CA3246961A1 - Microcompartiments cellulaires comprenant des lymphocytes formant une culture groupée en 3d et ayant une faible teneur en granzyme b - Google Patents

Microcompartiments cellulaires comprenant des lymphocytes formant une culture groupée en 3d et ayant une faible teneur en granzyme b

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CA3246961A1
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Maxime Feyeux
Camille FIALIN
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Treefrog Therapeutics SAS
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Abstract

L'invention concerne un microcompartiment cellulaire en trois dimensions ou un ensemble de microcompartiments cellulaires en trois dimensions de forme ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique ou sensiblement ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique dont la plus petite dimension est comprise entre 200 et 400µm, comprenant une couche externe en hydrogel définissant une partie interne, ladite partie interne ayant une teneur en granzyme B inférieure à 1µg/mL de milieu et comprenant entre 500 et 5000 lymphocytes formant une culture groupée en trois dimensions. L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'un tel microcompartiment ou ensemble de microcompartiment.

Description

MICROCOMPARTIMENTS CELLULAIRES COMPRENANT DES LYMPHOCYTES FORMANT UNE CULTURE GROUPEE EN 3D ET AYANT UNE FAIBLE TENEUR EN GRANZYME B Domaine technique La presente invention se rapporte au domaine de la culture cellulaire de lymphocytes a grande echelle. L'invention a en particulier pour objet un microcompartiment cellulaire particulier, son procede de preparation et ses utilisations. Art anterieur Les progres realises au cours de ces dernieres decennies ont permis de mettre en avant I'interet de la therapie cellulaire pour traiter de nombreuses pathologies. La therapie cellulaire se definit comme l'administration de cellules vivantes a un patient dans Ie but de prevenir, traiter ou d'attenuer une pathologie. L'objectif est d'obtenir un effet durable grace a une injection de cellules therapeutiques. De nombreuses approches de therapie cellulaire peuvent etre envisagees telles que : - I'approche dite autologue dans laquelle Ie patient est son propre donneur. - I'approche dite allogenique dans laquelle Ie donneur est different du patient. La therapie cellulaire recouvre de larges domaines therapeutiques et s'applique a de nombreux types cellulaires allant des cellules pluripotentes jusqu'aux cellules adultes specialisees a fonction metabolique (e.g hepatocytes) ou a fonction mecanique (e.g myoblastes, chondrocytes), en passant par les lignees hematopoietiques telles que les cellules mononucleees du sang (e.g lymphocytes T ou lymphocytes NK). Une des therapies les plus prometteuse a ce jour est la therapie cellulaire CAR (Recepteur antigenique chimerique). Les cellules CAR-T sont des lymphocytes T exprimant des recepteurs antigeniques chimeriques qui sont des recepteurs artificiels cong:us pour reconnaitre un antigene present a la surface des cellules tumorales. Les cellules CAR-T guident Ie systeme immunitaire pour cibler et eradiquer les cellules cancereuses. Cette approche est consideree comme une avancee majeure dans I'immunotherapie et de nombreuses cellules CAR-T sont en cours de developpement de fa^on a etendre leurs utilisations. Les cellules CAR-T sont produites en general selon I'approche autologue. Toutefois, il est egalement possible de creer des cellules CAR-T allogeniques. II existe egalement une alternative utilisant des lymphocytes NK (natural killer). Les5 10 15 20 25 30 WO 2023/194479 2 PCT/EP2023/059019 lymphocytes NK sont des cellules effectrices cytotoxiques tres puissantes ayant demontre un effet antitumoral. Afin de pouvoir developper Ie potentiel des therapies cellulaires utilisant des lymphocytes, notamment les therapies CAR-T ou CAR-NK, il est necessaire de pouvoir s'appuyer sur des techniques de culture cellulaire de lymphocytes a grande echelle. La production ex vivo de cellules immunitaires tels que les lymphocytes T ou NK est particulierement complexe, surtout a grande echelle. En effet, les methodes de cultures in vitro developpees a ce jour sont trop stressantes et conduisent rapidement a I'epuisement cellulaire ne permettant pas de produire les lymphocytes a grande echelle. In vivo, la proliferation des cellules immunitaires se produit principalement dans des environnements mecaniquement stables tels que des tissus solides. L'environnement d'un bioreacteur etant rempli de contraintes de cisaillement non physiologiques, les taux d'expansion obtenus sont generalement encore insuffisants par rapport aux capacites d'expansion in vivo. Actuellement, il n'existe aucune solution satisfaisante pour produire rapidement a grande echelle des lymphocytes fonctionnels, en particulier des cellules CAR-T ou CAR-NK. Plusieurs methodes de cultures sont principalement utilisees pour I'expansion des cellules CAR : la culture statique en flasque, la culture en sac statique permeables aux gaz et la culture en bioreacteur a mouvement de bascule (Vormittag P, Gunn R, Ghorashian S, Veraitch FS. Curr Opin Biotechnol. 2018), la plateforme G-rex® (Ludwig et al. "Methods and Process Optimization for Large-Scale CART Expansion Using the G-Rex Cell Culture Platform" Methods Mol Biol 2020;2086:165-177). Toutefois, ces methodes de culture ne sont pas adaptees a la production de lymphocytes a grande echelle en raison d'exposition des cellules a de nombreuses etapes de manipulation augmentant les risques de contaminations, d'exposition des cellules a des stress trop importants et/ou de contraintes de developpement et de capacite des plateformes et methodes utilisees. Par ailleurs, Ie travail de maintien en culture et de stockage serait trop exigeant pour une production a grande echelle. Pour remedier a ce probleme, l'art anterieur propose d'activer les lymphocytes avant leur mise en culture afin d'obtenir une proliferation rapide des lymphocytes. Neanmoins, l'activation precoce des lymphocytes engendre un processus physiologique d'epuisement cellulaire. L'epuisement correspond a une maturation precoce des cellules T naives vers une sous population de lymphocytes T effecteurs limitant la persistance du greffon5 10 15 20 25 30 WO 2023/194479 3 PCT/EP2023/059019 in vivo. Une autre solution proposee par l'art anterieur est I'utilisation de microtubes d'hydrogel et d'alginate suspendus dans un milieu de culture cellulaire. Cette methode rapporte un taux d'expansion des lymphocytes de 320 a 14 jours de culture (Lin et al. Adv. Healthcare Mater. 2018, 1701297) Toutefois, bien que cette methode apporte un taux d'expansion satisfaisant, elle n'est pas adaptee pour une culture a grande echelle. Cette methode necessiterait de mettre au point un systeme de culture dedie et serait trop compliquee a adapter a grande echelle. Par ailleurs cette methode ne garantit pas Ie phenotype fonctionnel des lymphocytes et par consequent que l'action des lymphocytes soit durable. La complexite de la differentiation et de la fonction de chaque sous population de lymphocyte font que l'analyse du phenotype lors de la proliferation est une donnee essentielle pour mener a bien toute therapie a base de lymphocytes, en particulier les therapies utilisant des cellules CAR-T ou CAR-NK. Les sous populations de lymphocytes T les moins differencies tels que les lymphocytes T naifs et lymphocytes Tscm (cellule souche memoire) semblent particulierement importantes pour garantir un effet durable chez les patients (Vita Golubovskaya and Lijun Wu (Cancers 2016, 8, 36). De plus les sous-populations NK « memory-like » permettent une persistance de la reponse clinique (Romee et al. « Cytokine activation induces human memory-like NK cells » Blood 2012 Dec 6;120(24):4751-60). D'autre part, on sait egalement que la sous population de lymphocyte T effecteur est essentielle pour garantir un effet significatif sur la ou les cellules cibles. II apparait done necessaire de maitriser les sous populations cellulaires lors de la culture des lymphocytes a grande echelle pourobtenir un ratio optimal entre la persistance et I'efficacite in vivo. Les processus de production actuels impliquant des lymphocytes ont un cout tres important et sont difficiles a mettre a grande echelle et aboutissent a des lymphocytes de qualite mitigee et de persistance reduite. II existe done un besoin important pour une solution permettant une production a grande echelle de lymphocytes avec un phenotype fonctionnel, pour repondre a une demande indispensable de therapie cellulaire basee sur les lymphocytes. L'objectif de I'invention est par consequent de repondre a I'ensemble de ces besoins et de5 10 15 20 25 30 WO 2023/194479 4 PCT/EP2023/059019 pallier les inconvenients et limites de l'art anterieur. Resume de I'invention Pour repondre a cet objectif, I'invention propose de passer par un microcompartiment particulier pour obtenir une production a grande echelle de lymphocytes, adaptes a des utilisations en therapie cellulaire. A cet effet, I'invention a pour objet un microcompartiment cellulaire en trois dimensions clos de forme ovoide, cylindrique, spheroide ou spherique ou sensiblement ovoide, cylindrique, spheroide ou spherique, dont la plus petite dimension est comprise entre 200 et 400pm, comprenant une couche externe en hydrogel definissant une partie interne, ladite partie interne comprenant dans un milieu entre 500 et 5000 lymphocytes formant une culture groupee en trois dimensions ayant une teneur en granzyme B inferieure a Ipg/mL du milieu. Preferentiellement, la partie interne du microcompartiment comprend une teneur en perforine inferieure a 0,5 pg/mL du milieu et/ou une teneur en en Facteur de necrose tumorale endogene (TNF alpha) inferieure a 100 ng/mL du milieu et/ou une teneur en IL6 inferieure a 0,5 pg/mL du milieu et/ou une teneur en GM-CSF inferieure a inferieure a 0,5 pg/mL du milieu. Avantageusement, Ie microcompartiment selon I'invention permet de produire des lymphocytes presentant un phenotype fonctionnel tout en garantissant une production rapide a grande echelle. Selon un mode de realisation particulierement adapte, Ie microcompartiment selon I'invention comprend des lymphocytes formant une culture groupee en trois dimensions sans lumen. Le microcompartiment selon I'invention peut etre obtenu apres encapsulation de lymphocytes avec ou sans ajout de matrice extracellulaire, et selon une variante avec ou sans ajout d'element de matrice extracellulaire. Avantageusement, l'absence d'ajout de matrice extracellulaire ou d'element de matrice au moment de I'encapsulation des lymphocytes permet d'ameliorer leur taux d'expansion apres 3 jours de culture. Selon un objet prefere de I'invention, le microcompartiment selon I'invention a ete obtenu apres encapsulation de lymphocytes prealablement actives. L'activation des lymphocytes permet avantageusement de stimuler la proliferation des lymphocytes dans la partie interne5 10 15 20 25 30 WO 2023/194479 5 PCT/EP2023/059019 du microcompartiment selon I'invention. Selon une variante, l'activation des lymphocytes peut etre realisee dans Ie microcompartiment apres encapsulation. Selon un autre mode de realisation particulierement adapte, Ie microcompartiment selon I'invention comprend des lymphocytes exprimant un recepteur antigenique chimerique. Lorsque Ie microcompartiment selon I'invention comprend des lymphocytes T, il comprend preferentiellement une concentration en lymphocyte naif et/ou Tscm superieure a 20%, encore plus preferentiellement superieure a 40%. Avantageusement, une telle concentration en lymphocytes naif et/ou Tscm permet de garantir un effet durable et d'eviter Ie phenomene d'epuisement precoce des lymphocytes. Selon un objet prefere de I'invention, I'invention concerne un ensemble de microcompartiments. Selon un autre aspect, I'invention concerne un procede de preparation d'un microcompartiment ou d'un ensemble de microcompartiments comprenant au moins la mise en oeuvre des etapes suivantes, une incubation, une encapsulation et une etape de culture. Enfin, I'invention vise un microcompartiment selon I'invention pour son utilisation comme medicament, preferentiellement dans la prevention ou Ie traitement de maladies autoimmunes, de syndromes d'immunodeficience, de cancers, de maladies virales ou de malades inflammatoires. D'autres caracteristiques et avantages ressortiront de la description detaillee de I'invention et des exemples qui vont suivre. Breve description des figures La Figure la est une image de microscopie a contraste de phase au grossissement x20 d'un ensemble de microcompartiments selon I'invention comprenant des lymphocytes T apres 3 jours de cultures en capsules. La Figure