rotation par minute) a I’obscurite a 27-28°C. Le surnageant cellulaire est recoIte a la pipette laissant les amas de cals residuels. La suspension cellulaire obtenue est cultivee pendant 15 jours puis propagee par dilution au 1/5®me dans du nouveau milieu tous les 15 jours.5 10 15 20 25 CA 03023192 2018-11-02 WO 2017/194757 PCT/EP2017/061504 24 Le taux de remplissage des Erlenmeyers est de 40 % (80 mL) et Ie taux d’inoculation par transfert de suspension cellulaire est de 20-25 % du volume, soit environ 160 g/L de biomasse frafche. La culture est menee ainsi pendant 15 jours a I’obscurite a 27-28°C sous agitation orbitale de 110-120 RPM. A ce stade la biomasse est presente a une concentration de 300 g/L environ de biomasse fraTche par litre de suspension. Exemple 3 : Production de Triterpenes en Erlenmeyer (phase d’elicitation et de preparation de I’extrait brut enrichi). Phase d’elicitation : Apres les 15 jours de culture, 1/5®me de la culture cellulaire est retiree de I’Erlenmeyer et 20 mL d’un milieu de proliferation concentre est ajoute dans I’Erlenmeyer. La composition du milieu concentre est la suivante : Macroelements : NH4NO3 a 13,9 g/L, KNO3 a 15,2 g/L, CaCl2.2H2O a 2,2 g/L, MgSO4.7H2O a 370 mg/L, KH2PO4 a 170 mg/L ; Microelements : KI a 0,83 mg/L, H3BO3 a 31,2 mg/L, MnSO4.4H2O a 91,5 mg/L, ZnSO4.H2O a 33,05 mg/L, Na2MoO4.2H2O a 1,25 mg/L, CuSO4.5H2O a 0,125 mg/L, COCI2.6H2O a 0,125 mg/L, FeSO4.7H2O a 139 mg/L, Na2EDTA.2H2O a 186,5 mg/L ; Vitamines : myo-inositol a 1250 mg/L, acide nicotinique a 8,5 mg/L, pyridoxine-HCI a 5 mg/L, thiamine-HCI a 5 mg/L ; Acide amine : glycine a 20 mg/L ; Source de carbone : saccharose a 150 g/L (solubilise dans de I’eau demineralisee). Le cocktail d’elicitation est ensuite ajoute dans I’Erlenmeyer au milieu de proliferation a I’aide de solutions meres realisees dans du dimethylsulfoxyde. La composition du cocktail eliciteur permet d’obtenir les concentrations suivantes dans le milieu d’elicitation (+ cellules): pyruvate de sodium 1,5 g/L, pyrophosphate de potassium 0,440 g/L, 2iP 0,0004 g/L, jasmonate de methyle 0,036 g/L et chitine 2 g/L. La production de Celastrol et ses derives est menee pendant 12 jours a I’obscurite a 27-28°C sous agitation orbitale de 120 rpm.5 10 15 20 25 CA 03023192 2018-11-02 WO 2017/194757 PCT/EP2017/061504 25 RecoIte de la biomasse pour extraction : A I’arret de la culture, on filtre Ie milieu pour recuperer la totalite de la biomasse qui contient la majorite de Celastrol. Apres separation de la biomasse par filtration 0-50 pm, 2 volumes de solvant de type ester et plus particulierement acetate d’alkyle, notamment I’acetate d’ethyle (on encore I’acetate d’isopropyle), sont melanges a 1 poids de biomasse. Ce melange est soumis a une extraction par sonication permettant de lyser les cellules et rendre disponible les elements du cytosol. La phase organique comprenant la fraction triterpenique est recuperee apres centrifugation du melange. La concentration en Celastrol dans la phase organique est mesuree. La concentration en Celastrol par litre de suspension est estimee a 553 mg, ce qui correspond a un poids de 0,0166 g de Celastrol par gramme en poids sec de cellules. Exemple 4 : Production de Triterpenes (Celastrol et derives) en bioreacteurs en poches a usage unique de type WAVE L’exemple illustre est decrit pour des reacteurs de type WAVE, par exemple, de marque Sartorius, pour des volumes de 5 L ou 10 L ou 2 X 5 L, mais la methode peut etre