Verfahren zur Herstellung eines._Gemisclies von Butylalkohol und Azeton dureh Gärung. Das Verfahren bezieht sich auf die Her stellung eines Gemisches von Butylalkohol und Azeton durch Vergärung von Kohlen- hydraten.
Nachdem Fernbach festgestellt hatte (D. R. P. Nr.323533), dass bei der Vergä rung von Kohlenhydraten oder kohlenhydrat- haltigen Stoffen, durch Gärungserreger "vom Typus Bac. butylicus Fitz" unter Luftab- schluss als Hauptprodukt Butylalkohol und Azeton neben geringen Mengen anderer Alko hole entstehen, ist dieses Verfahren in den Vereinigten Staaten von Nordamerika rasch bis zu grosser industrieller Bedeutung ent wickelt worden.
Als Ausgangsprodukte kön nen sowohl stärkehaltige, als auch zucker haltige natürliche Rohstoffe dienen, indem die Erreger der bakteriellen azeton-butylalko- holischen Gärung Stärke zu Monosacchariden enzymatisch leicht abzubauen vermögen. Bu tt' lalkohol und Azeton werden von allen bis- her verwendeten Gärungserregern im festen Verhältnis von 2 : 1 gebildet. Die Ausbeute an diesen beiden flüssigen Gärungsprodukten schwankt bei den bekannten Verfahren zwi schen 21 bis 25 % auf trockenen Mais berech net. Daneben entstehen als gasförmige Gä rungsprodukte stets Kohlensäure und Was serstoff.
Die Entwicklung. dieser Art von Gärung bis zum gegenwärtigen Stand der Technik ist insbesondere durch die Erkenntnis geför dert worden, dass es sich zur regelmässigen Erzielung kräftiger Gärungen empfiehlt, von Kulturen auszugehen, die keine vegetativen Formen, sondern ausschliesslich Sporen ent halten. Man verwendet demgemäss zur Aus saat vorteilhaft Kulturen, die kurze Zeit auf etwa 95 erhitzt worden sind. Weiter hat es sich durch die bereits früher geleistete Forschungsarbeit als vorteilhaft erwiesen, die bei der Gärung entstehenden Säuren nicht mit Kreide abzustumpfen. Es ist für den regelrechten Verlauf der Gärung günstig, wenn die Azidität anfangs stetig ansteigt, bis sie ein Maximum erreicht, um sodann bis zum Schluss der Gärung wieder stetig ab zusinken.
Die Gärungskurve hat sich so zu einem wichtigen Mittel der Betriebsüber wachung herausgebildet, wenn die Azi.dität sehr langsam oder etwa auch gar nicht zu rückgeht, so ist dies ein sicheres Zeichen da für, dass die Maischen infiziert sind oder der Gärungserreger selbst geschwächt ist. Der Kohlemhydratgehalt der Maischen wird zweckmässig wesentlich unter den Konzentra tionen gehalten, die bei der alkoholischen Gärung zulässig sind; die oberste Grenze wird mit 8 % Stärke angegeben. Die Erreger der aceton-butylalkoholischen Gärung sind also gegen ihre eigenen Stoffwechselprodukte empfindlicher als die Hefe.
Trotz geringerer Konzentration ist aber die Viskosität der Maischen, welche durch Dämpfen der Aus gangsprodukte unter Druck hergestellt wer den, insbesondere bei der Verarbeitung von Maismehl, beträchtlich, weshalb vorgeschla gen worden ist, diese Druckkochung unter Zusatz jener beschränkten Mengen von Salz säure auszuführen, welche gerade ausreichen, um die im Mehle enthaltenen Diphosphate in Monophosphate überzuführen. Schliesslich hat schon Fernbach empfohlen, den einge maischten kohlenhydrathaltigen. Rohstoffen erforderlichenfalls aufgeschlossene oder teil weise abgebaute Hefe als Nährstoff zuzu setzen.
Neben diesen für die technische Entwick lung des Verfahrens mehr oder minder wich tigen Vorschlägen fi"-2en sich, insbesondere in Patentschriften, Angaben über verschie dene Organismen, welchen für diesen Prozess spezifische Eignungen zugeschrieben werden.
So sollen nach Weizmann (Österr. Patent Nr. 95449) im allgemeinen hitzebeständige, unter anderem im Boden und auf Feldfrüch ten vorkommende Bakterien verwendet wer den, die Gelatine verflüssigen und ohne Mit verwendung von Hefe oder dergleichen den grösseren Teil von Mais- oder anderer Zerea- lienstärke unter aeroben oder anaeroben Be dingungen unmittelbar in eine Mischung von Butylalkohol und Azeton verwandeln. An dere haben geglaubt, besondere Arten von Mikroorganismen für diesen Zweck gefunden zu haben, welche sie beschreiben und benen nen.
Es ist aber von bedeutenden Forschern behauptet und zum Teil nachgewiesen wor den, da.ss diese Organismen nur dem Namen nach verschieden sind und durchweg der Species Bacillus Amylobacter A. M. et Brede- mann angehören, indem etwa auftretende morphologische und physiologische Verschie denheiten nur durch die Auswirkung der ver schiedenen Nährmedien und Züchtungsver fahren verursacht sind.