lb est une image de microscopie a contraste de phase au grossissement xlO d'un ensemble de microcompartiments selon I'invention comprenant des lymphocytes T apres 3 jours de cultures en capsules. La Figure 2 est une representation des resultats d'essais sur l'amplification de lymphocytes dans des microcompartiments selon I'invention. La Figure 3 est une representation du facteur d'expansion des lymphocytes T apres 6 jours de culture avec ou sans encapsulation.5 10 15 20 25 30 WO 2023/194479 6 PCT/EP2023/059019 La Figure 4 est une representation comparative du profil d'expression de cytokines lors de la culture de Lymphocytes T apres 6 jours de culture avec ou sans encapsulation. Les resultats sont presentes avec des valeurs normalisees par rapport a la secretion de GM-CSF et d'lFN-g. La Figure 5 est une image obtenue par microscopie confocale d'un microcompartiment presentant des lymphocytes polarises. La Figure 6 est une representation du facteur d'expansion des lymphocytes NK apres 14 jours de culture avec encapsulation (« Capsules ») ou sans encapsulation (« Controle »). La Figure 7a est une representation comparative de I'expression de cytokines lors de la culture de Lymphocytes NK apres 14 jours de culture avec ou sans encapsulation (pour un donneur A- surnageant dilue au lOeme). Les resultats sont presentes avec des valeurs normalisees par rapport a la secretion d'lFN-g. La Figure 7b est une representation comparative de I'expression de granzyme B lors de la culture de Lymphocytes NK apres 14 jours de culture avec ou sans encapsulation (pour un donneur A- surnageant dilue au lOOeme). Les resultats sont presentes avec des valeurs normalisees par rapport a la secretion d'lFN-g. La Figure 8a est une representation comparative de I'expression de cytokines lors de la culture de Lymphocytes NK apres 11jours de culture avec ou sans encapsulation (pour un donneur B - surnageant dilue au lOeme). Les resultats sont presentes avec des valeurs normalisees par rapport a la secretion d'lFN-g. La Figure 8b est une representation comparative de I'expression de granzyme B lors de la culture de Lymphocytes NK apres 11 jours de culture avec ou sans encapsulation (pour un donneur B- surnageant dilue au lOOeme). Les resultats sont presentes avec des valeurs normalisees par rapport a la secretion d'lFN-g. La Figure 9 represente les resultats comparatifs d'un test de toxicite realise sur des NK obtenus sans encapsulation et sur des NK obtenus selon I'invention (pour Ie donneur B). La Figure 10 represente les resultats comparatifs de devolution de la viabilite lors de la culture de NK sans encapsulation et de NK encapsules selon I'invention (resultats pour deux donneurs A et B). La Figure 11a est une image de microscopie a contraste de phase au grossissement x4 d'un ensemble de microcompartiments selon I'invention contenant des NK au jour de I'encapsulation est presentee en figure 11a. La Figure lib est une image de microscopie a contraste de phase au grossissement xlO d'un5 10 15 20 25 30 WO 2023/194479 7 PCT/EP2023/059019 ensemble de microcompartiments selon I'invention contenant des NK apres 11 jours de cultures en capsules. La Figure 12a est une representation du facteur d'expansion des lymphocytes NK lors de la culture pendant 12 jours de culture avec encapsulation (« Capsules » encapsulation sans biHe d'activation) ou sans encapsulation (« Controle »). La Figure 12b represente les resultats comparatifs de I'evolution de la viabilite lors de la culture de NK sans encapsulation (« controle ») et de NK encapsules selon I'invention (« capsules » encapsulation sans bille d'activation) (resultats pour deux donneurs B et C). Description detaillee de I'invention Definitions Par « alginate » au sens de I'invention, on entend des polysaccharides lineaires formes a partir de |3-D-mannuronate et a-L-guluronate, des seis et des derives de ceux-ci. Par « capsule en hydrogel » ou « microcompartiment en hydrogel » au sens de I'invention, on entend une structure tridimensionnelle formee a partir d'une matrice de chafnes polymeres, gonflee par un liquide et preferentiellement de I'eau. Par « cellules humaines » au sens de I'invention on entend des cellules humaines ou des cellules de mammiferes non humains immunologiquement humanisees. Meme lorsque cela n'est pas precise, les cellules, les cellules souches, les cellules progenitrices et les tissus selon I'invention sont constitues ou sont obtenus a partir de cellules humaines ou a partir de cellules de mammiferes non humains immunologiquement humanisees. Par « cellule mutante » au sens de I'invention, on entend une cellule porteuse d'au moins une mutation. Par « diametre de Feret » d'un microcompartiment (ou d'une partie d'un microcompartiment) selon I'invention, on entend la distance « d » comprise entre deux tangentes audit microcompartiment (ou a ladite partie), ces deuxtangentes etant paralleles, de telle sorte que I'ensemble de la projection dudit microcompartiment (ou de ladite partie) soit compris entre ces deux tangentes paralleles. Un diametre de Ferret de la partie interne du microcompartiment est mesure entre deux interfaces de la partie interne et de la couche externe du microcompartiment, c'est-a-dire la distance « d » comprise entre deux tangentes a ladite partie interne, ces deux tangentes etant paralleles, de telle sorte que I'ensemble de la projection de ladite partie interne soit compris entre ces deux tangentes paralleles.5 10 15 20 25 30 WO 2023/194479 8 PCT/EP2023/059019 Par « epaisseur variable » d'une couche, on entend au sens de I'invention Ie fait que la couche pour un meme microcompartiment, n'a pas la meme epaisseur partout. Par « microcompartiment » ou « capsule » au sens de I'invention, on entend une structure tridimensionnelle partiellement ou totalement close, contenant plusieurs cellules. Par « milieu » au sens de I'invention on entend solution aqueuse englobant des cellules, compatible avec la survie, Ie developpement et/ou Ie metabolisme des cellules. II peut s'agir d'un milieu de culture. Par « milieu de culture convectif » au sens de I'invention on entend un milieu de culture anime par des mouvements internes. Par « mutation » au sens de I'invention, on entend une mutation genetique ou epigenetique, preferentiellement une mutation fonctionnelle. II peut s'agir en particulier d'une modification ponctuelle de la sequence genetique, d'un variant structurel, d'une modification epigenetique, ou d'une modification de l'ADN mitochondrial. Par « mutation fonctionnelle » au sens de I'invention, on entend une modification genetique ou epigenetique transmissible qui confere un gain ou perte de fonction ou perte de fonction potentielle a cellule mutante concernee. II s'agit preferentiellement d'une mutation entrainant une modification du phenotype de la cellule mutante concernee. Tres preferentiellement il s'agit d'un changement de la sequence du genome et/ou de I'epigenome qui altere Ie potentiel therapeutique d'une population de cellules, soit en augmentant Ie risque associe a la therapie produite soit en diminuant Ie benefice apporte par la therapie produite. Par « plus petite dimension » d'un microcompartiment ou d'une couche de cellules au sens de I'invention, on entend la valeur du plus petit diametre de Feret dudit microcompartiment. Par « lumiere » ou « lumen » au sens de I'invention, on entend un volume de solution aqueuse topologiquement entoure de cellules. Preferentiellement son contenu n'est pas en equilibre diffusif avec Ie volume de liquide convectif present a I'exterieur du microcompartiment. Par « plus petit rayon » de la partie interne d'un microcompartiment selon I'invention, on entend la moitie de la valeur du plus petit diametre de Ferret de la partie interne du microcompartiment. Par « rayon moyen » de la partie interne d'un microcompartiment selon I'invention, on entend la moyenne des rayons du plus petit compartiment, chaque rayon correspondant la moitie de la valeur d'un diametre de Ferret de la partie interne du microcompartiment.5 10 15 20 25 30 WO 2023/194479 9 PCT/EP2023/059019 Par « taux d'expansion a X jours » selon I'invention, on entend une mesure de la proliferation cellulaire au temps t=X. Le taux d'expansion est mesure en faisant Ie ratio du nombre de cellule comptees au jour X de la culture divise par le nombre de cellule au depart de la culture (jour de ^encapsulation ou jour de mise en culture). Par « culture a grande echelle » selon I'invention, on entend une methode de culture cellulaire adaptee pour un lot de production de lymphocytes permettant de traiter au moins1patient, preferentiellement 10 patients, plus preferentiellement 100 patients, encore plus preferentiellement plus de 1000 patients. Par « phenotype fonctionnel » selon I'invention, on entend des lymphocytes presentant un profil d'expression de marqueurs membranaires classique (CD3+, CD4+ ou CD8+ pour les lymphocytes T et CD3-, CD56+ pour les lymphocytes NK), connu de I'homme du metier et une capacite a secreter des interleukines (IL2, IL6, IL10, IL12) ou d'autres facteurs d'interet (Granzyme B, INF gamma, GMCSF, et TNF alpha) sous I'induction de la presentation d'un antigene in vitro. Par « cellule progenitrice » au sens de I'invention, on entend une cellule souche deja engagee dans la differenciation cellulaire en lymphocytes mais pas encore differenciee. Par « cellule souche embryonnaire » au sens de I'invention on entend une cellule souche pluripotente de cellule derivee de la masse cellulaire interne du blastocyste. La pluripotence des cellules souches embryonnaires peut etre evaluee par la presence de marqueurs tels que les facteurs de transcription OCT4, NANOG et SOX2 et des marqueurs de surface comme SSEA3/4, Tra-1-60 et Tra-1-81. Les cellules souches embryonnaires utilisees dans le cadre de I'invention sont obtenues sans destruction de I'embryon dont elles sont issues, par exemple a l'aide de la technique decrite dans Chang et al. (Cell Stem Cell, 2008, 2(2)) : 113-117). Eventuellement les cellules souches embryonnaires d'etres humains peuvent etre exclues. Par « cellule souche pluripotente » ou « cellule pluripotente » au sens de I'invention, on entend une cellule qui a la capacite de former tous les tissus presents dans I'organisme d'origine entier, sans pour autant pouvoir former un organisme entier en tant que tel. Les cellules souches pluripotentes humaines peuvent etre appelees hPSC dans la presente demande. II peut s'agir en particulier de cellules souches pluripotentes induites (iPSC ou hiPSC pour les cellules souches pluripotentes induites humaines), de cellules souches embryonnaires ou de cellules MUSE (pour « Multilineage-differentiating Stress Enduring »). Par « cellule souche pluripotente induite » au sens de I'invention on entend une cellule souche5 10 15 20 25 30 WO 2023/194479 10 PCT/EP2023/059019 pluripotente induite a la pluripotence par reprogrammation genetique de cellules somatiques differenciees. Ces cellules sont notamment positives pour les marqueurs de pluripotence, comme la coloration a la phosphatase alcaline et I'expression des proteines NANOG, SOX2, OCT4 et SSEA3/4. Des exemples de procedes permettant I'obtention de cellules souches pluripotentes induites sont decrits dans les articles Yu et al. (Science 2007, 318 (5858) : 1917- 1920), Takahashi et al (Cell, 207, 131(5) : 861-872) et Nakagawa et al (Nat Biotechnol, 2008, 26(1) : 101-106). Microcompartiment cellulaire L'invention a done pour objet un microcompartiment cellulaire en trois dimensions clos de forme ovoTde, cylindrique, spheroide ou spherique ou sensiblement ovoTde, cylindrique, spheroide ou spherique, dont la plus petite dimension est comprise entre 200 et 400pm, comprenant une couche externe en hydrogel definissant une partie interne, ladite partie interne comprenant dans un milieu entre 500 et 5000 lymphocytes formant une culture groupee en trois dimensions et ayant une teneur en granzyme B inferieure a lpg/mLde milieu . Preferentiellement, la partie interne du microcompartiment comprend une teneur en granzyme B inferieure a 0,5pg/mL de milieu, plus preferentiellement inferieure a 0,lpg/mL, encore plus preferentiellement inferieure a 50ng/mL. Le microcompartiment selon l'invention comprend done au moins des lymphocytes ne secretant pas ou peu de granzyme B. Dans le contexte de l'invention, la teneur en molecule(s) (notamment cytokines telles que TNF, telles que granzyme B, perforine, etc.) dans le milieu interne au microcompartiment peut etre mesuree directement dans la capsule, ou bien dans le milieu externe au microcompartiment lorsque celui-ci est dans un milieu. En effet, les molecules inferieures a 150KDa sont en equilibre osmotique entre la partie interne du microcompartiment et le milieu dans lequel est compris