CA3251978A1 - Method for the selection of lymphocytes - Google Patents

Method for the selection of lymphocytes

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CA3251978A1
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lymphocyte
peptides
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CA3251978A
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Gabriel Moreau
Matthieu Schoenhals
Jean-François Zagury
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Conservatoire National des Arts et Métiers
Institut Pasteur
Peptinov SAS
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Abstract

La présente invention concerne un procédé de sélection de lymphocytes reconnaissant un épitope conformationnel d'un antigène protéique à partir d'une population de cellules, comprenant une étape d'identification d'au moins un lymphocyte se liant à au moins deux peptides distincts comprenant des séquences issues de l'antigène protéique, notamment au moins trois peptides distincts comprenant des séquences issues de l'antigène protéique.

Description

1 PROCEDE DE SELECTION DE LYMPHOCYTES Domaine de I’invention La presente invention concerne un procede de selection de lymphocytes, notamment de lymphocytes B ou T, ainsi qu’un procede de preparation d’anticorps a partirdes lymphocytes B selectionnes.
Arriere-plan technique L'interet pour les anticorps monoclonaux therapeutiques ne cesse de croTtre, annee apres annee.
En effet, leur affinite hautement specifique des antigenes permet de fournir des traitements medicaux tres efficaces.
Ainsi, de 2005 a 2017 Ie nombre d’anticorps monoclonaux approuves par I’agence americaine du medicament est passe de 2 a 64.
Toutefois, il reste un obstacle critique a surmonter pour preparer des anticorps monoclonaux efficaces.
En effet, la selection des Lymphocytes B a partir desquels sont derives les anticorps monoclonaux se fait souvent vis-a-vis de la structure primaire des antigenes proteiques cibles, c’est a dire des epitopes lineaires auxquels se fixent les anticorps, et ce alors que ce sont des epitopes issus de la structure tridimensionnelle, tertiaire ou quaternaire, des proteines qui permettent Ie plus souvent d’obtenir la meilleure affinite pour les anticorps et ainsi d’assurer au mieux leurs fonctions biologiques.
Ainsi, permettre I’obtention d’anticorps monoclonaux specifiques d'epitopes conformationnels, reconnaissant done la structure tridimensionnelle des antigenes cibles, devrait ameliorer I'avidite de ces anticorps, et done leur utilisation comme outils a usage experimental, comme marqueurs a usage diagnostic, ou comme traitements immunotherapeutiques.
Dans ce cadre, Tsumoto et al. (2019) Immunotherapy 11:119-127 proposent de preparer des anticorps monoclonaux diriges contre des epitopes conformationnels d’un antigene en immunisant des souris a I’aide de molecules d’ADN codant I’antigene, d’isoler les lymphocytes B puis de les fusionner avec des cellules de myelome exprimant cet antigene pour obtenir des hybridomes produisant des anticorps monoclonaux specifiques de la structure tridimensionnelle de I’antigene.5 2 Toutefois, si ce procede permet bien d'obtenir des anticorps monoclonaux diriges contre des epitopes conformationnels, il est relativement complexe a mettre en oeuvre.
II reste done a fournir un procede simple a mettre oeuvre permettant d’obtenir des anticorps monoclonaux diriges contre des epitopes conformationnels.
Resume de I’invention La presente invention decoule de la mise en evidence inattendue, par les inventeurs, qu'il etait possible de selectionner des lymphocytes B specifiques d’un epitope conformationnel d’un antigene en utilisant deux peptides distincts issus de I’antigene et tridimensionnellement proches dans la structure de I’antigene.
Ainsi, la presente invention concerne un procede deselection de lymphocytes, notamment B ou T, reconnaissant un antigene proteique, notamment un epitope conformationnel d’un antigene proteique, a partir d’une population de cellules, comprenant une etape d’identification d’au moins un lymphocyte, notamment B ou T, se liant a au moins deux peptides distincts comprenant des sequences issues de I’antigene proteique, notamment au moins trois peptides distincts comprenant des sequences issues de I’antigene proteique.
La presente invention concerne egalement un procede de preparation d’au moins un anticorps, ou fragment d’anticorps, dirige contre un antigene proteique, dans lequel I’anticorps, ou Ie fragment d’anticorps, est prepare a partir d’au moins un lymphocyte B obtenu par la mise en oeuvre du procede de selection de lymphocytes B tel que defini ci-dessus.