adaptee et appliquee a des volumes superieurs et a des materiels issus d’autres fabricants. Le systeme binaire decrit precedemment pour des bioreacteurs traditionnels de laboratoire en verre ou industriel en inox est applique de la meme maniere avec les 2 poches WAVE. Proliferation : Le bioreacteur Wave A (5 L), place sur son support, est rempli du milieu de proliferation par filtration sterilisante en ligne et gonfle par de I’air.5 10 15 20 25 CA 03023192 2018-11-02 WO 2017/194757 PCT/EP2017/061504 26 Une pre-culture de Trypterygium wilforddi est realisee pendant 15 jours en Erlenmeyer comme decrit a I’exemple 2. Le milieu de proliferation du bioreacteur est ensuite ensemence par cette pre-culture a une concentration de 160 g/L (poche A). Le bioreacteur est incube selon les conditions suivantes : - angle de basculement : 5-8° ; - frequence de basculement : 16-30 RPM ; - debit d’aeration : 0,1-0,5 L/mn d’air enrichi a 50 % en oxygene pur ; - temperature : 27°C ; - duree : 17 jours. Lors de cette phase de proliferation la croissance des cellules est mesuree tous les jours (Figure 1). Elicitation et Production de Triterpenes (Celastrol et derives) : Un volume d’environ 1000 ml de culture de la poche A (5 L) est transfere dans la poche B placee a cote de la poche A sur le meme plateau. Le milieu de la poche A est complemente par 1000 mL de milieu concentre dans de I’eau demineralisee ayant la composition suivante : Macroelements :NH4NO3 a 13,9 g/L, KNO3 a 15,2 g/L, CaCI2.2H2O a 2,2 g/L, MgSO4.7H2O a 370 mg/L, KH2PO4 a 170 mg/L; Microelements: KI a 0,83 mg/L, H3BO3 a 31,2 mg/L, MnSO4.4H2O a 91,5 mg/L, ZnSO4.H2O a 33,05 mg/L, Na2MoO4.2H2O a 1,25 mg/L, CuSO4.5H2O a 0,125 mg/L, CoCI2.6H2O a 0,125 mg/L, FeSO4.7H2O a 139 mg/L, Na2EDTA.2H2O a 186,5 mg/L; Vitamines : myo-inositol a 1250 mg/L, acide nicotinique a 8,5 mg/L, pyridoxine-HCI a 5 mg/L, thiamine-HCI a 5 mg/L ; Acide amine : glycine a 20 mg/L ; Source de carbone : saccharose a 150 g/L ; auquel on ajoute le cocktail d’elicitation suivant : pyruvate de sodium 7,5 g/L, pyrophosphate de potassium 2,2 g/L, 2iP 0,002 g/L, jasmonate de methyle 1,8 g/L et chitine 10 g/L.5 10 15 20 25 CA 03023192 2018-11-02 WO 2017/194757 PCT/EP2017/061504 27 Le contend de la poche A est ainsi elicite sous agitation a une temperature de 27°C. La culture en phase d’elicitation est suivie par la mesure de la croissance cellulaire et de la concentration en Celastrol dans la culture pendant 16 jours (Figure 1). On peut constater que la concentration de Celastrol dans la poche A augmente regulierement jusqu’a J32 et est a son maximum a 553 mg par litre de milieu d’elicitation apres 15 jours d’incubation. La vitesse de production du Celastrol est d’environ 46 mg/L de suspension cellulaire et par jour durant les 15 jours apres elicitation et ce jusqu’a J32. La cinetique de production de Celastrol commence a s’inflechir peu de temps apres avoir consomme la quasi-totalite du saccharose disponible (Figure 1). Exemple 5 : Production d’un extrait enrichi en Celastrol par extraction solide/liquide de la biomasse issue de suspension cellulaire de Tripterygium wilfordii (TW08) A 15 jours apres elicitation (32 jours apres inoculation), la majorite de la biomasse est recuperee par filtration de la suspension cellulaire avec un filtre nylon (20- 50 pM) (TW08). A partir de 5 L de suspension, on recupere environ 1925 g de biomasse. Cette biomasse est extraite avec de I’acetate d’ethyle (on encore de