Tatsächlich ist es den Anmeldern durch langjährige Versuche gelungen, die Eigenschaften des Bacillus Amylobacter A. M. et Bredemann durch ein besonderes Züchtungsverfahren derart zu be einflussen, dass er befähigt wird, unter geeig neten Verhältnissen Stärke oder sonstige Koh lenhydrate vollständig zu vergären, und zwar mit, dem bekannten Ergebnis, dass neben den gasförmigen Gärungsprodukten (Kohlensäure und Wasserstoff) ein Gemisch von normalem Butylalkohol und Azeton im Verhältnis von 2 : 1 neben geringen Mengen anderer Alko hole gebildet wird.
Gemäss dem Verfahren der Erfindung werden als Gärungserreger Stämme der Species Bacillus Amylobacter A. M. et Bre- demann (Zentralblatt für Bakteriologie 1909, II. Abt. 23, :385) verwendet, die durch Züch tung an steigende Mengen von Säure ge wöhnt worden sind.
Es hat sich gezeigt, dass alle Erreger der azeton-butylalkoholischen Gärung äusserst säureempfindlich sind, indem sie in sauren Nährmedien degenerieren, asporogen werden und schliesslich zugrundegehen. Bei dem Verfahren der Erfindung wird die Empfind lichkeit des Gärungserregers gegen freie Säure durch allmähliche Gewöhnung herab gesetzt. Es geschieht dies vorteilhaft da durch, dass man den Bacillus A.
M. et Brede- ma.nn auf Nährböden mit steigender An- fangsazidität ohne Abstumpfung der sich bei der Gärung bildenden Säure solange fort züchtet, bis er im erwünschten Mass säure fest geworden ist, dabei aber zwischen ,je zwei aufeinanderfolgenden Züchtungen auf einem solchen Nährboden (die im folgenden als "Gewöhnungsgärungen" bezeichnet wer den) eine Gärung in einem neutralen oder alkalischen Medium unter Abstumpfung der sich bei der Gärung bildenden Säuren (im folgenden Sporulierungsgärungen genannt)
einschaltet und die Kulturen vor dem Über impfen auf die nächste Gewöhnungsgärung mit höherer Anfangsazidität jedesmal in der üblichen Weise kurze Zeit erhitzt, um alle vegetativen Formen abzutöten, so dass nur Sporen in den Gewöhnungsgärungen weiter gezüchtet werden.
Bei der Ausführung der Erfindung kann durch Pufferung des Nährmediums der Ge wöhnungsgärungen verhindert werden, dass die Wasserstoffionenkonzentration trotz Zu nahme der Säure während der Gärung ge wisse Grenzen überschreitet, wobei der Puf- ferungsgra.d az der Nährmedien in :den auf einanderfolgenden Gewöhnungsgärungen ent sprechend der steigenden Anfangsazidität ge steigert wird.
Zur Pufferung sind insbeson dere die bekannten Systeme: Gemische von schwachen Säuren mit ihren Alkalisalzen (vergleiche Michaelis, Die Wasserstoffionen konzentration, S. 87 ff. und S. 89 ff.) ge eignet.
Der Pufferungsgrad n wird mathematisch durch die Gleichung
EMI0003.0019
ausgedrückt, und zwar streng genommen als partieller Dif- fL-r.entiaIquotient bei einem besinmmten ph. Der zahlenmässige Betrag der Pufferung wird bekanntlich durch Messung der Ände rung des i>>,-Wertes bei Zusatz einer bestimm ten kleinen Menge Säure oder Alkali in einer gegebenen Menge des Gärmediums bestimmt.
Die Zusätze müssten theoretisch unendlich klein sein, praktisch ist die untere Grenze durch die Genauigkeit der p,i Bestimmungs methode gesetzt. Um vergleichbare Messergeb- nisse zu erhalten, muss die zugesetzte Säure- (Lauge-) menge bei allen Versuchen kon stant sein. Den unten angeführten 7i-Werten liegt die folgende bekannte Bestimmungs methode zugrunde. Es werden je drei Pro ben des Gärmediums, und zwar je 1 cm'. gleichzeitig entnommen. In einer dieser Pro ben wird das ph nach einer üblichen Methode gemessen.
Der zweiten Probe werden 0,5 cm m100 H2S04, der dritten 0,5 cm' n/100 Na0H zugesetzt, worauf der ph-Wert auch in diesen beiden Proben nach derselben Methode ge messen wird. Die Änderungen der pi,-Werte sind der Pufferung indirekt proportional. Die Beträge dieser Änderungen sollten theo retisch bei verschiedenen Vorzeichen densel ben Wert haben. Praktisch zeigen sich zwi schen den Änderungen des p,,-Wertes, die durch äquivalente Mengen Säure und Lauge hervorgerufen werden, oft bedeutende Ab weichungen.
Bei der praktischen Bestim mung wird das arithmetische Mittel der reziproken Werte der Änderungen des Pi,- W ertes nach der sauren und nach der alkali schen Seite hin als 3 angenommen. Zur Be stimmung des ph wurde die bekannte Indi- katorfolienmethode von Dr. Peter Wulff (D. R. P. Nr.405091) verwendet.
Der Pufferungsgrad der Nährmedien der aufeinanderfolgenden Gewöhnungsgärungen wird unter Anwendung dieser Bestimmungs methode vorteilhaft derart geregelt, dass er von etwa 4 am Beginn der Züchtungsreihe langsam ansteigt.
