Verfahren zur Herstellung eines antl-diabetischen Produktes. Zweck vorliegender Erfindung ist eine Substanz in stabiler und konzentrierter Form zu erhalten, welche die physiologischen und therapeutischen Eigenschaften und Wirkungen des aktiven anti-diabetischen Prinzips oder Hormons des Pankreas besitzt, die zur Um wandlung von Zucker im tierischen Körper nötig sind und fähig sind, die hauptsächlicbsten nachteiligen Symptome von Diabetes mellitus zu beseitigen, und ferner diese Substanz in sehr reiner Form und im wesentlichen frei von unwirksamen oder schädlichen Stoffen zu erhalten.
Nach der Erfindung wird das aktive Prinzip oder Hormon durch eine geeignete Niederschlagung von dasselbe verunreinigenden oder verdünnenden, grösstenteils stickstoffhal tigen, Substanzen getrennt, mit welchen es in dem Pankreas vereinigt ist und von wel chen es bisher auch nicht annähernd so voll ständig, wie es jetzt möglich ist, getrennt werden konnte.
Es wird seit langem angenommen, dass das Pankreas oder die Bauchspeicheldrüse, einschliesslich der Pankreas von Landtieren und Knorpelfischen, und der verwandten Drüsen (Hauptinselzellen) von Knochenfischen, normalerweise als innere Sekretion ein aktives Prinzip oder Hormon produziert, dass zur Umwandlung von Zucker im tierischen Kör per notwendig ist, und dass diabetes mellitus entsteht, wenn diese Sekretion aufhört oder ungenügend wird.
Forscher haben jahrelang umsonst versucht, dieses aktive Prinzip oder Hormon von- dem Pankreas in einer Form zu erhalten, welche mit Sicherheit angewendet werden konnte und welche bei Anwendung beim Menschen das diabetiscbe Syndrom be seitigt, aber erst durch die Arbeiten von Banting, Best und Collip an der Universität von Toronto wurde dieses Produkt erhalten.
Das Verfahren, welches diese Forscher ausgebildet haben, umfasst die folgenden Verfahrensstufen 1. Ausziehen des gemahlenen Pankreas, bevor eine wesentliche Menge des darin ent haltenen anti-diabetischen Hormons durch Trypsin oder andere Enzyme des Pankreas zerstört wurde, mittelst eines geeigneten Lösungsmittels wie z. B. Alkohol, welches dieses Hormon extrahiert und entweder die zerstörenden Enzyme, wie Trspsin, zurück- lässt, oder deren zerstörende Wirkung auf das anti-diahetischeHormon aufhebt oder in beiden Hinsichten wirkt.
2. Ändern der Lösungskonzentration entweder mittelst des ursprünglichen Lösungs mittels oder finit einem andern oder mit beiden und Filtrieren, um durch fraktionierte Aus fällung verschiedene der ursprünglich extra hierten Komponenten zu trennen.
Alkohol wurde mit grösstem Erfolg bei der Ausfüllung verwendet, und der Niederschlag, welcher bei einer Alkoholkonzentration von 80 - 90 0:'0 erhalten wird, enthält, nachdem der vorher bei einer niedrigeren Alkoholkonzentration erhaltene Niederschlag entfernt wurde, den grössten Teil des gewünschten anti-diabeti- schen Hormons.
3. Lösen dieses bei einer Alkoholkon- zentration von 80-9001o erhaltenen und das Hormon enthaltenden Liederschlages in Wasser.
4. Normalisieren der anti-diabetischen Aktivität der so erhaltenen Lösung, wobei als Einheit der Aktivität, auf welche nach stehend Bezug genommen wird, diejenige Menge gilt, welche, wenn sie einem normalen Kaninchen von 1 kg Gewicht injiziert wird, den Blutzucker unter 0,045 0,lllo innerhalb 6 Stunden erniedrigt und Zuckungen hervorruft.
Das beste vor der jetzigen Erfindung her gestellte Produkt hatte gewöhnlich einen Gehalt an Stickstoffrückständen von 0,2 bis 1,0 mgr per Einheit der anti-diabetischen Akti vität, dieser Gehalt war sehr oft höher als der angegebene;
das Produkt enthielt auch einige anorganische Salze und war überdies häufig und in unterschiedlicher Weise unsta bil und veränderte sich manchmal in uner klärlicher und nicht vorauszusehender -Weise, so dass man sich auf seine Wirksamkeit nicht verlassen konnte.
Während das Hormon selbst wahrscheinlich stickstoffartiger Natur ist, so bestand der Gehalt an Stickstoffrückständen nahezu ganz aus verunreinigenden Proteinen oder deren Abbauprodukten, welche unter gewissen Umständen unliebsame Mrkungen, wie Empfindlichkeit oder Verhärtuny an der Injektionsstelle hervorriefen. Die vorhandenen Verunreinigungen wiesen auch phosphorhaltige Substanzen,
Substanzen, welche Purin- Gruppen und PS@rimidin-Gruppen enthalten, auf.