I’acetate d’isopropyle) en proportion 2 : 1 (Vol : Poids) par rapport au poids de biomasse (ici 3850 mL de solvant pour 1925 g de biomasse). Le melange biomasse/solvant est alors soumis a une extraction physique, par sonication. La phase organique est alors recuperee apres maceration sous agitation. L’ajout de solvant (suivi d’une maceration sous agitation et la recuperation de la phase organique) est repete 2 fois.5 10 15 20 25 CA 03023192 2018-11-02 WO 2017/194757 PCT/EP2017/061504 28 La concentration en Celastrol et derives dans la phase organique est mesuree par dosage HPLC (quantification Celastrol, derives de Tingenine) (voir Figure 2) Conditions experimentales : Colonne Waters Atlantis dC18 4,6x150 mm - 5p equipee d’une colonne de garde Atlantis dC18 5 pm 4,6 x 20 mm Gd Column -5p. Phases mobiles : (A) Acetate d’ammonium 0,1 mM pH 4,0 (B) Acetate d’ammonium 0,1 mM pH 4,0 dans acetonitrile 99,8 %. Gradient: initial 25 %(A)/75 %(B) - 20 min 0 %(A)/100 %(B) - 24,5 min 0 %(A)/100 %(B) - 25 min 25 %(A)/75 %(B) - 30 min 25 %(A)/75 %(B). Debit : 1 mL/mn. Detection a 426 nm : pics de retention (min) : Tingenine B (6,5), Tingenine A (8,2), Celastrol (10,5). Exemple 6 : Purification du Celastrol a partir de la culture de Tripterygium wilfordii A partir de I’extrait obtenu a I’exemple 5, I’acetate d’ethyle (ou I’acetate d’isopropyle) est evapore sous pression reduite afin d’obtenir un extrait sec. Une partie de I’extrait ainsi obtenu est purifie dans un premier temps par chromatographie liquide moyenne pression (CLMP) sur silice (40 g, 125 x 25 mm, 30 pm) avec un gradient d’elution CH2Cl2/MeOH (100/0 a 0/100). Toutes les fractions obtenues sont analysees par Chromatographie sur Couche Mince (CCM - Phase stationnaire : Silice 60 A ; Phase mobile : toluene I acetate d’ethyle / acide acetique 70 : 33 : 3) et les fractions contenant majoritairement Ie Celastrol et ses derives Tingenine (A et B) sont rassemblees. Dans un deuxieme temps, la fraction contenant les produits d’interets (Celastrol et derives) est purifiee par chromatographie liquide haute performance (HPLC) sur phase inverse (Lichrospher 100RP18, 250 x25 mm, 5 pM) avec un gradient lineaire Eau/Acetonitrile/0,1 % acide formique (80/20 a 0/100). Le pic du Celastrol est collecte et concentre sous pression reduite, on obtient environ 2,5 a 3 g de Celastrol a partir de 5 L de suspension de culture de depart. Eventuellement, il peut etre cristallise pour avoir une purete absolue.5 10 15 20 25 30 Date Regue/Date Received 2023-10-02 29 En parallele, une partie de I'extrait sec obtenu est repris dans un tampon pourdonner I'extrait R003034 qui sera evalue en activite pharmacologique antiTh17. Exemple 7 : Activite anti-Th17 sur cellules CD4+ humaines de I'extrait CCV enrichi en Celastrol. Dans les dermatoses inflammatoires (notamment dans Ie psoriasis), il est connu que les cellules T CD4+ surexpriment les interleukines IL17, IL6 et IL22, ainsi que I'lFN gamma et Ie TNF alpha. Dans Ie cas de la dermatite atopique, IL17 est surexprime dans une certaine phase de la pathologie. En outre, la voie Th17 est fortement activee en cas d'acne. Le pouvoir inhibiteur d'un extrait enrichi selon I'invention sur la surexpression de ces molecules a ete teste. Les cellules CD4+ humaines ont ete isolees a partir des cellules mononucleees du sang de 2 donneurs sur Ficoll Paque plus® selon le protocole preconise par le fabricant (GE Healthcare). Les lymphocytes CD4+ sont isoIes partri positif