Dabei hat es sich als sehr vorteilhaft erwiesen, zur Pufferung des Gär- mediums gut puffernde Stoffgemische von gleicher Art mitzuverwenden, wie sie her nach in den Haupt,-l' ngen dem kohlen bydrathaltigen Ausgangsstoff als stickstoff haltige Nährstoffe zugesetzt werden (zum Beispiel Malzkeime, abgetötete und zweck mässig abgebaute Hefe, Harnstoff, Ammo- niumphosphat oder dergleichen).
Hierdurch wird erreicht, dass -der Mikroorganismus mit der Gewöhnung an steigende Säuremengen gleichzeitig auch an steigende Mengen sol cher stickstoffhaltiger Nährstoffzusätze ge wöhnt wird. Zur Ansäuerung der Nährmedien dieser Gewöhnungsgärungen werden am besten organische Säuren, vorzugsweise Milchsäure, verwendet.
Man kommt zu den günstigsten Ergebnissen, wenn man die Anfangsazidität des Gärmediums in den aufeinanderfolgen- den Gewöhnungsgärungen bei einem n von etwa 4 von 0,1 bis 1,6 ansteigen lä,sst. (Die Aziditätsgrade geben hier und in der Folge die Anzahl der cm' n-Natronlauge an, wel che bei Verwendung von Bromthymolblau als Indikator zur Neutralisierung von 100 cm' des Mediums erforderlich sind.)
Mit dem Ansteigen der Azidität und des Puf- ferungsgra.des kann man ferner auch die Konzentration des Nährmediums an Kohlen hydraten von Gewöhnungsgärung zu Gewöh nungsgärung stetig wachsen lassen. Man beginnt zweckmässig mit Nährmedien, die 1 % Kohlenhydrat (als Stärke gerechnet) en-E- halten und endigt mit einem Kohlenhydrat gehalt von 6 bis 8 %.
Der Nährboden der für die Gewöhnungs gerungen verwendet wird, kann als kohlen hydrathaltige Ausgangsstoffe beispielsweise Kartoffeln, Mais- oder Reismehl enthalten. Die stickstoffhaltigen Puffenzngsmischungen können zum Beispiel Malzkeime oder auto- lysierte Hefe, Harnstoff oder. Ammonium phosphat oder Ammoniumsulfat in verschie denen Kombinationen enthalten.
Das Nähr medium für .die Sporulierungsgärungen ist vorteilhaft von gleichbleibender Zusammen setzung und besteht beispielsweise aus 100 Gewichtsteilen Kartoffelbrei, 100 Gewichts teilen Wasser, 10 Gewichtsteilen Malzkeimen oder Blut und 2 Gewichtsteilen Kreide (CaC03). Beide Nährböden werden zum Bei spiel in Eprouvetten verfüllt und dreimal fraktioniert sterilisiert. Der Bacillus kann entweder aus dem Boden oder aus Feldfrüch ten nach den von Bredemann angegebenen Methoden "gefangen" und reingezüchtet wer den (a. a. 0.
S. 390 ff.), oder es können Sporen verschiedener Stämme des Bacillus Amylobacter A. M. et Bredemann schon vor handenen Kulturen entnommen werden. Diese Organismen werden zweckmässig zunächst 24 Stunden auf dem Sporulierungsnährboden weitergezüchtet, sodann etwa 5 Minuten auf etwa<B>90'</B> erhitzt und dann in das Nähr medium der ersten Gewöhnungsgärung über geimpft.Nach 48stündiger Gärung emp fiehlt es sich, die Kulturen in der üblichen Weise auf ihre bakteriologischen, morpho logischen und physiologischen Eigenschaf ten zu untersuchen,
um die bestgeeigneten Mikroorganismen hernach einer zweiten Gä rung auf dem Sporulierungsnährboden zu über lassen und nach der Abtötung der vegetativen Formen auf den entsprechend vorbereiteten Nährboden der zweiten Gewöhnungsgärung zu übertragen. Alle Gärungen werden zweckmässig völlig anaerob bei 3 7 bis 38 C geführt.
Dieses Verfahren der abwechseln den Gewöhnungs- und Sporulierungsgärung kann solange fortgesetzt werden, bis eine Prüfungsgärung zeigt, .dass die Organismen eine 6 bis 8 % Stärke enthaltende Maische, die durch Zusatz von Säure bis zu einer Titrationsazidität von 1,4 bis 1,6 angesäuert worden ist und bei einem Anfangspuffe- rungsgrad von mindestens 4 ein A von 5 bis 4,7 besitzt,
bis zum vollständigen Ver schwinden der Kohlenhydrate zu vergären imstande ist, womit gesagt werden soll, dass im Gärmedium am Schluss der Gärung prak tisch weder Zucker noch Stärke nachweisbar sein darf. (Da die Kulturen stark gasbil dend sind, werden zur Ausführung dieser Prüfungsgärung zweckmässig Kölbchen ver wendet, die, wie dies zur Züchtung von anaeroben Mikroorganismen üblich ist, mit geeigneten gasdurchlässigen Gärverschlüssen versehen sind.) Zu diesem Ziel kommt man, wie Versuche ergaben, erst nach einer sehr langen Reihe von Gewöhnungsgärungen,
ohne jedoch an die Auswahl von vornherein morphologisch unterschiedener Stämme des Bacillus Amyloba.cter A. M. et Bredemann gebunden zu ,sein.