Durch vorliegende Erfindung ist es mög lich, ein Produkt zu erhalten, das mit maxi maler Sicherheit und mit maximaler Vor ausbestimmung seiner anti-diabetischen Wir kung angewendet werden kann. Dieses Produkt besitzt eine Stabilität, welche auch nach Ablauf von mehr als drei Monaten keine Verminderung erftihrt_, und ist von einer so grossen Reinheit, daf,) unter den vielen Tau senden von Patienten, bei welchen bis jetzt das Produkt angewendet wurde.,
und worunter einige waren, bei welchen bei Behandlung mit den besten bisherigen Produkten Emp- findlichkeit und Verhärtung eintrat, nicht ein einziger Fall von l;mpfindlichkeit oder Ver härtung oder andere schädigende Wirkungen bekannt geworden sind.
Nach dune Verfahren gemäss vorliegender Erfindung stellt man die -Wasserstoff-Ionen- könzentration einer Lösung des aus der Drüse mittelst eines Lösungsmittels extrahierten Hormons in die Nähe des isoelektrischen Punktes ein, bei welchem eine (las anti-dia- betischeHormon enthaltende Substanz nieder geschlagen wird, welcher Niederschlag von der Flüssigkeit getrennt und in M"asser, das chic Säure oder Base enthält;
gelöst wird. Untersuchungen haben gezeigt, dass der Gehalt an Stickstoffrückständen in diesem Niederschlag im Vergleich mit den bisherigen Produkten stark verringert ist und 0,1 mgr per Einheit der anti-diabetischen Aktivität beträgt und häufig sogar nur 0,005-0,0ä mgr per Einheit der anti-diabetischen Aktivität,
während kein früheres Produkt bekannt ge worden ist mit einem Gehalt an Stickstoff- rückstiin(len von f),1 nigr per Einheit der anti-diabetischen Aktivität.
Um diesen 0rad der Reinheit zii erhalten, ist manchmal wieder- Boltes Ausfällen nötig abwechselnd mit Lö sung der gebildeten Niederschläge, aber wenn einmal dieser Grad der Reinheit annähernd erreicht ist, so verursachen weitere Nieder schlagungen keine wesentliche weitere Herab setzung des Gehaltes an Stickstoffrückstän den. Überdies ist dieser Niederschlag und die aus ihm bereitete Lösung im wesentlichen frei von wasserlöslichen Verunreinigungen, wie anorganische Salze, Phosphor enthaltende Substanzen, Substanzen, welche Purin- oder Pyrimidin-Gruppen enthalten;
und welche in dem nach den früheren Verfahren erhaltenen Produkt in bemerkbaren Mengen vorhanden waren. Die auf diese Weise erhaltene end gültige Lösung ist völlig klar und in geringen Mengen praktisch farblos wie Wasser, wäh rend die bisherigen Produkte sogar in kleinen Mengen deutlich gefärbt erschienen.
Anscheinend hängt diese grosse Reinheit von der Tatsache ab, dass der Niederschlag von "anti-diabetischer Substanz" nur das Hormon und mit demselben eng vereinigte oder verbundene Substanz oder Substanzen enthält, welche keine nachteilige Wirkung auf die Stabilität, Wirkungskraft oder anti- diabetischen Eigenschaften des endgültigen Produktes haben, der grösste Teil der verun reinigenden Substanzen (Proteine, Abbaupro dukte der Proteine, andere stickstoffhaltige Substanzen, anorganische Salze, etc.) bleibt in Lösung und wird von dem Produkt getrennt.
Infolge der grossen Reinheit ist die Wir kung bei der Anwendung des Produktes nahezu, wenn nicht völlig, auf die. Aufhebung des diabetischen Syndroms beschränkt, ohne dass unerwünschte Nebenwirkungen (wie Ver härtung oder Empfindlichkeit) eintreten.
<I>Beispiel</I> Schweins-Pankreasdrüsen werden so gut als möglich von dem ihnen anhaftenden Fett gereinigt und in einer gewöhnlichen Wurst maschine zerkleinert und gemahlen und 1 Pfund dieser gemahlenen Masse in 11/z- fachem Volumen 95 % Alkohol, zu. welchem 0,2 % Schwefelsäure zugegeben wurde,
ge- bracht. Dieses Gemisch lässt man etwa zwei Stunden lang stehen und filtriert es dann in einer Zentrifuge. Darauf wird ein zweiter Extrakt hergestellt mit einfacher Menge von 70% Alkohol, es wird wieder filtriert und die beiden Extrakte werden gemischt. Das Gemisch wird darauf auf 1/15 seines ursprüng lichen Volumens eingedampft und dann fil triert.
