1 COMPOSITION DE PROTEINES DE POIS A QUALITE NUTRITIONNELLE AMELIOREE DOMAINE DE L'INVENTION La presente invention a pour objet une composition de proteines de pois dont la qualite nutritionnelle, en particulier son PDCAAS, est amelioree, son procede de preparation ainsi que 1'utilisation de cette composition dans une composition alimentaire ou pharmaceutique ART ANTERIEUR Les besoins quotidiens de proteines sont compris entre 12 et 20% de la ration alimentaire. Ces proteines sont fournies aussi bien par des produits d'origine animate (viandes, poissons, oeufs, produits laitiers) que par des aliments vegetaux (cereales, legumineuses, algues). Cependant, dans les pays industrialises, les apports en proteines sont majoritairement sous la forme de proteines d'origine animate. Or, de nombreuses etudes demontrent qu'une consommation excessive de proteines d'origine animate au detriment des proteines vegetates est une des causes d'augmentation de cancers et maladies cardio-vasculaires. Par ailleurs, les proteines animates presentent beaucoup de desavantages, tant sur le plan de leur allergenicite, concernant notamment les proteines issues du lait ou des oeufs, que sur le plan environnemental en relation avec les mefaits de 1'elevage intensif. Ainsi, il existe une demande croissante des industriels pour des proteines d'origine vegetate possedant des proprietes nutritionnelles et fonctionnelles interessantes sans pour autant presenter les inconvenients des composes d'origine animate. Depuis les annees 70, le pois est la legumineuse a graines qui s'est le plus developpee en Europe et majoritairement en France, notamment comme ressource proteique pour 1'alimentation animate mais aussi humaine. Le pois contient environ 27 % en poids de proteines. Le terme « pois » est ici considere dans son acception la plus large et inclut en particulier toutes les varietes sauvages de « pois5 10 15 20 25 30 CA 03077637 2020-04-01 2 lisse » (« smooth pea »), et toutes les varietes mutantes de « pois lisse » et de « pois ride » (« wrinkled pea »), et ce quelles que soient les utilisations auxquelles on destine generalement lesdites varietes (alimentation humaine, nutrition animale et/ou autres utilisations). Malgre leurs qualites indeniables, les proteines du pois souffrent d'un pouvoir nutritionnel en dega des proteines animales et de soja. En effet, plusieurs etudes ont demontre que leur PDCAAS est inferieur a 1 (voir par exemple « Aliments a base de soja - source de proteines de haute qualite », ENSA, Aout 2015). Le PDCAAS, ou score en acides amines corrige de la digestibilite des proteines, sert a evaluer la qualite des proteines en fonction de deux criteres : les besoins en acides amines essentiels de 1'homme et la digestibilite des proteines. Depuis 1989, 1'OMS et la FAO conseillent d'utiliser cette methode pour determiner la qualite des proteines. Il est admis qu'une proteine parfaite d'un point de vue nutritionnel doit y obtenir un score de 1 (ou 100% selon 1'expression du resultat). De nombreux travaux et etudes ont essaye de pallier a cette lacune de la proteine de pois. Le PDCAAS inferieur a 1 est du en partie au moins a la presence de facteurs antinutritionnels coextraits avec la proteine de pois. On peut citer, par exemple les facteurs anti-trypsiques qui, en inhibant la trypsine digestive, perturbent la digestion de la proteine. La Demanderesse a done developpe un procede de preparation d'une composition de proteines de pois comprenant majoritairement des globulines et ayant une faible teneur en facteurs antinutritionnels (voir WO2007017572). Le PDCAAS de cette composition est nettement ameliore en atteignant une valeur de 93% (ou 0,93) (voir « Vegetable Protein : A winner ? », C.Lefranc-Millot, 2014). Afin d'atteindre la valeur PDCAAS de 1, une solution bien connue consiste a ajouter a cette composition un melange de proteines extraites du ble (voir toujours dans « Vegetable Protein : A winner ? », C.Lefranc-Millot, 2014). Cette solution elegante presente neanmoins plusieurs desavantages, tels5 10 15 20 25 30 CA 03077637 2020-04-01 3 que la necessite d'enchainer plusieurs etapes afin d'obtenir la proteine desiree et 1'utilisation de proteines de ble susceptibles de contenir des traces de gluten. Il existe done toujours un besoin non satisfait d'une proteine extraite uniquement du pois dont la qualite nutritionnelle est equivalente a celles des proteines animales. Il est du merite de la Demanderesse d'avoir entrepris des travaux pour repondre a ces besoins et d'avoir elabore la presente invention. En particulier, la Demanderesse a mis au point une composition ayant un PDCAAS de 1 comprenant uniquement des proteines extraites du pois en melangeant la composition proteique de la demande WO2007017572 avec un extrait de pois riche