La presente invention concerne egalement un procede de preparation d’au moins un TCR, ou fragment de TCR, dirige contre un antigene proteique, dans lequel Ie TCR, ou Ie fragment de TCR, est prepare a partir d’au moins un lymphocyte T obtenu par la mise en oeuvre du procede de selection de lymphocytes T tel que defini cidessus.
La presente invention concerne egalement les anticorps, ou fragments d’anticorps, et les TCR, ou fragments de TCR, susceptibles d’etre obtenus par la mise en oeuvre des procedes de preparation selon I’invention.
La presente invention concerne egalement les anticorps, ou fragments d’anticorps, et les TCR, ou fragments de TCR, susceptibles d’etre obtenus par la mise5 3 en oeuvre des procedes de preparation selon I'invention pour leur utilisation a titre de medicament ou d’agent diagnostic.
La presente invention concerne egalement I’utilisation in vitro des anticorps, ou fragments d’anticorps, et des TCR, ou fragments de TCR, susceptibles d’etre obtenus par la mise en oeuvre des procedes de preparation selon I’invention a des fins experimentales ou de diagnostic.
Description detaillee de I'invention Comme on I’entend ici, Ie terme « comprenant » est synonyme « d’incluant », « contenant » ou « englobant » c’est-a-dire que lorsqu'un objet « comprend » une ou plusieurs caracteristiques, d’autres caracteristiques que celles mentionnees peuvent egalement etre comprises dans I’objet. A I’inverse, I’expression « consistant en » signifie « constitue de », c’est-a-dire que lorsqu’un objet « consiste en » une ou plusieurs caracteristiques, I’objet ne peut pas comprendre d’autres caracteristiques que celles mentionnees.
Lymphocytes Les lymphocytes selon I’invention sont de preference des lymphocytes B et/ou des lymphocytes T.
Par « lymphocyte B » on entend toute cellule de la lignee B, comme par exemple, un lymphocyte B na’ff, un lymphocyte B active, un lymphocyte B memoire, un plasmablaste ou un plasmocyte, notamment a longue duree.
Par lymphocyte T, on entend toute cellule de la lignee T.
Comme cela apparaitra clairement a la personne du metier, les lymphocytes B reconnaissent I’antigene proteique par 1'intermediaire des anticorps qu’ils portent et les lymphocytes T reconnaissent I’antigene proteique par I’intermediaire du recepteur des lymphocytes T (« T cell receptor », TCR).
Cellules La population de cellules est de tout type susceptible de comprendre des lymphocytes, notamment des lymphocytes B ou T.
La population de cellules peut provenir d'un seul individu ou de plusieurs individus.
De preference, la population de cellules est obtenue a partir d’un echantillon ou d’un prelevement biologique d’un ou plusieurs individus, tel qu’un echantillon ou un prelevement de sang total ou de moelle osseuse. L’individu est de5 4 preference un humain ou un animal, notamment un mammifere. L’individu est de preference immunise confre I’antigene proteique qui peut etre de la meme espece ou d’une espece differente de celle de l’individu, nofamment un agent infectieux.
L’immunisation peut etre naturelle, par exemple lorsque I’antigene proteique est issu d’un agent infectieux qui aura precedemment infecte l’individu, ou etre provoquee par administration a l’individu de I’antigene proteique ou d’une partie de celui-ci, ou d’un acide nucleique, ADN ou ARN, codant I’antigene proteique ou une partie de celui-ci, c’est-a-dire par immunisation active ou vaccination.
De preference, la population de cellules est une population de cellules mononuclees du sang peripherique (PBMC).
De preference, Ie procede d'identification de lymphocytes, notamment B ou T, tel que defini ci-dessus, comprend une etape anterieure de selection des lymphocytes, notamment B ou T, parmi la population de cellules.
Comme on I’entend ici, I'etape anterieure de selection de lymphocytes, notamment B ou T, peut aboutir une sous-population comprenant uniquement des lymphocytes, notamment B ou T, ou enrichie en lymphocytes, notamment B ou T.