Das wässerige Filtrat wird dann auf 80 % Alkohol gebracht, wobei Proteine und einige anorganische Salze ausgefällt werden.
Nach der Filtration wird das Filtrat auf 93 % Alkohol gebracht, wodurch das aktive Prinzip ausgefällt wird, der Niederschlag wird gesammelt und in säurehaltigem Wasser gelöst, dem man Natriumhydroxyd zusetzt -bis der isoelektrische Punkt erreicht und das anti-diabetische Hormon niedergeschlagen wird. Der Niederschlag wird wieder in säure haltigem Wasser gelöst und nochmals aus gefällt.
Schliesslich wird .er in säurehaltigem Wasser von P. gleich ungefähr 3 gelöst und wird nach Passieren von Berkfeld-Filtern in 5 cm' Alnpulen gefüllt.
Wenn die Wasserstoff-Ionenkonzentration des fertigen Produktes innerhalb des PH Be reiches von etwa 4-7 liegt, so findet eine Herabsetzung der anti-diabetischen Wirkungs kraft der Lösung in einem Masse statt, welche mindestens teilweise von der Wasserstoff Ionenkonzentration abhängt. Möglicherweise ist diese Herabsetzung zum Teil eine Folge der zerstörenden Wirkung stickstoffhaltigen Verunreinigungen in der Lösung; aber min destens ein grosser Teil ist nicht das Resultat der Zerstörung des Hormons, sondern der langsamen Bildung eines Niederschlages, welcher das anti-diabetische Hormon enthält und dadurch die Wirkung der Lösung herab setzt.
Der Umfang und die Geschwindigkeit, mit welcher die Bildung des Hormonhaltigen Niederschlages erfolgt, ändert sich mit der Wasserstoff-Ionenkonzentration der Lösung und die beiden steigen an, wenn sich die Konzentration dem isoelektrischen Punkt von irgend einer der beiden Seiten aus nähert. Wenn die Lösung weniger Verunreinigungen enthält, so ist der isoelektrische Punkt we niger genau begrenzt, der Niederschlag bildet sich rascher und dessen Menge vergrössert sich.
Der Niederschlag fängt an, sich unter günstigen Bedingungen, bei P" von ungefähr =4 zri bilden, erreicht einen maximalen Wert bei PH von etwa 4.5-5.5 und ist nahezu völlig wiedergelöst bei PH von etwa 6.5-7, ausser wenn die Konzentration der Verunreinigungen so hoch ist, dass der sich sonst bildende Niederschlag in Lösung bleibt, in diesem Falle braucht die Lösung nur verdünnt zu werden und der Niederschlag wird sich bilden.
In vorliegender Erfindung wird daher, um. die stabile und gereinigte ariti-diabetische Substanz zu erhalten, ein Verfahren einge schlagen, bei welchem Nutzanwendung von gerade diesem Niederschlag bildenden Bestre ben, das früher Schwierigkeiten verursachte, gemacht wird.
Obgleich es nicht notwendig ist, ist es zweckmässig, bei der Anwendung des vor liegenden Verfahrens von dein Produkt, das als endgültiges Produkt durch die bisherigen Verfahren erhalten wurde, auszugehen. Die Begründung hierfür liegt darin, dass die Wirk samkeit des Verfahrens zur isoelektrischen Ausfällung einer Substanz, welche das anti- diabetische Hormon enthält, gesteigert wird, in dem Masse in welchem das Hormon frei von verunreinigenden Substanzen in der Lösung ist, in welcher der Niederschlag er zeugt wird;
obwohl das Verfahren zur iso- elektrischen Ausfällung mit gutem Erfolg auf Lösungen angewendet werden kann, welche vor Erreichung der durch die bishe rigen Verfahren erzeugten endgültigen Lö sung erhalten werden, so wird vorgezogen, es bei solchen bisherigen endgültigen Ver- fahren anzuwenden, da der Hauptteil der Verunreinigungen durch diese bisherigen Ver fahren sehr erfolgreich beseitigt wurde.