par le kit Miltenyi Biotec™ (CD4) et une colonne LS column et sont remis en suspension dans un milieu de culture RPMI (Sigma-Aldrich : contenant de la L-glutamine et 10% de serum foetal bovin) complete avec 100 g/ml de streptomycine et 100 U/ml de penicilline. Les lymphocytes en suspension sont repartis dans des puits de microplaques. Differents extraits ou controles sont ensuite ajoutes dans les puits : 1. controle negatif (le meme volume de tampon sans reactif est ajoute) ; 2. extrait R003034 a 0,06 mg/ml (titre en Celastrol a 9 ng/ml) (concentration finale dans le puits) ; 3. extrait R003034 a 0,2 mg/ml (titre en Celastrol a 30 ng/ml) (concentration finale dans le puits) ; 4. extrait R003034 a 0,6 mg/ml (titre en Celastrol a 90 ng/ml) (concentration finale dans le puits) ;5 10 15 20 25 CA 03023192 2018-11-02 WO 2017/194757 PCT/EP2017/061504 30 5. dexamethasone a 2 pM (controle positif) (concentration finale dans Ie puits). Apres 2 heures d’incubation a temperature ambiante, les lymphocytes CD4+ sont actives a 37°C pendant 20 heures avec des anticorps anti-CD3 et anti-CD28 a une concentration finale respective de 300 ng/ml et de 400 ng/ml. Les anticorps anti-CD3 et anti-CD28 sont connus pour induire une reponse de type Th17. Les cytokines IL-17A, INF gamma, IL-22, TNF alpha et IL-6 ont ete quantifiees dans Ie surnageant de chaque tube par la methode de Multiplex Immunoassays (Jager et al. 2003). Les resultats obtenus sont issus de 2 experiences avec des lymphocytes provenant de 2 donneurs differents. Les resultats sont presentes en Figures 3 a 7 en pourcentage d’induction par rapport au temoin negatif (1). On constate que : Ie controle positif 5 (Ie dexamethasone (2 pM)) inhibe la surexpression de toutes les cytokines : IL-17A, INF gamma, IL-22, TNF alpha et IL-6 ; I’extrait selon I’invention (2, 3 et 4) inhibe fortement la surexpression des cytokines IL-17A, INF gamma, IL-22, TNF alpha et IL-6. L’inhibition de la surexpression d’IL-17A et TNF alpha est dose-dependante. Des la plus faible dose, titree a 9 ng/ml en Celastrol, on constate une inhibition de la surexpression de I1L-17A de 75 %, une inhibition de la surexpression du TNF alpha de 80 % et une inhibition presque totale de la surexpression de I’lNF-gamma, de l’IL-22 et de I’IL-6. Ceci demontre que I’extrait R003034 a une activite anti-Th17 tres forte, comparable sinon superieure a la dexamethasone (2 pM), ce qui lui confere une activite remarquable dans Ie traitement de pathologies Th17-dependantes comme Ie psoriasis, I’acne et la dermatite atopique.5 10 15 20 25 CA 03023192 2018-11-02 WO 2017/194757 PCT/EP2017/061504 31 Exemple 8 : Comparaison des rendements en celastrol obtenus a partir de cultures de cellules vegetales de Tripterygium wilfordii. Dix cultures en erlenmeyer (volume = 50 mL) ont ete realisees en parallele, a partir d’une meme lignee cellulaire de Tripterygium wilfordii, en duplicata dans les memes conditions d’agitation, d’aeration et de temperature. Des la fin de la phase de croissance, la densite de la suspension etant maximale, la quantite de biomasse fraiche pesee etait equivalente fpoids en moyenne de 340 g de biomasse fraTche/L) dans chacun des erlenmeyers. A cet instant, les eliciteurs ont ete ajoutes dans Ie milieu de culture des dix erlenmeyers aux concentrations indiquees dans Ie tableau ci-dessous, dans lequel Ie rendement est exprime en mg de Celastrol/kg de biomasse fraiche. Examples de reference Exemples impliquant