Cette selection peut notamment se faire a I’aide de ligands, notamment d’anticorps, ciblant des marqueurs membranaires specifiques de lymphocytes, notamment B ou T, les anticorps pouvant etre couples a des billes magnetiques ou a des luminophores, notamment des fluorophores, pour faciliter la detection, la selection, I’isolement ou la purification des complexes lymphocyte-anticorps.
Peptides Comme on I’entend ici, des sequences issues de I’antigene proteique sont des portions de sequences de residus d’acides amines contigus de la sequence de residus d'acide amines totale de I’antigene proteique.
De preference, les au moins deux peptides distincts comprennent respectivement de 6 a 30 residus d’acides amines, 6 a 25 residus d’acides amines, 6 a 20 residus d’acides amines, 6 a 15 residus d’acides amines, 10 a 30 residus d’acides amines, 10 a 20 residus d’acides amines, 12 a 20 residus d’acides amines, 10 a 18 residus d’acides amines, ou 10 a 15 residus d’acides amines.
De preference, les au moins deux peptides distincts comprennent respectivement au moins 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 residus d’acides amines.5 De preference, les au moins deux peptides distincts comprennent respectivement au plus 30, 25, 20 ou 15 residus d’acides amines.
De preference, les au moins deux peptides comprennent des sequences non chevauchantes issues de I’antigene proteique.
Comme on I’entend ici, des sequences non chevauchantes sont telles qu’elles ne se recouvrent pas au sein de la structure primaire de I’antigene, il s’agit de peptides disjoints.
De preference, les au moins deux peptides sont a une distance entre eux de 3.IO-9 m, 2,5.10-9, 2.10-9 m, IO-9 m ou moins dans la structure tridimensionnelle de I’antigene proteique.
La structure tridimensionnelle de I’antigene proteique peut etre obtenue par cristallographie aux rayons, par resonnance magnetique nucleaire (RMN), microscopic ou encore par prediction informatique de structure tridimensionnelle.
La distance entre les au moins deux peptides distincts peut etre calculees de nombreuses manieres bien connues de la personne du metier. II peut s’agir de la moyenne des distances entre chaque residu d’acide amine d'un des peptides vis-avis de chaque residu d’acide amine de I’autre ou des autres peptides.
De preference, il s’agit de la distance minimale parmi les distances respectives entre chaque residu d’acide amine d’un des peptides vis-a-vis de chaque residu d’acide amine de I’autre ou des autres peptides.
Comme on I’entend ici, la distance entre deux residus acides amines est la distance entre les centres respectifs de carbones en alpha de chaque residu.
Antigene proteique L’antigene proteique selon I'invention peut etre une proteine ou un complexe proteique de tout type. II peut notamment s’agir d'une proteine monomerique ou multimerique, notamment homomultimerique ou heteromultimerique.
Dans un mode de realisation de I'invention, notamment dans Ie cadre d'un procede de selection de lymphocytes T tel que defini ci-dessus, I’antigene proteique est un complexe entre un peptide, un polypeptide ou une proteine antigenique et une proteine de presentation d’antigene, notamment une molecule du complexe majeur d’histocompatibilite (CMH).
De preference, I’antigene proteique comprend au plus 5000, 2500, 1000 ou 500 residus d’acides amines.5 6 De preference, l’antigene proteique comprend au moins 25, 50, 75, 100 ou 200 residus d’acide amines.
De preference, I’antigene proteique comprend de 25 a 5000, plus preferablement de 50 a 2500, encore plus preferablement de 75 a 2000 residus d’acides amines.
L’antigene proteique peut etre constitue uniquement de residus d’acides amines ou comprendre des composants aproteiques en plus des residus d’acides amines.
La proteine peut etre substituee par au moins polysaccharide et/ou au moins lipide.
Par ailleurs, la proteine peut comprend un ou plusieurs groupements prosthetiques, tels qu’un groupement heminique, un cofacteur, un acide nucleique ou un cluster fer-souffre.
L’antigene proteique peut etre issu de tout type d'organisme.
De preference, I’antigene proteique est issu d'un agent infectieux ou d’une proteine humaine ou animaIe.
L’antigene proteique peut notamment etre obtenu par purification a partir de I’organisme Ie produisant naturellement ou par voie recombinante, a partirde cultures cellulaires de tout type (eucaryotes ou procaryotes).