en albumines. Cette solution n'aurait pas ete contemplee par 1'homme du metier car les extraits de pois riches en albumines presentent egalement une forte teneur en facteurs anti-trypsiques. Les facteurs antitrypsiques sont des albumines de faible poids moleculaire, de 8 a 10 kDa, qui sont capables de se lier de maniere irreversible aux sites actifs de la trypsine. Ils empechent ainsi 1'hydrolyse gastrointestinale des proteines ingerees par les proteases et diminuent done la digestibilite des proteines et leur PDCAAS. En parvenant a abaisser la teneur en facteurs anti-trypsiques d'extraits de pois riches en albumines et en les combinant a des extraits de pois riches en globulines, la Demanderesse a pu obtenir une composition de proteines de pois ayant une excellente qualite nutritionnelle. DESCRIPTION DETAILLEE Un premier objet de la presente invention est une composition de proteines de pois comprenant des globulines et des albumines caracterisee en ce que 1'extrait sec de la composition : comprend au moins 80% en poids, de preferences de 80 a 99% en poids, plus preferentiellement de 85 a 98% en poids, de 90 a 97% en poids, de 92 a 95% en poids de proteines par rapport au poids de 1'extrait sec ;5 10 15 20 25 30 CA 03077637 2020-04-01 4 - presente un ratio massique des globulines sur les albumines de 65/35 a 85/15, de preference de 70/30 a 82/18, plus preferentiellement de 75/25 a 80/20. Un second objet de la presente invention est un procede de preparation d'une composition de proteines de pois comprenant les etapes suivantes : a) extraire les globulines et les albumines du pois pour obtenir une fraction proteique ; b) separer les globulines des albumines pour obtenir une fraction enrichie en globulines et une fraction enrichie en albumines ; c) reduire la teneur en facteurs anti-trypsiques de la fraction enrichie en albumines pour obtenir une fraction enrichie en albumines traitee ; d) melanger la fraction enrichie en globulines et la fraction enrichie en albumines traitee de maniere a ce que 1'extrait sec du melange presente un ratio massique des globulines sur les albumines de 65/35 a 85/15, de preference de 70/30 a 82/18, plus preferentiellement de 75/25 a 80/20. Un troisieme objet de la presente invention est 1'utilisation de la composition de proteines de pois selon 1'invention dans une composition alimentaire ou pharmaceutique. Le terme « pois » doit se comprendre dans la presente demande comme toutes les varietes sauvages de « pois lisse » (« smooth pea »), et toutes les varietes mutantes de « pois lisse » et de « pois ride » (« wrinkled pea »). Le terme « proteine » doit se comprendre dans la presente demande comme les macromolecules formees d'une ou de plusieurs chaines polypeptidiques constituees de 1'enchainement de residus d'acides amines lies entre eux par des liaisons peptidiques. Dans le cadre particulier des proteines de pois, la presente invention concerne plus particulierement les globulines (environ 50-60% en5 10 15 20 25 30 CA 03077637 2020-04-01 5 poids des proteines du pois) et les albumines (20-25% en poids des proteines du pois). Les globulines de pois se subdivisent principalement en trois sous-familles : les legumines, les vicilines et les convicilines. Les albumines de pois se subdivisent principalement en deux families baptisees PAI et PA2. Le terme « facteurs anti-trypsiques » doit se comprendre dans la presente demande comme 1'ensemble des composes possedant une activite inhibant les proteases digestives, en particulier la trypsine. La methode de calcul de la teneur en facteurs antitrypsique de la composition selon 1'invention est detaillee dans les exemples de la presente demande. Le terme « PDCAAS » doit s'entendre dans la presente invention comme le Protein Digestibility Corrected Amino Acid Scoring ou Score en Acides Amines Corrige de la Digestibilite des Proteines. Cette methode est la plus utilisee aujourd'hui pour estimer la qualite proteique des aliments destines a 1'alimentation humaine. Le PDCAAS evalue la qualite des proteines en fonction de deux criteres : les besoins en acides amines essentiels de 1'homme selon les recommandations de la FAO et la digestibilite des proteines. Depuis 1989, 1'OMS et la FAO conseillent d'utiliser cette methode pour determiner la qualite des proteines. Il est admis qu'une proteine parfaite d'un point de vue nutritionnel doit y obtenir un score de 1 (ou 100% selon 1'expression du resultat). La methode de calcul du PDCAAS de la composition selon 1'invention est detaillee dans les exemples de la presente demande. Les differents objets de 1'invention seront mieux compris dans la description detaillee de 1'invention qui suit. La composition objet de la presente invention est une composition de proteines de pois qui comprend des globulines et