I’utilisation d’un cocktail de 2 eliciteurs Erlen E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 MeJa (pM) 0 0 64 36 36 64 64 64 92 92 Chitine (g/L) 0 2 0 2 4,2 1,3 2,5 3,7 3,1 4,2 Rendement 4 ,5 55 738 1730 2178 1506 1724 2025 1986 1878 Le dosage du Celastrol en suspension a ete realise par HPLC selon I’exemple 5, une courbe d’etalonnage ayant ete realisee avec des produits temoins. Les suspensions contenues dans les erlenmeyers notes E1, E2, E3, ont ete elicitees avec une solution temoin ne comportant aucun eliciteur pour El, avec la chitine seule (2 g/L) pour E2 et avec le MeJa seul (64 pM) pour E3. La concentration en MeJa dans E3 est equivalente a celle decrite par Liu et al. 2016, c’est-a-dire 64pM. Les suspensions contenues dans les erlenmeyers notes E4 a E10 ont ete elicitees a trois concentrations differentes en MeJa (36, 64 et 92pM) et cinq concentrations differentes en Chitine (1,3 ; 2 ; 2,5 ; 3,1 et 4,2 g/L). II est constate que les rendements en Celastrol obtenus pour E6, E7 et E8 sont augmentes respectivement de 204 %, 233 % et 274 % par rapport a E3, la concentration en MeJa etant la meme dans ces quatre erlens. Un rendement5 10 15 20 25 CA 03023192 2018-11-02 WO 2017/194757 PCT/EP2017/061504 32 encore meilleur est observe pour E5, dans lequel la concentration en MeJa est differente. Exemple 9 : Activite inhibitrice vis-a-vis de NFkB Le facteur de transcription NFkB controle I’expression d’un grand nombre de genes impliques dans la regulation de la reponse inflammatoire. A I’etat inactif, NFkB est sequestre dans le cytoplasme par la proteine IKB. Certains stimuli proinflammatoires tels que le TNF alpha et l’IL-1 beta conduisent a I’activation de NFkB, c’est-a-dire a sa translocation nucleaire. Une fois dans le noyau, NFkB va induire la transcription de genes pro-inflammatoires codant des cytokines, des chemokines, des molecules d’adhesion, des facteurs de croissance et des enzymes inductibles. Les activites anti-inflammatoires des extraits obtenus a partir des suspensions contenues dans les erlenmeyers E1, E2, E3 et E6 de I’exemple 8 ont ete evaluees in vitro sur des keratinocytes humains HaCat selon la methode decrite par Albanesi el al. Les extraits peses en poids sec ont ete repris dans un tampon et introduits dans une solution de culture de cellules HaCat en concentrations finales equivalentes (ng/mL) pour chaque extrait, et ont ete incubes pendant 1 h. L’expression de NFkB est ensuite induite par stimulation avec TNF alpha (0,3 ng/mL). Dex : Dexamethasone ; Cone. : concentration (ng/mL) ; %inh : % d’inhibition de I’expression de NFkB par rapport a I’induction de TNF alpha ; sem : erreur standard moyenne. TNF alpha Dex Extrait issu de E1 Extrait issu de E2 Extrait issu de E3 Extrait issu de E6 Cone. 0,3 2 pM 0,19 0,58 0,19 0,58 0,19 0,58 0,19 0,58 % inh. 0 42,5 -1 -9 -7 2 3 1 20 68 sem 4 6 2 3 3 3 2 3 3 4 La dexamethasone a 2pM, utilisee comme controle positif, inhibe de plus de 40 % I’expression de NFkB.5 10 15 20 25 30 CA 03023192 2018-11-02 WO 2017/194757 PCT/EP2017/061504 33 L’extrait selon la presente invention (obtenu a partir de E6, avec Ie couple d’eliciteurs MeJa et chitine) evalue aux concentrations de 0,19 et 0,58 ng/mL inhibe respectivement de 20 % et 70 % I’expression de NFkB. L’extrait prepare selon Liu et al. (a partir de E3, avec MeJa comme seul eliciteur) evalue aux memes concentrations n’induit aucune inhibition notable de I’expression de NFkB. De meme, les extraits