Identification Comme cela sera clair pour la personne du metier, I’etape d’identification d’au moins un lymphocyte, notamment B ou T, se liant a au moins deux peptides distincts comprenant des sequences issues de l’antigene proteique comprend la mise en contact des peptides avec la population de cellules pour identifier au sein de la population de cellules au moins un lymphocyte qui se lie au au moins deux peptides distincts.
De preference, Ie procede de selection tel que defini ci-dessus comprend une etape supplementaire d’isolement d’au moins un lymphocyte, notamment B ou T, se liant aux au moins deux peptides distincts de l’antigene proteique.
L’identification, et eventuellement I’isolement, de lymphocytes, notamment B ou T, se liant aux au moins deux peptides distincts peut etre realisee par de nombreuses techniques bien connues de la personne du metier. A titre d’exemple on peut citer Ie passage successif de cellules sur des colonnes chromatographiques sur lesquelles sont fixees les peptides (un premier peptide puis selection, un deuxieme peptide puis selection), ou des liaisons-selections successives avec des billes5 7 magnetiques portant les peptides (un premier peptide puis selection, un deuxieme peptide puis selection), ou des accrochages-selections successifs a des plaques presentant les peptides, ou encore en tri cellulaire associe a la cytometrie en flux ou les cellules sont identifiees d’une part puis triees.
Dans Ie cas des lymphocytes B, il est egalement possible de cloner les cellules par dilution limite et de tester les anticorps du surnageant qui reconnaissent a la fois les au moins deux peptides.
Une fois les lymphocytes selectionnes et clones pour la reconnaissance d’au moins deux peptides distincts, on peut sequencer leurs sequences variables directement ou apres amplification du clone selectionne.
De preference, I’etape d’identification, et eventuellement d'isolement, est mise en oeuvre par cytometrie en flux, avec eventuellement triage de cellules.
Lorsque I’etape d'identification, et eventuellement d'isolement, est mise en oeuvre par cytometrie en flux, les aux moins deux peptides distincts sont de preference marques par des luminophores, notamment des fluorophores, distincts.
Ceci permet de s’assurer que les peptides distincts sont bien reconnus par Ie meme lymphocyte, notamment B ou T.
Parailleurs, lorsque I’etape d’identification, et eventuellement d’isolement, est mise en oeuvre par cytometrie en flux, I’identification de la liaison des peptides au lymphocyte peut etre mise en oeuvre en mettant en contact la population de cellules avec les peptides distincts ajoutes tous en meme temps, c’est-a-dire lors d’un meme tri, ou de maniere sequentielle, peptide par peptide, c’est-a-dire en plusieurs tris successifs, par exemple en isolant des lymphocytes grace a un premier peptide, puis en utilisant un deuxieme peptide sur les lymphocytes tries avec Ie premier peptide, puis eventuellement en utilisant un ou plusieurs peptide supplementaire sur les lymphocytes tries grace aux deux premiers peptides etc...
La mise en contact de la population de cellules avec les peptides ajoutes en meme temps necessitera en general que chaque peptide soit marque par un marqueur different. A contrario, la mise en contact de la population de cellules et des peptides ajoutes de maniere sequentielle ne necessite pas Ie marquage de chaque peptide par un marqueur different, voire permet de n’utiliser qu’un seul type de marquage des peptides.
De preference, Ie procede de selection de lymphocytes, notamment B, reconnaissant un epitope conformationnel d’un antigene proteique, a partir d’une population de cellules selon I’invention, comprend : - une etape de selection de lymphocytes parmi la population de cellules ;5 8 - une etape d'identification d’au mains un lymphocyte, notamment B, se liant a au moins deux peptides distincts, notamment de 6 a 30 resides d’acides amines, comprenant des sequences, notamment non chevauchantes, issues de I’antigene proteique, les au moins deux peptides distincts etant en particulier a une distance entre eux de 3.IO-9 m ou moins dans la structure tridimensionnelle de I’antigene proteique ; - une etape d’isolement d’au moins un lymphocyte identifie a I’etape precedente.
Anticorps - TCR Comme on I'entend ici, Ie terme « anticorps » englobe les anticorps en entier ainsi que les fragments d’anticorps comprenant au moins une partie de liaison a I’antigene, tels que les fragments Vl et/ou Vh, Fab, F(ab')2, et scFv. L'anticorps selon I’invention peut etre issu d'une seule espece, etre chimerique, humanise ou encore humain. L'anticorps selon I’invention peut etre monospecifique ou bispecifique.
