CH268325A - Procédé de préparation de riboflavine par biosynthèse. - Google Patents

Description

  Procédé de préparation de riboflavine par biosynthèse.    Il est connu que certains micro-organismes,  en particulier     l'Lrémothécium        Ashbyii,    syn  thétisent, de la riboflavine en quantités nota  bles lorsqu'ils sont cultivés sur des milieux  appropriés.

   On n'avait obtenu     jusqu'à    présent  aucun résultat sous ce rapport avec le micro  organisme     Ashbya        gossypii;    même après un  long temps d'incubation, on n'a trouvé que des  traces de riboflavine.     Ashbya        gosspii    était donc  considérée dans la littérature comme étant  impropre à la synthèse de la riboflavine en  quantités quelque peu importantes, bien que  cet organisme croisse très bien dans une solu  tion contenant de la thiamine, de     l'inosite    et  de la     biotine,    comme facteurs de croissance,  du glucose, du nitrate d'ammonium et des  oligoéléments; dans ce milieu toutefois, il ne  se forme que très peu de riboflavine.  



  On a trouvé maintenant. que     Ashbya        gossy-          pii    peut synthétiser la riboflavine en quantités  telles que ce micro-organisme entre en consi  dération pour la préparation de riboflavine.  Suivant la présente invention, la préparation  de riboflavine par biosynthèse est effectuée  par culture     d'Ashbya        gossypii    en conditions  aérobies, dans un milieu qui contient un  hydrate de carbone assimilable et une matière       albuminoïde        bruite    d'origine naturelle ou les  produits de dégradation partielle d'une telle  matière brute, et séparation de la riboflavine  produite.  



  Pour réaliser le procédé suivant l'inven  tion, on peut procéder de la manière suivante:    Le milieu est stérilisé et. ensuite ensemencé au  moyen d'une culture active     d'Ashbya        gossypii.     Pendant le développement, la culture est  aérée ou agitée ou à la fois agitée et aérée.  L'aération est effectuée de préférence par l'in  sufflation directe d'air stérile dans la culture.  Une bonne aération est favorisée par l'agita  tion pendant l'insufflation d'air stérile dans la  culture. Après une période d'environ 4 à 7  jours, la production de riboflavine atteint  son maximum. La fermentation est alors inter  rompue, tandis que la riboflavine est récu  pérée d'une manière connue.  



  Les matières     albuminoïdes    brutes d'origine  naturelle contiennent,. outre de l'albumine et  les produits de dégradation de celle-ci, encore  des facteurs qui favorisent la production de  riboflavine par     l'Ashbya        gossypii.    Dans quel  ques-unes de ces substances alimentaires, les  dits facteurs sont présents sous forme combi  née; ils doivent être alors mis en liberté à  l'aide d'acides, d'alcalis, d'enzymes ou par  combinaison de ces moyens.  



  Les substances alimentaires peuvent. égale  ment contenir des facteurs qui paralysent la  production de la riboflavine bien qu'ils n'in  fluencent pas la croissance. La présence de  telles substances paralysantes en concentration  quelque peu notable doit être évitée.  



  Pour réaliser les conditions optima, il est  par conséquent nécessaire de choisir avec soin  les différentes substances alimentaires et leur  concentration, et d'adapter le milieu de faon      à libérer les facteurs favorables à la produc  tion de riboflavine et à     éliminer    ou rendre  inactifs les facteurs paralysants. Pour le choix  de nouvelles substances alimentaires ou pour  l'emploi d'une nouvelle quantité     d'iuse    subs  tance alimentaire déjà employée antérieure  ment, il est donc à conseiller de faire quelques  essais préalables.  



  L'albumine brute naturelle et, ses produits  de dégradation partielle peuvent être d'ori  gine animale ou végétale. Conviennent par  exemple comme matières d'origine végétale: la  levure, les produits de levure, les sous-pro  duits de distillation et, avant tout la matière  appelée      corn        steep        liquor     (eau de trempage  de maïs concentrée), et comme matières d'ori  gine animale: la peptone, le bouillon, la ma  tière appelée  animal stick     liquor     (extrait de  viande concentré), le      tankage     (farine ani  male) et les      meat        scraps     (détritus de  viande).