issus de E2 (avec la chitine comme unique eliciteur) et du temoin E1 n’ont aucun effet sur I’expression de NFkB. Seul l’extrait issu de culture elicitee selon la presente invention inhibe fortement NFkB, et de maniere concentration-dependante. Exemple 10 : Activite antimicrobienne vis-a-vis de Propionibacterium acnes d’un extrait prepare selon Ie procede de la presente invention comparee a cede d’autres composes L’activite est evaluee sur la souche Propionibacterium acnes (CIP53117T), avec une suspension d’inoculation a 108 UFC/mL. Le milieu d’entretien est compose de gelose Columbia + 5% de sang de mouton, avec une incubation durant 24h a 36 ± 1 °C sous anaerobiose. Le milieu d’essai est compose de bouillon Mueller Hinton + 10 % de serum de veau foetal (SVF) et gelose Columbia, + 5 % de sang de mouton, avec une incubation durant 24 h a 36 ± 1 °C sous anaerobiose. La determination des concentrations minimales inhibitrices (CMI) est realisee par micromethode en milieu liquide. 100 pL de milieu de culture liquide sont deposes dans chaque puits d’une microplaque sterile 96 puits. 100 pL du produit a tester sont deposes dans le premier puits d’une ligne. Des dilutions de raison 2 sont ensuite realisees des puits 1 a 10. Les suspensions-test de Propionibacterium acnes sont preparees extemporanement dans du Tryptone sei. 100 pL sont deposes dans chaque puits d’une seconde microplaque, a I’exception de la colonne 11. L’ensemble de la premiere microplaque est inocule, a I’aide d’un ensemenceur multipoint Denley, a partir de la seconde microplaque. Apres incubation, les CMI sont definies comme la plus grande dilution avec absence de croissance visible. Les colonnes 11 et 125 10 15 20 CA 03023192 2018-11-02 WO 2017/194757 PCT/EP2017/061504 34 servent respectivement de temoin negatif et positif de croissance. Deux references ont ete testees en parallele. La determination des concentrations minimales bactericides (CMB) est realisee par repiquage des microplaques de CMI sur milieu gelose, a I’aide de I’ensemenceur multipoint Denley. Apres incubation, la CMB est definie comme la plus grande dilution avec absence de croissance visible. Tous les essais sont realises en duplicate. Les composes testes sont : - Ie celastrol purifie dans Ie DMSO, (solution mere =150 pg/mL I 10 % DMSO) - I’extrait prepare selon Ie procede de la presente invention dans Ie pentylene glycol, (solution mere = 2 % / 2 % pentylene glycol) - la Tingenine A dansIe DMSO, (solution mere = 150 pg/mL /10% DMSO) - la Tingenine B dans Ie DMSO, (solution mere = 150 pg/mL /10% DMSO) - les references sont I’amoxicilline, Ie DMSO (solution mere = 100 %), et Ie pentylene glycol (solution mere = 2 %) Les resultats obtenus sont resumes dans Ie tableau ci-dessous, qui indique les valeurs de CMI et CMB pour les 4 echantillons et les deux excipients. La concentration maximale d’essai correspond a la concentration de la solution mere / 2. : soit 0,375 pg/mL en equivalent celastrol. Composes CMI (pg/mL) CMB (pg/mL) Celastrol 0,59 1,17 DMSO 5 5 Extrait selon Ie procede 0,25* 0,25* Pentylene glycol >1 >1 Tingenine A 2,34 2,34 Tingenine B 1,17 1,17 En conclusion, Ie celastrol presente une activite antibacterienne sur Propionibacterium acnes tout a fait interessante, mais il apparait que c’est I’extrait prepare selon Ie procede de I’invention qui presente Ie niveau d’activite antibacterienne sur Propionibacterium acnes Ie plus important. La Tingenine B5 10 15 20 CA 03023192 