Auch bei diesem beispielsweise ange- führten Verfahren wird die Wasserstoff-Ionen- Konzentration der Lösung, welche Lösung, wie vorstehend bemerkt, zweckmässig die Lösririg des bisherigen endgültigen Produktes ist, auf die Nähe des isoelektrischen Punktes eingestellt, uni die anti-diabetische Substanz in sehr reiner und sehr stabiler Form und aus den mit ihr in der Lösung vereinigten Substanzen niederzuschlagen, welche Sub stanzen bei der Ausfällung aus der Lösung das anti-diabetische Hormon einschliessen oder mit ihnen vereinigt haben,
wobei es gleich gültig ist, ob diese Substanzen selbst das Hormon sind; am isoelektrischen Punkt liegt Prr, zwischen 4 und 7. In der vorliegenden Beschreibung und in einigen der Ansprüche wird der Ausdruck ,,anti-diabetische Substanz" verwendet, um als (_Tattungsbegriff das anti- diabetisclie Hormon entweder allein oder in Vereinigung mit etwas anderem, das durch die Ausziehung aus dem Pankreas erhalten wurde, zu bezeichnen.
Ist P. zu niedrig, so kann es durch Beifügen von Alkali, zweck- mässig Natriumhy droxyd, erhöht werden, bis der isoelektrische Punkt angenähert erreicht wird, während bei zu hohem P. Säure, vor zugsweise Salzsäure beigefügt werden kann.
Während der Bildung des Niederschlages kann eine Änderung in der Wasserstoff-Ionen- konzentration eintreten, es ist jedoch nicht nötig, P,I konstant zii halten;
dein obwohl der isoelektrische Punkt irgendwo zwischen 4. 5 und 5. 5 auf der Prr Skala liegt, genauer lässt sich dies nicht angeben, so wird der Niederschlag in grösserem oder geringerem Masse innerhalb des PH Bereiches von 4-7 erhalten, so dass irgend eine Wasserstoff Ionenkonzentration innerhalb dieses Berei ches verwendet werden kann. Bis jetzt wurden die besten Resultate mit P" zwischen 4.5 und 5.5 erhalten.
Nachdem PFI so nahe als möglich auf den isoelektrisclien Punkt gebracht wird, wird die Lösung zwecks Bil dung des Niederschlages stehen gelassen. Zweckmässigerweise lässt man die Lösung mehrere Tage oder eine Woche lang stehen, obwohl ein trennbarer Niederschlag innerhalb einiger Stunden erhalten werden kann. Wenn der Niederschlag sich nur langsam oder gar nicht bildet, so wird die Lösung verdünnt, wobei man die zum Erscheinen des Nieder schlages nötige Wasserstoff-Ionenkonzen- tration aufrecht erhält.
Von Zeit zu Zeit wird der- Niederschlag entfernt und die Wasserstoff -Ionenkonzentration zweckrnässi- gerweise wieder auf das optimale P. gebracht, wodurch weitere Niederschlagsmengen erhalten werden. Um die Bildung dieses Niederschlages zu beschleunigen, ist es von Vorteil, wenn die Lösung gekühlt wird solange sie stehen gelassen wird.
Die auf diese Weise erhaltenen Nieder schläge werden in Wasser, das entweder eine Säure oder eine Base enthält, gelöst, wobei zweckmässig als Säure Salzsäure und als Base Natriumhydroxyd verwendet wird. Diese Lösung ermöglicht die hypodermische An wendung des Produktes. Die Wasserstoff Ionenkonzentration der so erhaltenen Lösung wird auf irgend ein gewünschtes P" gebracht.
Für die meisten Zwecke wird dies ein PH sein, welches ausserhalb dem P" Bereich von 4-7; bei welchem die Niederschlagsbildung erfolgt, liegt, so dass das Hormon in Lösung bleibt; es hat sich herausgestellt, dass ein PI, von 3.5 für gewöhnliche therapeutische Zwecke geeignet ist; PH kann aber noch niedriger sein und es kann mit P": auf 2 heruntergegangen werden, wobei der Gehalt an Säure noch nicht genügend ist, um bei der Anwendung übertriebenes Stechen zu verursachen, wenn Salzsäure verwendet wird. Für bestimmte Zwecke kann ein höheres PH verwendet werden, entweder innerhalb des isoelektrischen Bereiches oder darüber, es wurden bereits Lösungen mit P.=12 wirk sam verwendet.
Die Gesamtzahl an Einheiten von wirk samen anti-diabetischen Substanzen, welche nach vorliegendem Verfahren gewonnen wer den, beträgt manchmal 901/o von der in der Lösung vor der Ausfällung vorhandenen. Sie ändert sich mit der Vollständigkeit der Aus fällung und kann auf folgende Arten erhöht werden: Durch Verwendung eines reineren Ausgangsproduktes; durch längeres Stehen- lassen, durch Erniedrigung der Temperatur während dem Stehenlassen, und besonders dadurch, dass man näher an den isoelektri- schen_ Punkt gelangt.
Der Verlust an anti- diabetischer Aktivität kann verhältnismässig gering gehalten werden, wenn vorstehende Punkte berücksichtigt werden und ist auf alle Fälle aufgewogen durch die vielfach erhöhte Stabilität und Reinheit des Produktes.