CA 03150552 2022-02-08 1 Description DISPOSITIF CONTENANT DES BILLES DE VERRE FONCTIONNALISEES AVEC DU POLYETHYLENEIMINE, ET LEUR UTILISATION POUR CAPTER LES MICRO-ORGANISMES 5 La presente invention conceme un dispositif contenant des billes de verre fonctionnalisees, et son utilisation dans la captation de micro-organismes pour la mise en oeuvre d’un procede d’elimination de micro-organismes ou de diagnostic. La captation de micro-organismes presente un interet fondamental dans de nombreux types 10 d’industrie, tels que les industries pharmaceutique, cosmetique, veterinaire ou alimentaire. Elle peut notamment etre utilisee pour des applications qui se decoupent en deux grands domaines : - L’elimination de micro-organismes de solutions potentiellement contaminees, - L’analyse sous la forme d’un diagnostic, notamment dans le cadre d’un diagnostic clinique, permettant d’evaluer la qualite microbiologique d’une solution. 15 Pour eliminer des micro-organismes presents au sein de solutions potentiellement contaminees, les techniques utilisees font generalement appel au traitement thermique (Magali, WAGNER, Anne Gaelle MELLOUET, et Francois ZUBER. 2016. “Traitement thermique en continu de produits pompables.” “Agroalimentaire.” Techniques de 1’Ingenieur, 10 Septembre 2016) et/ou a la fdtration 20 membranaire (Christel, CAUSSERAND, Claire ALBASI, et Helene ROUX DE BALMANN. 2017. “Filtration membranaire (OI, NF, UF, MF) - Applications en traitement des eaux.” “Technologies de 1’eau.” Techniques de 1’Ingenieur, 10 Aout 2017). L’inconvenient majeur du traitement thermique provient du fait que la temperature est susceptible d’engendrer des modifications irreversibles du produit en agissant directement sur ses constituants. Egalement, au niveau microbiologique, le 25 traitement thermique correspond a une reduction de la charge en microorganismes et il est par exemple susceptible de reactiver des spores bacteriennes. Concemant la filtration membranaire, le colmatage de la membrane est le principal probleme pouvant etre rencontre. Ce dernier peut etre du a la concentration en micro-organismes dans le produit autant qu’a la nature du produit et en particulier aux particules solides presentes en son sein. 30 L’analyse microbiologique, necessite 1’utilisation de techniques precises pour lesquelles le temps d'obtention du resultat le plus court possible est recherche. En effet, plus les resultats d’analyse sont obtenus rapidement, plus il est possible d'engager des actions correctives en cas de resultats non satisfaisants ou non acceptables. En particulier, dans le domaine medical, il est necessaire de prevoir et 35 diagnostiquer le risque infectieux : plus le diagnostic est rapide et precis, plus la prise en charge des malades est efficace et le risque de transmission minimise.5 10 15 20 25 30 35 CA 03150552 2022-02-08 2 Cependant, pour mettre en evidence la presence de microorganismes, il est necessaire de realiser des prelevements suffisamment importants afin de s'assurer de recuperer une quantite minimale de microorganismes. Il faut ensuite augmenter leur concentration, les isoler et les identifier. Une etape cle pour la plupart de ces methodes de detection/quantification de microorganismes dans les echantillons liquides ou rendus liquides, est leur capacite a depasser la limite de detection de la technique d’evaluation mise en oeuvre. Ceci est particulierement difficile pour les echantillons faiblement concentres en microorganismes d’interet. Une etape d’enrichissement ou de concentration apparait souvent necessaire pour ce type d’echantillon, ladite etape d’enrichissement pouvant eventuellement etre mise en oeuvre directement dans le conditionnement dans lequel se trouve 1’echantillon. Il s’agit dans ce cas, d’une etape d’enrichissement directement dans le produit. L’etape d’enrichissement necessite d’utiliser des milieux de culture, selectifs ou non, qui ont pour but de promouvoir la croissance des microorganismes cibles dans les echantillons biologiques ou environnementaux, tout en limitant la croissance des Hores non cibles. Ainsi, la population cible, qui est souvent presente a des niveaux bas par rapport a la flore annexe presente dans les aliments, est amplifiee. Ces etapes d’enrichissement en amont de 1’analyse permettent d’accroitre le nombre de microorganismes d’interet dans 1’echantillon mais condamnent a la fois la possibilite d’une analyse rapide mais egalement la possibilite de quantifier la population initiale de microorganismes d’interet. L’autre possibilite consiste a passer par une etape de concentration des microorganismes a partir de 1’echantillon liquide ou rendu liquide. Une des techniques les plus utilisees pour la concentration de micro-organismes a partir d’echantillons est 1’utilisation d’un ou plusieurs filtres membranes de porosite variable a travers lequel le milieu liquide est filtre. Ues microorganismes contenus dans 1’echantillon sont arretes par la membrane et done concentres. Une telle technique est generalement mise en oeuvre pour 1’analyse microbiologique d’eau de process, d’eau potable, de boisson, ou de produit pharmaceutique. Bien que simple d’utilisation, cette methode de filtration sur membrane reste limitee par des facteurs provoquant le colmatage du filtre membrane tels que la turbidite elevee, ou la presence de particules dans 1’echantillon. D'autres facteurs lies a la nature du filtre et a son mode de sterilisation peuvent aussi influer sur le resultat de 1’analyse microbiologique pouvant gravement alterer la viabilite, la precision et la sensibilite de la methode et conduire a des resultats errones et faiblement reproductibles. Nous pouvons citer a titre d’exemple non exhaustif, 1'inhibition de la croissance microbienne, une propagation anormale des colonies, 1’existence de zones non mouillantes, la fragilite du filtre, un defaut de planeite du filtre, un faible taux de recuperation. En outre, la necessite de concentrer de grandes quantites d’echantillon afin de compenser les variations spatiales et temporelles de 1’occurrence des microorganismes, augmente la probabilite de colmatage du filtre membrane.5 10 15 20 25 30 35 CA 03150552 2022-02-08 3 D’autres methodes permettent egalement de concentrer les micro-organismes et de les separer des elements constitutifs de 1’echantillon. Par exemple, les methodes d’immunocapture ou d’immunoconcentration sont largement utilisees dans de nombreuses applications. Elles mettenttres souvent en oeuvre des supports fonctionnalises avec des anticorps et permettent de capturer specifiquement ou non les microorganismes contenus dans 1’echantillon. Ces methodes sont largement utilisees pour l’analyse microbiologique de fluides humains ou d’echantillons alimentaires, et peuvent etre mises en oeuvre sur les echantillons bruts, enrichis, ou dans des milieux de cultures specifiques (pre-enrichissement et enrichissement). De nouvelles methodes permettent egalement la capture semi-specifique de microorganismes a 1'aide de surfaces cellulaires fonctionnalisees. Elles mettent en oeuvre des derives de lectines ou d’hydrates de carbone, des peptides et des composes mimant les peptides et sont appliquees a la capture a large spectre et / ou de liaison specifique des micro-organismes dans 1’echantillon. En outre, les peptides antimicrobiens lies a des composes non solubles ont ete utilises pour tuer, immobiliser et detecter des microorganismes. L’un des buts de 1’invention est de foumir un dispositif comprenant les billes de verre fonctionnalisees pour une utilisation dans la captation de micro-organismes. Un autre but de 1’invention est de foumir un procede de preparation des billes de verre fonctionnalisees. Un autre but de 1’invention est de foumir un procede efficace de captation de micro-organismes pour une utilisation en elimination de micro-organismes ou en diagnostic. Un premier objet de la presente invention est un dispositif comprenant un recipient creux nontenant des billes de verre, fonctionnalisees par du polyethyleneimine adsorbe a la surface des billes de verre. En particulier, la presente invention conceme un dispositif comprenant un recipient creux contenant des billes de verre non poreuses, fonctionnalisees par du polyethyleneimine adsorbe a la surface des billes de verre. La presente invention conceme un dispositif comprenant un recipient creux contenant des billes de verre, fonctionnalisees par du polyethyleneimine adsorbe a la surface des billes de verre, les billes de verre etant notamment constituees de verre de type sodocalcique ou borosilicate, dans lequel la masse moleculaire du polyethyleneimine adsorbe est comprise de 0,6 a 2000 kDa.5 10 15 20 25 30 CA 03150552 2022-02-08 4 Selon un mode de realisation particulier, la presente invention conceme un dispositif comprenant un recipient creux nontenant des billes de verre, fonctionnalisees par du polyethyleneimine directement adsorbe a la surface des billes de verre, en particulier sans agent de couplage entre ledit polyethyleneimine et la surface des billes de verre, de preference par des interactions electrostatiques, lesdites billes de verre etant notamment constituees de verre de type sodocalcique ou borosilicate, dans lequel la masse moleculaire du polyethyleneimine adsorbe est comprise de 0,6 a 2000 kDa. Au sens de la presente invention, on entend par « recipient » un objet destine a recevoir les billes de verre. Au sens de la presente invention, on entend par « recipient creux » un recipient tel que defini cidessus, comprenant un espace concave, ou une cavite, pouvant accueillir les billes de verre. Au sens de la presente invention on entend par « billes de verre » des elements de forme spherique ou ovoide composes de verre. Au sens de la presente invention, on entend par « billes de verre non poreuses » des billes de verre lisses et depourvues de pores. A titre d’exemple, les billes type Poravor®, ou les billes de gel de silice sent considerees comme poreuses. Les billes de verres utilisables dans la presente invention ont notamment une densite comprise de 2 a 3 kg/1, en particulier comprise de 2.3 a 2.7 kg/1, notamment d’environ 2,48 kg/1. Au sens de la presente invention on entend par « polyethyleneimine » un polymere sous forme lineaire ou ramifie compose de motifs ethylene diamine. Il s’agit d’un polymere hydrosoluble dont plusieurs produits de poids moleculaire differents sont commercialement disponibles. Le polyethyleneimine peut etre synthetise a partir de 1’Aziridine par une polymerisation par ouverture de cycle, conduisant a un polyethyleneimine ramifie. Structure du polyethyleneimine ramifie et lineaire5 10 15 20 25 30 35 CA 03150552 2022-02-08 Au sens de la presente invention on entend par « adsorbe a la surface des billes de verre » le fait que le polyethyleneimine soit lie de fa?on non-covalente a la surface des billes de verre sans pour autant modifier la structure du verre. Le precede d’adsorption fait intervenir des interactions electrostatiques type van de Waals entre le polymere cationique presentant des charges positives et la surface de verre anionique presentant des charges negatives. L’adsorption de polymere cationique sur une surface de verre non poreuse par des interactions electrostatiques est connue. Ce phenomene est notamment mis en oeuvre pour adsorber des microorganismes sur des plaques de verre pour une observation par microscopie optique, ou un polymere cationique, tel que la polylysine, est ajoute dans le milieu comme liant entre les microorganismes et la plaque de verre. Les inventeurs ont constate de fa^on inattendue dans le cas de billes de verre fonctionnalisees par adsorption du polyethyleneimine, une stabilite surprenante de 1’interaction entre le polyethyleneimine et la bille de verre. Les billes de verre ainsi fonctionnalisees permettent la captation de microorganismes dans leur etat, mort ou vivant, dans un milieu de fa?on quantitative et permettent sous elution le relargage de la totalite des microorganismes retenus a la surface des billes de verres fonctionnalisees par le polyethyleneimine en conservant 1’etat, mort ou vivant, des microorganismes. L’adsorption presente de nombreux avantages par rapport a un greffage par liaison covalente egalement connu. L’adsorption ne necessite pas de modification chimique prealable de la surface de verre afin d’y introduire des groupements fonctionnels, tels que les