le microcompartiment. Selon un mode de realisation prefere, la partie interne du microcompartiment comprend une teneur en perforine inferieure a 0,5pg/ml de milieu, preferentiellement inferieure a 0,lpg/mL, plus preferentiellement inferieure a 50ng/mL, encore plus preferentiellement inferieure a lOng/mL. L'invention a egalement pour objet un microcompartiment cellulaire en trois dimensions clos de forme ovoTde, cylindrique, spheroide ou spherique ou sensiblement ovoTde, cylindrique, spheroide ou spherique, dont la plus petite dimension est comprise entre 200 et 400pm,5 10 15 20 25 30 WO 2023/194479 11 PCT/EP2023/059019 comprenant une couche externe en hydrogel definissant une partie interne, ladite partie interne comprenant dans un milieu entre 500 et 5000 lymphocytes formant une culture groupee en trois dimensions et ayant une teneur en perforine inferieure a 0,5pg/ml de milieu, preferentiellement inferieure a 0,lpg/mL, plus preferentiellement inferieure a 50ng/mL, encore plus preferentiellement inferieure a lOng/mL. Selon un mode de realisation prefere, la partie interne du microcompartiment comprend une teneur en TNF alpha inferieure a 100 ng/mL, en particulier inferieure a 50 ng/mL de milieu, notamment inferieure a 30ng/mL, plus preferentiellement inferieure a 10 ng/mL, encore plus preferentiellement inferieure a 3 ng/mL. L'invention a egalement pour objet un microcompartiment cellulaire en trois dimensions clos de forme ovoide, cylindrique, spheroide ou spherique ou sensiblement ovoide, cylindrique, spheroide ou spherique, dont la plus petite dimension est comprise entre 200 et 400pm, comprenant une couche externe en hydrogel definissant une partie interne, ladite partie interne comprenant dans un milieu entre 500 et 5000 lymphocytes formant une culture groupee en trois dimensions et ayant une teneur en TNF alpha inferieure a 100 ng/mL, en particulier inferieure a 50 ng/mL de milieu, notamment inferieure a 30ng/mL, plus preferentiellement inferieure a 10 ng/mL, encore plus preferentiellement inferieure a 3 ng/mL. Selon un mode de realisation, lorsque les lymphocytes sont des lymphocytes NK, la partie interne du microcompartiment comprend une teneur en IL6 inferieure a 0,5pg/ml de milieu, preferentiellement inferieure a 0,lpg/mL, plus preferentiellement inferieure a 50ng/mL, encore plus preferentiellement inferieure a lOng/mL. L'invention a egalement pour objet un microcompartiment cellulaire en trois dimensions clos de forme ovoide, cylindrique, spheroide ou spherique ou sensiblement ovoide, cylindrique, spheroide ou spherique, dont la plus petite dimension est comprise entre 200 et 400pm, comprenant une couche externe en hydrogel definissant une partie interne, ladite partie interne comprenant dans un milieu entre 500 et 5000 lymphocytes NK formant une culture groupee en trois dimensions et ayant une teneur en IL6 inferieure a 0,5pg/ml de milieu, preferentiellement inferieure a 0,lpg/mL, plus preferentiellement inferieure a 50ng/mL, encore plus preferentiellement inferieure a lOng/mL. Selon un mode de realisation, lorsque les lymphocytes sont des lymphocytes NK, la partie interne du microcompartiment comprend une teneur en GM-CSF inferieure a 0,5pg/ml de milieu, preferentiellement inferieure a 0,lpg/mL, plus preferentiellement inferieure a5 10 15 20 25 30 WO 2023/194479 12 PCT/EP2023/059019 50ng/mL, encore plus preferentiellement inferieure a lOng/mL. [.'invention a egalement pour objet un microcompartiment cellulaire en trois dimensions clos de forme ovoide, cylindrique, spheroide ou spherique ou sensiblement ovoide, cylindrique, spheroide ou spherique, dont la plus petite dimension est comprise entre 200 et 400pm, comprenant une couche externe en hydrogel definissant une partie interne, ladite partie interne comprenant dans un milieu entre 500 et 5000 lymphocytes NK formant une culture groupee en trois dimensions et ayant une teneur en GM-CSF inferieure a 0,5pg/ml de milieu, preferentiellement inferieure a 0,lpg/mL, plus preferentiellement inferieure a 50ng/mL, encore plus preferentiellement inferieure a lOng/mL. Selon un mode de realisation, I'invention a pour objet un microcompartiment cellulaire en trois dimensions clos de forme ovoide, cylindrique, spheroide ou spherique ou sensiblement ovoide, cylindrique, spheroide ou spherique, dont la plus petite dimension est comprise entre 200 et 400pm, comprenant une couche externe en hydrogel definissant une partie interne, ladite partie interne comprenant dans un milieu entre 500 et 5000 lymphocytes T formant une culture groupee en trois dimensions et ayant une teneur en granzyme B inferieure a lpg/mLde milieu et : - une teneur en en perforine inferieure a 0,5pg/ml de milieu, et/ou - une teneur en TNF-a inferieure a 100 ng/mL de milieu. Selon un mode de realisation, I'invention a pour objet un microcompartiment cellulaire en trois dimensions clos de forme ovoide, cylindrique, spheroide ou spherique ou sensiblement ovoide, cylindrique, spheroide ou spherique, dont la plus petite dimension est comprise entre 200 et 400pm, comprenant une couche externe en hydrogel definissant une partie interne, ladite partie interne comprenant dans un milieu entre 500 et 5000 lymphocytes NK formant une culture groupee en trois dimensions et ayant une teneur en granzyme B inferieure a lpg/mLde milieu et : - une teneur en en perforine inferieure a 0,5pg/ml de milieu, et/ou - une teneur en TNF-a inferieure a 100 ng/mL de milieu, et/ou - une teneur en IL6 inferieure a 0,5pg/ml de milieu et/ou - une teneur en GM-CSF inferieure a 0,5pg/ml de milieu. Selon un mode de realisation, I'invention a pour objet un microcompartiment cellulaire en trois dimensions clos de forme ovoide, cylindrique, spheroide ou spherique ou sensiblement ovoide, cylindrique, spheroide ou spherique, dont la plus petite dimension est comprise entre5 10 15 20 25 30 WO 2023/194479 13 PCT/EP2023/059019 200 et 400nm, comprenant une couche externe en hydrogel definissant une partie interne, ladite partie interne comprenant dans un milieu entre 500 et 5000 lymphocytes NK formant une culture groupee en trois dimensions et ayant une teneur en granzyme B inferieure a lpg/mLde milieu et : - une teneur en en perforine inferieure a 0,5pg/ml de milieu, et/ou - une teneur en IL6 inferieure a 0,5pg/ml de milieu et/ou - une teneur en GM-CSF inferieure a 0,5pg/ml de milieu. Selon I'invention, de fa?on surprenante, une teneur en granzyme B inferieure a lpg/mL de milieu dans la partie interne du microcompartiment, preferentiellement inferieure a 0.5pg/mL, plus preferentiellement inferieure a O.lpg/mL, encore plus preferentiellement inferieure a 50ng/mL et/ou une teneur en perforine inferieure a 0,5pg/ml de milieu, preferentiellement inferieure a O.lpg/mL, plus preferentiellement inferieure a 50ng/mL, encore plus preferentiellement inferieure a lOng/mL est un critere garantissant Ie phenotype fonctionnel des lymphocytes au sein de la partie interne du microcompartiment selon I'invention. Les granzymes font partie de la famille des serines proteases et sont connues pour etre des moyens d'action des cellules immunitaires cytotoxiques, notamment les lymphocytes T et lymphocytes NK, pour lyser leur cible. Les granzymes sont stockees dans des granules cytotoxiques comprenant egalement de la perforine. Ces granules sont classiquement liberes dans I'environnement immediat des cellules cibles, puis penetre Ie cytoplasme via l'action de la perforine. Parmi ces granzymes, on retrouve la granzyme B qui est connue pour activer l'apoptose des cellules par des voies de signalisation impliquant des caspases. Dans les methodes de culture classique, les lymphocytes sont soumis a differentes contraintes physiques et/ou stress ayant tendance a provoquer un relargage d'interleukines et des granules contenant les granzymes, plus particulierement la granzyme B. Ce relargage va provoquer une diminution significative de la viabilite des lymphocytes en provoquant l'apoptose d'une partie d'entre eux. D'autre part, les lymphocytes restants ne presentent plus un phenotype fonctionnel. En effet, les lymphocytes ont perdu leur capacite a secreter des interleukines sous I'induction de la presentation d'un antigene ce qui affectent ainsi leur capacite d'action sur l'antigene cible. Le facteur de necrose tumorale (TNF alpha) est une cytokine pleiotrope impliquee dans de nombreux processus physiologiques qui controlent I'inflammation, la reponse aux tumeurs,5 10 15 20 25 30 WO 2023/194479 14 PCT/EP2023/059019 et I'homeostasie du systeme immunitaire. Le TNF alpha peut etre secrete par des lymphocytes ou par d'autres cellules (notamment les macrophages actives) pour agir directement sur des cellules infectees par certains pathogenes ou pour favoriser la proliferation des lymphocytes. Le TNF alpha peut ainsi promouvoir l'activation et la proliferation des cellules T naives et effectrices, mais peut aussi induire l'apoptose de cellules T effectrice activees. Le TNF alpha est stocke dans des vesicules de secretion intracellulaires. Ces vesicules sont classiquement liberees dans I'environnement immediat des cellules cibles. Dans les methodes de culture classique, les lymphocytes sont soumis a differentes contraintes physiques et/ou stress ayant tendance a provoquer un relargage d'interleukines plus particulierement de TNF alpha. Ce relargage incontrole du TNF alpha va modifier I'environnement direct des lymphocytes et peut provoquer une diminution significative de la viabilite des lymphocytes en provoquant l'apoptose d'une partie d'entre eux. D'autre part, les lymphocytes restants ne presentent plus un phenotype fonctionneL En effet, les lymphocytes ont perdu leur capacite a secreter des interleukines sous I'induction de la presentation d'un antigene ce qui affectent ainsi leur capacite d'action sur l'antigene cible. Avantageusement, le microcompartiment selon I'invention permet d'obtenir des lymphocytes presentant un phenotype fonctionneL Contrairement a ce qui est suggere dans I'art anterieur, une teneur en granzyme B inferieure a lpg/mL de milieu, preferentiellement inferieure a 0.5pg/mL, plus preferentiellement inferieure a O.lpg/mL, encore plus preferentiellement inferieure a 50ng/mL et/ou une teneur en perforine inferieure a 0,5pg/ml de milieu, preferentiellement inferieure a O.lpg/mL, plus preferentiellement inferieure a 50ng/mL, encore plus preferentiellement inferieure a lOng/mL est particulierement recherchee dans le cadre de la culture de lymphocytes. Une concentration en granzyme B superieure lpg/mLde milieu et/ou une teneur en perforine superieure a 0,5pg/ml de milieu et/ou une concentration en TNF alpha superieure lOOng/mL de milieu indiquerait qu'un processus anarchique de relachement d'interleukines a lieu dans le microcompartiment selon I'invention et le rendrait incompatible avec une culture a grande echelle de lymphocytes presentant un phenotype fonctionneL II en est de meme pour une concentration en IL6 superieure a a 0,5pg/ml de milieu et/ou une concentration superieure a 0,5pg/ml de milieu GM-CSF pour les lymphocytes NK. IL6 en particulier est connue pour diminuer l'activite cytotoxique des NK (Cifadi et aL, « Inhibition of natural killer cell cytotoxicity by interleukin-6: implications for the pathogenesis of5 10 15 20 25 30 WO 2023/194479 15 PCT/EP2023/059019 macrophage activation syndrome » Artritis Rheumatol, 2015 Nov;67(ll):3037-46. doi: 10.1002/art.39295.). Ainsi une diminution de la concentration en IL6 permet avantageusement d'augmenter I'efficacite des NK. Avantageusement, Ie microcompartiment selon I'invention est adapte a une culture a grande echelle. Le microcompartiment selon I'invention presente avantageusement un taux d'expansion des lymphocytes T d'au moins fois 20 apres 3 jours de mise en culture, et un taux d'expansion des lymphocytes NK d'au moins 40 fois apres 14 jours de mise en culture. Le microcompartiment selon I'invention comprend une couche externe en hydrogel. Preferentiellement I'hydrogel utilise est biocompatible, c'est-a-dire qu'il n'est pas toxique pour les cellules. La couche externe d'hydrogel doit permettre la diffusion d'oxygene et de nutriment pour alimenter les cellules contenues dans le microcompartiment et permettre leur survie. Selon un mode de realisation, la couche externe d'hydrogel comprend au moins de l'alginate. Elle peut etre constituee exclusivement d'alginate. L'alginate peut etre en particulier un alginate de sodium, compose a 80% d'a-L-guluronate et 20% de p-D-mannuronate, avec une masse moleculaire moyenne de 100 a 400 kDa et une concentration totale comprise entre 0,5 et 5% en masse. La couche externe en hydrogel est depourvue de cellules. La couche externe d'hydrogel permet notamment de proteger les cellules du stress mecanique des bioreacteurs, de