des albumines.5 10 15 20 25 30 CA 03077637 2020-04-01 6 Dans tout ce qui suit, les termes « proteines » « globulines » et « albumines » designent respectivement des proteines, des globulines et des albumines extraites uniquement du pois. Ainsi, les proteines, globulines et albumines extraites d'une source vegetale autre que le pois ou d'une source animale ne sont pas englobees par ces termes. Les globulines peuvent etre distingues des albumines par diverses methodes bien connues de 1'homme du metier, notamment par leur solubilite dans 1'eau, les albumines etant solubles dans 1'eau pure alors que les globulines sont uniquement solubles dans 1'eau salee. On peut egalement identifier les albumines et globulines presentes dans un melange par electrophorese ou chromatographie. L'extrait sec de la composition selon 1'invention comprend au moins 80% en poids, de preferences de 80 a 99% en poids, plus preferentiellement de 85 a 98% en poids, de 90 a 97% en poids, de 92 a 95% en poids, de proteines par rapport au poids de 1'extrait sec. Toute methode de dosage reference pour quantifier le taux de proteines bien connue de 1'homme de l'art peut etre utilisee. De preference, on realise un dosage de l'azote total (en %/brut) et on multiplie le resultat par le coefficient 6,25. Cette methodologie bien connue dans le domaine des proteines vegetales se base sur le constat que les proteines contiennent en moyenne 16% d'azote. Toute methode de dosage de la matiere seche bien connue de 1'homme du metier peut etre egalement utilisee. En outre, 1'extrait sec de la composition selon 1'invention presente un ratio massique des globulines sur les albumines de 65/35 a 85/15, de preference de 70/30 a 82/18, plus preferentiellement de 75/25 a 80/20. Selon un mode de realisation particulier, les albumines contenues dans la composition selon 1'invention consistent essentiellement en des albumines de type PAI et PA2 et des lectines. Ainsi, le pourcentage en poids des facteurs anti-trypsiques par rapport au poids des proteines de la composition selon 1'invention5 10 15 20 25 30 CA 03077637 2020-04-01 7 est inferieur au pourcentage en poids des facteurs anti-trypsiques par rapport au poids des proteines dans le pois a 1'etat naturel. De preference, 1'extrait sec de la composition selon 1'invention presente une teneur en facteurs anti-trypsiques de 6 a 10 UIT/mg. La teneur en facteurs anti-trypsiques peut notamment etre mesuree selon le procede decrit ci-apres. Selon un mode de realisation particulier, la composition selon 1'invention presente un PDCAAS egal a 1 (ou 100% selon 1'expression des resultats). En effet, la faible teneur en facteurs antitrypsiques de la composition selon 1'invention lui confere une bonne digestibilite. Le ratio massique des globulines sur les albumines dans la composition selon 1'invention contribue en outre a un bon equilibre des acides amines. La presence d'albumines permet notamment d'enrichir la composition en acides amines soufres. Ainsi, la composition selon 1'invention presente une excellente qualite nutritionnelle. La composition selon 1'invention peut notamment etre obtenue par le procede de preparation d'une composition de proteines de pois decrit ci-apres. Le procede de preparation d'une composition de proteines de pois objet de la presente 1'invention comprend une etape a) dans laquelle les globulines et les albumines sont extraites du pois pour obtenir une fraction proteique. Selon un mode de realisation preferentiel, dans 1'etape a) les globulines et les albumines sont extraites du pois avec un procede comprenant les etapes suivantes : a-i) broyer des pois ; a-ii) introduire les pois broyes dans une solution aqueuse pour obtenir une phase solide A en suspension dans une phase liquide B ; et5 10 15 20 25 30 CA 03077637 2020-04-01 8 a-iii) separer la phase liquide B, correspondant a la fraction proteique, de la phase solide A. Un tel procede est notamment decrit dans la demande de brevet EP1400537. Les pois mis en ceuvre dans 1'etape a-i) auront pu subir au prealable des etapes bien connues de 1'homme du metier, telles que notamment un nettoyage (elimination des particules non desirees telles que pierres, insectes morts, residus de terre, etc.) ou bien encore 1'elimination des fibres externes du pois (enveloppe externe cellulosique) par une etape bien connue appelee « dehulling ». Dans 1'etape a-i), les pois peuvent etre broyes en absence d'eau (procede dit de « broyage a sec »). Selon un mode de realisation alternatif, les pois peuvent etre broyes en presence d'eau (procede dit de « broyage humide »). Dans ce cas, 1'etape a-ii) n'est pas mise en ceuvre puisqu'on obtient directement une phase solide A en suspension dans une phase liquide B a 1'issue de 1'etape de broyage humide. Dans 1'etape a-ii), le pH