siloxanes, pouvant reagir avec le polymere. De plus, l’adsorption met en jeu de faibles interactions rendant le processus reversible. Les billes de verre, ainsi que le polymere peuvent alors potentiellement etre recycles par desorption. Contrairement a un greffage covalent, l’adsorption peut s’effectuer dans un materiel ou appareil non specifique. Ainsi, 1’invention constitue un moyen de captation/elimination de micro-organismes dans un produit. Puis, dans un objectif de diagnostic, de proposer un moyen d’elution permettant le relargage de la totalite des microorganismes retenus sur la colonne et garantissant la viabilite cellulaire. Ceci permet d’apporter une quantification precise des microorganismes vivants contenus dans 1’echantillon analyse. Les surfaces traitees par du polyethyleneimine trouvent de nombreuses applications parmi lesquelles 1'adhesion et 1'etalement de diverses lignees cellulaires, la differenciation cellulaire et 1'excroissance de neurites, 1'adhesion des lignees de cellules transfectees et la survie de neurones primaires dans la culture.5 10 15 20 25 30 35 CA 03150552 2022-02-08 6 Le dispositif de la presente Invention pent etre utilise en statique on en flux. Le mode statique permet d’augmenter le temps de contact entre les billes de verre fonctionnalisees par du polyethylenemine et le liquide contamine et done de maximiser la probabilite de rencontre entre les billes et les microorganismes. Cette probabilite de rencontre peut etre encore amelioree en procedant a une agitation manuelle ou mecanique. L’inconvenient de cette technique conceme les grands volumes de solution a analyser ou a debacteriser (100 mL, 250 mL) puisqu’ils necessitent une quantite importante de billes, et par consequent un cout plus eleve. La methode en flux, permet de passer de grands volumes de liquide dans un espace reduit pour forcer, en quelque sorte, les microorganismes a rencontrer le polyethyleneimine adsorbe a la surface des billes (la quantite de billes utilisees pouvant-etre de 1g). Ainsi, si 1’on souhaite obtenir un cout reduit par analyse, on peut utiliser la methode statique pour de petits volumes et la methode en flux pour de grand volume. L’invention presente de nombreux avantages par rapport aux techniques de 1’art anterieur. Elle permet tout d’abord d’eviter 1’utilisation du traitement thermique pour eliminer les micro-organismes de solutions potentiellement contaminees et ainsi de preserver toutes les qualites originelles du produit sans engendrer de modifications sur ses constituants. L’invention permet egalement d’eviter d’utiliser la filtration membranaire et ses inconvenients lies entre autres au colmatage. Ainsi, l’invention permet d’eliminer les microorganismes contenus dans des echantillons liquides ou rendus liquides de volume important, echantillons pouvant etre de natures differentes et posseder par exemple une turbidite elevee ou des particules ou des sediments en son sein. En ce qui conceme 1'analyse microbiologique, la presente invention conceme notamment un procede pour capturer et concentrer au moins un microorganisme susceptible d'etre present dans un echantillon en vue de le detecter, le quantifier ou d’en evaluer la viabilite. Cette invention permet ainsi de s’affranchir d’une etape d’enrichissement, et par consequent de reduire considerablement le temps d’analyse mais egalement de quantifier la population cible initiale. Le microorganisme peut etre une bacterie, un Fungi (par exemple une levure ou une moisissure) ou un vims. Ce precede est particulierement applicable aux microorganismes contenus dans les milieux complexes. Ces milieux correspondant a des echantillons biologiques peuvent etre d’origine humaine, alimentaire, cosmetique, veterinaire ou pharmaceutique. L’un des avantages de la presente invention reside dans le fait que le produit ne subit aucune modification au contact des billes de verre fonctionnalisees et que celle-ci permet egalement de s’affranchir des problemes de colmatage.5 10 15 20 25 30 35 CA 03150552 2022-02-08 7 Un autre avantage de la presente invention est la possibilite d’utiliser le dispositif de captation de micro-organismes en flux continu, sans etapes d’enrichissement et ce meme si la quantite de microorganismes est faible. Il est ainsi possible d’integrer ce dispositif a une unite industrielle de production sur laquelle une etape d’elimination de micro-organismes serait necessaire, et ce sans interrompre la chaine de production. Par consequent, cette invention permet un gain de temps considerable par rapport aux methodes impliquant une etape d’enrichissement. Selon un mode de realisation particulier, la presente invention conceme un dispositif tel que decrit cidessus, comprenant un recipient creux contenant des billes de verre non poreuses, exclusivement fonctionnalisees par du polyethyleneimine adsorbe a la surface des billes de verre. Selon ce mode de realisation particulier, les billes de verre sont exclusivement fonctionnalisees par du polyethyleneimine. L’expression « exclusivement » designe le fait que le polyethyleneimine est le seul polymere present sur les billes de verre. Un systeme multicouche avec la presence d’un autre polymere ne fait pas partie de ce mode de realisation. Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un dispositif tel que decrit ci-dessus, dans lequel les billes de verre sont constituees de verre de type sodocalcique ou borosilicate. Le type de verre utilise pour la presente invention, notamment le verre sodocalcique, presente un avantage en termes de cout qui est peu eleve. Au sens de la presente invention, on entend par « verre de type sodocalcique », un verre a base de silice (SiO2), de calcium et de sodium. Au sens de la presente invention, on entend par « verre de type borosilicate », un verre a base de silice (SiO2), et de trioxyde de bore (B2O3). Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un dispositif tel que decrit ci-dessus, comprenant un recipient creux contenant des billes de verre non poreuses, fonctionnalisees par du polyethyleneimine adsorbe a la surface des billes de verre, les billes de verre etant notamment constituees de verre de type sodocalcique ou borosilicate. Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un dispositif tel que decrit ci-dessus, dans lequel les billes de verre sont constituees de verre de type sodocalcique ou borosilicate non modifie au prealable.5 10 15 20 25 30 35 CA 03150552 2022-02-08 8 Dans ce mode de realisation, les billes de verre n’ont pas subi un traitement chimique, hors nettoyage, modifiant la structure du verre, dont par exemple un traitement par de l’aluminate de sodium, avant adsorption du polyethyleneimine. Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un dispositif tel que decrit ci-dessus, dans lequel les billes de verre ont un diametre d’environ 20 a environ 1000 pm, notamment d’environ 20 a 30 pm, d’environ 30 a 40 pm, d’environ 40 a 50 pm, d’environ 50 a 75 pm, d’environ 75 a 100 pm, d’environ 100 a 200 pm, d’environ 200 a 300 pm, d’environ 300 a 400 pm, d’environ 400 a 500 pm, d’environ 500 a 600 pm, d’environ 600 a 700 pm, d’environ 700 a 800 pm, d’environ 800 a 900 pm, d’environ 900 a 1000 pm. Si la taille des billes de verre est inferieure a 20 pm, les billes passent a travers le fritte sense les retenir. En revanche, pour des billes de taille superieure a 1000 pm, les taux de captation obtenus sont faibles. La diminution de la taille des billes, combinee a un nombre de billes plus important permet d’avoir une surface de contact plus elevee par rapport a des billes plus grandes en nombre moins important. Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un dispositif tel que decrit ci-dessus, dans lequel les billes de verre ont une masse d’environ 10 ng a environ 2 mg notamment d’environ 10 a 50 ng, d’environ 50 a 100 ng, d’environ 100 a 200 ng, d’environ 200 a 500 ng, d’environ 500 ng a 1 pg, d’environ 1 a 5 pg, d’environ 5 a 10 pg, d’environ 10 a 20 pg, d’environ 20 a 50 pg, d’environ 50 a 100 pg, d’environ 100 a 200 pg, d’environ 200 a 500 pg, d’environ 500 pg a 1 mg, d’environ 1 a 1,5 mg, d’environ 1,5 a 2 mg. Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un dispositif tel que decrit ci-dessus, dans lequel : • les billes de verre ont un diametre d’environ 20 a environ 1000 pm, notamment d’environ 20 a 30 pm, d’environ 30 a 40 pm, d’environ 40 a 50 pm, d’environ 50 a 75 pm, d’environ 75 a 100 pm, d’environ 100 a 200 pm, d’environ 200 a 300 pm, d’environ 300 a 400 pm, d’environ 400 a 500 pm, d’environ 500 a 600 pm, d’environ 600 a 700 pm, d’environ 700 a 800 pm, d’environ 800 a 900 pm, d’environ 900 a 1000 pm, et/ou • les billes de verre ont une masse unitaire d’environ 10 ng a environ 2 mg, notamment d’environ 10 a 50 ng, d’environ 50 a 100 ng, d’environ 100 a 200 ng, d’environ 200 a 500 ng, d’environ 500 ng a 1 pg, d’environ 1 a 5 pg, d’environ 5 a 10 pg, d’environ 10 a 20 pg, d’environ 20 a 50 pg, d’environ 50 a 100 pg, d’environ 100 a 200 pg, d’environ 200 a 500 pg, d’environ 500 pg a 1 mg, d’environ 1 a 1,5 mg, d’environ 1,5 a 2 mg.5 10 15 20 25 30 35 CA 03150552 2022-02-08 9 Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un dispositif dans lequel la masse moleculaire du polyethyleneimine adsorbe est comprise de 0,6 a 2000 kDa, notamment d’environ 0,6 a 1,3 kDa, d’environ 1,3 a 10 kDa, d’environ 10 a 25 kDa, d’environ 25 a 100 kDa, d’environ 100 a 250 kDa, d’environ 250 a 500 kDa, 500 a 1000 kDa, d’environ 1000 a 1500 kDa, d’environ 1000 a 2000 kDa. Par masse moleculaire on entend la masse moleculaire en masse (Mw). Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un dispositif dans lequel le polyethyleneimine adsorbe est lineaire ou ramifie, notamment ramifie. Au sens de la presente invention, on entend par « ramifie » un polymere dans lequel 1’enchainement des motifs monomeres presente des ramifications. Au sens de la presente invention, on entend par « lineaire » un polymere dans lequel 1’enchainement des motifs monomeres se fait de fa^on lineaire. Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un dispositif tel que decrit ci-dessus, dans lequel la masse totale des billes de verre est d’environ 10 mg a environ 1 kg, notamment d’environ 10 a 50 mg, d’environ 50 a 100 mg, d’environ 100 a 200 mg, d’environ 200 a 500 mg, d’environ 500 mg a 1 g, d’environ 1 a 2 g, d’environ 2 a 5 g, d’environ 5 a 10 g, d’environ 10 a 50 g, d’environ 50 a 100 g, d’environ 100 a 200 g, d’environ 200 a 500 g, d’environ 500 gal kg. L’une des premieres applications du procede est 1’elimination de micro-organismes : grace a la captation, 1’echantillon est deplete des microorganismes initialement presents. Une seconde application envisagee est le diagnostic : la captation est alors utilisee comme un moyen pour concentrer les microorganismes en vue d’un diagnostic. Ce dernier peut etre qualitatif, de type presence/absence, ou quantitatif. Il peut etre specifique ou non du type de microorganisme, et differencier ou non les cellules vivantes des cellules mortes. L’analyse des microorganismes captes peut se faire directement apres captation sur billes. Ces tests peuvent etre par exemple bases sur la detection de la cellule entiere ou de la detection/quantification d’un de ses constituants (ADN, ARN, ATP, enzymes et leurs activites ou plus largement les proteines...). Pour ce faire, il est possible d’eluer les microorganismes captes sur les billes, eventuellement suivi d’une etape de lyse, ou alors, d’effectuer la lyse sur les microorganismes toujours captes sur les billes, puis d’eluer les constituants liberes des cellules. Ensuite, une multitude de techniques sont utilisables, parmi lesquelles la cytometric en flux ou en phase solide, la colorimetrie, la spectroscopic, la microscopic, l’ATPmetrie (ATP : Adenosine triphosphate), la PCR (Polymerase Chain Reaction ou reaction en chaine par5 10 15 20 25 30 35 CA 03150552 2022-02-08 10 polymerase), la RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction on reaction en chaine par polymerase apres transcription inverse), Tamplification isothermale on encore la detection immunologique. Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un dispositif tel que decrit ci-dessus, dans lequel le recipient creux est sous forme d’un tube, d’un flacon d’un becher ou d’un pot. Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un dispositif tel que decrit ci-dessus, dans lequel le recipient creux est sous forme de colonne comprenant de facon optionnelle un fritte. Au sens de la presente invention, lorsque la colonne comprend un fritte, la colonne et le fritte peuvent etre deux elements d’un meme ensemble, ou deux elements separes pouvant etre assembles. Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un dispositif tel que decrit ci-dessus, dans lequel la colonne a un volume d’environ 0,5 mL a environ 2 L, notamment d’environ 0,1 a 1 mL, d’environ 1 a 2 ml, d’environ 2 a 5 mL, d’environ 5 a 10 mL, d’environ 10 a 50 mL, d’environ 50 a 100 mL, d’environ 100 a 200 mL, d’environ 200 a 500 mL, d’environ 500 mL a 1 L, d’environ 1 L a 2 L, et le fritte a une porosite inferieure a la taille des billes de verre utilisees. Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un dispositif tel que decrit ci-dessus, dans lequel le recipient creux est sous forme d’un tube, d’un flacon d’un becher ou d’un pot, ledit recipient creux etant notamment sous forme de colonne comprenant de faqon optionnelle un fritte, ladite colonne ayant notamment un d’environ 0,5 mL a environ 2 L et le fritte ayant notamment une porosite inferieure a la taille des billes de verre utilisees. La taille de la colonne est choisie en fonction de la masse totale des billes, ainsi que les quantites des solutions utilisees (solutions de polyethyleneimine, solutions de captation et solutions d’elution). Une quantite plus importante de billes necessite une colonne de taille plus elevee, que 1’Homme du Metier peut choisir. Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un dispositif tel que decrit ci-dessus, dans lequel les billes de verre ont un diametre d’environ 20 a environ 1000 pm, et une masse d’environ 10 ng a environ 2 mg, dans lequel le verre est de type sodocalcique ou borosilicate, fonctionnalise par du polyethyleneimine adsorbee a sa surface, dans lequel le polyethyleneimine a une masse moleculaire comprise de 0,6 et 2000 kDa, dans lequel le polyethyleneimine est ramifie ou5 10 15 20 25 30 35 CA 03150552 2022-02-08 11 lineaire, dans lequel le nontenant est sous forme d’un tube, d’un flacon, d’un becher, d’un pot ou d’une colonne comprenant de facon optionnelle un fritte, dans lequel la colonne a un volume comprise de 0,5 ml a 2 L, et le fritte a une porosite inferieure a la taille des billes de verre utilisees et dans lequel le poids total des billes est compris de 10 mg a 1 kg. Un second objet de 1’invention est un procede de preparation d’une bille de verre utilisee dans le dispositif tel que decrit ci-dessus, comprenant une etape de mise en contact du polyethyleneimine avec une bille de verre pour obtenir une bille de verre non poreuse fonctionnalisee par du polyethyleneimine adsorbe a sa surface. L’adsorption consiste a mettre en contact une solution aqueuse de polyethyleneimine a une concentration comprise de 0,1% a 5% (pourcentages massiques) avec la surface de la bille de verre pendant une duree moyenne de 5 a 10 minutes, notamment d’une dizaine de minutes. Un linkage par de 1’eau permet neanmoins d’eliminer le polyethyleneimine excedentaire, de diminuer la mortalite induite et d’ameliorer une eventuelle elution des microorganismes. Un sechage est ensuite realise a l’air libre ou accelere a 1’aide d’un systeme de chambre sous vide, ou par lyophilisation. Le temps de sechage peut ainsi etre reduit a une dizaine de minutes. A 1’issue de ces differentes etapes, les billes sont fonctionnalisees et pretes a 1’emploi. Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un procede de preparation d’une bille de verre utilisee dans le dispositif tel que decrit ci-dessus, comprenant une etape de mise en contact d’une solution de polyethyleneimine avec une bille de verre pour une duree de 1 minute a 24 heures, notamment de 1 a 5 minutes, de 5 a 10 minutes, de 10 a 15 minutes, de 15 a 20 minutes, de 20 a 25 minutes, de 25 a 30 minutes, de 30 minutes a 1 heure, de 1 a 2 heures, de 2 a 5 heures, de 5 a 10 heures, de 10 a 24 heures, de preference de 10 minutes a 24 heures, pour obtenir une bille de verre fonctionnalisee par du polyethyleneimine adsorbe. Lorsque le temps de contact est inferieur a 1 minute, la fonctionnalisation des billes de verre n’est pas toujours adequate. Le temps de contact augmente en fonction de la masse totale des billes a fonctionnaliser. A titre d’exemple, pour la fonctionnalisation de 300 mg de billes, un temps de fonctionnalisation de 5 minutes peut suffire, tandis-que pour la fonctionnalisation de 1 g de billes, un temps de contact de 10 minutes et preconise. Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un precede de preparation d’une bille de verre utilisee dans le dispositif tel que decrit ci-dessus, dans lequel la solution de polyethyleneimine est a une concentration de 0,1 et 5%, notamment de 0,1 a 0,5%, de 0,5 a5 10 15 20 25 30 35 CA 03150552 2022-02-08 12 1%, de 1 a 2%, de 2 a 3%, de 3 a 4%, de 4 a 5% pour obtenir une bille de verre fonctionnalisee par du polyethyleneimine. Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un precede de preparation d’une bille de verre utilisee dans le dispositif tel que decrit ci-dessus, dans lequel le volume de la solution de polyethyleneimine utilise est compris de 4 pl a environ 0,5 L, notamment d’environ 4 a 25 pl, d’environ 25 a 50 pl, d’environ 50 a 100 pl, d’environ 100 a 250 pl, d’environ 250 a 500 pl, d’environ 500 pl a 1 ml, d’environ 1 a 2,5 ml, d’environ 2,5 a 5 ml, d’environ 5 a 25 ml, d’environ 25 a 50 ml, d’environ 50 a 100 ml, d’environ 100 a 250 ml, d’environ 250 ml a 0,5 L, pour obtenir une bille de verre fonctionnalisee par du polyethyleneimine. Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un precede de preparation d’une bille de verre utilisee dans le dispositif tel que decrit ci-dessus, comprenant une etape de mise en contact du polyethyleneimine avec une bille de verre, notamment pour une duree de 1 minute a 24 heures, dans lequel la solution de polyethyleneimine est notamment a une concentration entre 0,10 et 5%, et dans lequel le volume de la solution de polyethyleneimine utilise est notamment compris de 4 pl a 0,5 L, pour obtenir une bille de verre fonctionnalisee par du polyethyleneimine. La concentration et le volume de la solution de polyethyleneimine a utiliser sont dependants de la surface totale des billes a fonctionnaliser. 11 est possible de calculer ladite surface a partir de de la masse totale, la taille et la densite des billes utilisees. • La surface par bille peut etre calculee avec la formule 4?tr2 (r etant le rayon de la bille) • Le volume par bille peut etre calcule avec la formule (4/3)?tr3 (r etant le rayon de la bille) • Le volume total des billes peut etre calcule en divisant la masse totale des billes par la densite • Le nombre de billes peut etre calcule en divisant le volume total des billes par le volume par bille • Enfin, la surface totale des billes est obtenue par la multiplication de la surface par bille et le nombre de billes Une surface totale plus elevee necessite 1’utilisation d’une quantite plus importante de polyethyleneimine. Cette quantite plus importante peut etre apportee par 1’utilisation d’un volume de solution plus important, 1’utilisation d’une solution plus concentree, ou une combinaison des deux. A titre d’exemple, il est possible d’utiliser 0.5 ml d’une solution a 0.16 % de polyethyleneimine afin de fonctionnaliser 1 g de billes de 105-150 um (exemple 12). Dans ce cas, la surface totale des billes est d’environ 188 cm2 (lesdites billes ayant une densite des billes de 2.50 g/cm3).5 10 15 20 25 30 35 CA 03150552 2022-02-08 13 En revanche, 1 g de billes de 30-50 um ont une surface calculee plus importante (600 cm2). Dans ces conditions, en utilisant egalement une concentration en polyethyleneiminde de 0.16%, environ 3,2 fois plus de solution (600/188) est necessaire afin d’effectuer la fonctionnalisation dans les memes conditions que precedemment. Il est egalement possible d’utiliser 0.5 ml d’une solution 3,2 fois plus concentree, ou de modifier la concentration et le volume en appliquant une regie de trois. Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un precede de preparation d’une bille de verre utilisee dans le dispositif tel que decrit ci-dessus, comprenant une etape de sechage pour une duree de 1 minute a 12 heures, notamment de 1 a 5 minutes, de 5 a 10 minutes, de 10 a 15 minutes, de 15 a 20 minutes, de 20 a 25 minutes, de 25 a 30 minutes, de 30 minutes a 1 heure, de 1 a 2 heures, de 2 a 5 heures, de 5 a 12 heures, pour obtenir une bille de verre fonctionnalisee par du polyethyleneimine. Selon un autre mode de realisation encore plus particulier, la presente invention conceme un precede de preparation d’une bille de verre utilisee dans le dispositif tel que decrit ci-dessus, comprenant une etape de sechage pour une duree d’environ 10 minutes, pour obtenir une bille de verre fonctionnalisee par du polyethyleneimine adsorbe. Le temps de sechage d’environ 10 min correspond a la duree de 1’etape de sechage lorsque ce dernier est accelere a l’aide d’un systeme de chambre sous vide avec la depression reglee sur son maximum (-900 mbar au manometre avant ouverture de la vanne). Lorsque le sechage est realise a l’air libre, le temps de sechage est plus long et peut atteindre environ 12 heures. Au sens de la presente invention, on entend par « sechage » une methode de sechage a l’air libre ou accelere a l’aide d’un systeme de chambre sous vide, ou par lyophilisation. Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un precede de preparation tel que decrit ci-dessus, dans lequel 1’etape de sechage est effectuee a l’air libre ou acceleree par flux d’air, notamment a une temperature allant de la temperature ambiante a 90°C, notamment de la temperature ambiante a 80°C, de temperature ambiante a 60 °C, de temperature ambiante a 30 °C, de 30°C a 40°C, de 40°C a 50°C et de 50°C a 60°C, ou de 60 °C a 90 °C, pour obtenir une bille de verre fonctionnalisee par du polyethyleneimine. Au sens de la presente invention, on entend par « temperature ambiante », une temperature allant d’environ 20°C a environ 25°C.5 10 15 20 25 30 35 CA 03150552 2022-02-08 14 Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un precede de preparation tel que decrit ci-dessus, comprenant une etape de linkage avec une solution aqueuse, notamment de 1’eau, prealable a Tetape de sechage, pour eliminer le polyethyleneimine non adsorbee lors de 1’etape de mise en contact. Au sens de la presente invention, on entend par « solution aqueuse » une phase liquide contenant de 1’eau. Des exemples de solution aqueuses pouvant etre utilisees sont I’eau, des solutions aqueuses de NaCl IM ou de Tris 50 mM. L’objectif pendant le linkage peut etre de diminuer le pH a 1’aide d’une solution acide afin de maximiser les charges positives a la surface du polyethyleneimine ; il est possible dans ce cas d’utiliser des acides tels que l’acide citrique ou 1’acide acetique. Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un precede de preparation d’une bille de verre utilisee dans le dispositif tel que decrit ci-dessus, comprenant les etapes suivantes : une etape de mise en contact d’une solution de polyethyleneimine avec une bille de verre notamment pour une duree de 1 minute a 24 heures, dans lequel la solution de polyethyleneimine est notamment a une concentration entre 0,10 et 5%, et dans lequel le volume de la solution de polyethyleneimine utilise est notamment compris de 4 pl a 0,5 L, pour obtenir une bille de verre fonctionnalisee par du polyethyleneimine ; une etape de sechage pour une duree de 1 minute a 12 heures, en particulier une duree d’environ 10 minutes, dans lequel 1’etape de sechage est effectuee a 1’air libre ou acceleree par flux d’air, notamment a une temperature allant de la temperature ambiante a 90°C Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un precede de preparation tel que decrit ci-dessus, comprenant une etape de sechage d’une duree de 1 minute a 12 heures, en particulier une duree d’environ 10 minutes, a temperature ambiante. Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un precede de preparation d’une bille de verre utilisee dans le dispositif tel que decrit ci-dessus, comprenant les etapes suivantes : une etape de mise en contact d’une solution de polyethyleneimine avec une bille de verre notamment pour une duree de 1 minute a 24 heures, dans lequel la solution de polyethyleneimine est notamment a une concentration entre 0,10 et 5%, et dans lequel le volume de la solution de polyethyleneimine utilise est notamment compris de 4 pl a 0,5 L, pour obtenir une bille de verre fonctionnalisee par du polyethyleneimine ; une etape de rincagc avec une solution aqueuse, notamment de 1’eau, pour eliminer le polyethyleneimine non adsorbee lors de 1’etape de mise en contact ;5 10 15 20 25 30 35 CA 03150552 2022-02-08 15 une etape de sechage pour une duree de 1 minute a 12 heures, en particulier une duree d’environ 10 minutes, dans lequel 1’etape de sechage est effectuee a 1’air libre ou acceleree par flux d’air, notamment a une temperature allant de la temperature ambiante a 90°C. Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un precede de preparation tel que decrit ci-dessus, comprenant une etape de sechage d’une duree de 1 minute a 12 heures, en particulier une duree d’environ 10 minutes, a temperature ambiante. Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un precede de preparation d’une bille de verre utilisee dans le dispositif tel que decrit ci-dessus, comprenant les etapes suivantes : une etape de rin^age et de sechage des billes de verres avec de 1’eau ; une etape de mise en contact d’une solution de polyethyleneimine avec une bille de verre notamment pour une duree de 1 minute a 24 heures, dans lequel la solution de polyethyleneimine est notamment a une concentration entre 0,10 et 5%, et dans lequel le volume de la solution de polyethyleneimine utilise est notamment compris de 4 pl a 0,5 L, pour obtenir une bille de verre fonctionnalisee par du polyethyleneimine ; une etape de linkage avec une solution aqueuse, notamment de 1’eau, pour eliminer le polyethyleneimine non adsorbee lors de 1’etape de mise en contact ; une etape de sechage pour une duree de 1 minute a 12 heures, en particulier une duree d’environ 10 minutes, dans lequel 1’etape de sechage est effectuee a 1’air libre ou acceleree par flux d’air, notamment a une temperature allant de la temperature ambiante a 90°C. Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un precede de preparation tel que decrit ci-dessus, comprenant une etape de sechage d’une duree de 1 minute a 12 heures, en particulier une duree d’environ 10 minutes, a temperature ambiante. Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un precede de preparation d’une bille de verre utilisee dans le dispositif tel que decrit ci-dessus, dans lequel ladite solution de polyethyleneimine est exempte de borate. Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un precede de preparation d’une bille de verre utilisee dans le dispositif tel que decrit ci-dessus, dans lequel un agent de reticulation du polyethyleneimine n’est pas introduit.5 10 15 20 25 30 35 CA 03150552 2022-02-08 16 Un troisieme objet de 1’invention est 1’utilisation d’un dispositif tel que decrit ci-dessus, pour la captation de micro-organismes en vue d’un diagnostic. Au sens de la presente invention, on entend par « micro-organismes » des organismes microscopiques vivants ou morts. Des exemples de micro-organismes pouvant etre captes sont les bacteries, les levures, les champignons, les virus, les archees, les micro-algues, et certains parasites microscopiques. Au sens de la presente invention, on entend par « diagnostic » la detection des micro-organismes captes. Des exemples de techniques de diagnostic pouvant etre utilisees sont notamment la cytometric en flux ou en phase solide, la colorimetrie, la spectroscopic, la microscopic, 1’ATPmetrie (ATP : Adenosine triphosphate), la PCR (Polymerase Chain Reaction ou reaction en chaine par polymerase), la RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction ou reaction en chaine par polymerase apres transcription inverse), Tamplification isothermale, ou la detection immunologique. Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme une utilisation telle que decrite ci-dessus, pour la captation de micro-organismes en vue de Telimination ou de la diminution de la charge de micro-organismes d’echantillons liquides ou visqueux susceptibles de contenir lesdits micro-organismes. Au sens de la presente invention, on entend par « elimination ou de la diminution de la charge de micro-organismes » Taction de diminuer la quantite de micro-organismes presents dans un echantillon. Un autre objet de 1’invention est un procede de captation de micro-organismes comprenant une etape de mise en contact d’un echantillon liquide ou visqueux contenant les dits micro-organismes, avec un dispositif tel que decrit ci-dessus, dans des conditions permettant de creer une interaction entre les dits micro-organismes et les billes de verre, et d’obtenir les dits micro-organismes captes sur les billes de verre. Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un precede tel que decrit ci-dessus, dans lequel 1’etape de mise en contact d’un echantillon liquide ou visqueux contenant les dits micro-organismes est realisee en un seul passage dans le dispositif selon 1’invention et n’est pas effectuee de facon iterative. Un seul passage dans le dispositif selon 1’invention permet de capter quantitativement 1’ensemble des microorganismes presents dans ledit echantillon liquide ou visqueux. Par exemple, il n’est pas necessaire de faire de multiples passages de 1’echantillon liquide ou visqueux dans une colonne5 10 15 20 25 30 35 CA 03150552 2022-02-08 17 contenant les billes de verre fonctionnalisees pour capter ou concentrer les microorganismes dans la colonne. Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un precede tel que decrit ci-dessus, dans lequel la proportion de micro-organismes provenant de 1’echantillon et captes sur les billes de verre est comprise de 0,001% a 100% en vue de la debacterisation dudit echantillon. Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un precede tel que decrit ci-dessus, comportant une etape supplementaire d’elution des micro-organismes precedemment captes dans des conditions permettant la separation des susdits micro-organismes captes des susdites billes de verre et la recuperation des dits micro-organismes. L’elution avec une solution chimique est realisee a temperature ambiante. Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un precede tel que decrit ci-dessus, dans lequel lors de 1’etape d’elution la proportion des micro-organismes separes des billes de verre sur lesquelles les susdits micro-organismes avaient ete precedemment captes, puis recuperes est comprise de 0,001% a 100%. Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un precede tel que decrit ci-dessus, dans lequel la recuperation des micro-organismes est effectuee en vue d’un diagnostic. Ce diagnostic peut etre qualitatif, de type presence/absence, ou quantitatif. Il peut etre specifique ou non du type de microorganisme, et differencier ou non les cellules vivantes des cellules mortes. Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un precede tel que decrit precedemment, comprenant : une etape de mise en contact, de preference non iterative, d’un echantillon liquide ou visqueux contenant les dits micro-organismes, avec des billes de verre contenues dans le dispositif decrit ci-dessus, dans des conditions permettant de creer une interaction entre les dits microorganismes et les billes de verre, et d’obtenir les dits micro-organismes captes sur les billes de verre, une etape supplementaire d’elution des micro-organismes precedemment captes dans des conditions permettant la separation des susdits micro-organismes captes des susdites billes de verre et la recuperation des dits micro-organismes. Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un precede tel que decrit ci-dessus, dans lequel 1’etape d’elution est realisee en utilisant une solution de type chimique.5 10 15 20 25 30 35 CA 03150552 2022-02-08 18 Au sens de la presente invention, les solutions d’elution de type chimique pouvant etre utilisees sont par exemples : NaCl IM, Tris 50mM pH 7,5, Tris 50mM pH 9,5, sodium hexametaphosphate 0,01% a 0,1% EDTA 0,1 a 10%, bicarbonate de soude 1%, citrate de sodium 10%, acide acetique 0,1 a 10%, methanol 0,1 a 10%, pluronic F-127 0,01 a 0,1% (poloxamere 407, copolymere non-ioniques a trois blocs : Poly(ethylene glycol)-block-poly(propylene glycol)-block-poly(ethylene glycol)). Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un procede tel que decrit ci-dessus, dans lequel la mise en contact de Techantillon avec les billes de verre ou le dispositif a lieu de facon statique ou en flux. Au sens de la presente invention, on entend par « de faqon statique », le fait que la mise en contact entre Techantillon et les billes de verre a lieu dans un recipient sans qu’il y ait un mouvement continu de Techantillon et que Techantillon ne soit renouvele au cours de la mise en contact. La mise en contact de fa?on statique necessite qu’a la fin du temps de contact Techantillon soit separe des billes de verre. Cette etape peut par exemple se realiser par aspiration du liquide a travers un fritte ou par prelevement du liquide. Lorsque le procede de captation est realise en statique, Tetape de mise en contact de Techantillon nontenant les micro-organismes avec des billes de verre est realisee sur une duree de 5 a 15 minutes avant que 1’aspiration ne soit declenchee et realisee a 1’aide de la chambre a vide. Au sens de la presente invention, on entend par « en flux », le fait que la mise en contact entre Techantillon et les billes de verre ait lieu dans un recipient permettant de faire s’ecouler de faqon continue Techantillon entre les billes de verre. Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un procede tel que decrit ci-dessus, dans lequel les micro-organismes sont choisis parmi les bacteries, et les Fungi, notamment les levures et les champignons. Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un procede tel que decrit ci-dessus, dans lequel les Fungi appartiennent aux genres Absidia, Altemaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botrytis, Brettanomyces, Byssochlamys, Candida, Chaetomium, Cladosporium, Colletotrichum, Cryptococcus, Debaryomyces, Emericella, Epicoccum, Eupenicillium, Eurotium, Fusarium, Galactomyces, Geotrichum, Gliocladium, Hanseniaspora, Humicola, Hyphopichia, Kluyveromyces, Lichtheimia, Lodderomyces, Meyerozyma, Monascus, Mucor, Mycocladus, Neosartorya, Nigrospora, Paecilomyces, Penicillium, Pestalotia, Phoma, Phytophthora, Pichia, Pythium, Rhizoctonia, Rhizopus, Rhodotorula, Saccharomyces, Saccharomycopsis, Schizosaccharomyces, Sclerotinia, Scopulariopsis, Serpula, Stemphylium Talaromyces, Thielaviopsis,5 10 15 20 25 30 35 CA 03150552 2022-02-08 19 Torulaspora, Trichoderma, Trichosporon, Trichothetium, Ulocladium, Verticillium, Wallemia, Wickerhamomyces, Xylaria, Zygosaccharomyces. Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un procede tel que decrit ci-dessus, dans lequel les bacteries sont des bacteries Gram + ou Gram Les bacteries Gram + sont mises en evidence par la technique de coloration de Gram. Apres coloration, lesdites bacteries apparaissent en couleur mauve lors d’une analyse microscopique. En revanche, les bacteries Gram - ne sont pas colorees en mauve a 1’issue du test de coloration de Gram. Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un procede tel que decrit ci-dessus, dans lequel les bacteries appartiennent aux genres Acetobacter, Achromobacter, Acidovorax, Acinetobacter, Actinomyces, Aerococcus, Aeromonas, Alcaligenes, Alicyclobacillus, Aquaspirillum, Asaia, Bacillus, Bifidobacterium sp., Bordetella, Brachybacterium, Brevibacillus, Brevibacterium, Brevundimonas, Burkholderia, Buttiauxella, Campylobacter, Carnobacterium, Cellulomona, Citrobacter, Clavibacter Clostridium, Corynebacterium, Cronobacte, Cupriavidu, Curtobacterium, Elizabethkingia, Enteractinococcus, Enterobacter, Enterococcus, Escherichia, Flacklamia, Flavobacterium, Geobacillus, Glutamicibacte, Halobacillus, Klebsiella, Kocuria, Lactobacillus, Lactococcus, Leclercia, Lelliottia, Leuconostoc, Lysinibacillus, Macrococcus, Methylobacteriu, Microbacterium spp. (CDC A-5), Micrococcus, Moraxell, Mycobacterium, Nesterenkonia, Oceanobacillus sp, Ochrobactrum, Paenibacillus, Pandorae, Pantoea, Paracoccus, Pasteurell, Pediococcus, Propionibacterium, Proteus, Pseudomonas, Ralstonia, Rhizobium, Roseomona, Rothia, Salmonella, Sanguibacter, Serratia, Shewanella, Sphingomonas, Sporolactobacillus, Sporosarcina, Staphylococcus, Stenotrophomonas, Streptococcus, Streptomyces, Thermoanaerobacterium, Variovorax, Virgibacillus. Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un procede tel que decrit ci-dessus, dans lequel 1’echantillon liquide ou visqueux est choisi parmi : un echantillon biologique, humain ou veterinaire, tel que I’urine, le sang, le liquide synovial, la lymphe, le liquide lacrymal, les secretions, les muqueuses, un echantillon pharmaceutique, tel que les solutions injectables, les sirops, les vaccins, les collyres, les gels ophtalmiques, un echantillon cosmetique, tel que les demaquillants, produits pour le nettoyage de la peau, deodorants, produits destines au rasage, autobronzants, cremes de protection solaire, dissolvants, shampoings, apres-shampoings,5 10 15 20 25 30 35 CA 03150552 2022-02-08 20 un echantillon alimentaire, tel que les boissons, notamment 1’eau (plate, petillante et/ou aromatisee), le lait, les jus de fruits, tel que le jus d’orange, les sodas, les boissons alcoolisees, les boissons a base de the, les viandes, les plats cuisines, les produits laitiers, les ovoproduits, Un echantillon d’eaux de process, tel qu’un echantillon issu des boucles de nettoyage, de 1’eau de production, Un echantillon de type environnemental, tel que des echantillons marins, ou pluviaux. Au sens de la presente invention, on entend par « echantillon biologique », un echantillon provenant d’un liquide corporel ou d’un tissu d’un corps humain ou animal. Des exemples d’echantillons biologiques pouvant etre utilisees sont 1’urine, le sang, le liquide synovial, la lymphe, le liquide lacrymal, les secretions, les muqueuses. Au sens de la presente invention, on entend par « echantillon pharmaceutique », un echantillon provenant d’un produit pharmaceutique contenant des substances chimiques, naturelles ou synthetiques a usage humain ou veterinaire. Des exemples d’echantillons pharmaceutiques pouvant etre utilises sont les solutions injectables, les sirops, les vaccins, les collyres, les gels ophtalmiques, les solutions nasales, les complements de vaccination rendus liquide, les poudres rendues liquide. Au sens de la presente invention, on entend par « echantillon cosmetique », un echantillon provenant d’un produit cosmetique contenant une substance ou un melange destine a etre mise en contact avec les diverses parties superficielles du corps humain, en vue, exclusivement ou principalement, de les nettoyer, de les parfiimer, d'en modifier 1'aspect, de les proteger, de les maintenir en bon etat ou de corriger les odeurs corporelles. Des exemples d’echantillons cosmetiques pouvant etre utilises sont les demaquillants, produits pour le nettoyage de la peau, deodorants, produits destines au rasage, autobronzants, cremes de protection solaire, dissolvants, shampoings, apres-shampoings, lotions demaquillantes, cremes, emulsions, savons, agents de nettoyage. Au sens de la presente invention, on entend par « echantillon alimentaire », un echantillon provenant d’un produit alimentaire pouvant servir de nourriture ou de boisson a un etre humain ou animal. Des exemples d’echantillons alimentaires pouvant etre utilises sont les boissons, notamment 1’eau (plate, petillante et/ou aromatisee), le lait, les jus de fruits, les sodas, les boissons alcoolisees, les5 10 15 20 25 30 CA 03150552 2022-02-08 21 boissons a base de the, les viandes, les plats cuisines, les produits laitiers, les ovoproduits, la charcuterie, les poissons, les ceufs, les soupes, les concentres de fruits. Au sens de la presente invention, on entend par « echantillon d’eaux de process », un echantillon provenant d’une usine de production, notamment un echantillon d’eau entrant dans un precede de production. Des exemples d’echantillons d’eaux de process pouvant etre utilises sont des echantillons issu des boucles de nettoyage, de 1’eau de production, une tour de lavage, une tour aerorefrigerante. Au sens de la presente invention, on entend par « echantillon de type environnemental », un echantillon provenant de I’environnement. Des exemples d’echantillons de type environnementaux sont pouvant etre utilises sont des echantillons de sols, d’eau, notamment d’eau de mer, riviere, fleuve. Un autre objet de 1’invention est un kit comprenant des billes de verre, du polyethyleneimine et un dispositif sous forme de colonne et des solutions d’elution de type chimique. Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un kit comprenant des billes de verre, du polyethyleneimine et un dispositif sous forme de colonne et des solutions d’elution de type chimique, pour la captation de micro-organismes en vue d’un diagnostic, ou en vue de 1’elimination ou de la diminution de la charge de micro-organismes d’echantillons liquides ou visqueux susceptibles de contenir lesdits micro-organismes. Selon un autre mode de realisation particulier, la presente invention conceme un kit comprenant des billes de verre, du polyethyleneimine et un dispositif sous forme de colonne pour son utilisation pour mettre en oeuvre le dispositif selon 1’invention et des solutions d’elution de type chimique, pour la captation de micro-organismes en vue d’un diagnostic, ou en vue de 1’elimination ou de la diminution de la charge de micro-organismes d’echantillons liquides ou visqueux susceptibles de contenir lesdits micro-organismes. Description des figures [Fig 1A] Figure 1A : Principe general de fonctionnement de captation/elimination des microorganismes en mode flux La Figure 1A represente le principe general de fonctionnement de la captation/elimination des microorganismes en mode flux.5 10 15 20 25 30 35 CA 03150552 2022-02-08 22 1 represente 1’ajout de la solution potentiellement contaminee ; 2 represente la colonne ; 3 represente les billes de verre fonctionnalisees a 1’aide de polyethyleneimine ; 4 represente le fritte ; 5 represente la solution depourvue de ses microorganismes a la sortie de la colonne ; 6 represente un grossissement des microorganismes immobilises au contact des billes fonctionnalisees. [Fig IB] Figure IB : Principe general de fonctionnement de 1’elution en mode flux 1 represente 1’ajout de la solution d’elution ; 2 represente la solution d’elution a la sortie de la colonne contenant les microorganismes precedemment immobilises. [Fig 2A] Figure 2A : Principe general de fonctionnement de captation/elimination des microorganismes en mode statique La Figure 2A represente le principe general de fonctionnement de la captation/elimination des microorganismes en mode statique. 1 represente 1’ajout de la solution potentiellement contaminee ; 2 represente le contenant ; 3 represente la solution potentiellement contaminee mise en contact avec les billes de verre ; 4 represente les billes de verre fonctionnalisees a l’aide de polyethyleneimine ; 5 represente un grossissement des microorganismes immobilises au contact des billes fonctionnalisees ; 6 represente la recuperation ou 1’elimination de la solution depourvue de ses microorganismes. [Fig 2B] Figure 2B : Principe general de fonctionnement de 1’elution en mode statique 1 represente 1’ajout de la solution d’elution ; 2 represente le prelevement de la solution d’elution pourvue des microorganismes elues. EXEMPLES Exemple 1 Protocole generale d’adsorption du polyethyleneimine sur les billes de verre 1g de billes de verre de diametre 105-150 pm (ref. 15927, Polysciences Europe GmbH, Germany) sont pesees directement dans des colonnes de filtration 2,4 mL en polypropylene munies d’un fritte en PEHD de porosite 45-90 pm (ref. 208-3049-03S, Evergreen Scientific, USA). L’ensemble est place sur une plaque adaptee pour pouvoir placer 24 colonnes simultanement (NucleoVac Adapter Plate, ref.740694, Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Germany) qui s’integre a une chambre a vide NucleoVac96 (ref. 740681, Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Germany). Le tout est relie a une pompe a vide KNF type N816.1.2KN.45.18 (KNF Neuberger SAS, France). Une solution de polyethyleneimine ramifie (1,3 kDa, ref. 482595 Sigma-Aldrich) a 0,166% dans de 1’eau desionisee biologique (Ref. W4502, Sigma-Aldrich, Merck KGaA, Darmstadt, Germany) est additionnee a chaque colonne. Le melange est homogeneise pendant 10 minutes a l’aide d’une pointe a filtre de 10 pl, suivi d’un rincage par de 1’eau de biologic moleculaire (1 ml). Pour chaque aspiration, la pompe a5 10 15 20 25 30 35 CA 03150552 2022-02-08 23 vide est reglee sur 700 mbar de depression. Apres linkage, les colonnes sont fonctionnalisees et pretes a 1’emploi. Exemple 2 : Preparation des souches Les souches de microorganismes ont ete decongelees a 1’aide d’une cryobille dans un milieu liquide ou solide approprie avant d’etre placees a une temperature permettant leur croissance pendant le temps necessaire a leur croissance. Les souches ont subi deux repiquages minimums a 2% dans un milieu liquide approprie ou par transfert sur milieu solide avant d’etre utilisees pour les essais. Exemple 3 : Preparation des suspensions de travail Les suspensions fdles ont ete realisees dans de 1’eau supplementee ou non de NaCl a 0,85% par dilutions successives (habituellement au dixieme). A partir des suspensions fdles realisees, des matrices liquides (jus de fruits, sodas, eaux plates, gazeuses, aromatisees ou pas) ont ete inoculees afin de contenir des microorganismes pour les essais. Pour ce faire, la derniere dilution a ete realisee dans la matrice a tester. Exemple 4 : Protocole general de captation en statique Un faible volume (de 500 pL a 1 mL) de solution contenant une quantite donnee de microorganismes (de 20 a -107 unites) a ete introduit dans une colonne contenant 1g de billes de verre fonctionnalisees par du polyethyleneimine. Un temps de contact de 5 a 15 min a ete applique avant que l’aspiration ne soit declenchee et realisee a 1’aide de la chambre a vide, la depression de la pompe etant fixee sur 50 mbar. Exemple 5 : Protocole general de captation en flux Un volume donne (de 500 pL a 100 mL) de solution contenant une quantite donnee de microorganismes (de 20 a -107 unites) a ete filtre a travers une colonne contenant 1g de billes de verre fonctionnalisees par du polyethyleneimine. L’aspiration a ete declenchee avant 1’introduction de la solution et a ete realisee a l’aide de la chambre a vide, la depression de la pompe a ete fixee sur 50 mbar. Exemple 6 : Protocole general d’elution chimique Apres passage de 1’echantillon d’interet au travers de la colonne, une solution d’elution a ete introduite afin de proceder au decrochage des microorganismes. La quantite de solution d’elution a ete variable mais a ete au minimum de 500 pL afin de recouvrir toutes les billes presentes dans la colonne. La solution a ete de nature chimique. Toutes les solutions chimiques (NaCl IM, Tris 50mM pH 7,5, Tris 50mM pH 9,5, sodium hexametaphosphate 0,01% a 0,1 EDTA 0,1 a 10%, bicarbonate de soude 1%, sodium citrate 10%,5 10 15 20 25 30 35 CA 03150552 2022-02-08 24 acide acetique 0,1 a 10%, methanol 0,1 a 10%, pluronic F-127 0,01 a 0,1%) ont ete preparees a 1’aide d’eau desionisee puis filtree sur filtre 0,2 pm. Les pourcentages cites precedemment correspondent a un rapport poids/volume d’eau (g/100 mL). L’aspiration a ete declenchee avant introduction de la solution ou apres un temps de contact plus ou moins important (5 minutes minimum testees). La filtration a ete realisee a l’aide de la chambre a vide, la depression de la pompe etant fixee sur 700 mbar. Exemple 7 : Evaluation du taux de captation et/ou d’elution L’evaluation du taux de captation ou d’elution a pu etre realisee de famous differentes en fonction de la quantite de microorganismes presents et du volume de solution a analyser. Il a par exemple ete possible d’evaluer le nombre de microorganismes presents dans une solution donnee a l’aide (1) de la cytometrie en flux, (2) de la filtration sur membrane deposee sur milieu gelose, (3) par observation au microscope ou encore (4) de 1’etalement sur boite de Petri. Exemple 7-1 : Evaluation du taux de captation et/ou d’elution par cytometrie en flux La cytometrie en flux a necessite une concentration en microorganisme relativement importante pour obtenir un resultat fiable (—105 UFC/mL). Les resultats en termes de taux de captation et d’elution ont ete obtenus comme decrits ci-apres. Les permeats