limiter la secretion anarchique par les lymphocytes en culture de cytokines potentiellement toxiques quand accumulees dans le milieu. L'epaisseur moyenne de couche externe peut etre variable. Elle est preferentiellement comprise entre 20 et 60um, plus preferentiellement entre 30 et 40um. Le ratio entre le plus petit rayon de la partie interne et cette epaisseur est preferentiellement comprise entre 2 et 10 um. Le microcompartiment selon I'invention peut etre obtenu apres encapsulation de lymphocytes sans ajout de matrice extracellulaire, naturelle ou de synthese. Selon une variante, le microcompartiment selon I'invention ne comprend pas dans sa partie interne de matrice extracellulaire telle que du Matrigel® et/ou de la Geltrex® et/ou une matrice type hydrogel d'origine vegetale comme des alginates modifies ou d'origine synthetique ou de copolymere de poly(N-isopropylacrylamide) et de polyethylene glycol) (PNIPAAm-PEG) type Mebiol®. Selon une variante, le microcompartiment selon I'invention peut etre obtenu apres5 10 15 20 25 30 WO 2023/194479 16 PCT/EP2023/059019 encapsulation de lymphocytes sans ajout d'aucun element de matrice extracellulaire.Les elements de matrice extracellulaire peuvent etre les sequences peptidiques ou peptidomimetiques, les melanges de proteines, les composes extracellulaires ou les proteines structurelles, telles que coIlagene, des laminines, de I'entactine, de la vitronectine, ainsi que des facteurs de croissance ou des cytokines. L'absence d'element de matrice extracellulaire dans la partie interne du microcompartiment selon I'invention apres encapsulation garantie aux lymphocytes une liberte d'organisation structurelle au sein du microcompartiment selon I'invention. Avantageusement, l'absence d'element de matrice extracellulaire ameliore de taux d'expansion des lymphocytes. Au sein du microcompartiment, les lymphocytes se regroupent en trois dimensions preferentiellement en amas ou grappes (« clusters »). De fa^on preferee, Ie microcompartiment selon I'invention comprend des lymphocytes formant une culture groupee en trois dimensions sans lumen. L'absence de lumen permet avantageusement de limiter les signaux autocrines et paracrines des lymphocytes rendant leur phenotype particulierement stable a partir de leur encapsulation. Avantageusement, l'absence de lumen permet egalement de mieux controler la taille des regroupements de lymphocytes presents sous forme d'amas ou de grappes dans Ie microcompartiment. Le microcompartiment selon I'invention peut etre obtenu apres encapsulation de lymphocytes prealablement actives permettant ainsi d'augmenter leur taux d'expansion en stimulant leur proliferation. L'activation peut etre realisee en mettant en contact les lymphocytes avec des Artificial antigen presenting cells dites aAPC (cellules presentatrices de l'antigene artificielles) tres preferentiellement via des anticorps CD3/CD28 pour des lymphocytes T, via des CD2/NKp46 pour des lymphocytes NK. Lorsque les lymphocytes ont ete prealablement actives et pour maintenir leur activation, la partie interne du microcompartiment selon I'invention peut comprendre une solution comprenant des cytokines, notamment de l'IL2 ou la combinaison d'IL7 et d'lL15 pour des lymphocytes T, notamment IL2, 1L12, 1L18, IL21(preferentiellement IL2 ou IL12 ou IL18 ou IL21 ou la combinaison d'au moins deux cytokines choisies parmi IL2, IL12, IL18 et IL21) pour des NK.5 10 15 20 25 30 WO 2023/194479 17 PCT/EP2023/059019 Les cytokines pouvant etre comprises dans la partie interne du microcompartiment permettent ainsi d'accelerer la proliferation des lymphocytes. Selon un autre mode de realisation, Ie microcompartiment selon I'invention comprend des lymphocytes actives pendant et/ou apres encapsulation. Dans ce mode de realisation, les lymphocytes peuvent etre une co-encapsules avec des cellules presentatrices de l'antigene artificielles, par exemples des biIles d'activation cotees avec un ou des anticorps adaptes (par exemple Cloudz Human NK Cell Expansion Kit (R&D Systems) ou NK Cell Activation/Expansion Kit (Miltenyi Biotec)). De fa?on preferee, dans ce mode de realisation, l'activation des lymphocytes est effectuee au sein du microcompartiment. Preferentiellement, l'activation des lymphocytes au sein du microcompartiment est realise dans un ratio nombre de lymphocytesI quantite d'antigene superieur a 8/1, preferentiellement superieur a 9/1, encore plus preferentiellement superieur a 10/1. Avantageusement, l'activation est realisee dans Ie microcompartiment en maitrisant Ie ratio du nombre de lymphocytes I quantite d'antigene necessaire de fa^on a activer les lymphocytes tout en limitant I'epuisement cellulaire. Le microcompartiment selon I'invention permet d'isoler les lymphocytes empechant un brassage ou une convection des cellules. Cette isolation mecanique permet de se rapprocher de I'organisation spatiale et structurelle des lymphocytes existant in vivo. Grace a I'isolement mecanique fournie par le microcompartiment, l'activation des lymphocytes ne peut se faire de fa§:on homogene ou continue. De cette maniere l'activation se rapproche des conditions d'activation in vivo des lymphocytes, ce qui favorise leur polarisation. Preferentiellement, les lymphocytes formant les amas ou grappes sont polarisees. La polarite de ces lymphocytes a I'interieur de chaque amas ou grappes peut etre mise en evidence par le positionnement excentre du noyau dans la cellule. Par ailleurs, les lymphocytes polarises peuvent presenter des anisotropies de distribution des proteines Dig, Scrib and LgL La polarisation des lymphocytes dans le microcompartiment peut etre un indicateur du phenotype fonctionnel. En effet, si un lymphocyte contient une quantite suffisante de granules comprenant desgranzymes, notamment des granzymes B, alors les lymphocytes sont polarises. De fa?on inattendue, le microcompartiment selon I'invention conserve la conformation sous5 10 15 20 25 30 WO 2023/194479 18 PCT/EP2023/059019 forme d'amas ou grappes des lymphocytes permettant ainsi d'avoir une meilleure proliferation tout en maintenant un phenotype fonctionnel. Par consequent cela permet de reduire Ie nombre de passages et de reduire Ie temps en culture necessaire pour atteindre Ie nombre de lymphocytes final necessaire. Le microcompartiment peut comprendre egalement, en plus des amas ou grappes, des cellules en suspension dans le microcompartiment. Le microcompartiment selon I'invention comprend preferentiellement une concentration en lymphocytes naif et/ou Tscm superieure a 20%, encore plus preferentiellement superieure a 40%. La concentration en lymphocyte naif et/ou Tscm permet de garantir un effet durable lors de la therapie cellulaire. II est particulierement important lors de la culture d'obtenir une teneur en lymphocyte naif et/ou Tscm superieure a 20% afin d'obtenir un ratio optimal entre persistanee de I'effet et efficacite in vivo. Une concentration en lymphocyte naif et/ou Tscm inferieure a 20% serait indicatif d'une duree de vie des lymphocytes trop faible ne garantissant pas un effet persistant. Les lymphocytes naifs et Tscm sont des lymphocytes immatures presentant les marqueurs CD3+ CD45RO- CD45RA+ CCR7+ facilement identifiables et quantifiables par des methodes de detection bien connues de I'homme du metier telle que la cytometrie en flux. Selon un mode de realisation particulier, I'invention vise un microcompartiment cellulaire en trois dimensions clos de forme ovoide, cylindrique, spheroide ou spherique ou sensiblement ovoide, cylindrique, spheroide ou spherique, dont la plus petite dimension est comprise entre 200 et 400pm, comprenant une couche externe en hydrogel definissant une partie interne, ladite partie interne formant dans un milieu une culture groupee en trois dimensions de lymphocytes ayant : - une teneur en granzyme B inferieure a lpg/mL de milieu; et - une teneur en TNF alpha inferieure a lOOng/mL de milieu;et/ou - une teneur en perforine inferieure a 0,5pg/mL de milieu. Dans ce mode de realisation, lorsque les lymphocytes sont des lymphocytes T, la proportion de lymphocyte T naif et/ou Tscm reste preferentiellement superieure a 20%. Preferentiellement, le microcompartiment est obtenu apres encapsulation de lymphocytes sans ajout de matrice extracellulaire et/ou sans ajout d'element de matrice extracellulaire. Les lymphocytes presents dans le microcompartiment selon I'invention ont ete5 10 15 20 25 30 WO 2023/194479 19 PCT/EP2023/059019 preferentiellement obtenus apres au moins deux cycles de division cellulaire apres ^encapsulation dans une couche externe d'hydrogel d'au moins un lymphocyte. De fa?on preferee, les lymphocytes presents dans Ie microcompartiment selon I'invention ont ete obtenus apres au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 28, 30 cycles de division cellulaire apres ^encapsulation dans une couche externe d'hydrogel, preferentiellement au moins 5, encore plus preferentiellement au moins 6, pour obtenir notamment entre 5 et 100 lymphocytes par lymphocyte encapsule. Par exemple, les lymphocytes presents dans Ie microcompartiment ont ete obtenus apres au moins six cycles de division cellulaire apres ^encapsulation des cellules dans la couche externe en hydrogel. Preferentiellement Ie nombre de divisions cellulaires pour la mise en oeuvre du procede selon I'invention est inferieur a 100, encore plus preferentiellement inferieur a 30. Preferentiellement Ie microcompartiment est obtenu apres au moins 2 passages apres ^encapsulation, plus preferentiellement au moins 3, 4 ou 5 passages. Chaque passage peut durer par exemple entre 2 et 10 jours, notamment entre 2 et 4 jours. De fa^on preferee, Ie microcompartiment est obtenu apres au moins une re-encapsulation, plus preferentiellement entre 1 et 14 re-encapsulations, notamment entre 2 et 7 re¬ encapsulations. Tres preferentiellement une re-encapsulation correspond a un nouveau passage et chaque cycle d'encapsulation correspond a un passage. Preferentiellement, Ie microcompartiment selon I'invention a ete obtenu en moins de 6 jours apres ^encapsulation, encore plus preferentiellement en moins de 4 jours apres encapsulation d'au moins 5 lymphocytes dans la partie interne definie par la couche externe en hydrogel. Le microcompartiment selon I'invention peut contenir entre 500 et 5000 lymphocytes, preferentiellement entre 1000 et 3000 lymphocytes. Avantageusement, le microcompartiment selon I'invention protege les lymphocytes du stress mecanique permettant ainsi d'obtenir un taux d'expansion particulierement adapte a la culture a grande echelle. Le microcompartiment selon I'invention peut se presenter sous toute forme en trois dimensions, c'est-a-dire qu'il peut avoir la forme de tout objet de I'espace. Le microcompartiment peut avoir n'importe quelle forme compatible avec ^encapsulation de cellules. Preferentiellement le microcompartiment selon I'invention se presente sous une forme spherique ou allongee ou sensiblement spherique ou allongee. II peut avoir la forme d'un ovoide, d'un cylindre, d'un spheroide ou d'une sphere ou sensiblement cette forme.5 10 15 20 25 30 WO 2023/194479 20 PCT/EP2023/059019 C'est la couche externe du microcompartiment, c'est-a-dire la couche d'hydrogel, qui confere sa tailIe et sa forme au microcompartiment selon invention. Preferentiellement la plus petite dimension du microcompartiment selon I'invention est comprise entre 200 pm et 400 pm, preferentiellement entre 200 pm et 350 pm, encore plus preferentiellement 200 pm et 300 pm, notamment entre 200pm et 250 pm. Sa plus grande dimension est preferentiellement superieure a 10 pm, plus preferentiellement comprise entre 10 pm et lm, encore plus preferentiellement entre 10 pm et 50 cm. Selon un mode de realisation particulierement prefere, les lymphocytes encapsules dans Ie microcompartiment selon I'invention sont des lymphocytes T ou des lymphocytes NK. Preferentiellement, les lymphocytes compris dans Ie microcompartiment selon I'invention expriment un recepteur antigenique chimerique. Le microcompartiment selon I'invention est ainsi particulierement adapte aux cultures a grande echelle de lymphocytes pour des therapie cellulaires de type CAR-T ou CAR-NK. Selon un mode de realisation, le microcompartiment selon I'invention ne comprend pas de cellules souches embryonnaires humaines et/ou n'est pas obtenu a partir de cellules souches embryonnaires humaines. Le microcompartiment selon I'invention peut etre eventuellement congele pour etre stocke. II devra ensuite etre preferentiellement decongele avant son utilisation. L'invention a egalement pour objet plusieurs microcompartiments ensemble. L'invention a egalement pour objet un ensemble ou serie de microcompartiments comprenant au moins deux microcompartiments cellulaires en trois