de la solution aqueuse peut notamment etre compris entre 6,2 et 7 et la temperature de la solution aqueuse peut notamment etre comprise entre 5 et 20°C. L'etape a-iii) permet de separer la phase liquide B de la phase solide A. La phase liquide B correspond a la fraction proteique et est egalement appelee « fraction soluble ». Elle contient les proteines, en particulier les globulines et les albumines, ainsi que d'autres composes solubles dans la phase aqueuse, en particulier, des seis, des acides amines et des glucides. La phase solide A contient quant a elle les fibres de pois et de l'amidon. De preference, la phase liquide B et la phase solide A sont separees par fractionnement. La separation par fractionnement peut notamment etre realisee au moyen de decanteurs centrifuges ou d'hydrocyclones.5 10 15 20 25 30 CA 03077637 2020-04-01 9 Le procede selon 1'invention comprend une etape b) dans laquelle les globulines et les albumines sont separees pour obtenir une fraction enrichie en globulines et une fraction enrichie en albumines. Par « fraction enrichie en globulines » et « fraction enrichie en albumines », on entend une fraction ayant un pourcentage en poids de globulines, respectivement d'albumines, par rapport au poids des proteines dans ladite fraction qui est superieur au pourcentage en poids de globulines, respectivement d'albumines, par rapport au poids des proteines dans le pois a 1'etat naturel. L'enrichissement correspond done au pourcentage d'augmentation de la proportion de globulines, respectivement d'albumines, entre le pois a 1'etat naturel et la fraction enrichie. En particulier, 1'enrichissement de la fraction enrichie est d'au moins 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, ou 50% par rapport au pois a 1'etat naturel. L'enrichissement peut notamment etre obtenu par purification et/ou concentration des fractions proteiques d'interet en globulines et en albumines. Ces fractions, selon le procede applique, peuvent se presenter sous forme hydratee ou seche. L'etape b) peut notamment etre mise en oeuvre par precipitation des proteines a leur pH isoelectrique ou par separation membranaire, par exemple par ultrafiltration. Selon un mode de realisation preferentiel, dans 1'etape b) les globulines sont separees des albumines avec un procede comprenant les etapes suivantes : b-i) faire floculer des globulines de la fraction proteique pour obtenir une phase solide C en suspension dans une phase liquide D ; et b-ii) separer la phase liquide D, contenant les albumines, de la phase solide C, contenant les globulines.5 10 15 20 25 30 CA 03077637 2020-04-01 10 De preference, dans 1'etape b-i) la floculation des globulines est realisee en amenant le pH de la fraction proteique au pH isoelectrique des globulines. Plus preferentiellement, le pH de la fraction proteique est ajuste a 4,5. La floculation des proteines peut notamment etre realisee en chauffant la fraction proteique a une temperature de 30 a 70°C, en particulier pendant 5 a 30 minutes, plus particulierement entre 10 a 30 minutes. Dans 1'etape b-ii), la phase solide C (egalement appelee « floc ») est de preference separee de la phase liquide D par centrifugation. La phase solide C correspond a la fraction enrichie en globulines et comprend les globulines. La phase liquide D correspond a la fraction enrichie en albumines et comprend les albumines ainsi que d'autres composes solubles en phase aqueuse, en particulier, des seis, des acides amines et des glucides. Le procede selon 1'invention comprend une etape c) dans laquelle la teneur en facteurs anti-trypsiques de la fraction enrichie en albumines est reduite pour obtenir une fraction enrichie en albumines traitee. Selon un mode de realisation preferentiel, dans 1'etape c) la fraction enrichie en albumines traitee presente une teneur en facteurs anti-trypsiques dans 1'extrait sec de 20 a 80 UIT/mg, de preference de 30 a 50 UIT/mg. De preference, dans 1'etape c) la teneur en facteurs antitrypsiques de la fraction enrichie en albumine est reduite avec un procede comprenant les etapes suivantes : c-i) faire une microfiltration ou une centrifugation de la fraction enrichie en albumines pour obtenir un permeat de microfiltration ou un surnageant de centrifugation; et c-ii) faire une ultrafiltration dudit permeat de microfiltration ou dudit surnageant de centrifugation pour obtenir un retentat5 10 15 20 25 30 CA 03077637 2020-04-01 11 d'ultrafiltration, correspondent a la fraction enrichie en albumines traitee. La microfiltration de l'etape c-i) conduit a un permeat et a un retentat de microfiltration. C'est le permeat qui est ensuite traitee dans l'etape ulterieure c-ii) d'ultrafiltration. La centrifugation de l'etape c-i) conduit quant-a-elle a un surnageant et a un sediment de centrifugation. C'est