obtenus apres captation ont ete analyses au cytometre pour evaluer le nombre de microorganismes non captes. Il a ainsi ete possible de deduire le nombre de microorganismes captes sur la colonne etant donne que la quantite de microorganismes prealablement introduits dans la colonne est connue (denombrement realise au cytometre). Pour 1’elution, le nombre de microorganismes elues a directement ete mesure a l’aide du cytometre. A noter qu’il a ete possible de marquer les microorganismes ce qui a perrnis a la fois de mieux discriminer les microorganismes du bruit de fond et en meme temps de decrire leur etat physiologique (vivants ou morts) a un instant donne. Exemple 7-2 : Evaluation du taux de captation et/ou d’elution par filtration sur membrane deposee sur milieu gelose La filtration sur membrane a perrnis, elle, de concentrer les microorganismes. Il a ensuite ete possible de deposer cette membrane sur un milieu favorable a leur croissance a une temperature donnee et pendant un temps defini. Les fdtrations independantes des permeats et des eluats ont perrnis ainsi de calculer les taux de captation et d’elution de la meme maniere que pour la cytometrie en flux. Pour cela, il a ete necessaire de compter les colonies sur la membrane apres le temps d’incubation. Exemple 7-3 : Evaluation du taux de captation et/ou d’elution par filtration sur membrane pour observation au microscope5 10 15 20 25 30 35 CA 03150552 2022-02-08 25 La filtration sur membrane a permis de concentrer les microorganismes et de les observer apres marquage directement an microscope. De la meme maniere que precedemment, il a ensuite ete necessaire de compter les microorganismes presents sur la membrane a l’aide d’un microscope. Pour rappel, les marqueurs permettent de decrire 1’etat physiologique des microorganismes (vivants ou morts) a un instant donne ce que ne permet pas la croissance sur membrane en boite de Petri (Exemple 7-2) ou 1’etalement sur milieu gelose (Exemple 7-4) pour lesquels seuls les microorganismes viables et cultivables sont observables, et ce, au minimum 24 heures apres le depot. Exemple 7-4 : Evaluation du taux de captation et/ou d’elution par filtration sur membrane pour de 1’etalement sur boite de Petri Une autre methode consiste en 1’etalement de tout ou une partie des permeats et des eluats sur un milieu gelose (en boite de Petri) favorable a la croissance des microorganismes. Cette methode a necessite un temps d’incubation variable a une temperature donnee. De la meme maniere que precedemment, il a ensuite ete necessaire de compter les microorganismes presents sur la boite afin d’en deduire les taux de captation et d’elution, le nombre de microorganismes introduits etant connu grace a la meme methode d’etalement. Exemple 8 : Protocole de fonctionnalisation des billes de verre 300 mg de billes de verre de diametre 30-50 pm ont ete reparties dans des colonnes de 0,8 mL munies d’un fritte de 20 pm. 142,8 pL d’une solution aqueuse de polyethyleneimine (ramifie, 25 kDa) a 0,5% (m/v) ont ete ajoutes dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 5 min a ete respecte entre les billes et le polyethyleneimine. La solution a ensuite ete eliminee a l’aide d’un systeme de chambre a vide et d’une pompe reglee sur 50 mbar de depression. Un rin<?age de la colonne a ete realise a l’aide de 1 mL d’eau de biologic moleculaire avec la meme depression. La pompe a ensuite ete reglee sur 700 mbar de depression pour un sechage pendant 5 minutes. Apres cette etape, les billes de verre fonctionnalisees par du polyethyleneimine ont ete pretes a 1’emploi. Protocole de captation/elimination des micro-organismes Dans un premier temps, un denombrement de la suspension mere d’Escherichia coli CIP 54.8 a ete realise par dilutions successives au dixieme dans de 1’eau physiologique 0,85% NaCl et etalements sur milieux geloses en boite de Petri, ainsi qu’en cytometrie. 500 pL de suspension a la concentration souhaitee ont ete ajoutes par colonne et le procede de captation a ete realise en flux a l’aide du systeme de chambre a vide. La depression a ete reglee sur 50 mbar. Les 500 pL de suspension ayant traverse la colonne ont ete collectes dans un tube puis un denombrement a ete realise par dilutions successives au dixieme dans de 1’eau physiologique 0,85% NaCl et etalements sur milieux geloses en boite de Petri, ainsi que par cytometrie.5 10 15 20 25 CA 03150552 2022-02-08 WO 2021/083907 26 PCT/EP2020/080199 Efficacite de la captation/elimination des micro-organismes Le Tableau 1 presente le nombre d’Unites Formant Colonie (UFC) introduites et le taux de captation correspondant, evalue par etalement sur milieux geloses en boite de Petri. Colonne UFC introduites Pourcentage de captation Moyenne 1 2 9.82x10s 90.28% 9.82x10s 71.99% 76.66% 3 9.82x10s 67.73% Tableau 1 Resultats de la captation de microorganismes Le Tableau 2 presente le nombre d’Unites Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant, evalue par cytometrie. Tableau 2 Resultats de la captation de microorganismes Colonne UFC introduites Pourcentage de captation Moyenne 1 1.46x107 91.27% 2 1.46X107 77.48% 80.10% 3 1.46xl07 71.53% Exemple 9 : Protocole de fonctionnalisation des billes de verre 300 mg de billes de verre de diametre 30-50 pm ont ete reparties dans des colonnes de 0,8 mL munies d’un fritte de 20 pm. 142,8 pL d’une solution aqueuse de polyethyleneimine (ramifie, 1,3 kDa) a 0,5% (m/v) ont ete ajoutees dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 5 min a ete respecte entre les billes et le polyethyleneimine. La solution a ensuite ete eliminee a l’aide d’un systeme de chambre a vide et d’une pompe reglee sur 50 mbar de depression. Un Engage de la colonne a ete realise a l’aide de 1 mL d’eau de biologie moleculaire avec la meme depression. La pompe a ensuite ete reglee sur 700 mbar de depression pour sechage durant 5 min. Apres cette etape, les billes de verre fonctionnalisees par du polyethyleneimine ont ete pretes a 1’emploi. Protocole de captation/elimination des micro-oiganismes Dans un premier temps, un denombrement de la suspension mere &Escherichia coli CIP 54.8 a ete realise par dilutions successives au dixieme dans de 1’eau physiologique 0,85% NaCl et etalements sur milieux geloses en boite de Petri, ainsi qu’en cytometrie. 500 pL de suspension a la concentration5 10 15 20 CA 03150552 2022-02-08 WO 2021/083907 27 PCT/EP2020/080199 souhaitee ont ete ajoutes par colonne et le procede de captation a ete realise en flux a l’aide du systeme de chambre a vide. La depression a ete reglee sur 50 mbar. Les 500 pL de suspension ayant traverse la colonne ont ete collectes dans un tube puis un denombrement a ete realise par dilutions successives au dixieme dans de 1’eau physiologique 0,85% NaCl et etalements sur milieux geloses en boite de Petri, ainsi que par cytometrie. Efficacite de la captation/elimination des micro-organismes Le Tableau 3 presente le nombre d’Unites Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant, evalue par etalement sur milieux geloses en boite de Petri. Colonne UFC introduites Pourcentage de captation Moyenne 1 9.64x10s 95.71% 2 9.64x10« 91.56% 93.27% 3 9.64x10« 92.55% 4 9.64x104 93.54% 5 9.64x10« 92.97% 93.52% 6 9.64x10« 94.06% Tableau 3 Resultats de la captation de microorganismes Le Tableau 4 presente le nombre d’Unites Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant, evalue par cytometrie. Colonne UFC introduites Pourcentage de captation Moyenne 1 1.25x10’ 96.98% .,7. 1.25x10’ 92.58% 94.37% /3; 1.25x10’ 93.54% 1.25x10s 94.04% 1.25x10s 93.81% 94.02% 6 1.25xlO5 94.20% Tableau 4 Resultats de la captation de microorganismes Exemple 10 :5 10 15 20 25 30 CA 03150552 2022-02-08 28 Protocole de fonctionnalisation des billes de verre 300 mg de billes de verre de diametre 30-50 gm ont ete reparties dans des colonnes de 0,8 mL munies d’un fritte de 20 pm. 142,8 pL d’une solution aqueuse de polyethyleneimine (ramifie, 1,3 kDa) a 0,5% (m/v) ont ete ajoutes dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 5 min a ete respecte entre les billes et le polyethyleneimine. La solution a ensuite ete eliminee a l’aide d’un systeme de chambre a vide et d’une pompe reglee sur 50 mbar de depression. Un linkage de la colonne a ete realise a l’aide de 1 mL d’eau de biologie moleculaire avec la meme depression. La pompe a ensuite ete reglee sur 700 mbar de depression pour sechage durant 5 min. Apres cette etape, les billes de verre fonctionnalisees par du polyethyleneimine ont ete pretes a 1’emploi. Protocole de captation/elimination des micro-organismes Dans un premier temps, un denombrement de la suspension mere d’Escherichia coli CIP 54.8 a ete realise par dilutions successives au dixieme dans de 1’eau physiologique 0,85% NaCl et etalements sur milieux geloses en boite de Petri. 500 pL de suspension a la concentration souhaitee ont ete ajoutes par colonne et le procede de captation a ete realise en flux a l’aide du systeme de chambre a vide. La depression a ete reglee sur 50 mbar. Les 500 pL de suspension ayant traverse la colonne ont ete collectes dans un tube puis un denombrement est realise par dilutions successives au dixieme dans de 1’eau physiologique 0,85% NaCl et etalements sur milieux geloses en boite de Petri. Protocole d’elution des micro-organismes 2 elutions successives au NaCl IM de 500 pL chacune ont ete realisees par colonne. Les deux elutions ont ete realisees en respectant un temps de contact de 5 min a temperature ambiante. L’aspiration a ete realisee a 50 mbar de depression. Les deux eluats ont ete collectes dans des tubes differents a l’aide du systeme de chambre a vide. Les 500 pL d’eluat ayant traverse la colonne ont ete collectes dans un tube puis un denombrement a ete realise par dilutions successives au dixieme dans de 1’eau physiologique 0,85% NaCl et etalements sur milieux geloses en boite de Petri. Efficacite de la captation/elimination des micro-organismes Le Tableau 5 presente le nombre d’Unites Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant, evalue par etalement sur milieux geloses en boite de Petri.5 10 15 20 25 CA 03150552 2022-02-08 Tableau 5 Resultats de la captation de microorganismes WO 2021/083907 29 PCT/EP2020/080199 Colonne UFC introduites Pourcentage de captation Mayenne? 1 9.50x10s 87.80% 2 9.50x10s 89.04% 88.16% 3 9.50x10s 87.66% Efficacite de relation Le Tableau 6 presente le taux d’elution correspondant a chaque colonne. Colonne Pourcentage cumule d’elution Moyenne 1 83.27% 2 88.34% 88.46% 3 93.78% Tableau 6 Resultats de 1’elution de microorganismes Le rendement global est done de 77,98%. Exemple 11 : Protocole de fonctionnalisation des billes de verre 300 mg de billes de verre de diametre 30-50 pm ont ete reparties dans des colonnes de 0,8 mL munies d’un fritte de 20 pm. 142,8 pL d’une solution aqueuse de polyethyleneimine (ramifie, 1,3 kDa) a 0,5% (m/v) ont ete ajoutes dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 5 min a ete respecte entre les billes et le polyethyleneimine. La solution a ensuite ete eliminee a l’aide d’un systeme de chambre a vide et d’une pompe reglee sur 50 mbar de depression. Un rinqage de la colonne a ete realise a l’aide de 1 mL d’eau de biologie moleculaire avec la meme depression. La pompe a ensuite ete reglee sur 700 mbar de depression pour sechage durant 5 min. Apres cette etape, les billes de verre fonctionnalisees par du polyethyleneimine ont ete pretes a 1’emploi. Protocole de captation/elimination des micro-oiganismes Dans un premier temps, un denombrement de la suspension mere d’Escherichia coli CIP 54.8 a ete realise par dilutions successives au dixieme dans de 1’eau physiologique 0,85% NaCl et etalements sur milieux geloses en boite de Petri. 