dimensions, caracterise en ce qu'au moins un microcompartiment est un microcompartiment selon I'invention. De fa^on preferee, la serie de microcompartiments selon I'invention est dans un milieu de culture, en particulier dans un milieu de culture au moins partiellement convectif. Tout milieu de culture adapte a la culture de lymphocytes peut etre utilise, tel que par exemple le milieu « TexMACS (Miltenyi Biotec) » ou «VIVO 15-20 (Lonza) » ou « CTS™ OpTmizer™ (ThermoFisher) » ou NKMACS (Miltenyi Biotec) ou ExCellerate Human NK Cell Expansion Media (R&D Systems), des lors que la concentration en seis dissouts est compatible avec le maintien de la reticulation de I'alginate par les cations divalents. Selon un mode de realisation particulierement adapte, I'invention a pour objet une serie de microcompartiments cellulaires dans une enceinte close, telle qu'un bioreacteur, preferentiellement dans un milieu de culture dans une enceinte close, telle qu'un bioreacteur.5 10 15 20 25 30 WO 2023/194479 21 PCT/EP2023/059019 Ainsi, preferentiellement, les microcompartiments sont disposes dans un milieu de culture dans un bioreacteur clos. L'ensemble ou serie de microcompartiments selon I'invention comprend preferentiellement entre 2 et 1016 microcompartiments. Les microcompartiments selon I'invention peuvent etre utilises pour toutes applications, en particulier comme medicament en therapie cellulaire chez I'homme ou l'animal. Preferentiellement, les microcompartiments selon I'invention peuvent etre utilises dans la prevention ou Ie traitement de maladies auto-immunes, de syndromes d'immunodeficience, de cancers, de maladies virales ou de malades inflammatoires. Ainsi, Ie microcompartiment selon I'invention est adapte a la culture a grande echelle en fournissant des lymphocytes presentant un phenotype fonctionnel garantissant une efficacite et une persistance optimale in vivo. Procede de preparation de microcompartiments selon I'invention L'invention vise egalement un procede de preparation de microcompartiments selon I'invention. Le microcompartiment selon I'invention peut etre obtenu a partir de lymphocytes ou de cellules aptes a se differencier en lymphocytes (en particulier cellules souches, notamment cellules souches pluripotentes induites, cellules souches hematopoietiques dont des cellules CD34+, etc...). Selon un premier mode de realisation, le microcompartiment selon I'invention est obtenu a partir de lymphocytes. Le procede de preparation d'un microcompartiment ou d'un ensemble de microcompartiments selon I'invention, peut comprendre les etapes suivantes : -(a) incuber les lymphocytes dans un milieu de culture comprenant des cytokines -(b) encapsuler les lymphocytes laves dans un milieu de culture dans une couche d'hydrogel, preferentiellement sans ajouter de matrice extracellulaire ou sans ajouter d'element de matrice extracellulaire, pour former un microcompartiment en trois dimensions clos de forme ovoide, cylindrique, spheroide ou spherique ou sensiblement ovoide, cylindrique, spheroide ou spherique, dont la plus petite dimension est comprise entre 200 et 400pm, de fa^on a ce que chaque microcompartiment comprennent au moins 5 lymphocytes dans sa partie interne. -(c) cultiver les microcompartiments obtenus a I'etape (b) dans un milieu de culture5 10 15 20 25 30 WO 2023/194479 22 PCT/EP2023/059019 comprenant des cytokines, pendant 2 a 6 jours. L'etape (a) d'incubation du procede selon I'invention comprend entre 0,5 et 2 millions de lymphocytes par ml de milieu de culture, preferentiellement 1million de lymphocytes par ml de milieu de culture. Les lymphocytes de l'etape (a) sont preferentiellement des lymphocytes T et/ou des lymphocytes NK. Preferentiellement, Ie procede de preparation selon I'invention comprend une etape prealable a I'incubation des lymphocytes, qui consiste a activer lesdits lymphocytes a l'aide d'un systeme d'activation artificielle (aAPC) pendant 3 jours pre-encapsulation. Selon un mode de realisation particulier, l'activation des lymphocytes est effectuee a l'aide d'un systeme d'activation artificielle (aAPC) au sein du microcompartiment issu de l'etape (b). Tout milieu de culture adapte a la culture de lymphocytes, notamment de lymphocytes T ou lymphocytes NK peut etre utilise, tel que Ie milieu « TexMACS (Miltenyi Biotec) » ou «VIVO 15-20 (Lonza) » ou « CTS™ OpTmizer™ (ThermoFisher) » par exemple. Chaque microcompartiment obtenu a l'etape (b) comprend au moins 0,5 million de cellules par mL de volume de la partie interne du microcompartiment, plus preferentiellement au moins 1 million de cellules/mL, notamment au moins 2 millions de cellules/mL, encore plus preferentiellement 5 millions de cellules par mL. De fa?on preferee, chaque microcompartiment obtenu a l'etape (b) comprend au moins 5 lymphocytes, preferentiellement au moins 8 lymphocytes dans sa partie interne. Les cytokines contenues dans Ie milieu de culture peuvent etre par exemple un ou plusieurs cytokines telles qu'IL-2 ou un melange d'IL-7 et IL-15, ou IL-17 et/ou IL-18 et/ou IL-21 ou d'autres cytokines connues de I'homme du metier pour stimuler la proliferation des lymphocytes. Preferentiellement, les milieux de culture utilises dans Ie procede de preparation de I'invention pour des lymphocytes T sont supplementes de 100 a 1000 unites/ml d'IL2 ou la combinaison de 300 a 600 unites/ml d'IL7 et 50 a 100 unites /ml d'IL15. Dans Ie procede selon I'invention la totalite des lymphocytes encapsules initialement a l'etape (b) representent preferentiellement un volume inferieur a 50% du volume du microcompartiment dans lequel ils sont encapsules, plus preferentiellement inferieur a 40%, 30%, 20%, 10% du volume du microcompartiment dans lequel ils sont encapsulees. Les lymphocytes encapsules sont en suspension sous forme de cellules uniques et/ou d'amas5 10 15 20 25 30 WO 2023/194479 23 PCT/EP2023/059019 ou ensemble(s) d'au moins deux cellules (« cluster(s) » / regroupements). De fag:on preferee, lorsqu'il y a au moins 15 lymphocytes la ou les cellules uniques representent moins de 50% en nombre de la totalite des cellules encapsulees initialement a I'etape (b). Preferentiellement chaque amas de lymphocytes encapsule initialement a I'etape (b) a une plus grande dimension inferieure a 20% de la plus grande dimension d'un microcompartiment dans lequel il est encapsule, encore plus preferentiellement inferieure a 10%. En effet les regroupements de lymphocytes ne doivent pas avoir une trap grande taille par rapport a la taille du microcompartiment car une dimension trap grande de ces amas cellulaires initiaux, pourrait entrainer, lors des divisions cellulaires, une confluence cellulaire plus precoce dans la capsule ; cette confluence trap precoce de toute ou partie des capsules, pourrait entrainer une augmentation des pressions intracellulaires et entrainer un stress cellulaire, impactant la croissance cellulaire mais egalement la segregation chromosomique. L'etape (b) d'encapsulation est mise en oeuvre selon les techniques connues de I'homme du metier. En effet, toute methode de production de microcompartiments cellulaires contenant a I'interieur d'une capsule d'hydrogel et des cellules peut etre utilisee pour la mise en oeuvre du procede de preparation selon I'invention. Notamment, il est possible de preparer des microcompartiments en adaptant la methode et Ie dispositif microfluidique decrits dans Alessandri et al., 2016 (« A 3D printed microfluidic device for production of functionalized hydrogel microcapsules for culture and differentiation of human Neuronal Stem Cells (hNSC) », Lab on a Chip, 2016, vol. 16, no. 9, p. 1593-1604), conformement aux etapes decrites cidessous. Preferentiellement I'etape (b) est mise en oeuvre sans ajouter de matrice extracellulaire, naturelle ou de synthese. Selon une variante, I'etape (b) est mise en oeuvre sans ajouter d'element de matrice extracellulaire. Preferentiellement I'etape (b) est mise en oeuvre dans un dispositif capable de generer des capsules d'hydrogel a l'aide d'une puce microfluidique. Par exemple Ie dispositif peut comprendre des pousses seringues pour plusieurs solutions injectees de maniere concentrique grace a un injecteur microfluidique qui permet de former un jet qui se fractionne en gouttes collectees ensuite dans un bain de calcium. Selon un mode de realisation particulierement adapte, deux ou trois solutions chargees sur deux ou trois pousse-seringues : - une solution d'hydrogel, par exemple d'alginate, - optionnellement une solution intermediaire isotonique preferentiellement une solution5 10 15 20 25 30 WO 2023/194479 24 PCT/EP2023/059019 isotonique ne contenant pas de cation divalent tel que Ca2+ Mg2+ pour eviter une reticulation de I'hydrogel trap precoce dans I'injecteur, telle que par exemple une solution de sorbitol, - la solution issue de I'etape (a) comprenant des lymphocytes et du milieu de culture Les trois solutions sont co-injectees (injectees simultanement) de maniere concentrique grace a un injecteur microfluidique ou puce microfluidique qui permet de former un jet qui se fractionne en gouttes dont la couche exterieure est la solution d'hydrogel et Ie cceur la solution de I'etape (a) comprenant les lymphocytes; Ces gouttes sont collectees dans un bain de calcium qui reticule et/ou gelifie la solution d'alginate pour former la coque. Pour ameliorer la mono-dispersite des microcompartiments cellulaires, la solution d'hydrogel est preferentiellement chargee avec un courant continu a (entre 1et lOkV). Un anneau a la masse peut eventuellement etre dispose a une distance de la pointe comprise entre 1mm et 20 cm, preferentiellement 3mm a 10 cm, encore plus preferentiellement 1cm a 5cm, de la pointe dans Ie plan perpendiculaire a l'axe du jet sortant de I'injecteur microfluidique (puce de coextrusion) pour generer Ie champ electrique. Selon I'invention, il est necessaire de generer des capsules dont la partie interne a un rayon moyen ou plus petit rayon d'au moins 100pm. Pour generer des capsules avec de telles dimensions avec une puce de coextrusion (injecteur microfluidique ou puce microfluidique) I'invention propose notamment de modifier Ie debit des solutions coextrudees et I'ouverture finale de la puce de co-extrusion. Par debit on entend Ie debit de de chaque solution qui arrive a I'injecteur. Par ouverture finale de la puce de co-extrusion, on entend I'ouverture interne du canal de sortie de la puce. - pour Ie debit : on passe preferentiellement d'une valeur comprise entre 20 et 40 ml/h pour chaque solution coextrudee pour les tailles standards de capsules connues de l'art anterieur, a une valeur comprise entre 45 et 150 mL/h, preferentiellement entre 45 et 110 mL par heure pour une variante de I'invention, - pour Ie diametre de I'ouverture finale de la puce de coextrusion (injecteur microfluidique) qui passe d'une valeur preferentiellement comprise entre 50 et 120 pm pour les tallies standards de capsules connues de l'art anterieur, a une valeur de diametre comprise entre 150 et 300 pm, preferentiellement entre 180 et 240 pm. Ainsi, selon un mode de realisation particulier I'etape (b) d'encapsulation est realisee a l'aide d'un injecteur microfluidique dont Ie diametre d'ouverture finale est compris entre 150 et 300 pm, preferentiellement entre 180 et 240 pm, et avec Ie debit de chacune des 3 solutions5 10 15 20 25 30 WO 2023/194479 25 PCT/EP2023/059019 compris entre 45 et 150 mL/h, preferentiellement entre 45 et 110 mL/h. Selon un mode de realisation, les etapes (a) et/ou (c) sont mises en oeuvre sous agitation permanente ou sequentielle. Cette agitation est importante carelle maintient I'homogeneite de I'environnement de culture et evite la formation de tout gradient diffusif. Par exemple, eIIe permet un controle homogene de niveau d'oxygenation cellulaire; evitant ainsi les phenomenes de necrose lie a I'hypoxie, ou de stress oxydatif lie a I'hyperoxie. Le procede selon I'invention est preferentiellement mis en oeuvre d'une enceinte close tel qu'un bioreacteur clos. Dans une variante preferee, le procede selon I'invention comprend au moins une re¬ encapsulation des lymphocytes apres I'etape (c), c'est-a-dire au moins deux cycles d'encapsulation. Preferentiellement chaque cycle d'encapsulation correspond a un passage. Dans cette variante du procede (au moins une re-encapsulation des cellules apres I'etape (c)) le nombre de divisions cellulaires de I'ensemble du procede (pour I'ensemble des passages) est d'au moins 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 cycles de division cellulaire. Dans un procede selon I'invention il peut y avoir plusieurs re-encapsulations, preferentiellement entre 1et 100, notamment entre 1et 10 re-encapsulation(s). Selon un mode de realisation particulier, une etape d'activation des