le surnageant qui est ensuite traite dans l'etape ulterieure c-ii) d'ultrafiltration. Lorsque 1'etape c-i) est une microfiltration, celle-ci est preferentiellement une microfiltration tangentielle membranaire. Plus particulierement, la microfiltration tangentielle est preferentiellement realisee avec une membrane ceramique presentant une porosite de 0,01 pm a 1 pm, preferentiellement de 0,05 pm a 0,5 pm. L'etape c-ii) d'ultrafiltration est effectuee sur le permeat de microfiltration ou sur le surnageant de centrifugation. Elle permet d'obtenir d'une part un retentat d'ultrafiltration riche en albumines, et d'autre part un permeat riche en seis, en acides aminees et en glucides. Plus particulierement, il est recommande de realiser 1'ultrafiltration a 1'aide d'une membrane presentant un seuil de coupure compris entre 0.1 et 0.5 pm, la pression transmembranaire etant maintenue inferieure a 4 bars. Le procede selon 1'invention comprend une etape d) dans laquelle la fraction enrichie en globulines et la fraction enrichie en albumines traitee sont melangees de maniere a ce que 1'extrait sec du melange presente un ratio massique des globulines sur les albumines de 65/35 a 85/15, de preference de 70/30 a 82/18, plus preferentiellement de 75/25 a 80/20. Selon un mode de realisation particulier, dans l'etape d) la fraction enrichie en globulines et la fraction enrichie en albumines traitee sont melangees en milieu humide et ledit melange est ensuite5 10 15 20 25 30 CA 03077637 2020-04-01 12 seche. Le melange en milieu humide peut notamment etre realise dans tout recipient convenant a cet effet, de preference equipe d'un systeme d'agitation adequat tel qu'un arbre mobile equipe de pales ou de turbines. Apres obtention d'un melange homogene, celui-ci est seche a l'aide de techniques bien connues de 1'homme du metier telles que 1'atomisation ou bien la lyophilisation. Le procede selon 1'invention peut en outre comprendre une ou plusieurs etapes facultatives avant et/ou apres 1'une des etapes a) b) c) ou d). Selon un mode de realisation particulier, le procede selon 1'invention peut comprendre une etape d'hydrolyse enzymatique de la fraction proteique enrichie en globulines et/ou de la fraction proteique enrichie en albumines traitee entre 1'etape c) et 1'etape d). Le type d'enzyme utilise dans la reaction d'hydrolyse enzymatique est de preference une enzyme du groupe des proteases. La presente invention a egalement pour objet 1'utilisation de la composition de proteines de pois selon 1'invention dans une composition alimentaire ou pharmaceutique. En effet, du fait de son excellente qualite nutritionnelle et de sa faible allergenicite, une telle composition de proteines de pois est d'un interet certain dans de nombreuses applications industrielles, en particulier dans 1'Industrie agroalimentaire ou pharmaceutique, et en nutrition animate. Par composition alimentaire on entend une composition destinee a 1'alimentation humaine ou animate. Le terme composition alimentaire englobe les produits alimentaires et les complements alimentaires. Par composition pharmaceutique on entend une composition destinee a un usage therapeutique. Les exemples qui suivent permettent de mieux illustrer la demande, sans toutefois en limiter la portee.5 10 15 20 25 30 CA 03077637 2020-04-01 13 Exemple 1 : Production de farine de pois et des fractions enrichies respectivement en globulines et en albumines de pois. De la farine de pois est initialement prepares par broyage de pois fourragers decortiques sur broyeur a marteaux de type ALPINE equipe d'une grille de 100 pm. Cette farine sera nominee « farine de pois ». 300 kg de farine de pois a 87% en poids de matiere seche sont ensuite mis a tremper dans de 1'eau a la concentration finale de 25% en poids de matiere seche (MS), a un pH de 6,5. 1044 kg de suspension de farine a 25% en poids de MS (soit done 261 kg de farine seche) sont alors introduits avec 500 kg d'eau dans une batterie d'hydrocyclones composee de 14 etages. Elle est alimentee par la suspension de farine a 1'etage n° 5. Cette separation conduit a 1'obtention d'une phase legere qui correspond a la sortie de 1'etage n° 1. Elle est constituee d'un melange de proteines, de fibres et de solubles. Cette phase legere en sortie d'hydrocyclones renferme en melange (142 kg de MS au total) : les fibres (environ 14,8% en poids, soit 21 kg de MS), les proteines (environ 42,8% en poids, soit 60,8 kg de MS) et les solubles (environ 42,4% en poids, soit 60,2 kg de MS). Cette fraction presente une teneur en MS de 11,4% en poids. On procede a la separation des fibres sur decanteurs centrifuges de type WESTFALIA employes dans une unite industrielle feculiere de traitement de la pomme de terre. La phase legere en sortie de decanteur centrifuge renferme