Immerhin ist es unter Anwendung die ser Methode gelungen, in Reihen von mehr als hundert Gewöhnungsgärungen zwei für die Durchführung der a.zeton-butylalkoholi- sehen Gärung besonders geeignete Stämme dieser Speci.es heranzuzüchten, welche als Bacillus Amylohacter W. und als Bacillus Amylobacter S.. bezeichnet werden sollen.
Diese beiden Stämme unterscheiden sich mor phologisch in ihren Vegetationsformen ledig lich dadurch! voneinander, dass der Bacillus Amylobacter W. längere Stäbchen bildet, wogegen die Vegetationsformen des andern Stammes eine weniger schlanke Gestalt haben. Im Sporulierungsstadium wiegen beim Bacillus, Amylobacter W. die Plectridien- formen, beim andern Stamm die Clostridien- formen vor. Die Oidienformen beider Orga nismen sind lebhaft beweglich.
Beide Stämme verflüssigen Gelatine nicht und sind obligat anaerob; .sie stehen daher in diesen beiden Hinsichten im Gegensatz zu den von Weiz- mann empfohlenen Bakterien (Österr. Patent N r. 95449).
Zur Durchführung der Gärung im grossen Massstab werden zweckmässig lediglich Spo ren enthaltende Kulturen, wie dies allgemein üblich ist, in mehreren Ansätzen von zuneh mendem Volumen vermehrt, bis schliesslich die zum Anstellen der Hauptmaische erfor derliche Ansatzmenge vorhanden ist.
Die Maischen für die grosse Gärung kön nen in der üblichen Art bereitet werden. Die optimale Konzentration an Stärke oder Zuk- ker beträgt vorteilhaft 6 bis 7 %.
Abweichend vom bekannten kann man bgi dem Verfahren gemäss der Erfindung die Hauptgärung mit besonderem Vorteil in Maischen vor sich gehen lassen, die vor Ein leitung der Gärung durch den Zusatz oder die fermentative Bildung von organischen Säuren, insbesondere von Milchsäure, ange säuert werden. Auch der Hauptmaische wer den ferner vorteilhaft gut puffernde Stoff gemische, die gleichzeitig stickstoffhaltige Nährstoffe darstellen, zum Beispiel eiweiss haltige Gemische pflanzlichen Ursprunges, ferner Ammoniumverbindungen, insbesondere Ammoniaksalze,ode1 Harnstoff zugesetzt.
Es hat sich als zweckmässig herausge stellt, die Anfangsazidität der Hauptmaische ('1'itrationsa.zidität gegen Bromthymolblau) auf mindestens 1.,4 bis 1,6 einzustellen. Der Ah-Wert soll zweckmässig bei einem Puffe- rungsgrad von mindestens 4 zwischen 5 bis 4,6 liegen.
In Verbindung damit hat sieh zur Betriebskontrolle als günstig ergeben, den Verlauf der Gärung nicht nur durch bakteriologische Untersuchung und Bestim mung der Aziditätskurve, sondern auch durch periodische Messungen des Pufferungs- grades zu überwachen, wobei der -r--#Vert der Veränderung der Azidität angepasst wird, das heisst mit dieser ansteigen und vorteilhaft mit dem Säuremaximum den höchsten Wert gleichzeitig erreichen soll.
Wird ein unge nügend hoher Pufferungsgrad festgestellt, so kann er durch Zugabe von hochpuffernden Zusätzen, zum Beispiel milchsaure, wein säume, zitronensaure oder oxalsaure Salze, im Zuge der Hauptgärung ausgeglichen werden. In dieser Weise wird die Herabsetzung der Empfindlichkeit der Gärungserreger gegen Säuren durch die oben beschriebene Gewöh nungsgärung ausgenutzt, um die Reinheit der Hauptgärung in einem bisher nicht erreich ten Grad und im Zusammenhang damit die regelmässige Erzielung höchster Ausbeuten sicherzustellen.
Unter diesen Arbeitsbedin- gungen werden im Höhepunkt der Haupt gärung Säuremaxima von 8 bis 9 erreicht. ''s werden also von den an -Säure gewöhn ten Organismen auch im Zizge der Gärung weitaus grössere Säuremengen gebildet. als dies bei der azeton-1)utylalkoholiseben Gärung bisher beobachtet wurde. <I>Ausführungsbeispiel:</I> <B>100</B> Liter der Maische sollen etwa. 35 bis 37 kg Kartoffeln oder t) bis IL) kg Mais mehl enthalten.
Andere stärkehaltige Ma terialien werden entsprechend ihrem Stärke gehalt zu Maischen gleicher Konzentration (6 bis 7 % reine Stärke) verarbeitet. Man bringt die Kartoffeln unzerkleinert, Mais oder dergleichen in Mehlform finit der geeig neten W.ass,ermenge in Autoklavcn ein, die mit Rührwerken ausgestattet sind, und dämpft bei einem Druck von 2 bis 3 Atmo sphären etwa 1, bis 2 Stunden.
Die -Nähr- Stoffzusätze (abgetötete oder autolysierte Hefeoder Malzkeime in Verbindung mit Harnstoff oder Ammoniumphosphat oder Ammoniumsulfat oder mit ähnlichen stick stoffhaltigen Stoffen in verschiedenartigen Kombinationen) werden der Maische zweck mässig schon. im Autoklaven zugefügt.