2018-11-02 WO 2017/194757 PCT/EP2017/061504 35 presente une activite antibacterienne superieure a celle observee avec la Tingenine A. Exemple 11 : Activite antimicrobienne vis-a-vis de Staphylococcus aureus d’un extrait prepare selon Ie procede de la presente invention comparee a celle d’autres composes II est connu que Ie S. aureus est un pathogene qui colonise les lesions des patients atteints de la dermatite atopique, et est egalement present chez les patients atteints de psoriasis (Tomi et al. 2005). L’activite antibacterienne contre Ie S. aureus de I’extrait obtenu selon Ie procede de la presente invention a ete evaluee. L’experience a ete realisee comme decrit dans I’exemple 10, avec la souche pathogenique S. aureus CIP 4.83, Ie milieu d’entretien Gelose Trypticase-Soja, Ie milieu d’essai CMI/CMB bouillon et gelose Mueller Hinton et une incubation a 36°C pendant 24 h. Les resultats obtenus sont resumes dans Ie tableau ci-dessous. On constate que si Ie Celastrol a une forte activite antibacterienne, l’activite anti-S. aureus de I’extrait obtenu selon Ie procede de la presente invention titre en equivalent en Celastrol est encore meilleure. Par ailleurs, la molecule Tingenine B a une meilleure activite que la Tingenine A. Composes CMI (pg/mL) CMB (pg/mL) Celastrol 0,29 0,59 DMSO >5 >5 Extrait selon Ie procede 0,125* 0,25** Pentylene glycol >1 >1 Tingenine A 1,17-2,34 2,34 Tingenine B 0,59 1,17 * 0,1875 pg/mL en equivalent celastrol ; ** 0.375 pg/mL en equivalent celastrol. En conclusion, cet extrait possede non seulement une activite pharmacologique anti-Th17 interessante, mais de maniere surprenante uneCA 03023192 2018-11-02 WO 2017/194757 36 PCT/EP2017/061504 forte activite anti-S. aureus, ce qui Ie rend tres attrayant comme actif dans Ie traitement topique de la dermatite atopique et du psoriasis. Exemple 12 : Creme pour application topique Produits Pourcentage massique glycerine 8 a 10 % copolymere d’hydroxyacrylate 1,8 a 2 % gomme xanthane 0,1 a 0,3 % ceteareth 33 et alcool cetearylique 4 a 6 % stearate de glyceryle 1,5 a 2 % palmitate d’ethylhexyle 12 a 15% extrait de Tripterygium wilfordii (en solution ;10 a 600 mg/L) 0,1 a 2,0 % acide glycolique 2 a 4 % Lactamide MEA 3 a 6 % Laureth-9 1 a 3 % sulfonate d’huile de schiste sodique 1 a 3 % extrait de racine de chicoree 1 a 3 % Eau completee a 100 % L’extrait de Tripterygium wilfordii est prepare selon la presente invention, sa concentration etant exprimee en poids d’extrait sec dans un solvant compatible avec la formulation, tel que I’huile d’olive, Ie pentylene glycol ou Ie myritol 318 ou autres. io Cet exemple de formulation n’est en aucun caslimitatif, et peut etre adapte selon Ie traitement. Ainsi, pour Ie traitement du cuir chevelu, un shampoing pourra etre formule en faisant appel aux connaissances de I’homme de I’art.CA 03023192 2018-11-02 WO 2017/194757 37 PCT/EP2017/061504 REFERENCES : Camelio et al. JACS 2015, 137:11864-67 Coppede et al. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 2014, 118:33-43 Jager et al. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2003, 10(1):133-9 5 Kelhala et al. PLOS One 2014, 9(8):e105238 Liu etal. J. Asian Nat. Prod. Res. 2016, 19:1-10 Lowes et al. Annu. Rev. Immunol. 2014, 32:227 Miyagaki etal. J. Derm. Science 2015, 78:89 Murashige & Skoog Physiol. Plant. 1962, 15: 473-497 io Albanesi el al. Curr. Drug Targets Inflamm. Allergy 2005, 4(3):329-334 Tomi etal. J. Am. Acad. Dermatol. 2005, 53(1):67-72.