un melange de proteines et de solubles, tandis que la phase lourde renferme les fibres de pois. La phase lourde renferme 105 kg de fibres a 20% en poids de MS. On constate que la quasi-totalite des fibres est bien retrouvee dans cette fraction. Quant a la fraction proteines et matieres solubles, elle renferme 1142 kg d'un melange en solution de matieres solubles et de proteines (fraction a 6% en poids de MS). On procede a la floculation des proteines a leur point isoelectrique par ajustement de la phase legere en sortie de decanteur centrifuge a un pH de 4,5 et chauffage a 50°C. Les proteines ainsi mises a floculer sont5 10 15 20 25 30 CA 03077637 2020-04-01 laissees 10 minutes en cuve de maturation. Apres precipitation des proteines, on procede a une decantation centrifuge, qui permet de recuperer du sediment renfermant 56 kg de proteines (86% de Nx6,25 sur sec) a 20% en poids de MS et un surnageant contenant entre autre la fraction proteique contenant les albumines. Le sediment correspond a la fraction proteique enrichie en globulines et il sera nomme « fraction enrichie en globulines ». Le surnageant correspond a la fraction proteique enrichie en albumines et il sera nomme « fraction enrichie en albumines ». On procede ensuite au raffinage de la fraction enrichie en albumines. Son pH est ajuste a 7.0 par ajout de soude a 50%. La temperature de la suspension ainsi obtenue a ete amenee a 70°C. La solution est pompee au travers d'une unite de microfiltration equipee de membranes ceramiques type Inside Ceram® ayant un seuil de coupure de 0,14 pm (19 canaux de 4,5 mm). Tout au long de la filtration, la temperature est regulee a 60°C et la pression transmembranaire maintenue a une valeur comprise entre 0,4 et 0,6 bar. 707 litres de permeat de microfiltration et 1768 litres de retentat de microfiltration sont ainsi recuperes. 550 litres du permeat sont pompes au travers d'une unite d'ultrafiltration. L'unite d'ultrafiltration est equipee de membranes ceramiques type KERASEP® BX commercialisees par la societe NOVASEP et ayant un seuil de coupure de 15 kDa (7 canaux de 6 mm). Tout au long de la filtration, la temperature est regulee a 60°C et la pression transmembranaire maintenue a une valeur comprise entre 1 et 3 bars. 467 litres de permeat d'ultrafiltration et 33 litres de retentat contenant 75% en poids de proteines a 7,2% en poids de MS sont ainsi recuperes. Ce retentat d'ultrafiltration correspond a la fraction proteique enrichie en albumines traitee et sera nomme « fraction enrichie en albumines traitee ».5 10 15 20 25 30 CA 03077637 2020-04-01 15 Exemple 2 : Preparation de compositions de proteines de pois selon 1'invention On utilise une cuve en acier inoxydable equipee d'un agitateur motorise. On introduit dans cette cuve 1,89 kg de « fraction enrichie en globulines » et 2 kg de « fraction enrichie en albumines traitee ». Ce melange permet 1'obtention d'un ratio exprime en pourcentage relatif de matiere seche entre la « fraction enrichie en globulines » et la « fraction enrichie en albumines traitee » de 75/25. On demarre ensuite l'agitateur motorise et on homogeneise le produit pendant 15 a 30 minutes. Le melange est ensuite envoye vers une tour d'atomisation simple effet afin d'etre seche. On recupere ainsi une poudre titrant 95% en poids de MS. Le produit sera nomine « composition proteique de pois 75/25 ». On utilise a nouveau la cuve precedente en acier inoxydable equipee d'un agitateur motorise. On introduit dans cette cuve 2,5 kg de « fraction enrichie en globulines » et 2 kg de « fraction enrichie en albumines traitee ». Ce melange permet 1'obtention d'un ratio exprime en pourcentage relatif de matiere seche entre la « fraction enrichie en globulines » et la « fraction enrichie en albumines traitee » de 80/20. On demarre ensuite l'agitateur motorise et on homogeneise le produit pendant 15 a 30 minutes. Le melange est ensuite envoye vers une tour d'atomisation simple effet afin d'etre seche. On recupere ainsi une poudre titrant 96% en poids de MS. Le produit sera nomme « composition proteique de pois 80/20 » On realise egalement les melanges decrits ci-dessus mais en realisant le melange uniquement a sec, sans presence d'eau. On utilise pour ce faire un agitateur orbital Missenard-Quint, mais tout autre materiel destine au melange de poudre serait adequat. Les produits seront nommes « composition proteique de pois 80/20 a sec » et « composition proteique de pois 75/25 a sec ».5 10 15 20 25 30 CA 03077637 2020-04-01 16 Exemple 3 : Methodologie du calcul de la digestibilite et du PDCAAS La mesure de la digestibilite proteique chez le rat est decrite dans 1'article de la FAO suivant : « Protein Quality Evaluation. Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation. Rome, Italy." Pour cela, 1'aliment experimental est compose de 10% en poids des proteines a tester, 1% en poids d'un melange de vitamines AIN93, 3,5% en poids d'un melange de mineraux AIN93, 0,2% en poids de bitartrate de choline, 5% en poids de cellulose, 10% en poids d'huile de mais. L'aliment est complete a 100% avec de l'amidon de mais. Ce meme aliment ne contenant pas de proteine sera utilise comme temoin de 1'essai. Pour cela, les proteines seront substitutes par de l'amidon de mais. Des rats Sprague-Dawley en croissance (poids compris entre 50 et 70g au debut de 1'essai) seront heberges individuellement dans des cages a metabolisme a une temperature comprise entre 18 et 24°C et une humidite comprise entre 40 et 70%. Les rats seront nourris avec un aliment standard au minimum 2 jours avant le debut de 1'essai. Ils sont ensuite nourris avec les regimes experimentaux pendant une duree minimum de 9 jours constituee d'une premiere periode d'acclimatation aux regimes de 4 jours suivie par une periode de 5 jours de recueil des feces. L'eau est donnee ad-libitum pendant toute la duree de 1'etude. Les feces ainsi recueillies quotidiennement sont pesees, lyophilisees pendant 24 heures et broyees. La mesure de 1'azote contenu dans l'aliment et dans les feces permettra de calculer la digestibilite proteique. La methode de mesure utilisee est la methode Kjeldahl. L'azote ingere et 1'azote excrete est obtenu en multipliant la prise alimentaire ou le poids des feces par les taux d'azote respectifs. Le taux d'azote basal est obtenu par la mesure de 1'azote fecal des animaux nourris par le regime ne contenant pas de proteines.CA 03077637 2020-04-01 17 La digestibilite Digestibilite = ingere *100 proteique est obtenue [Azote ingere-(Azote de la fagon suivante : fecal-Azote basal)]/Azote L'aminogramme ou profil en acides amines totaux est etabli a 5 l'aide de la methode officielle NF EN ISO13903 :2005. Le score en acides amines est determine comme etant l'acide amine essentiel limitant par rapport au profil de reference determine chez l'adulte. Pour 1'obtenir, il faut calculer le ratio suivant : [mg de l'acide amine contenu dans 1g de la proteine 10 test]/[mg de l'acide amine du profil de reference]. La plus petite valeur represente le score en acides amines. Le PDCAAS (Protein digestibility corrected amino acid score) est obtenu est multipliant ce score en acide amine limitant par la digestibilite proteique determinee chez le rat. 15 Le profil de reference chez l'adulte est decrit par la FAO dans son article : « Protein and amino acid requirements in human nutrition. Report of a joint WHO/FAO/UNU expert consultation. Geneva, Switzerland. 2007. Acide amine essentiel g/g de proteine Histidine 15 Isoleucine 30 Leucine 59 Lysine 45 Methionine 16 Cysteine 6 Methionine + Cysteine 22 Phenylalanine + Tyrosine 30 Threonine 23 Tryptophane 6 Valine 39CA 03077637 2020-04-01 18 Exemple 4 : Methodologie de mesure de la teneur en facteurs anti-trypsiques La methode de mesure de la teneur en facteurs anti-trypsiques consiste a extraire par de la soude les inhibiteurs de la trypsine. 5 Des volumes croissants de 1'echantillon dilue sont mis en contact avec un exces de trypsine en presence de N-alpha-benzoyl D Larginine p-nitroanilide (BAPNA) qui va alors etre hydrolyse sous forme de p-nitroaniline, compose absorbant a 410 nm. Apres blocage de la reaction a 1'acide acetique, 1'augmentation de coloration est 10 mesuree au spectrophotometre a 410 nm. La teneur en inhibiteurs est alors calculee a partir de la vitesse de diminution de la coloration Une unite de trypsine est arbitrairement definie comme la quantite d'enzyme necessaire pour entrainer un accroissement de 0,01 unites de 1'absorbance a 410 nm pour 10 ml de melange reactionnel dans les 15 conditions de la methode AOCS Ba 12-75. La teneur en facteur antitrypsiques s'exprime en unite d'inhibition de la trypsine par mg d'echantillon a tester (UIT/mg).CA 03077637 2020-04-01 19 Exemple 5 : Comparaison des differentes fractions Reference Teneur en facteurs anti-trypsiques (UIT/mg) DigestibiilBte////P|CAAS7| Farine de pois Pas realise 77,3 0,63 Fraction enrichie en globulines 3 97,3 0,93 Fraction enrichie en albumines traitee 41 96,9 0,56 Composition proteique de pois 75/25 selon 1'invention 7 97,2 1 Composition proteique de pois 80/20 selon 1'invention 8 97,4 1 Ces examples demontrent bien la concentration des facteurs anti-trypsiques dans la fraction enrichie en albumines, ce qui confirme done 1'enseignement general du domaine technique indiquant 5 que ces fractions de bas poids moleculaire et hydrosolubles sont riches en facteurs anti-trypsiques. L'homme de l'art aurait done ete dissuade de reutiliser cette fraction dans 1'intention d'ameliorer le PDCAAS de la fraction enrichie en globulines. Il aurait plutot choisi