Pas sende Zusammensetzungen sind zum Beispiel: auf 100 Liter Maische 125 gr abgetötete oder abgebaute Hefe, 125 gr Malzkeime und 40 gr Ammoniumsulfat. Die Maische wird unmit telbar in vorher sorgfältig sterilisierte, mit Rührwerken versehene Gärgefässe, die voll kommen geschlossen und mit einem zum Ab fangen der entweichenden Gase geeigneten Gäraufsatz versehen-sein müssen, ausgebla sen.
Nach Einstellung der entsprechenden Anfangsazidität, wozu zweckmässig 80 bis 90 cm' einer 80 % igen Milchsäure auf je 100 Liter der Maische zugesetzt werden, wird die Maische zum Beispiel durch eingebaute Kühler auf die Gärtemperatur von 37 bis 38 ! C abgekühlt; man kann sie zu diesem Zweck aber auch durch vorgebaute Wärme austauschapparate hindurchgehen lassen.
Wenn die Hauptmaische zum Anstellen bereit ist, muss auch der zum Anstellen die nende Bakterienansatz von geeignetem Vo lumen fertig sein. Zu seiner Herstellung überimpft man Bakterium Amylobacter W. oder S. nach kurzer Erhitzung auf etwa 90 auf 100 cm' eines annähernd in gleicher Weise wie die Hauptmaische bereiteten Nähr- hodeng lind üharlä.sst ihn hai .27 hic<B>29</B> (f; unter anaeroben Bedingungen der Entwick lung.
Nach etwa 48 Stunden beginnt das Wachstum und die Entwicklung der Oidien. Nachdem man sich von der einwandfreien Beschaffenheit der Kultur überzeugt hat, er folgt die Überimpfung auf etwa 2 Liter steriler Maische von gleicher Beschaffenheit und nach etwa 24 Stunden auf etwa 20 Liter gleichartiger Maische. Nach weiteren 24 Stunden kommen diese 20 Liter in eine vor bereitete Maische von 200 bis 300 Litern. welche nach weiteren 24 Stunden in die in zwischen zum Anstellen fertiggemachte Hauptmaische übergeführt wird.
Während der Gärung der Hauptmaische werden mindestens viermal täglich neben der bakteriologischen Kontrolle und der Titra- tionsazidität, ph und Pufferungsgrad festge stellt, was unter Umständen zum Zusatz wei terer Pufferstoffe führt. Nach etwa 30 bis 32stündiger Gärung, während welcher die gärende Maische ab und zu vorsichtig ge rührt werden muss, ist der Höhepunkt der Gärung und damit auch das Säuremaximum (bis zu 8 bis 9 ) erreicht. Dieser hohe Säure gehalt wird von den an Säure gewöhnten Organismen in Verbindung mit dem hohen Pufferungsgrad der Maische ohne Schwä chung vertragen.
Nach etwa 48 Stunden ist die Gärung beendet, das heisst es ist in der Maische weder Stärke noch Zucker praktisch nachweisbar.
Nach Beendigung der Gärung können die gebildeten Hauptprodukte (Butylalkohol und Azeton) durch fraktionierte Destillation ge wonnen werden. Die geringen Mengen an dere- Alkohole lassen eine abgesonderte Ge winnung nicht wirtschaftlich erscheinen. Die in üblicher Weise vor sich gehende Tren nung der Gärungsprodukte ist nicht mehr als eine Operation des beanspruchten Verfahrens zu betrachten.
Die während der Gärung entweichenden Gase, Wasserstoff und Kohlensäure, können, wie dies auch sonst geschieht, verwertet wer den, desgleichen die wertvolle Futterstoffe enthaltenden Rückstände. Es ist bereits vorgeschlagen worden, die Gärungserreger der a.zeton-butylalkoholischen Gärung .durch Gewöhnung an gewisse Stoffe, welche bei der. sogenannten trägen Gärung (sluggish fermentation) in der Maische vor- haiden sind, in einen Zustand zu bringen, durch den das Eintreten dieser epidemisch auftretenden Betriebsstörung vermieden wer den soll.
Diese Stoffe bleiben bei sorgfältiger Filtration der Maische durch Bakterienfilter in ihr zurück; auch aus andern Gründen wird auf die ultramikroskopische Beschaffen heit der Erreger der trägen Gärung geschlos- sen. Es handelt sich also hier, wie angenom- inen wird, um die Gewöhnung der Organis men an ein invisibles Virus oder einen Bak- teriophagen. Desgleichen ist auch schon be kannt, die Kulturen einem oder mehreren selektiven Prozessen zu unterwerfen, wobei diese in einer Nährlösung ,gezüchtet werden,
der geringe Mengen der durch Gärung zu olewinnenden Produkte zugesetzt werden. In diesem Fall handelt es sich darum, die Gä rungserreger, gegen Azeton bezw. Butylalko- hol widerstandsfähig zu machen. Mit diesen beiden Vorschlägen hat das vorliegende Ver fahren nur die allgemein bekannte bakterio logische Methode der Gewöhnung-von Mikro organismen an bestimmte Stoffe durch wie derholte Züchtung in Gegenwart dieser Stoffe gemeinsam.
Process for the production of a._Gemisclies of butyl alcohol and acetone by fermentation. The process relates to the production of a mixture of butyl alcohol and acetone by fermenting carbohydrates.
After Fernbach had established (DRP No. 323533) that the fermentation of carbohydrates or substances containing carbohydrates caused by fermentation pathogens "of the type Bac. Butylicus Fitz" in the absence of air as the main product butyl alcohol and acetone, along with small amounts of other alcohols , this process has been developed rapidly in the United States of North America to great industrial importance.