lymphocytes a l'aide d'un systeme d'activation artificielle (aAPC) peut etre realisee au sein du microcompartiment apres au moins une re-encapsulation. Chaque re-encapsulation peut comprendre : - une etape qui consiste a dissocier le microcompartiment ou la serie de microcompartiments pour obtenir une suspension de lymphocytes ou une suspension d'amas de lymphocytes; I'elimination de la couche externe en hydrogel peut etre realisee notamment par hydrolyse, dissolution, penjage et/ou rupture par tout moyen biocompatible, c'est-a-dire non toxique pour les cellules. Par exemple, I'elimination peut etre realisee en utilisant un tampon phosphate salin, un chelateur d'ions divalents, une enzyme comme l'alginate lyase si I'hydrogel comprend de l'alginate et/ou la microdissection laser, et -une etape d'activation des lymphocytes a l'aide d'un systeme d'activation artificielle (aAPC) preferentiellement a l'aide d'anticorps CD3/CD28 ; -une etape de re-encapsulation de tout ou partie des lymphocytes ou amas de lymphocytes dans une capsule d'hydrogel. La re-encapsulation est un moyen adapte pour une augmentation de l'amplification cellulaire obtenue depuis I'etape pluripotente, et diminuer5 10 15 20 25 30 WO 2023/194479 26 PCT/EP2023/059019 les risques de mutation. La re-encapsulation consiste a eliminer la couche externe d'hydrogel, preferentiellement a remettre en suspension de maniere partiellement ou totalement dissociees les cellules qui etaient sous forme de cystes dans les microcompartiments et a remettre en oeuvre les etapes du procede. Selon un mode de realisation la re-encapsulation comprend les etapes suivantes : - (i) eliminer la couche externe en hydrogel, - (ii) remettre en suspension les lymphocytes qui etaient contenues dans Ie microcompartiment de fa^on a obtenir des cellules uniques et/ou au moins un ensemble ou amas de lymphocytes dans un milieu de culture contenant des cytokines - (iii) encapsuler la solution de lymphocytes dans une couche d'hydrogel de fa^on a former un microcompartiment de forme ovoide, cylindrique, spheroide ou spherique ou sensiblement ovoide, cylindrique, spheroide ou spherique, comprenant une couche externe en hydrogel definissant une partie interne, Ie plus petit rayon ou Ie rayon moyen de ladite partie interne etant d'au moins 100 pm ; - (iv) cultiver les microcompartiments obtenus dans un milieu de culture contenant des cytokines, - (vi) preferentiellement rincer les microcompartiments, de maniere a eliminer les cytokines; - (vi) cultiver les microcompartiments dans un milieu de culture depourvu de cytokines, pendant au moins un cycle de division cellulaire, et - (vii) optionnellement recuperer les microcompartiments cellulaires obtenus. La compartimentalisation dans des microcompartiments permet d'eliminer les microcompartiments contenant d'avantage de cellules mutees que les autres capsules. Meme si les cellules mutees ont une croissance rapide elles vont atteindre la confluence capsulaire qui va contenir leur multiplication. La compartimentalisation permet aussi de ne pas contaminer I'integralite de la population cellulaire, et egalement d'eliminer les capsules contenant des cellules mutantes, a tout moment, en particulier avant une etape de re¬ encapsulation. Ce tri peut etre fait soit par analyse en ligne, soit par elimination des capsules remplies plus rapidement que les autres par exemple. Dans un mode de mise en oeuvre, au moins une des etapes (preferentiellement toutes les etapes) est realisee a une temperature adaptee a la survie des cellules, comprise entre 4 et 42°C. La temperature lors de la proliferation cellulaire doit etre preferentiellement entre 32 et5 10 15 20 25 30 WO 2023/194479 27 PCT/EP2023/059019 37°C pour eviter de declencher des mutations en baissant la performance des enzymes de reparation. De meme, de fa^on preferee, la temperature doit etre basse (idealement environ 4°C) pour gerer Ie stress des cellules a I'etape (c). A tout moment, Ie procede selon I'invention peut comprendre une etape consistant a verifier Ie phenotype des cellules contenues dans Ie microcompartiment. Cette verification peut etre realisee en identifiant I'expression par au moins une partie des cellules contenues dans Ie microcompartiment, d'au moins 4 genes specifiques du phenotype recherche choisis parmi CD45 RA RO, CCR7, CD62L, CD3, CD4, CD8, CD56, CD16. Les microcompartiments cellulaires obtenus selon les procedes de I'invention peuvent ensuite etre congeles avant toute utilisation. La congelation est preferentiellement realisee a une temperature comprise entre -190°C et -80°C. La decongelation peut etre realisee par immersion du vehicule de congelation etanche (ampoule vissable ou poche plastique) dans un bain d'eau tiede (37 degres preferentiellement) pour que les cellules decongelent assez rapidement. Les microcompartiments selon I'invention avant leur utilisation peuvent etre maintenus a plus de 4°C pendant une duree limitee avant leur utilisation, preferentiellement entre 4°C et 38°C. La mise en oeuvre du procede selon I'invention, permet d'obtenir des microcompartiments comprenant au moins 80, preferentiellement au moins 500, au moins 800, au moins 1000, notamment au moins 3000 lymphocytes. L'invention favorise surtout l'amplification avec un taux d'expansion eleve, ce qui par consequent diminue Ie temps de culture et Ie nombre de divisions pour obtenir un nombre de lymphocytes fonctionnels tres important. Selon un second mode de realisation, Ie microcompartiment selon I'invention est obtenu a partir de cellules aptes a se differencier en lymphocytes, et comprend au moins la mise en oeuvre d'un procede de differenciation en lymphocytes de cellules aptes a se differencier en lymphocytes (cellules souches, notamment cellules souches pluripotentes induites, cellules souches hematopoietiques dont des cellules CD34+, etc...). Les cellules aptes a se differencier en lymphocytes sont preferentiellement choisies parmi : * soit des cellules souches capables de se differencier en lymphocytes, au moins en lymphocytes T ou lymphocytes NK, preferentiellement des cellules souches embryonnaires ou des cellules souches pluripotentes induites, ou des cellules souches hematopoietiques dont des cellules CD34+, tres preferentiellement des cellules souches pluripotentes induites, et/ou,5 10 15 20 25 30 WO 2023/194479 28 PCT/EP2023/059019 * soit des cellules progenitrices capables, de se differencier en lymphocytes, au moins en lymphocytes? ou lymphocytes NK, *soit des cellules differenciees capables de subir une reprogrammation de fa?on a ce qu'elles deviennent des cellules souches pluripotentes induites capables de se differencier en lymphocytes, au moins en lymphocytes T ou lymphocytes NK. Dans cette variante, Ie procede peut comprend au moins la mise en oeuvre des etapes qui consistent a : -produire un microcompartiment cellulaire comprenant, a I'interieur d'une capsule en hydrogel : * preferentiellement au moins des elements de matrice extracellulaire ou une matrice extracellulaire, naturelie ou de synthese, * des cellules aptes a se differencier en lymphocytes, preferentiellement des cellules souches pluripotentes induites (IPS), - induire la differenciation cellulaire en lymphocytes au sein du microcompartiment cellulaire, de maniere a obtenir au moins des lymphocytes. Exemples : Exemple1: Procede selon I'invention (Lymphocytes T) Reactifs utilises : -Solution 1: Milieu de culture utilise : TexMACS (Miltenyi Biotec) supplement^ avec 1000 unites/ml d'IL-2 recombinant (Miltenyi Biotec) -Solution 2 : Reactif d'activation polyantigenique CD3/CD28 (Transact™ Miltenyi Biotec) -Solution 3 : Milieu de rin^age des capsules : DMEM/F-12 + Glutamax -Solution 4 : Solution pour dissoudre les capsules d'alginate : tampon de detachement cellulaire non-enzymatique (RelesR™ Stem Cell Technology) Etape 1: decongelation des cellules (JO) Les ampoules de lymphocytes T tries a partir de sang peripherique de donneur sain ont ete decongelees selon les recommandations du fournisseur (Hu PB Pan-T, Stem Cell Technologies, #70024). Etape 2 : Activation des lymphocytes T (JO) Les lymphocytes T ont ete comptes au NucleoCounter NC2000 (protocole Standard1cassette) et mise en culture dans la solution 1a une densite de 1million de cellules par ml dans une5 10 15 20 25 30 WO 2023/194479 29 PCT/EP2023/059019 flasque de culture. La solution 2 a ete ajoutee au 1/100 dans la suspension cellulaire ainsi preparee. Les cellules ainsi traitees ont ete laissees en culture dans un incubateur a 37°C et 5% de CO2 pendant 3 jours. Etape 3 : Changement de milieu et encapsulation (J3) : Afin d'eliminer Ie Transcart™ dans Ie milieu, les cellules ont ete centrifugees a 300g pendant 10 min et Ie surnageant aspire. Les cellules ont ete rincees en solution1une fois. Une partie du culot cellulaire a ete repris en solution1a une densite cellulaire de 5 millions de cellules par ml en vue de I'encapsulation. L'autre partie du culot cellulaire a ete repris en solution1a une densite cellulaire de 5 millions de cellules par ml (controle). Etape 4 : Encapsulation (J3) Le dispositif d'encapsulation est prepare comme decrit dans Alessandri et al., 2016 (« A 3D printed microfluidic device for production of functionalized hydrogel microcapsules for culture and differentiation of human Neuronal Stem Cells (hNSC) », Lab on a Chip, 2016, vol. 16, no. 9, p. 1593-1604). Les trois solutions necessaires sont chargees surtrois pousse-seringues, i) solution d'alginate (PRONOVA®SLG100 a 2% en masse dans de I'eau distillee), ii) solution intermediaire (sorbitol a 300mM), iii) solution cellulaire (preparee a I'etape precedente) ; Les trois solutions sont coinjectees de maniere concentrique grace a un injecteur microfluidique qui permet de former un jet qui se fractionne en gouttes dont la couche exterieure est la solution d'alginate et le coeur la solution de cellules; Ces gouttes sont collectees dans un bain de calcium (a 100mM) qui rigidifie la solution d'alginate pour former la coque. L'invention favorise surtout l'amplification avec un taux d'expansion eleve, ce qui par consequent diminue le temps de culture et le nombre de divisions pour obtenir un nombre de lymphocytes fonctionnels tres important, et limite done de nouvelles mutageneses. Une image de microscopie a contraste de phase au grossissement x20 d'un ensemble apres 3 jours de culture en capsules est presentee en figure la. Une image de microscopie a contraste de phase au grossissement xlO apres 3 jours de culture en capsules est presentee en figure lb. Etape 5 : traitement apres encapsulation (J3)5 10 15 20 25 30 WO 2023/194479 30 PCT/EP2023/059019 Les capsules sont recuperees avec un tamis cellulaire 40pm puis apres rin^age (lx) avec la solution 3 elles sont stockees dans une flasque de 75cm2 avec la solution 1 a une densite cellulaire de 100 000 cellules par ml (condition 1) ou 200 000 cellules par ml (condition 2). La flasque est gardee a I'incubateur a 37°C et 5% de CO2 pendant 3 jours. Les cellules non encapsulees telles que preparees durant la 3eme etape sont cultivees en parallele dans les memes conditions atmospheriques pendant 3 jours. Etape 6 : Dissolution des capsules et comptage (J6) -(a) : Bras1: capsule -La suspension de capsules a ete prelevee et laissee a sedimenter pendant 5 minutes dans un tube Falcon de 50mL -Le surnageant a ete preleve avec precaution et elimine. -Les capsules ont ensuite ete traitees avec la solution 4 pendant 5 min a 37°C. -Les cellules liberees des capsules ont ete centrifugees a 300g pendant lOminutes pour eliminer la solution 4. -Les cellules ont ete finalement comptees au NC2000 (protocole standard1cassette) -(b) : Bras 2 : controle en suspension -La suspension cellulaire a ete prelevee puis centrifugee a 300g pendant lOmin. -Le surnagent a ete aspire. -Les cellules ont ensuite ete comptees au NC2000 (protocole standard1cassette). Les resultats d'encapsulation de lymphocytes T selon le protocole decrit montre une meilleure amplification cellulaire en capsules par rapport a une culture classique en suspension. Ainsi nous obtenons un facteur d'amplification de fois 20 en 3 jours de culture en capsule contre un facteur de fois 2 pour une culture classique. Exemple 2 : Mesure de la secretion de cytokines de lymphocytes T encapsules ou non Le kit de detection utilise est le MACSPlex Cytotoxic T/NK Cell Kit (Miltenyi Biotec, 130-125- 800) La preparation des differents reactifs et solutions a ete faite selon les recommandations du fournisseur dans la plaque MACSPlex Filter Plate Les surnageants de culture des cellules encapsulees ou non ont ete preleves a jour 6 apres, non dilues, et incubes en duplicat et incubes dans la plaque preparee en etape 2 de I'exemple 1;WO 2023/194479 31 PCT/EP2023/059019 L'incubation a ete