   Le rendement en     riboflavine    est en  général plus élevé lorsque ces produits natu  rels sont hydrolysés au préalable; cela est  vrai principalement pour les matières pre  mières animales. A cet effet, outre les acides  et les alcalis, les ferments comme la     papaïne     et la trypsine conviennent aussi, par exemple.  



  Il est fréquemment à recommander de  prendre comme source d'albumine brute natu  relle un mélange d'albumines brutes naturelles  d'origines diverses, par exemple de la      corn          steep        liquor     et de la  stick     liquor     et/ou du        tankage .     



  L'invention est exposée plus en     détail    dans  les exemples ci-dessous.  



  <I>Exemple I:</I>  On met dans des fioles coniques de 500     em3     trois séries de milieux qui diffèrent de com  position. Dans toutes ces séries, la teneur en  glucose était de 4%. Dans la première série,  on a utilisé 0,5 % de      corn        steep        liquor ,    cal  culé sur la matière sèche; la concentration en  peptone variait de 0 à 2,0 %; le tout comme  on l'a indiqué au tableau     A..    Dans la seconde  série, la concentration en peptone était de       0,51/o,    tandis que la concentration des consti-    tuants solides de la      corn        steep        liquor     variait  de 0 à 2,0 0/0.

   Dans la troisième série, on a  ajouté des quantités égales de constituants so  lides de      corn        steep        liquor     et de peptone et     5o     cela en quantités qui variaient de 0 à 2,0 %  de chaque constituant. Chaque fiole conique  contenait 100 cm' de milieu, tandis qu'à l'aide  d'hydroxyde de sodium le contenu de chaque  fiole conique a été réglé à un<B>pH</B> de 6,5.

   Toutes     5s     les fioles coniques sont stérilisées par de la  vapeur à 1,1 atm. de surpression pendant  30 minutes, après quoi elles sont refroidies et  ensemencées au moyen de 1     %    en volume d'une  culture active d'     Ashbya        gossypii.    Les fioles     6o     coniques sont alors secouées mécaniquement  pendant. 8 jours à 290 C. Tous les essais sont  faits en double.

   Les résultats qui sont rassem  blés au tableau A sont des moyennes de ces  déterminations doubles.     6s     
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       Les résultats réunis au tableau A font voir  que, dans ce cas, l'emploi de peptone seule ou  de      corn        steep        liquor     seule donnait un mi  nime rendement en riboflavine.

   Lorsque les  deux substances sont employées ensemble, on  a obtenu des résultats convenables avec 0,25 à  0,75 de peptone alors que la      corn        steep          liquor     avait une concentration de     0,51/o.    Si       on        prenait.        0,25    à     0,75        %        de         corn        steep        liquor ,     le rendement,

   était remarquable en cas     d'em-          ploi        de        0,25        %        de        peptone.        De        phis        grandes     quantités de      corn        steep        liquor     ou de pep  tone diminuaient le rendement en riboflavine  dans une forte mesure.

   Comme la peptone et  la      corn        steep        liquor     du commerce sont su  jettes à de fortes variations de composition,  le rapport et la quantité des constituants qui  sont nécessaires pour le rendement optimum  en riboflavine devront varier. Ces valeurs doi  vent être déterminées pour chaque nouvelle  quantité de la matière.  



  On peut prendre d'autres matières conte  nant de l'azote que la peptone, en particulier  après qu'elles ont été traitées par des acides,  des alcalis ou des enzymes.  



  Lors de la stérilisation, comme on l'a dé  crit ci-dessus, on ne doit pas faire durer le  traitement trop longtemps. On a en effet  constaté qu'à une température de 1200 C, une  durée de stérilisation plus longue que 30 mi  nutes a la tendance de réduire le rendement  en riboflavine parfois même dans une mesure  considérable.  



  On peut naturellement stériliser le milieu  alimentaire d'une autre manière, par exemple  au moyen d'un filtre     Seitz.     