500 pL de suspension a la concentration souhaitee ont ete ajoutes par colonne et l’aspiration a ete realisee apres un temps de contact de 5 min de la solution avec les billes contenues dans la colonne. L’aspiration a ete realisee a l’aide du systeme de chambre a vide. La5 10 15 20 25 CA 03150552 2022-02-08 30 depression a ete reglee sur 50 mbar. Les 500 pL de suspension ayant traverse la colonne ont ete collectes dans un tube puis un denombrement a ete realise par dilutions successives au dixieme dans de 1’eau physiologique 0,85% NaCl et etalements sur milieux geloses en boite de Petri. Protocole d’elution des micro-organismes Une elution au NaCl IM de 500 pL a ete realisee par colonne. L’elution a ete realisee en respectant un temps de contact de 5 min a temperature ambiante. L’aspiration a ete realisee a 50 mbar de depression. Les 500 pL d’eluat ayant traverse la colonne ont ete collectes dans un tube puis un denombrement a ete realise par dilutions successives au dixieme dans de 1’eau physiologique 0,85% NaCl et etalements sur milieux geloses en boite de Petri. Efficacite de la captation/elimination des micro-organismes Le Tableau 7 presente le nombre d’Unites Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant, evalue par etalement sur milieux geloses en boite de Petri. Colonne UFC introduites Pourcentage de captation Moyenne 1 1.27xlO7 96.85% 2 1.27xlO7 96.95% 96.69% 3 1.27xlO7 96.27% Tableau 7 Resultats de la captation de microorganismes Efficacite de l’elution Le Tableau 8 presente le taux d’elution correspondant a chaque colonne. Colonne Pourcentage cumule d’elution Moyenne 1 73.94% 2.. 86.51% 81.53% 3 84.14% Tableau 8 Resultats de l’elution de microorganismes Le rendement global est done de 78,83%. Exemple 12 : Protocole de fonctionnalisation des billes de verre5 10 15 20 25 30 CA 03150552 2022-02-08 31 956 mg de billes de verre de diametre 105-150 pm ont ete reparties dans des colonnes de 0,8 mL munies d’un fritte de 20 pm. 455,1 pL d’une solution aqueuse de polyethyleneimine (ramifie, 1,3 kDa) a 0,16% (m/v) ont ete ajoutes dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 5 min a ete respecte entre les billes et le polyethyleneimine. La solution a ensuite ete eliminee a l’aide d’un systeme de chambre a vide et d’une pompe reglee sur 50 mbar de depression. Un linkage de la colonne a ete realise a l’aide de 1 mL d’eau de biologie moleculaire avec la meme depression. Protocole de captation/elimination des micro-organismes Dans un premier temps, un denombrement au cytometre de la suspension mere d’Escherichia coli CIP 54.8 a ete realise par dilutions successives au dixieme dans de 1’eau physiologique 0,85% NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5. 500 pL de suspension a la concentration souhaitee ont ete ajoutes par colonne et le precede de captation a ete realise en flux a l’aide du systeme de chambre a vide. La depression a ete reglee sur 50 mbar. Les 500 pL de suspension ayant traverse la colonne ont ete collectes dans un tube puis un denombrement au cytometre a ete realise par dilutions successives au dixieme dans de 1’eau physiologique 0,85% NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5. Protocole d’elution des micro-organismes Trois elutions successives a l’aide de 500 pL de solution d’elution (Tris 50 mM pH 9,5, NaCl IM) ont ete realisees par colonne. Les elutions ont ete realisees en respectant systematiquement un temps de contact de 5 min a temperature ambiante. L’aspiration a ete realisee a 50 mbar de depression. Les 500 pL d’eluat ayant traverse la colonne ont ete collectes dans un tube puis un denombrement au cytometre est realise par dilutions successives au dixieme dans de 1’eau physiologique 0,85% NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5 Efficacite de la captation/elimination des micro-organismes Le Tableau 9 presente le nombre d’Unites Formant Colonie introduces et le taux de captation correspondant, evalue par cytometric. Tableau 9 Resultats de la captation de microorganismes Colonne UFC introduces Pourcentage de captation /Mayenne 1 1.72xl07 82.15% •2- 1.72x10' 82.50% 82.83% 3 1.72x10’ 83.85% Efficacite de 1’elution5 10 15 20 25 30 CA 03150552 2022-02-08 32 Le Tableau 10 presente la colonne et le taux d’elution correspondant evalue par cytometrie. Tableau 10 Resultats de 1’elution de microorganismes Le rendement global est done de 75,24%. Colonne Pourcentage cumule d’elution 1 91.84% 2 96.58% 90.8451 3 84.11% Exemple 13 : Protocole de fonctionnalisation des billes de verre 300 mg de billes de verre de diametre 30-50 pm ont ete reparties dans des colonnes de 0,8 mL munies d’un fritte de 20 pm. 142,8 pL d’une solution aqueuse de polyethyleneimine (ramifie, 1,3 kDa) a 0,5% (m/v) ont ete ajoutes dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 5 min a ete respecte entre les billes et le polyethyleneimine. La solution a ensuite ete eliminee a 1’aide d’un systeme de chambre a vide et d’une pompe reglee sur 50 mbar de depression. Un linkage de la colonne a ete realise a l’aide de 1 mL d’eau de biologie moleculaire avec la meme depression. La pompe a ensuite ete reglee sur 700 mbar de depression pour sechage durant 5 min. Apres cette etape, les billes de verre fonctionnalisees par du polyethyleneimine ont ete pretes a I’emploi. Protocole de captation/elimination des micro-organismes Dans un premier temps, un denombrement au cytometre des suspensions meres de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa ATCC 13388 et Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis ATCC 13076 a ete realise par dilutions successives au dixieme dans de 1’eau physiologique 0,85% NaCl du Tris 50 mM pH 7,5. 500 pL de suspension a la concentration souhaitee ont ete ajoutes par colonne et le procede de captation a ete realise en flux a l’aide du systeme de chambre a vide. La depression a ete reglee sur 50 mbar. Les 500 pL de suspension ayant traverse la colonne ont ete collectes dans un tube puis un denombrement au cytometre a ete realise par dilutions successives au dixieme dans de 1’eau physiologique 0,85% NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5. Efficacite de la captation/elimination des micro-oiganismes Le Tableau 11 presente le nombre d’Unites Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant, evalue par cytometrie.5 10 15 20 CA 03150552 2022-02-08 WO 2021/083907 33 PCT/EP2020/080199 Espece Colonne UFC introduces Pourcentage de captation Moyenne 1 5.19x10s 98.19% Staphylococcus aureus 2 5.19x10s 99.18% 98.48% 3 5.19x10« 98.06% 4 1.46X107 94.15% Pseudomonas aeruginosa 5 1.46X107 90.02% 89.08% ATCC 13388 6 1.46X107 83.08% Salmonella enterica subsp. 7 1.07X107 94.66% enterica serovar Enteritidis 8 1.07X107 94.74% 94.16% ATCC 13076 9 1.07X107 93.09% Tableau 11 Resultats de la captation de microorganismes Exemple 14 : Protocole de fonctionnalisation des billes de verre 300 mg de billes de verre de diametre 30-50 pm ont ete reparties dans des colonnes de 0,8 mL munies d’un fritte de 20 pm. 142,8 pL d’une solution aqueuse de polyethyleneimine (ramifie, 1,3 kDa) a 0,5% (m/v) ont ete ajoutes dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 5 min a ete respecte entre les billes et le polyethyleneimine. La solution a ensuite ete eliminee a 1’aide d’un systeme de chambre a vide et d’une pompe reglee sur 50 mbar de depression. Un rin<?age de la colonne a ete realise a 1’aide de 1 mL d’eau de biologic moleculaire avec la meme depression. La pompe a ensuite ete reglee sur 700 mbar de depression pour sechage durant 5 min. Apres cette etape, les billes de verre fonctionnalisees par du polyethyleneimine ont ete pretes a 1’emploi. Protocole de captation/elimination des micro-organismes Dans un premier temps, un denombrement au cytometre des suspensions meres d’Escherichia coli CIP 54.8 a ete realise par dilutions successives au dixieme dans de 1’eau physiologique 0,85% NaCl du Tris 50 mM pH 7,5. 500 pL de suspension a la concentration souhaitee ont ete ajoutes par colonne et le precede de captation a ete realise en flux a 1’aide du systeme de chambre a vide. La depression a ete reglee sur 50 mbar. Les 500 pL de suspension ayant traverse la colonne ont ete collectes dans un tube puis un denombrement au cytometre a ete realise par dilutions successives au dixieme dans de 1’eau physiologique 0,85% NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5. Efficacite de la captation/elimination des micro-oiganismes5 10 15 20 CA 03150552 2022-02-08 WO 2021/083907 34 PCT/EP2020/080199 Le Tableau 12 presente le nombre d’Unites Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant, evalue par cytometrie. Colonne UFC introduites Pourcentage de captation /Mayenne 1 133x103 99.40% 3; 133x10s 100.00% >99.69%; 3; 133x10s 99.66% 133x10s 99.97% •5 1.33x10s 99.49% 99.553b 6 133x10s 99.21% 7 133xl07 98.84% 8 133xl07 98.15% 98.20% 9 133xl07 97.60% Tableau 12 Resultats de la captation de microorganismes Exemple 15 : Protocole de fonctionnalisation des billes de verre 1 g de billes de verre de diametre 105-150 pm ont ete reparties dans des colonnes de 0,8 mL munies d’un fritte de 20 pm. 500 pL d’une solution aqueuse de polyethyleneimine (ramifie 1,3 kDa) a 0,166% (m/v) ont ete ajoutes dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 10 min a ete respecte entre les billes et le polyethyleneimine. La solution a ensuite ete eliminee a 1’aide d’un systeme de chambre a vide et d’une pompe reglee sur 50 mbar de depression. Un rin<?age de la colonne a ete realise a l’aide de 1 mL d’eau de biologie moleculaire avec la meme depression. Apres cette etape, les billes de verre fonctionnalisees par du polyethyleneimine ont ete pretes a 1’emploi. Protocole de captation/elimination des micro-organismes Dans un premier temps, un denombrement au cytometre des suspensions meres des microorganismes utilises a ete realise par dilutions successives au dixieme dans de 1’eau physiologique 0,85% NaCl on du Tris 50 mM pH 7,5. 500 pL de suspension a la concentration souhaitee ont ete ajoutes par colonne et le precede de captation a ete realise en flux a l’aide du systeme de chambre a vide. La depression a ete reglee sur 50 mbar. Les 500 pL de suspension ayant traverse la colonne ont ete collectes dans un tube puis un denombrement au cytometre a ete realise par dilutions successives au dixieme dans de 1’eau physiologique 0,85% NaCl du Tris 50 mM pH 7,5.5 10 15 20 25 CA 03150552 2022-02-08 35 Protocole d’elution des micro-organismes Trois elutions successives a 1’aide de 4 mL (8x500 pL) de sodium hexametaphosphate 0,1% ont ete realisees par colonne. Les elutions ont ete realisees en respectant systematiquement un temps de contact de 5 min a temperature ambiante pour les 500 premiers microlitres de chaque elution. Les 3,5 mL restants ont ete passes en flux. L’aspiration a ete realisee a 50 mbar de depression. Les 4 mL d’eluat ayant traverse la colonne ont ete collectes dans un tube puis un denombrement au cytometre a ete realise par dilutions successives au dixieme dans de Leau physiologique 0,85% NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5. Efflcacite du couple captation/elution des micro-organismes Le Tableau 13 presente le rendement global de la captation/elution de microorganismes. Souches Rendement global Salmonella enterica svbsp.enterica serovar Choleraesuis CIP 55.133 93.29% Proteus mirabilis CIP A235 94.55% Bacillus cereus ATCC 10876 71.32% Bacillus thuringiensis ATCC 10792 86.03% Enterobacter cloacae NCTC 13406 75.88% Enterococcus faecium ATCC 27270 81.32% Proteus mirabilis ATCC 12453 82.19% Salmonella enterica subsp.enterica serovar Enteritidis ATCC 13076 87.60% Tableau 13 Resultats de la captation/elution de microorganismes Exemple 16 : Protocole de fonctionnalisation des billes de verre 1 g de billes de verre de diametre 105-150 pm ont ete reparties dans des colonnes de 0,8 mL munies d’un fritte de 20 pm. 500 pL d’une solution aqueuse de polyethyleneimine (ramifie, 1,3 kDa) a 0,166% (m/v) ont ete ajoutes dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 10 min a ete respecte entre les billes et le polyethyleneimine. La solution a ensuite ete eliminee a 1’aide d’un systeme de chambre a vide et d’une pompe reglee sur 50 mbar de depression. Un rincagc de la colonne a ete realise a 1’aide de 1 mL d’eau de biologie moleculaire avec la meme depression. Apres cette etape, les billes de verre fonctionnalisees par du polyethyleneimine ont ete pretes a 1’emploi. Protocole de captation/elimination des micro-oiganismesCA 03150552 2022-02-08 36 Dans un premier temps, un denombrement au cytometre des suspensions meres des microorganismes utilises a ete realise par dilutions successives au dixieme dans de 1’eau physiologique 0,85% NaCl du Tris 50 mM pH 7,5. 