realisee en accord avec les recommandations du fournisseur ; L'acquisition des donnees a ete realisee sur un cytometre MACSQuant 10 (Miltenyi Biotec) en utilisant un Express Mode dedie (Miltenyi Biotec). Les resultats sont exprimes en moyenne de fluorescence par million de cellules (MFI/e6 5 cellules) dans Ie tableau 1et dans la figure 4 (resultats normalises par rapport a la secretion de GMCSF et d'lFNg).WO 2023/194479 32 PCT/EP2023/059019 [Tableau 1] Ces resultats confirment notamment que les lymphocytes encapsules dans Ie microcompartiment selon I'invention presentent une concentration en granzyme B, en perforine et en TNF alpha extracellulaires moins importante par rapport aux lymphocytes en Surnageant non dilue GM-CSF Granzy me B IFNg IL-21 IL-6 MCP-1 Perforine TNF-a Lymphocytes T en suspension 499,3 1339,4 28,9 1,1 4,6 18,9 65,4 108,5 Lymphocytes T encapsules (invention) 22,2 0,9 1,2 0,1 0,6 1,6 1,8 0,2 Lymphocytes T en suspension normalise par rapport a la secretion de GMCSF et d'lFNg 1,89057 1753 5,07156 3802 0,10942 8247 0,00416 5089 0,01741 7645 0,0715 63802 0,247633 472 0,41082 9231 Lymphocytes T encapsules normalise par rapport a la secretion de GMCSF et d'lFNg 1,89743 5897 0,07692 3077 0,10256 4103 0,00854 7009 0,05128 2051 0,1367 52137 0,153846 154 0,01709 4017 Ratio invention/suspension 1,00363 0724 0,01516 7526 0,93727 2647 2,05205 9052 2,94425 864 1,9109 12133 0,621265 585 0,04160 8571 5 suspension. Exemple 3 : Polarisation d'un microcompartiment selon I'invention Les microcompartiment selon I'invention comprenant des lymphocytes T ont ete fixes en PFA 4% dilue dans du PBS avec calcium et conservees a 4°C Protocole de marquage : 10 Le marquage phalloidin et Lipilight (Membright) ont ete fait aux dilutions recommandees par les fournisseurs pendant 72h sous agitation, a temperature ambiante et protege de la lumiere L'acquisition des images (Figure 5) a ete faite en microscopie confocale. On peut observer un microcompartiment selon I'invention comprenant des lymphocytes dont le noyau est excentre. Par consequent, les lymphocytes sont polarises au sein du 15 microcompartiment et presentent ainsi un phenotype fonctionnel.5 10 15 20 25 30 WO 2023/194479 33 PCT/EP2023/059019 Exemple 4 : Procede selon I'invention (lymphocytes NK) Reactifs utilises : -Solution 1: Milieu de culture basal pour expansion de NK (ExCellerate Human NK Cell Expansion Media (R&D Systems)) supplement^ avec 27ng/ml d'IL-2 recombinant, 10 ng/mL d'IL-12 recombinant, lOng/ml d'IL-18 recombinant et lOng/ml d'IL-21recombinant. -Solution 2 : Solution1supplementee avec des billes d'activation polyantigenique CD2/NKp46 (e.g. Cloudz Human NK Cell Expansion Kit (R&D Systems)) -Solution 3 : Milieu de rin^age des capsules : DMEM/F-12 + Glutamax -Solution 4 : Solution pour dissoudre les capsules d'alginate : solution d'EDTA a 2.5mM Etape 1: decongelation des cellules (JO) Les ampoules de NK tries a partir de sang peripherique de donneurs sains (donneur A et donneur B) ont ete decongelees selon les recommandations du fournisseur (Hu PB NK, Stem Cell Technologies, #70036). Les NK ont ete comptes au NucleoCounter NC2000 (protocole Standard1cassette). Les cellules ont ete centrifugees a 300g pendant 10 min et Ie surnageant a ete aspire. Une partie du culot cellulaire a ete repris en solution 2 a une densite cellulaire de 15 millions de cellules par ml en vue de I'encapsulation. L'autre partie du culot cellulaire a ete repris en solution 2 a une densite cellulaire entre 0.2 et 1millions de cellules par ml (controle). Etape 2 : Encapsulation (JO) Le dispositif d'encapsulation est prepare comme decrit dans Alessandri et al., 2016 (« A 3D printed microfluidic device for production of functionalized hydrogel microcapsules for culture and differentiation of human Neuronal Stem Cells (hNSC) », Lab on a Chip, 2016, vol. 16, no. 9, p. 1593-1604). Les trois solutions necessaires sont chargees sur trois pousse-seringues, i) solution d'alginate (PRONOVA®SLG100 a 2% en masse dans de I'eau distillee), ii) solution intermediaire (sorbitol a 300mM), iii) solution cellulaire (preparee a I'etape precedente) ; Les trois solutions sont coinjectees de maniere concentrique grace a un injecteur microfluidique qui permet de former un jet qui se fractionne en gouttes dont la couche exterieure est la solution d'alginate et le cceur la solution de cellules; Ces gouttes sont collectees dans un bain de calcium (a lOOmM) qui rigidifie la solution d'alginate pour former la coque. L'invention favorise surtout I'amplification avec un taux d'expansion eleve, ce qui par5 10 15 20 25 30 WO 2023/194479 34 PCT/EP2023/059019 consequent diminue Ie temps de culture et Ie nombre de divisions pour obtenir un nombre de lymphocytes fonctionnels tres important, et limite done de nouvelles mutageneses. Etape 3 : traitement apres encapsulation (JO) Les capsules sont recuperees avec un tamis cellulaire 40pm puis apres rin^age (lx) avec la solution 3 elles sont stockees dans une flasque de 75cm2 (Donneur A) ou dans un minibioreacteur de 30mL (Donneur B) avec la solution 1a une densite cellulaire comprise entre 200 000 et 1000 000 cellules par ml. La flasque ou Ie mini-bioreacteur de 30mL sont gardes a I'incubateur a 37°C et 5% de CO2 pendant 11 a 14 jours. Les capsules en mini-bioreacteur sont agitees a 100 RPM. Le renouvellement du milieu de culture est effectue selon les recommandations des fournisseurs. Les cellules non encapsulees telles que preparees durant la 3eme etape sont cultivees en parallele dans les memes conditions pendant 11a 14 jours. Etape 6 : Dissolution des capsules et comptage (Jll ou J14, selon la confluence des capsules) -(a) : Bras1: capsule -La suspension de capsules a ete prelevee et laissee a sedimenter pendant 5 minutes dans un tube Falcon de 50mL -Le surnageant a ete preleve avec precaution et elimine. -Les capsules ont ensuite ete traitees avec la solution 4 pendant 5 min a 37°C. -Les cellules liberees des capsules ont ete centrifugees a 300g pendant lOminutes pour eliminer la solution 4. -Les billes d'activations sont eliminees selon les recommandations du fournisseur. -Les cellules ont ete finalement comptees au NC2000 (protocole standard1cassette) -(b) : Bras 2 : controle en suspension -La suspension cellulaire a ete prelevee puis centrifugee a 300g pendant lOmin. -Le surnagent a ete aspire. -Les billes d'activations sont eliminees selon les recommandations du fournisseur. -Les cellules ont ensuite ete comptees au NC2000 (protocole standard1cassette). Les resultats d'encapsulation de NK selon le protocole decrit une meilleure amplification cellulaire en capsules par rapport a une culture classique en suspension, comme illustre dans la figure 6. Ainsi, pour le donneur A, nous obtenons un facteur d'amplification de fois 40 en 14 jours de culture en capsule contre un facteur de fois 3 pour une culture classique. Pour le donneur B, nous obtenons un facteur d'amplification de fois 110 en 11 jours de culture enWO 2023/194479 35 PCT/EP2023/059019 capsule contre un facteur de fois 70 pour une culture classique. La figure 10 montre que la viabilite lors de la culture des NK obtenus selon I'invention est meilleure que celle des celle des NK cultives en 2D. Pour Ie donneur A, la viabilite a J14 est de 74% pour la culture en capsule contre 64% pour la culture en suspension. Pour Ie donneur B, 5 la viabilite a Jll est de 88% pour la culture en capsule contre 62% en suspension. Exemple 5 : Mesure de la secretion de cytokines de lymphocytes NK encapsules ou non Le kit de detection utilise est Ie MACSPlex Cytotoxic T/NK Cell Kit (Miltenyi Biotec, 130-125- 800) La preparation des differents reactifs et solutions a ete faite selon les recommandations du 10 fournisseur dans la plaque MACSPlex Filter Plate Les surnageants de culture des cellules encapsulees ou non ont ete preleves 14 jours apres, dilues au 10e ou au 100e, et incubes en duplicat dans la plaque preparee en etape 2 de I'exemple 4; L'incubation a ete realisee en accord avec les recommandations du fournisseur ; 15 L'acquisition des donnees a ete realisee sur un cytometre MACSQuant 10 (Miltenyi Biotec) en utilisant un Express Mode dedie (Miltenyi Biotec). Les resultats sont exprimes en moyenne de fluorescence par million de cellules (MFI/e6 cellules) dans les tableaux 2 et 3 et dans les figures 7a, 7b (Donneur A) et 8a, 8b (Donneur B).WO 2023/194479 36 PCT/EP2023/059019 [Tableau 2] Surnageant dilue au lOe GM-CSF IL-10 IL-17A IL-6 MCP-1 Perforin e NK, donneur A en suspension 168,3 1,2 8 635 3,8 94,7 NK, donneur A en capsule (invention) 14,8 5,5 0,8 25 7,7 27 NK, donneur B en suspension 60,9 3,9 2,7 9,6 2,8 110,3 NK, donneur B en capsule (invention) 3,3 0,3 0,9 0,5 0,4 3,5 NK, donneur A en suspension normalise par rapport a la secretion d'lFNg 0,01476 3158 0,00010 5263 0,00070 1754 0,05570 1754 0,00033 3333 0,00830 7018 NK, donneur A en capsule normalise par rapport a la secretion d'lFNg 0,00167 9337 0,00062 4078 9,0775E -05 0,00283 6718 0,00087 3709 0,00306 3656 NK, donneur B en suspension normalise par rapport a la secretion d'lFNg 0,02298 9807 0,00147 2254 0,00101 9253 0,00362 4009 0,00105 7003 0,04163 8354 NK, donneur B en capsule normalise par rapport a la secretion d'lFNg 0,01341 4634 0,00121 9512 0,00365 8537 0,00203 252 0,00162 6016 0,01422 7642 Ratio invention/suspension donneur A 0,11375 1906 5,92874 1632 0,12935 4363 0,05092 6915 2,62112 7879 0,36880 3358 Ratio invention/suspension donneur B 0,58350 3544 0,82833 0206 3,58943 0894 0,56084 8577 1,53832 7526 0,34169 5597WO 2023/194479 37 PCT/EP2023/059019 [Tableau 3] Surnageant dilue au lOOe Granzyme IFNg NK, donneur A en suspension 3700 11400 NK, donneur A en capsule (invention) 208 8813 NK, donneur B en suspension 474 2649 NK, donneur B en capsule (invention) 4 246 NK, donneur A en suspension normalise par rapport a la secretion d'lFNg 0,32456140 4 1 NK, donneur A en capsule normalise par rapport a la secretion d'lFNg 0,02360149 8 1 NK, donneur B en suspension normalise par rapport a la secretion d'lFNg 0,17893544 7 1 NK, donneur B en capsule normalise par rapport a la secretion d'lFNg 0,01626016 3 1 Ratio invention/suspension donneur A 0,07271812 8 1 Ratio invention/suspension donneur B 0,09087166 8 1 Ces resultats confirment notamment que les lymphocytes NK encapsules dans Ie microcompartiment selon I'invention presentent une concentration en granzyme B, en perforine, en GM-CSF et en IL-6 moins importante par rapport aux lymphocytes NK en 5 suspension. Exemple 6 : Mesure de la fonctionnalite de lymphocytes NK encapsules ou non La mesure a ete realisee par cytometrie en flux sur des K562 selon Ie protocole Ie suivant. Apres decapsulation, marquage des NK (NK donneurs B obtenus selon les procedes de I'exemple 4, bras capsule et bras controle en suspension) avec la sonde PKH-26, puis 10 incubation pendant 4h a 37°C 5% CO2 des NK avec K562 a differents ratios E :T (« effector to target » effecteur a cible) : 12.5 :1/ 6.25 :1/ 3.125 :1/ 1.5 :1. Marquage Annexin V et 7-AAD.5 10 15 20 25 30 WO 2023/194479 38 PCT/EP2023/059019 La strategic d'analyse des data de cytometrie a ete realisee comme suit : separation des populations de NK et de K562 en utilisant la sonde PKH-26 (K562 = population negative) : les K562 vivants sont negatifs pour 7aad-/AnnexinVLes K562 en apoptose precoce sont 7AAD-/AnnexinV+ Les K562 en apoptose tardive sont 7AAD+/AnnexinV+ Les K562 necrotiques ou mortes sont 7AAD+/AnnexinV-. Le pourcentage de cytotoxicite a ete calcule comme suit : %Cytotoxicite - (apoptose precoce + apoptose tardive + necrose) / total K562 Les resultats obtenus sont presentes sur la figure 9. On constate que les NK obtenus selon I'invention ont une cytotoxicite similaire aux NK obtenus en 2D. Exemple 7 Procede selon I'invention (lymphocytes NK) Reactifs utilises : -Solution 1: Milieu de culture basal pour expansion de NK (ExCellerate Human NK Cell Expansion Media (R&D Systems)) supplement^ avec 27ng/ml d'IL-2 recombinant, 10 ng/mL d'IL-12 recombinant, lOng/ml d'IL-18 recombinant et lOng/ml d'IL-21recombinant. -Solution 2 : Milieu de rin^age des capsules : DMEM/F-12 + Glutamax -Solution 3 : Solution pour dissoudre les capsules d'alginate : solution d'EDTA a 2.5mM Etape 1: decongelation des cellules (JO) Les ampoules de NK tries a partir de sang peripherique de donneurs sains (donneur B et donneur C) ont ete decongelees selon les recommandations du fournisseur (Hu PB NK, Stem Cell Technologies, #70036). Les NK ont ete comptes au NucleoCounter NC2000 (protocole Standard 1cassette). Les cellules ont ete centrifugees a 300g pendant 10 min et le surnageant a ete aspire. Une partie du culot cellulaire a ete repris en solution 1a une densite cellulaire entre 5 et 15 millions de cellules par ml en vue de I'encapsulation. L'autre partie du culot