Both starchy and sugar-containing natural raw materials can serve as starting products, as the pathogens of the bacterial acetone-butyl alcoholic fermentation are able to enzymatically break down starch to monosaccharides. Butt alcohol and acetone are formed by all fermentation pathogens used to date in a fixed ratio of 2: 1. The yield of these two liquid fermentation products fluctuates in the known processes between 21 and 25% calculated on dry corn. In addition, carbonic acid and hydrogen are always produced as gaseous fermentation products.
The development. This type of fermentation up to the current state of the art has been promoted in particular by the knowledge that to achieve regular strong fermentations it is advisable to start from cultures that do not contain vegetative forms, but exclusively contain spores. Accordingly, cultures which have been heated to about 95 for a short time are used for sowing. In addition, previous research has shown it to be advantageous not to dull the acids produced during fermentation with chalk. It is favorable for the proper course of fermentation if the acidity increases steadily at the beginning until it reaches a maximum and then steadily decreases again until the end of fermentation.
The fermentation curve has become an important means of operational monitoring, if the azimuth decreases very slowly or not at all, this is a sure sign that the mash is infected or that the fermentation pathogen itself is weakened. The carbohydrate content of the mash is expediently kept well below the concentrations that are permissible in alcoholic fermentation; the upper limit is given as 8% strength. The causative agents of acetone-butyl alcoholic fermentation are therefore more sensitive to their own metabolic products than yeast.
Despite the lower concentration, however, the viscosity of the mash, which is produced by steaming the output products under pressure, is considerable, especially when processing cornmeal, which is why it has been proposed to carry out this pressure cooking with the addition of the limited amounts of hydrochloric acid which just enough to convert the diphosphates contained in the flour into monophosphates. After all, Fernbach already recommended the mashed carbohydrate product. If necessary, add digested or partially degraded yeast to raw materials as a nutrient.
In addition to these proposals, which are more or less important for the technical development of the process, there are, in particular in patents, information about various organisms to which specific suitability for this process is ascribed.
Thus, according to Weizmann (Austrian Patent No. 95449), generally heat-resistant bacteria occurring in the soil and on field crops, among other things, are used to liquefy gelatin and, without using yeast or the like, the greater part of maize or other cereals - Convert starch directly into a mixture of butyl alcohol and acetone under aerobic or anaerobic conditions. Others believed they had found special types of microorganisms for this purpose, which they described and named.
But it has been asserted and in part proven by important researchers that these organisms differ only in name and all belong to the species Bacillus Amylobacter AM et Bredemann, in that any morphological and physiological differences that occur are only due to the effect caused by the various nutrient media and cultivation methods.
In fact, through many years of attempts, the applicants have succeeded in influencing the properties of Bacillus Amylobacter AM et Bredemann by means of a special breeding process in such a way that it is able to completely ferment starch or other carbohydrates under suitable conditions, namely with the known result that in addition to the gaseous fermentation products (carbonic acid and hydrogen) a mixture of normal butyl alcohol and acetone in a ratio of 2: 1 is formed alongside small amounts of other alcohols.
According to the method of the invention, strains of the species Bacillus Amylobacter A.M. et Bredemann (Zentralblatt für Bakteriologie 1909, II. Dept. 23,: 385) are used as fermentation pathogens which have been accustomed to increasing amounts of acid by breeding.
It has been shown that all pathogens in acetone-butyl alcoholic fermentation are extremely sensitive to acids, in that they degenerate, become asporogenic and finally perish in acidic nutrient media. In the method of the invention, the sensitivity of the fermentation pathogen to free acid is reduced by gradual habituation. This is done advantageously because the Bacillus A.
M. et Brede- ma.nn continues to breed on nutrient media with increasing initial acidity without dulling the acid formed during fermentation until it has solidified to the desired degree, but between two successive cultivations on such a culture medium (hereinafter referred to as "habituation" who) a fermentation in a neutral or alkaline medium with dulling of the acids that form during fermentation (hereinafter referred to as sporulation fermentation)
switches on and the cultures are heated in the usual way for a short time each time before over-inoculating for the next habituation fermentation with higher initial acidity in order to kill all vegetative forms, so that only spores are further grown in the habituation fermentations.
When carrying out the invention, buffering the nutrient medium of the habituation fermentations can prevent the hydrogen ion concentration from exceeding certain limits despite the increase in acid during fermentation, the buffering level of the nutrient media in the following habituation fermentations accordingly the increasing initial acidity is increased.
The known systems are particularly suitable for buffering: Mixtures of weak acids with their alkali salts (compare Michaelis, The hydrogen ion concentration, pp. 87 ff. And pp. 89 ff.).
The degree of buffering n is mathematically given by the equation
EMI0003.0019
Expressed, strictly speaking, as a partial dif- fL-r.entiaIquotient at a certain ph. As is well known, the numerical amount of buffering is determined by measuring the change in the i >>, value when a certain small amount of acid or alkali is added to a given amount of fermentation medium.
Theoretically, the additions should be infinitely small; in practice, the lower limit is set by the accuracy of the p, i determination method. In order to obtain comparable measurement results, the amount of acid (lye) added must be constant in all tests. The 7i values listed below are based on the following known determination method. There are three samples each of the fermentation medium, each 1 cm '. taken at the same time. In one of these samples, the pH is measured using a conventional method.