d'utiliser des sources complementaires telles que des 10 proteines de ble comme enseigne dans l'art anterieur. La Demanderesse a ete au-dela de cet enseignement et a developpe une solution permettant i'obtention d'une proteine dont le PDCAAS est egal a 1 uniquement base sur des fractions proteiques issues du poisCA 03077637 2020-04-01 20 Exemple 6 : Comparaison organoleptiques des differents produits dans des recettes de boissons a reconstituer ou « Powder-mix » : On se propose d'evaluer la difference en terme d'organoleptique a l'aide d'une recette de boisson a reconstituer ou « Powder-mix » 5 incluant : - « composition proteique de pois 80/20 a sec » et « composition proteique de pois 75/25 a sec » - « composition proteique de pois 80/20 » et « composition proteique de pois 75/25» 10 Ceci devrait nous permettre de mettre en evidence un interet potentiel de preparation de la composition proteique de pois selon 1'invention par dissolution dans de I'eau et atomisation versus melange a sec de poudres.CA 03077637 2020-04-01 21 La recette est la suivante : Ingredients (Quantite en % poids de la recette finale) Powder-mix 1 (reference) Powder-mix 2 (atomise) Powder-mix 3 (a sec) Composition de proteines de pois selon 1'invention obtenue par melange a sec 77,15 Composition de proteines de pois selon 1'invention obtenue par dissolution et atomisation 77,15 Isolat de pois NUTRALYS® S85XF (reference) 77,15 Rice protein plain (Nutribiotic) 19,29 19,29 19,29 Maltodextrine GLUCIDEX® IT19 (ROQUETTE) 1,63 1,63 1,63 Arome fraise 1 1 1 Gomme de Xanthane F80 0,40 0,40 0,40 Aspartame 0,15 0,15 0,15 Acesulfame K 0,08 0,08 0,08 Lecithine de soja 0,3 0,3 0,3 Les differents ingredients en poudre sent peses et introduits ensemble apres un melange a sec, a l'aide d'un agitateur orbital. Les differents melanges sont compares avec l'aide d'un panel de 5 degustation dont la methodologie est decrite ci-dessous. Le panel est qualifie a la degustation de produits formules. Il a regu une formation et un entrainement afin de verifier ses performances en termes de Capacite a discriminer les produits5 10 15 20 25 30 CA 03077637 2020-04-01 22 Consensus, utilisation correcte des descripteurs - Repetabilite, capacite a reperer un doublon. Le panel est constitue de personnes, specialement entrainees pour les applications liquides. Les trois boissons ont ete reconstitutes en melangeant 25g de poudre dans de 1'eau d'Evian au moment de la degustation. Les boissons sont alors proposees aux panelistes a temperature ambiante. Conditions de degustation : box individuels de degustation, murs blancs, ambiance calme (pour faciliter la concentration) - Lumiere rouge (pour ne pas etre influence par la couleur du produit) - En fin de matinee ou d'apres-midi (pour etre au maximum des capacites sensorielles) - Produits anonymes par un code a 3 chiffres (pour eviter que le code n'influence 1'appreciation des produits) - Produits presentes dans un ordre aleatoire (pour eviter les effets d'ordre et de remanence) La methode employee pour comparer les produits a ete le test triangulaire. Trois echantillons sont presentes simultanement aux degustateurs, 2 des 3 echantillons sont identiques. L'exercice consiste a identifier quel est 1'echantillon different des 2 autres. Afin d'eviter tout biais, le test a ete realise en blocs equilibres (1'echantillon different est soit 1'echantillon A soit 1'echantillon B, il se trouve en premiere, en deuxieme ou en troisieme position aleatoirement - AAB, ABA, ABB, BAA, BAB, BBA) Traitement des donnees En repondant au hasard a la question « quel est 1'echantillon different? » il y a 1 chance sur 3 de trouver la bonne reponse. Done, la probability d'avoir BR bonnes reponses selon N panelistes sous le fait du hasard suit une loi Binomiale BR~B(N,l/3). Le seuil de confiance usuel est 0.05. Resultats : 18 personnes ont participe au panel, il faut 10 bonnes reponses pour conclure a une difference significative avec ce tauxGA 03077637 2020-04-01 23 de participation (a = 0.05). 13 panelistes ont trouve le bon echantillon different, on pent done conclure a une difference significative entre les melanges. Les commentaires emis par les panelistes ayant trouve 1'echantillon different sont resume dans le 5 tableau ci-dessous : Commentaires des panelistes - Powder-mix (atomise) 2 - Plus long en bouche - Plus lisse - Plus sucre - Moins sableux - Moins amer Powder-mix 3 (a sec) - Gout moins fort, moins visqueux - Plus granuleux et gout pois - Plus sableux - Texture differente Il est done prouve qu'en melangeant dans de 1'eau les fractions albumines et globulines, puis en atomisant la solution ainsi obtenue, on obtient une composition proteique selon 1'invention qui possede un aspect organoleptique bien meilleur que s'il etait obtenu par 10 melange a sec.