Par ailleurs, l’anticorps selon I’invention peut etre monomerique ou multimerique, notamment dimerique ou pentamerique. L’anticorps selon I’invention peut etre d’isotype A, D, E, G ou M, de preference G.
L’anticorps, ou Ie TCR, dirige contre un antigene proteique est de preference un anticorps, ou un TCR, reconnaissant un epitope conformationnel de I’antigene proteique.
L’anticorps, ou Ie TCR, dirige contre un antigene proteique est de preference un anticorps, ou un TCR, specifique d’une structure tridimensionnelle de I’antigene proteique.
L’anticorps dirige contre un antigene proteique est de preference un anticorps monoclonal.
L’anticorps dirige contre un antigene proteique peut etre prepared partird’un lymphocyte B purifie, par de nombreuses techniques bien connues de la personne du metier.
A titre d’exemple, Ie lymphocyte B, eventuellement apres multiplication clonale, peut etre fusionne avec une cellule de myelome pour donner un hybridome producteur d’anticorps monoclonal. A titre d’exemple egalement, les portions du genome du lymphocyte B codant pour tout ou partie de l’anticorps, notamment ses parties variables, peuvent etre donees, puis etre exprimees, par voie recombinante,5 9 par des cellules de culture, eventuellement apres insertion dans une structure d’anticorps chimerique, humanises ou humain.
Le TCR dirige contre un antigene proteique peut etre prepare a partir d’un lymphocyte T par de nombreuses techniques bien connues de la personne du metier.
A titre d’exemple, les portions du genome du lymphocyte T codant pour tout ou partie du TCR, notamment ses parties variables, peuvent etre donees, puis etre exprimees, par voie recombinante, pard’autres cellules.
Les TCR peuvent notamment etre produits sous forme de proteines chimeriques fusionnees pour les stabiliser et faciliter leur utilisation, par exemple avec des parties constantes d'immunoglobulines.
L’invention est davantage explicitee a 1‘aide des Exemples et des figures, non limitatifs, qui suivent.
Description des figures Figure 1 La figure 1 montre quatre graphes (panneaux) de cytometrie en flux representant des evenements tries : - en fonction de la lumiere diffractee mesuree en face du rayon laser du cytometre (parametre FSC-A::FSC-A) et mesuree sur le cote (parametre SSC-A::SSC-A) (panneau en bas a gauche), - en fonction de la lumiere diffractee mesuree en face du rayon laser du cytometre (parametres FSC-H::FSC-H/FSC-A::FSC-A) (panneau en haut a gauche), - en fonction de la lumiere emise par les fluorophores allophycocyanin (ARC) et BV711™ (parametres comp-VL4-A::CD27-BV71l-A/comp-RLl-A::CD19-APC-A) (panneau en haut a droite), - en fonction de la lumiere emise par les fluorophores BV510™ et PE (parametres comp-VL2-A::S059-BV510-A/comp-BL2-A::S051-PE-A) (panneau en bas a droite).
Figure 2 La figure 2 montre quatre graphes (panneaux) de cytometrie en flux representant des evenements tries :WO 2023/214087 PCT/EP2023/062074 - en fonction de la lumiere diffractee mesuree en face du rayon laser du cytometre (parametre FSC-H) et mesuree sur Ie cote (parametre SSC-H) (panneau en haut a gauche), - en fonction de la lumiere diffractee mesuree en face du rayon laser du cytometre 5 (parametres FSC-A et FSC-H) (panneau en bas a gauche), - en fonction de la lumiere emise par les fluorophores allophycocyanin (ARC) et BV711™ (parametres Comp-BV711-A::CD27- I Comp- APC-A::CD19) (panneau en haut a droite), - en fonction de la lumiere emise par les fluorophores BV510™ et PE (parametres 10 Comp- BV510-A::S059- / Comp- PE-A::S051-) (panneau en bas a droite).5 1 1 EXEMPLES Exemple 1 Les cellules mononuclees du sang peripherique (PBMC) d’un individu immunise contre la Covid-19 ant ete purifiees parFicoll.