0.5 cm m100 H2S04 is added to the second sample, and 0.5 cm m100 Na0H to the third, whereupon the pH value is measured in these two samples using the same method. The changes in the pi, values are indirectly proportional to the buffering. Theoretically, the amounts of these changes should have the same value with different signs. In practice, there are often significant deviations between the changes in the p ,, value that are caused by equivalent amounts of acid and alkali.
In the practical determination, the arithmetic mean of the reciprocal values of the changes in the pi value towards the acidic and alkaline side is assumed to be 3. To determine the pH, the well-known foil indicator method was used by Dr. Peter Wulff (D. R. P. No. 405091) was used.
The degree of buffering of the nutrient media of the successive habituation fermentations is advantageously regulated using this determination method in such a way that it increases slowly from about 4 at the beginning of the cultivation series.
It has proven to be very advantageous to use well-buffering substance mixtures of the same type for buffering the fermentation medium as are generally added to the carbonaceous starting material as nitrogenous nutrients (for example malt germs, killed and suitably degraded yeast, urea, ammonium phosphate or the like).
This means that, as the microorganism becomes accustomed to increasing amounts of acid, it is also accustomed to increasing amounts of such nitrogenous nutrient additives. Organic acids, preferably lactic acid, are best used to acidify the nutrient media of these habituation fermentations.
The best results are obtained if the initial acidity of the fermentation medium is allowed to increase from 0.1 to 1.6 in the successive habituation fermentations with an n of about 4. (The degrees of acidity here and in the following indicate the number of cm 'n sodium hydroxide solution which are required to neutralize 100 cm' of the medium when using bromothymol blue as an indicator.)
With the increase in acidity and the degree of buffering, the concentration of carbohydrates in the nutrient medium can also be allowed to grow steadily from habituation to accustomed fermentation. It is advisable to start with nutrient media that contain 1% carbohydrate (calculated as starch) en-E- and end with a carbohydrate content of 6 to 8%.
The nutrient medium that is used for the struggling to get used to it can contain, for example, potatoes, corn or rice flour as carbon hydrated raw materials. The nitrogen-containing buffer mixtures can, for example, malt germs or autolyzed yeast, urea or. Contains ammonium phosphate or ammonium sulfate in various combinations.
The nutrient medium for .die sporulation fermentation is advantageously of constant composition and consists, for example, of 100 parts by weight of mashed potatoes, 100 parts by weight of water, 10 parts by weight of malt germs or blood and 2 parts by weight of chalk (CaC03). Both culture media are, for example, filled into test tubes and sterilized three times in a fractionated manner. The Bacillus can either be “caught” from the soil or from field crops using the methods specified by Bredemann and then bred (op.
P. 390 ff.), Or spores of different strains of Bacillus Amylobacter A.M. et Bredemann can be removed from existing cultures. These organisms are expediently first grown on the sporulation medium for 24 hours, then heated to about <B> 90 '</B> for about 5 minutes and then inoculated into the nutrient medium of the first familiarization fermentation. After fermentation for 48 hours, it is recommended to start the cultures to examine in the usual way for their bacteriological, morphological and physiological properties,
in order to leave the most suitable microorganisms on the sporulation medium after a second fermentation and to transfer them to the appropriately prepared nutrient medium of the second habituation fermentation after the vegetative forms have been killed. All fermentations are expediently carried out completely anaerobically at 37 to 38 C.
This process of alternating habituation and sporulation fermentation can be continued until a test fermentation shows that the organisms have made a 6 to 8% starch mash that has been acidified by adding acid to a titration acidity of 1.4 to 1.6 and has an A of 5 to 4.7 with an initial degree of buffering of at least 4,
is able to ferment until the carbohydrates have completely disappeared, which is to say that in the fermentation medium at the end of fermentation practically neither sugar nor starch should be detectable. (Since the cultures are strongly gas-forming, for this test fermentation it is advisable to use small flasks which, as is customary for the cultivation of anaerobic microorganisms, are provided with suitable gas-permeable fermentation seals.) This goal, as tests have shown, is only achieved after a very long series of habituation
but without being bound to the selection of strains of Bacillus Amyloba.cter A. M. et Bredemann that are morphologically different from the start.
After all, using this method, it has been possible to cultivate two strains of this Speci.es which are particularly suitable for carrying out the azetone-butyl alcoholic fermentation in series of more than a hundred familiarization fermentations, which are called Bacillus Amylohacter W. and Bacillus Amylobacter S. .. should be designated.
The only difference between these two tribes in terms of their vegetation forms is this! that the Bacillus Amylobacter W. forms longer rods, whereas the vegetation forms of the other trunk have a less slender shape. In the sporulation stage, in Bacillus and Amylobacter W. the plectridia forms predominate, in the other strain the clostridia forms. The oidial forms of both organisms are vigorously mobile.
Both strains do not liquefy gelatin and are absolutely anaerobic; In these two respects they are therefore in contrast to the bacteria recommended by Weizmann (Austrian Patent No. 95449).
To carry out fermentation on a large scale, cultures containing only spo ren are expediently, as is common practice, multiplied in several batches of increasing volume until the amount required to make the main mash is finally available.
The mash for the major fermentation can be prepared in the usual way. The optimal concentration of starch or sugar is advantageously 6 to 7%.