500 pL de suspension a la concentration souhaitee ont ete ajoutes par colonne et le precede de captation a ete realise en flux a 1’aide du systeme de chambre a vide. La depression a ete 5 reglee sur 50 mbar. Les 500 pL de suspension ayant traverse la colonne ont ete collectes dans un tube puis un denombrement au cytometre a ete realise par dilutions successives au dixieme dans de 1’eau physiologique 0,85% NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5. Protocole d’elution des micro-organismes 10 Trois elutions successives a 1’aide de 4 mL (8x500 pL) de sodium hexametaphosphate 0,01% ont ete realisees par colonne. Les elutions ont ete realisees en respectant systematiquement un temps de contact de 5 min a temperature ambiante pour les 500 premiers microlitres de chaque elution. Les 3,5 mL restants ont ete passes en flux. L’aspiration a ete realisee a 50 mbar de depression. Les 4 mL d’eluat ayant traverse la colonne ont ete collectes dans un tube puis un denombrement au cytometre a 15 ete realise par dilutions successives au dixieme dans de 1’eau physiologique 0,85% NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5. Efficacite du couple captation/elution des micro-organismes Souches Rendement global Proteus mirabilis CIP A235 91.76% Pseudomonas aeruginosa ATCC 13388 78.86% Salmonella enterica subsp.enterica serovarEnteritidis ATCC 13076 72.79% Meyerozyma guilliermondii ATCC 6260 93.08% Hanseniaspora guilliermondii ATCC 32857 78.63% Staphylococcus epidermidis ATCC 49134 91.42% Staphylococcus aureus 95.18% Salmonella enterica subsp. enterica serovar Choleraesuis CIP 55.133 85.89% Proteus mirabilis CIP A235 90.76% Serratia marcescens CIP 58.14 85.15% Escherichia coli CIP 54.8 92.15%. Bacillus pumilus ATCC 14884 99.32% Enterobacter cloacae NCTC 13406 93.95%5 10 15 20 25 30 CA 03150552 2022-02-08 37 Tableau 14 Resultats de la captation/elution de microorganismes Exemple 17 : Protocole de fonctionnalisation des billes de verre 1 g de billes de verre de diametre 105-150 pm ont ete reparties dans des colonnes de 0,8 mL munies d’un fritte de 20 pm. 500 pL d’une solution aqueuse de polyethyleneimine (ramifie, 1,3 kDa) a 0,166% (m/v) ont ete ajoutes dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 10 min a ete respecte entre les billes et le polyethyleneimine. La solution a ensuite ete eliminee a 1’aide d’un systeme de chambre a vide et d’une pompe reglee sur 50 mbar de depression. Un linkage de la colonne a ete realise a 1’aide de 1 mL d’eau de biologic moleculaire avec la meme depression. Apres cette etape, les billes de verre fonctionnalisees par du polyethyleneimine ont ete pretes a 1’emploi. Protocole de captation/elimination des micro-organismes Dans un premier temps, un denombrement au cytometre des suspensions meres d’Escherichia coli CIP 54.8 a ete realise par dilutions successives au dixieme dans de 1’eau physiologique 0,85% NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5. 500 pL d’une boisson a base de the (Nestea gout peche) contenant une concentration souhaitee en microorganismes ont ete ajoutes par colonne et le procede de captation a ete realise en flux a 1’aide du systeme de chambre a vide. La depression a ete reglee sur 50 mbar. Les 500 pL de suspension ayant traverse la colonne ont ete collectes dans un tube puis un denombrement au cytometre a ete realise par dilutions successives au dixieme dans de 1’eau physiologique 0,85% NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5. Protocole d’elution des micro-organismes Trois elutions successives a 1’aide de 4 mL (8x500 pL) de sodium hexametaphosphate 0,01% ont ete realisees par colonne. Les elutions ont ete realisees en respectant systematiquement un temps de contact de 5 min a temperature ambiante pour les 500 premiers microlitres de chaque elution. Les 3,5 mL restants ont ete passes en flux. L’aspiration a ete realisee a 50 mbar de depression. Les 4 mL d’eluat ayant traverse la colonne ont ete collectes dans un tube puis un denombrement au cytometre a ete realise par dilutions successives au dixieme dans de 1’eau physiologique 0,85% NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5. Efficacite de la capatation Le Tableau 15 presente le nombre d’Unites Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant, evalue par cytometrie5 10 15 20 25 CA 03150552 2022-02-08 WO 2021/083907 38 PCT/EP2020/080199 Colonne UFC introduites Pourcentage de captation :Moyenne 1 1.57x10’ 93.45% 1.57x10’ 95.77% 96.4%; 3 1.57x10’ 100% Tableau 15 Resultats de la captation de microorganismes Efficacite de 1’elution Le Tableau 16 presente la colonne et le taux d’elution correspondant evalue par cytometrie. Colonne Pourcentage d’elution Moyenne 1 89.06% 2 88.14% 90.84% 3 92.42% Tableau 16 Resultats de 1’elution de microorganismes Le rendement global est done de 88,2% Exemple 18 : Protocole de fonctionnalisation des billes de verre 1 g de billes de verre de diametre 105-150 pm ont ete reparties dans des colonnes de 2,4 mL munies d’un fritte de 45-90 pm. 500 pL d’une solution aqueuse de polyethyleneimine (ramifie, 1,3 kDa) a 0,166% (m/v) ont ete ajoutes dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 10 min a ete respecte entre les billes et le polyethyleneimine. La solution a ensuite ete eliminee a l’aide d’un systeme de chambre a vide et d’une pompe reglee sur 50 mbar de depression. Un Engage de la colonne a ete realise a l’aide de 1 mL d’eau de biologic moleculaire avec la meme depression. Apres cette etape, les billes de verre fonctionnalisees par du polyethyleneimine ont ete pretes a 1’emploi. Protocole de captation/elimination des micro-organismes Dans un premier temps, un denombrement au cytometre de la suspension mere de Serratia marcescens CIP 58.14 a ete realise par dilutions successives au dixieme dans de 1’eau physiologique 0,85% NaCl via la cytometrie. 8 mL de suspension a la concentration souhaitee ont ete ajoutes par colonne et le precede de captation a ete realise en flux a l’aide du systeme de chambre a vide. La depression a ete reglee sur 50 mbar. Les 8 mL de suspension ayant traverse la colonne ont ete collectes dans un tube puis un denombrement au cytometre a ete realise par dilutions successives au dixieme dans de 1’eau physiologique 0,85% NaCl .5 10 15 20 25 CA 03150552 2022-02-08 39 Protocole d’elution des micro-organismes Trois elutions successives a 1’aide de 4 mL (8x500 pL) de sodium hexametaphosphate 0,01% ont ete realisees par colonne. Les elutions ont ete realisees en respectant systematiquement un temps de contact de 5 min a temperature ambiante pour les 500 premiers microlitres de chaque elution. Les 3,5 mL restants ont ete passes en flux. L’aspiration a ete realisee a 50 mbar de depression. Les 4 mL d’eluat ayant traverse la colonne ont ete collectes dans un tube puis un denombrement au cytometre a ete realise par dilutions successives au dixieme dans de 1’eau physiologique 0,85% NaCl. Efficacite de la captation Le Tableau 17 presente le nombre d’Unites Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant, evalue par cytometrie Colonne UFC introduites Pourcentage de captation Moyenne 1 1.03xl07 85.81% 2 1.03x107 81.20% 83.57% 3 1.03xl07 83.71% Tableau 17 Resultats de la captation de microorganismes Efficacite de 1’elution Le Tableau 18 presente la colonne et le taux d’elution correspondant evalue par cytometrie. Colonne Pourcentage ciimule d’elution Moyenne 1 100% 2 100% 100% 3 100% Tableau 18 Resultats de 1’elution de microorganismes Le rendement global est done de 83,57%. Exemple 19 : Application sur les levures Protocole de fonctionnalisation des billes de verre 1 g de billes de verre de diametre 105-150 pm ont ete reparties dans des colonnes de 2,4 mL munies d’un fritte de 45-90 pm. 500 pL d’une solution aqueuse de polyethyleneimine (ramifie, 1,3 kDa) a 0,166% (m/v) ont ete ajoutes dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 10 min a ete respecte entre les billes et le polyethyleneimine. La solution a ensuite ete eliminee a l’aide d’un systeme de5 10 15 20 25 30 CA 03150552 2022-02-08 40 chambre a vide et d’une pompe reglee sur 50 mbar de depression. Un rincagc de la colonne a etc realise a l’aide de 1 mL d’eau de biologic moleculaire avec la meme depression. Apres cette etape, les billes de verre fonctionnalisees par du polyethyleneimine ont ete pretes a 1’emploi. Protocole de captation/elimination des micro-organismes Les suspensions meres de Candida albicans (ATCC 14053), Candida parapsilosis (ATCC 22019) et Saccharomyces cerevisiae (ATCC 18824) sont diluees au 10eme dans de 1’eau physiologique 0.85% NaCl puis denombrees par cytometrie en flux. 500 pL de suspension a la concentration souhaitee ont ete ajoutes par colonne et aspires en flux a travers la colonne grace au systeme de chambre a vide (50 mbar) et de pompe. Un denombrement des permeats a ete realise par cytometrie. Protocole d’elution des micro-organismes Trois elutions successives a l’aide de 4 mL (8x500 pL) de sodium hexametaphosphate 0,01% ont ete realisees par colonne. Les elutions ont ete realisees en respectant systematiquement un temps de contact de 5 min a temperature ambiante pour les 500 premiers microlitres de chaque elution. Les 3,5 mL restants ont ete passes en flux. L’aspiration a ete realisee a 50 mbar de depression. Les 4 mL d’eluat ayant traverse la colonne ont ete collectes dans un tube puis un denombrement au cytometre a ete realise par dilutions successives au dixieme dans de 1’eau physiologique 0,85% NaCl. Efficacite de la captation Le Tableau 19 presente le nombre d’Unites Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant pour chaque souche, evalue par cytometrie. Colonne ETC introduites Pourcentage de captation Candida albicans (n=3) 3.23E+05 96.90% Candida parapsilosis (n=3) 4.71E+05 98.10% Saccharomycescerevisiae(n=3) 3.92 E+06 95.40% Tableau 19 Resultats de la captation Efficacite de 1’elution Le Tableau 20 presente la colonne et le taux d’elution correspondant evalue par cytometrie.5 10 15 20 25 30 CA 03150552 2022-02-08 WO 2021/083907 41 PCT/EP2020/080199 Tableau 20 Resultats de 1’elution Colonne Pourcentage d’ekition Candida albicans (n=3) 72.8% Candida parapsilosis (n=3) 69.8'% SoccAaroffiycies cerevisiae (n=3) 81.5% Exemple 20 : Application sur les champignons Protocole de fonctionnalisation des billes de verre 1 g de billes de verre de diametre 105-150 pm ont ete reparties dans des colonnes de 2,4 mL munies d’un fritte de 45-90 pm. 500 pL d’une solution aqueuse de polyethyleneimine (ramifie, 1,3 kDa) a 0,166% (m/v) ont ete ajoutes dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 10 min a ete respecte entre les billes et le polyethyleneimine. La solution a ensuite ete eliminee a 1’aide d’un systeme de chambre a vide et d’une pompe reglee sur 50 mbar de depression. Un linkage de la colonne a ete realise a 1’aide de 1 mL d’eau de biologie moleculaire avec la meme depression. Apres cette etape, les billes de verre fonctionnalisees par du polyethyleneimine ont ete pretes a 1’emploi. Protocole de captation/elimination des micro-organismes Les suspensions meres de Fusarium oxysporum (UBOCC-A-112042) et Mucor racemosus (ATCC 42647) sont diluees au 10eme dans de 1’eau physiologique 0.85% NaCl puis denombrees par cytometrie en flux. 500 pL de suspension a la concentration souhaitee ont ete ajoutes par colonne et aspires en flux a travers la colonne grace au systeme de chambre a vide (50 mbar) et de pompe. Un denombrement des permeats a ete realise par cytometrie. Protocole d’elution des micro-organismes Trois elutions successives a 1’aide de 4 mL (8x500 pL) de sodium hexametaphosphate 0,01% ont ete realisees par colonne. Les elutions ont ete realisees en respectant systematiquement un temps de contact de 5 min a temperature ambiante pour les 500 premiers microlitres de chaque elution. Les 3,5 mL restants ont ete passes en flux. L’aspiration a ete realisee a 50 mbar de depression. Les 4 mL d’eluat ayant traverse la colonne ont ete collectes dans un tube puis un denombrement au cytometre a ete realise par dilutions successives au dixieme dans de 1’eau physiologique 0,85% NaCl. Efficacite de la captationCA 03150552 2022-02-08 WO 2021/083907 42 PCT/EP2020/080199 Le Tableau 21 presente le nombre d’Unites Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant pour chaque souche, evalue par cytometrie. Colonne UFC introduites Pourcentage de captation Fusarium oxysporum (n=3) 5.1E+O5 76.70% jMucof racemosus (n=3) 4.71E+05 80.20% Tableau 21 Resultats de la captation 5 Efficacite de 1’elution Le Tableau 22 presente la colonne et le taux d’elution correspondant evalue par cytometrie. Colonne Pourcentage d'elution Fusarium oxysporum (n=3) 55.2% Macor racemosus (n=3) 63.8% Tableau 22 Resultats de 1’elution 10