Les cellules ont ensuite ete marquees en utilisant les anticorps suivants : antiCD19-APC, anti-CD27-BV71 1 qui permettent de marquer les lymphocytes B memoire.
Puis, les cellules ont ete marquees avec les deux peptides S05 1 et S059 biotinyles en utilisant les recommandations du fournisseurThermo Scientific™(EZ-Link™Sulfo-NHSLC-Biotinilation kit) et couples a des conjugues fluorescent Streptavidine-BV510™ et Streptavidine-phycoerythrine (PE).
Le peptide S051 est constitue des residus 201 a 215 de la proteine Spike de SARS-CoV-2 et le peptide S059 est constitue des residus 233 a 247 de la proteine Spike de SARS-CoV-2.
Les peptides S051 et S059 sont disjoints (nonchevauchants) dans la sequence de la proteine Spike, mais voisins sur le plan tridimensionnel dans la mesure ou ils sont localises a moins de 25 Angstroms I’un de I’autre dans la structure tridimensionnelle de la proteine de Spike.
Les inventeurs ont analyse 231 000 evenements en cytometrie en flux, desquels ils ont elimine visuellement les debris acellulaire (panneau en bas a gauche de la Figure 1), puis elimine les doublets (panneau en haut a gauche de la Figure 1).
Ils ont ensuite selectionne les evenements CD19+CD27+ (panneau en haut a droite de la Figure 1) correspondent aux lymphocytes B memoires.
Parmi ces cellules, 4 possedent a leur surface des anticorps ayant une affinite en meme temps pour S051 et S059 (panneau en bas a droite de la Figure 1).
Les statistiques de la population CD19+/CD27+ sont resumees dans le Tableau 1 ci-dessous :5 12 Tableau 1 Cellules CD19+/ CD27+ Cellules S051+/ S059+ Cellules S051-/ S059+ Cellules S051+/ S059- Cellules S051-/ S059- Quantile 3554 4 9 20 3521 % parmi les cellules CD19+/CD27+ - 0,lI 0,25 0,56 99,1 % parmi les PBMC 2,27 L73.10-3 3,89.10-3 8.64.10-3 1,52 Les inventeurs ont ainsi pu identifier et isoler quatre lymphocytes B distincts reconnaissant a la fois les peptides S051 et S059 distincts et non chevauchants.
Ceci indique que les lymphocytes B identifies portent des anticorps reconnaissant a la fois Ie peptide S05l et Ie peptide S059 qui sont disjoints dans la structure primaire de Spike, ces anticorps reconnaissent done un epitope conformationnel de la proteine Spike de SARS-CoV-2.
Exemple 2 1.
Tri des lymphocytes B memoires specifiques et mise en culture des clones.
Deux tubes 8mL BD Vacutainer® CRT™ citrates ont ete collectes chez un individu sain ayant suivi un schema vaccinal complet et ayant subi 2 infections SARSCoV-2.
Ces tubes permettent de separer tres simplement les cellules mononucleees du sang peripherique (PBMC).
Les PBMC ainsi purifies ont ensuite ete marques par 2 peptides couples a un fluorophore, S051 et S059, peptides identifies dans I’Exemple 1 comme faisant partie d’un epitope conformationnel de la proteine Spike.
Ces deux peptides S051 et S059 ont ete couples respectivement a la phycoerythrine (PE) et au fluorochrome brilliant violet 510 (BV510™) comme indique dans I’Exemple 1.
Le marquage des lymphocytes B memoires a ete realise par des anticorps marques (anti-CDl9-APC, anti-CD27-BV7l I™).
Le tri a ensuite ete realise sur une plateforme de cytometrie en flux (Cytek Aurora cell sorter) comme illustre en Figure 2, et au bout du compte, quarante-huit cellules uniques marquees par tous les fluorophores (PE+, BV510+, APC+, BV7l l+) ont5 13 ete triees sur tapis cellulaire de cellules Feeder MS5-CD40L prealablement etalees sur des plaques de 96 puits a fond plat.