       Exemple   <I>II:</I>  Dans chacune de 12 fioles coniques de  500 cm', on place     41/o    de glucose et une quan  tité telle de      corn        steep        liquor     que la teneur       de        celle-ci        en        matière        sèche        était        de        0,5%.     Dans une série de fioles coniques, on ajoute  du      tankage     non traité en quantités variant  de 0,25 à 0,75%, tandis que, pour les autres  séries,

   on employait du      tankage     qui a été  au préalable hydrolysé à l'aide d'un acide; les    quantités de celui-ci étaient les mêmes que  dans la série précédente.  



  L'hydrolyse par un acide a été réalisée  dans un autoclave par conservation de 10 g     5o           tankage     dans 50 cm' d'acide chlorhydrique  2 n pendant 30 minutes à 1200 C. Tous les  milieux sont portés à un pH de 6,5, tandis que,  dans chaque fiole conique, il y avait 100 cm'  de milieu.

   Le contenu des fioles coniques a été     5s     stérilisé de la manière indiquée à l'exemple I,       refroidi        et        ensemencé        au        moyen        de        1%        en        vo-          lume    d'une culture active     d'Ashbya        gossypii.     Après     secouement    pendant 8 jours à 290 C, on  a déterminé le rendement en riboflavine. Tous     6o     les essais sont faits en double.

   Les résultats du  tableau B donnent les moyennes des détermi  nations doubles. Ces résultats font voir la va  leur du      tankage     et également l'élévation de  la valeur par le traitement préalable au moyen     6s     d'un acide. Une hydrolyse conforme avec de  l'hydroxyde de sodium ou de la papaïne donne  également une amélioration notable du      tan-          kage ,    de même que d'autres substances ali  mentaires brutes contenant.de l'azote.<B>70</B>  
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     Il est, à remarquer ici de façon expresse  que les essais qui précèdent possèdent seule  ment une valeur comparative. Avec des ingré  dients d'une autre origine, on obtient non  seulement des rendements absolus différents,  mais toute l'image peut changer.

   Ainsi, il est  parfois possible avec, par exemple, de la  coin       steep        liquor     seule à côté du glucose d'arriver      à des rendements remarquables. Comme on  l'a déjà dit, des essais préalables sont tou  jours désirés avant qu'on puisse appliquer en  grand des substances alimentaires détermi  nées.  



  Bien que dans l'exemple qui précède on       ait        pris        4%        de        glucose,        on        peut        employer        des     hydrates de carbone à une concentration de  0,5 et plus; il faut à ce sujet. conserver toute  fois à l'esprit qu'en cas de petites quantités  de glucose, celui-ci sert principalement à la  croissance     de.l'organisme.    D'une manière gé  nérale, le rendement en riboflavine croît  d'abord avec la concentration de glucose et  cela jusqu'à environ     311/o    de glucose.

   Il n'est  en règle générale pas raisonnable de prendre       plus        de    4 à 5     %        de        glucose.        Les        chiffres        men-          tionnés    ci-dessus peuvent subir des modifica  tions par changement de l'aération; un rende  ment tout à fait intéressant peut même être  obtenu pour une concentration de glucose de  1 ou     211/o.    On peut donc dire qu'il est indiqué  de     maintenir    la concentration de glucose entre  1 à 2 et 4 à 5%.

   En dehors du glucose, on  peut employer aussi d'autres sucres assimi  lables, comme le saccharose et le maltose.  



  D'autres substances alimentaires qui favo  risent la synthèse de la riboflavine par     Ashbya          gossypii    sont les substances lipoïdes.  



  Différents sels inorganiques comme le car  bonate de calcium et le chlorure de calcium       en        quantités        de        0,1-1%        et        le        phosphate          monopotassique    à peu près dans les mêmes       quantités    élèvent également le rendement en  riboflavine. Il en est de même avec des oligo  éléments tels que le cuivre, le fer, le manga  nèse et le     zinc.    Toutes ces substances peuvent  être ajoutées lorsque les substances alimen  taires employées ne les contiennent pas ou pas  en quantités suffisantes.  



  L'aération est effectuée avantageusement  par de l'air stérile envoyé dans le mélange.  Il est à recommander de répartir l'air fine  ment, par exemple à l'aide de pierres poreuses,  de carborundum ou de tuyaux perforés. Il est  préférable également de secouer ou d'agiter  pendant l'aération. Le volume d'air peut     va-          rier        de        10    à     100        %        de        celui        du        milieu        par       minute.