cellulaire a ete repris en solution1a une densite cellulaire entre 0.2 et 1millions de cellules par ml (controle). Etape 2 : Encapsulation (JO) Le dispositif d'encapsulation est prepare comme decrit dans Alessandri et aL, 2016 (« A 3D printed microfluidic device for production of functionalized hydrogel microcapsules for culture and differentiation of human Neuronal Stem Cells (hNSC) », Lab on a Chip, 2016, vol. 16, no.5 10 15 20 25 30 WO 2023/194479 39 PCT/EP2023/059019 9, p. 1593-1604). Les trois solutions necessaires sont chargees surtrois pousse-seringues, i) solution d'alginate (PRONOVA®SLG100 a 2% en masse dans de I'eau distillee), ii) solution intermediaire (sorbitol a 300mM), iii) solution cellulaire (preparee a I'etape precedente) ; Les trois solutions sont coinjectees de maniere concentrique grace a un injecteur microfluidique qui permet de former un jet qui se fractionne en gouttes dont la couche exterieure est la solution d'alginate et Ie coeur la solution de cellules; Ces gouttes sont collectees dans un bain de calcium (a lOOmM) qui rigidifie la solution d'alginate pour former la coque. L'invention favorise surtout l'amplification avec un taux d'expansion eleve, ce qui par consequent diminue Ie temps de culture et Ie nombre de divisions pour obtenir un nombre de lymphocytes fonctionnels tres important, et limite done de nouvelles mutageneses. Etape 3 : traitement apres encapsulation (JO) Les capsules sont recuperees avec un tamis cellulaire 40pm puis apres rin^age (lx) avec la solution 2 elles sont stockees dans un mini-bioreacteur de 30mL avec la solution 1 a une densite cellulaire de 200.000 cellules par ml. Les mini-bioreacteurs de 30mL sont gardes a I'incubateur a 37°C et 5% de CO2 pendant 11 jours. Les capsules en mini-bioreacteur sont agitees a 100 RPM. Le renouvellement du milieu de culture est effectue selon les recommandations des fournisseurs. Les cellules non encapsulees telles que preparees durant la 3eme etape sont cultivees en parallele dans les memes conditions pendant 11jours. Etape 6 : Dissolution des capsules et comptage (Jll) -(a) : Bras1: capsule -La suspension de capsules a ete prelevee et laissee a sedimenter pendant 5 minutes dans un tube Falcon de 50mL -Le surnageant a ete preleve avec precaution et elimine. -Les capsules ont ensuite ete traitees avec la solution 3 pendant 5 min a 37°C. -Les cellules liberees des capsules ont ete centrifugees a 300g pendant lOminutes pour eliminer la solution 3. -Les cellules ont ete finalement comptees au NC2000 (protocole standard 1cassette) -(b) : Bras 2 : controle en suspension -La suspension cellulaire a ete prelevee puis centrifugee a 300g pendant lOmin. -Le surnagent a ete aspire.WO 2023/194479 40 PCT/EP2023/059019 -Les cellules ont ensuite ete comptees au (protocole standard 1cassette). Une image de microscopie a contraste de phase au grossissement x4 d'un ensemble au jour de ^encapsulation est presentee en figure 11a. Une image de microscopie a contraste de phase au grossissement xlO apres 11 jours de cultures en capsules est presentee en figure 5 lib. Les resultats d'encapsulation de NK selon Ie protocole decrit une meilleure amplification cellulaire en capsules par rapport a une culture classique en suspension, comme illustre dans la figure 12a. Ainsi, pour Ie donneur B, Ie facteur d'amplification est de fois 135 en 11jours de culture en capsule contre un facteur de fois 72 pour une culture classique. Pour Ie donneur C, 10 Ie facteur d'amplification est de fois 41en 11jours de culture en capsule contre un facteur de fois 28 pour une culture classique. La figure 12b montre que la viabilite lors de la culture des NK obtenus selon I'invention est meilleure que celle des celle des NK cultives en 2D. Pour Ie donneur B, la viabilite a Jll est de 82% pour la culture en capsule contre 69% pour la culture en suspension. Pour Ie donneur C, 15 la viabilite a Jll est de 73% pour la culture en capsule contre 51% en suspension.

Claims

Revendications [Revendication 1] Microcompartiment cellulaire en trois dimensions clos de forme ovoTde, cylindrique, spheroide ou spherique ou sensiblement ovoTde, cylindrique, spheroide ou spherique, dont la plus petite dimension est comprise entre 200 et 400pm, comprenant une couche externe en hydrogel definissant une partie interne, ladite partie interne comprenant dans un milieu entre 500 et 5000 lymphocytes formant une culture groupee en trois dimensions et ayant une teneur en granzyme B inferieure a lpg/mL de milieu. [Revendication 2] Microcompartiment selon la revendication precedente, caracterise en ce que la partie interne comprend une teneur en perforine inferieure a 0,5pg/ml de milieu. [Revendication 3] Microcompartiment selon I'une des precedentes revendications, caracterise en ce que la partie interne comprend des lymphocytes formant une culture groupee en trois dimensions sans lumen. [Revendication 4] Microcompartiment selon I'une des precedentes revendications, caracterise en ce qu'il a ete obtenu apres encapsulation de lymphocytes sans ajout de matrice extracellulaire ou sans ajout d'element de matrice extracellulaire. [Revendications] Microcompartiment selon I'une des precedentes revendications, caracterise en en ce qu'il a ete obtenu apres ^encapsulation de lymphocytes prealablement actives. [Revendication 6] Microcompartiment selon I'une des precedentes revendications, caracterise en ce que I'epaisseur de la couche externe est variable et comprise entre 20 et 60pm. [Revendication 7] Microcompartiment selon I'une des precedentes revendications, caracterise en ce que les lymphocytes sont polarises. [Revendications] Microcompartiment selon I'une des precedentes revendications, caracterise en ce que Ie nombre de lymphocytes formant une culture groupee en trois dimensions est compris entre 500 et 5000. [Revendication 9] Microcompartiment selon I'une des precedentes revendications, caracterise en ce que Ie nombre de lymphocytes formant une culture groupee en trois dimensions est compris entre 1000 et 3000.5 10 15 20 25 30 WO 2023/194479 42 PCT/EP2023/059019 [Revendication 10] Microcompartiment selon I'une des precedentes revendications, caracterise en ce que les lymphocytes sont des lymphocytes T ou des lymphocytes NK. [Revendication 11] Microcompartiment selon I'une des precedentes revendications, caracterise en ce que les lymphocytes sont des lymphocytes exprimant un recepteur antigenique chimerique. [Revendication 12] Microcompartiment selon I'une des precedentes revendications, caracterise en ce que les lymphocytes sont des lymphocytes T et en ce qu'il presente : - une teneur en en perforine inferieure a 0,5pg/ml de milieu, et/ou - une teneur en TNF-a inferieure a 100 ng/mL de milieu. [Revendication 13] Microcompartiment selon I'une des revendications 1a 11, caracterise en ce que les lymphocytes sont des lymphocytes NK et en ce qu'il presente : - une teneur en en perforine inferieure a 0,5pg/ml de milieu, et/ou - une teneur en TNF-a inferieure a 100 ng/mL de milieu, et/ou - une teneur en IL6 inferieure a 0,5pg/ml de milieu et/ou - une teneur en GM-CSF inferieure a 0,5pg/ml de milieu. [Revendication 14] Microcompartiment selon I'une des precedentes revendications, caracterise en ce que la couche externe comprend de l'alginate. [Revendication 15] Microcompartiment selon I'une des precedentes revendications, caracterise en ce que la partie interne comprend une solution comprenant de l'IL2 ou la combinaison d'IL7 et d'IL15 ou IL12, IL18, IL21 ou la combinaison d'au moins deux cytokines choisies parmi IL2, IL12, IL18 et IL21. [Revendication 16] Microcompartiment selon I'une des precedentes revendications, caracterise en ce qu'il comprend des lymphocytes T et en ce que la proportion de lymphocyte T naif et/ou Tscm reste superieure a 20%. [Revendication 17] Ensemble de microcompartiments comprenant au moins deux microcompartiments cellulaires en trois dimensions, caracterise en ce qu'au moins un microcompartiment est un microcompartiment selon I'une des revendications1a 16. [Revendication 18] Ensemble de microcompartiments selon la precedente revendication, caracterise en ce que les microcompartiments sont disposes dans un milieu de culture dans un bioreacteur. [Revendication 19] Microcompartiment selon I'une des revendications 1 a 16 pour son utilisation comme medicament.5 10 15 20 25 30 WO 2023/194479 43 PCT/EP2023/059019 [Revendication 20] Microcompartiment selon I'une revendications 1 a 16, pour son utilisation dans la prevention ou Ie traitement de maladies auto-immunes, de syndromes d'immunodeficience, de cancers, de maladies virales ou de maladies inflammatoires. [Revendication 21] Procede de preparation d'un microcompartiment selon I'une des revendications 1a 16 ou d'un ensemble de microcompartiments cellulaires selon I'une des revendications 17 ou 18, comprenant les etapes suivantes : (a) incuber des lymphocytes dans un milieu de culture comprenant des cytokines, (b) encapsuler les lymphocytes dans leur milieu de culture dans une couche d'hydrogel, preferentiellement sans ajouter de matrice extracellulaire, pour former un microcompartiment en trois dimensions clos de forme ovoide, cylindrique, spheroide ou spherique ou sensiblement ovoide, cylindrique, spheroide ou spherique, dont la plus petite dimension est comprise entre 200 et 400pm, de fa^on a ce que chaque microcompartiment comprennent au moins 5 cellules dans sa partie interne, (c) cultiver les microcompartiments obtenus a I'etape (b) dans un milieu de culture comprenant au moins des cytokines, pendant 2 a 6 jours. [Revendication 22] Procede de preparation d'un microcompartiment selon la precedente revendication, caracterise en ce qu'il comprend une etape prealable a I'incubation des lymphocytes, qui consiste a activer lesdits lymphocytes. [Revendication 23] Procede de preparation d'un microcompartiment selon I'une des revendications 21 ou 22, caracterise en ce que les milieux de culture comprennent de 100 a 1000 unites/ml d'IL2 ou la combinaison de 300 a 600 unites/ml d'IL7 et 50 a 100 unites /ml d'IL15. [Revendication 24] Procede de preparation d'un microcompartiment selon I'une des revendications 21 a 23, caracterise en ce qu'a I'etape (a) entre 0,5 et 2 millions de lymphocytes sont incubees par ml de milieu de culture. [Revendication 25] Procede selon I'une des revendications 21 a 24, caracterise en ce que I'etape b) est realisee par co-injection d'au moins deux solutions : - une solution d'hydrogel, - la solution issue de I'etape a) comprenant des lymphocytes et du milieu de culture, de maniere concentrique via un injecteur microfluidique qui permet de former un jet en sortie d'injecteur constitue du melange des deux solutions, ledit jet se fractionnant en gouttes, lesdites gouttes etant collectees dans un bain de calcium qui rigidifie la solution d'hydrogel5 10 15 20 WO 2023/194479 44 PCT/EP2023/059019 pour former la couche externe de chaque microcompartiment, la partie interne de chaque goutte etant constituee par la solution issue de I'etape (a) comprenant des lymphocytes et du milieu de culture. [Revendication 26] Procede selon la revendication 25, caracterise en ce que I'injecteur microfluidique a un diametre d'ouverture finale est compris entre 150 et 300pm. [Revendication 27] Procede selon la revendication 25 ou 26, caracterise en ce que Ie debit de chacune des deux solutions est compris entre 45 et 150 mL/h. [Revendication 28] Procede selon I'une des revendications 25 a 27, caracterise en ce que la totalite des cellules encapsulees initialement a I'etape (b) represente un volume inferieur a 50% du volume du microcompartiment dans lequel elles sont encapsulees. [Revendication 29] Procede selon I'une des revendications 25 a 28, caracterise en ce que les etapes (a) et/ou (c) sont mises en oeuvre sous agitation permanente ou sequentielle. [Revendication 30] Procede selon I'une des revendications 25 a 29, caracterise en ce que Ie procede comprend au moins une re-encapsulation des cellules apres I'etape (c). [Revendication 31] Procede selon la revendication precedente, caracterise en ce que chaque re-encapsulation consiste a eliminer la couche externe d'hydrogel, preferentiellement a remettre en suspension les lymphocytes sous forme partiellement ou totalement dissociee dans les microcompartiments et a remettre en oeuvre les etapes du procede. [Revendication 32] Procede de preparation d'un microcompartiment selon I'une des revendications 21 a 31, caracterise en ce qu'il comprend une etape apres I'etape (c) qui consiste a congeler les microcompartiments. [Revendication 33] Procede de preparation d'un microcompartiment selon I'une des revendications 21 a 32, caracterise en ce que I'etape (c) est mise en oeuvre dans un bioreacteur.
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