Les milieux ant ete changes 2 fois parsemaine pendant 4 semaines. (RPMI-1640 additionne de 10 % de FCS, 55 uM de 2-ME, 1 % de Pen Strep (100 unites/ml de penicilline, 100 pg/ml de streptomycine), lOmMd'HEPES, 1 mM de sodium pyruvate et 1 % de MEM NEAA avec de I’IL-2 humaine recombinante (Peprotech 200-02, 500 pg ; concentration finale pour la culture de 50 ng/ml), de l’IL-4 humaine recombinante (Peprotech 200-04,100 pg; concentration finale de 10 ng/ml), de l'IL-21 humaine recombinante (Peprotech 200-21, 100 pg ; concentration finale de 10 ng/ml), et du BAFF humain recombinant (Peprotech 310-13 , 100 pg; concentration finale de 10 ng/ml).
Les surnageants ont ete collectes et congeles a -20°C avant d'etre testes pour la presence d’anticorps.
B.
Test des surnageants pour presence d’lgG specifiques.
Les surnggegnts ginsi prepares ont ete testes pour leur presence d'IgG en ELISA.
Les puits positifs ont ensuite ete testes en Western blot pour Io presence d’lgG specifiques de la proteine Spike.
La presence d’lgG est mise en evidence grace a un anticorps anti-IgG-HRP et la densite optique mesuree par luminescence. 30 surnageants testes provenant des 48 clones tries initialement presentent des niveaux variables d’anticorps, dont 7 des niveaux eleves (allant de 4 a 15 unites de luminescence). 2 de ces 7 surnageants repondent positivement pour la presence d’lgG specifiques de la proteine Spike recombinante deposee sur membrane de nitrocellulose.
Gela met en evidence que Ie tri des lymphocytes B memoire par cytometrie en flux grace aux 2 peptides marques par fluorescence permet bien d’obtenir des anticorps monoclonaux reconnaissant un epitope conformationel au sein de la proteine Spike.
Par ailleurs, il est verifie que ces surnageants reconnaissent egalement chacun des deux peptides isoIes.

Claims (12)

14 REVENDICATIONS 1. Procede de selection de lymphocytes reconnoissant un epitope conformationnel d’un antigene proteique a partir d’une population de cellules, comprenant une etape d’identification d’au moins un lymphocyte se liant a au moins deux peptides distincts comprenant des sequences issues de I’antigene proteique, notamment au moins trois peptides distincts comprenant des sequences issues de I’antigene proteique.
2. Procede de selection selon la revendication 1, comprenant une etape anterieure de selection de lymphocytes parmi la population de cellules.
3. Procede selon la revendication 1 ou 2, dans lequel les lymphocytes sont des lymphocytes B ou des lymphocytes T.
4. Procede selon I’une des revendications 1 a 3, dans lequel les lymphocytes sont des lymphocytes B.
5. Procede de selection selon I’une des revendications 1 a 4, dans lequel la population de cellules est une population de cellules mononuclees du sang peripherique (PBMC).
6. Procede de selection selon I’une quelconque des revendications 1 a 5, dans lequel les au moins deux peptides distincts comprennent respectivement de 6 a 30 residus d'acides amines.
7. Procede de selection selon I’une quelconque des revendications 1 a 6, dans lequel les au moins deux peptides distincts comprennent des sequences non chevauchantes issues de I’antigene proteique.
8. Procede de selection selon I’une quelconque des revendications 1 a 7, dans lequel les au moins deux peptides distincts sont a une distance entre eux de 3.10-9 m ou moins dans la structure tridimensionnelle de I’antigene proteique.WO 2023/214087 PCT/EP2023/062074
9. Procede de selection selon I’une quelconque des revendicotions 1 d 8, comprenant une etape supplementaire d’isolement d’au moins un lymphocyte se liant aux au moins deux peptides distincts. 5
10. Procede de selection selon I’une quelconque des revendicotions 1 a 9, dans lequel I’etape d’identification, et eventuellement d’isolement, est mise en oeuvre par cytometrie en flux, avec eventuellement triage de cellules.
11. Procede de selection selon I’une quelconque des revendicotions 1 a 10, dans 10 lequel I'antigene proteique est issu d’un agent infectieux ou d’une proteine humaine ou animale.
12. Procede de preparation d’au moins un anticorps, ou fragment d’anticorps, dirige contre un antigene proteique, dans lequel I’anticorps, ou Ie fragment d’anticorps, est 15 prepare a partir d’au moins un lymphocyte B obtenu par la mise en oeuvre du procede de selection de lymphocytes tel que defini dans I’une des revendicotions 1 all.
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