Deviating from the known one can bgi the method according to the invention, the main fermentation with particular advantage in mashes that are acidified before the start of fermentation by the addition or fermentative formation of organic acids, especially lactic acid. The main mash is also advantageously mixed with good buffering substances, which at the same time represent nitrogenous nutrients, for example protein-containing mixtures of vegetable origin, ammonium compounds, in particular ammonia salts, or urea.
It has proven to be useful to set the initial acidity of the main mash ('1'itrationsa.zidität against bromothymol blue) to at least 1., 4 to 1.6. The Ah value should expediently be between 5 and 4.6 with a degree of buffering of at least 4.
In connection with this, it has been shown to be beneficial for operational control to monitor the course of fermentation not only by bacteriological examination and determination of the acidity curve, but also by periodic measurements of the degree of buffering, the -r - # Vert of the change in acidity is adjusted, that is to say to increase with this and advantageously to reach the highest value at the same time as the acid maximum.
If an insufficiently high level of buffering is found, it can be compensated for by adding highly buffering additives, for example lactic acid, wine fringes, citric acid or oxalic acid salts, during the main fermentation. In this way, the reduction in the sensitivity of the fermentation pathogens to acids by the habitual fermentation described above is exploited to ensure the purity of the main fermentation in a previously unachieved degree and, in connection with this, the regular achievement of the highest yields.
Under these working conditions, acid maxima of 8 to 9 are reached at the peak of the main fermentation. So much larger amounts of acid are formed by the organisms used to acid, even during fermentation. than has been observed so far in acetone-1) utyl alcoholic fermentation. <I> Exemplary embodiment: </I> <B> 100 </B> liters of the mash should be around. 35 to 37 kg potatoes or t) to IL) kg corn flour.
Other starchy materials are processed into mashes of the same concentration (6 to 7% pure starch) depending on their starch content. The potatoes are brought whole, corn or the like in flour form finitely of the suitable water, put into autoclaves equipped with stirrers and steamed at a pressure of 2 to 3 atmospheres for about 1 to 2 hours.
The nutrient additives (killed or autolyzed yeast or malt germs in connection with urea or ammonium phosphate or ammonium sulfate or with similar nitrogen-containing substances in various combinations) are expediently already in the mash. added in the autoclave.
Suitable compositions are for example: 125 grams of killed or degraded yeast per 100 liters of mash, 125 grams of malt germ and 40 grams of ammonium sulfate. The mash is immediately blown out into fermentation vessels that have been carefully sterilized and equipped with agitators, which must be completely closed and provided with a fermentation attachment suitable for catching the escaping gases.
After setting the corresponding initial acidity, for which 80 to 90 cm 'of 80% lactic acid is added to every 100 liters of the mash, the mash is brought to the fermentation temperature of 37 to 38! C cooled; For this purpose, however, you can also let them pass through built-in heat exchange devices.
When the main mash is ready for pitching, the bacterial batch of suitable volume must also be ready for pitching. To produce it, the bacterium Amylobacter W. or S. is inoculated after briefly heating to about 90 by 100 cm of a nutritive testicle that has been prepared in approximately the same way as the main mash and leaves it .27 hic <B> 29 </ B > (f; under anaerobic conditions of development.
After about 48 hours, the growth and development of the oidia begins. After you have convinced yourself of the perfect condition of the culture, it is inoculated on about 2 liters of sterile mash of the same quality and after about 24 hours on about 20 liters of the same mash. After a further 24 hours, these 20 liters are put into a prepared mash of 200 to 300 liters. which after a further 24 hours is transferred to the main mash, which has been prepared for queuing.
During fermentation of the main mash, in addition to bacteriological control and titration acidity, pH and buffering level are determined at least four times a day, which may lead to the addition of further buffer substances. After about 30 to 32 hours of fermentation, during which the fermenting mash must be carefully stirred from time to time, the climax of the fermentation and thus the maximum acidity (up to 8 to 9) is reached. This high acid content is tolerated by the organisms used to acid in connection with the high degree of buffering of the mash without weakening.
Fermentation is over after about 48 hours, which means that neither starch nor sugar is practically detectable in the mash.
After fermentation has ended, the main products formed (butyl alcohol and acetone) can be obtained by fractional distillation. The small amounts of other alcohols make a separate Ge recovery seem uneconomical. The usual separation of the fermentation products is no longer to be regarded as an operation of the claimed process.
The gases escaping during fermentation, hydrogen and carbonic acid, can, as is usually the case, recycled, as can the residues containing valuable feed materials. It has already been suggested that the fermentation pathogens of a.zetone-butyl alcoholic fermentation. By getting used to certain substances that occur in the. So-called sluggish fermentation in the mash must be brought into a state that is intended to avoid the occurrence of this epidemic malfunction.
If the mash is carefully filtered through bacterial filters, these substances remain in it; For other reasons, too, the ultramicroscopic nature of the causative agent of sluggish fermentation is inferred. It is assumed here that the organisms have become accustomed to an invisible virus or a bacteriophage. Likewise, it is already known to subject the cultures to one or more selective processes, whereby these are grown in a nutrient solution,
the small amounts of the products to be extracted by fermentation are added. In this case, it is about the fermentation pathogen, bezw against acetone. To make butyl alcohol resistant. With these two proposals, the present process only has the well-known bacteriological method of habituation of microorganisms to certain substances by repeated breeding in the presence of these substances in common.