   On donne la préférence à une quantité       d'air        d'environ        40        %        par        minute        du        volume     de la solution alimentaire.  



  La production de riboflavine peut avoir  lieu pour des pH du milieu de culture qui  sont compris entre environ 4 et 7 ou 7,5. Pour  les bas pH, la production était trop minime;  elle commence dans une mesure remarquable  lorsqu'on règle le pH initial du milieu à envi  ron 5,5 ou plus. On commence avantageuse  ment avec un pH d'environ 6,5. Au commence  ment, le pH descend jusqu'à environ 4,5 lors  qu'on commence avec un pH supérieur à       celui-ci;    dans la suite, le pH s'élève progressi  vement jusqu'à ce qu'une valeur finale entre  6,5 et 8 et même un peu plus soit atteinte.  



       Ashbya        gossypii    croît et synthétise la ribo  flavine à des températures comprises - glo  balement - entre 20 et<B>350</B> C, mais la tem  pérature maximum pour la synthèse est. en  dessous de celle pour la croissance. On ob  tient le rendement le plus élevé en règle gé  nérale pour les températures comprises entre  24 et 300 C. On maintient de préférence la  température à environ 26-300 C. Pour des  températures plus élevées, le rendement en  riboflavine diminue; des températures plus  basses ont moins d'influence sur le rendement,       mais    alors les temps qui sont nécessaires pour  obtenir les mêmes rendements deviennent plus  longs.  



  Le temps qui est nécessaire pour atteindre  une production optima de riboflavine varie  avec la température, la quantité et la nature  de la matière d'ensemencement, le degré  d'aération et la nature et la concentration des  substances alimentaires. En règle générale, la  quantité la plus grande de riboflavine se forme  après 96-144 heures.  



  La matière d'ensemencement peut être une  culture liquide en quantités de 0,5 à     101/o    en  volume; la préférence est donnée à 0,5 ou 1,0  à 2,0 0/0; par application de plus grandes  quantités, le rendement a une tendance à di  minuer. La vieillesse de la matière d'ense  mencement peut varier de un à plusieurs jours.  Cette     vieillesse    n'a pas beaucoup d'influence sur  le temps qui est nécessaire pour faire commen-           cer    la synthèse de la riboflavine, mais bien sur  l'allure de celle-ci. Des cultures plus vieilles  sont moins actives et agissent également pen  dant un temps plus court que les cultures  jeunes. L'expérience a montré que le mieux est  d'employer une culture vieille d'au plus trois  jours et de préférence vieille d'un jour.  



  Les chiffres mentionnés     dans    les exemples  font voir l'influence de quelques facteurs sur    la production de riboflavine par     Ashbya          gossypii.    Les rendements mentionnés ne sont  toutefois pas susceptibles d'être atteints de  faon optima. En tenant compte des modifi  cations indiquées dans la description pour  l'aération, la vieillesse de la matière d'ense  mencement, etc., on a obtenu par exemple les  rendements suivants en riboflavine; le temps  était de 7 jours.  
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Claims (1)

1. REVENDICATION: Procédé de préparation de riboflavine par biosynthèse, caractérisé en ce qu'on cultive de l'Ashbya gossypii en conditions aérobies, dans un milieu qui contient un hydrate de carbone assimilable et une matière albuminoïde brute d'origine naturelle ou les produits de dégra dation partielle d'une telle matière brute, et sépare la riboflavine produite. SOUS-REVENDICATIONS 1. Procédé suivant la revendication, carac térisé en ce que ledit milieu contient une matière albuminoïde brute d'origine végétale et une matière albumindïde brute d'origine animale. 2.

   Procédé suivant la revendication et la sous-revendication 1, caractérisé en ce qu'on emploie comme source d'albumine brute ani male, pour constituer ledit milieu, du bouil lon. 3. Procédé suivant la revendication, carac térisé en ce que ledit milieu contient de la peptone. 4. Procédé suivant la revendication et la sous-revendication 1, caractérisé en ce qu'on emploie comme source d'albumine brute ani- male, pour constituer ledit milieu, un extrait de viande concentré. 5. Procédé suivant la revendication et la sous-revendication 1, caractérisé en ce qu'on emploie comme source d'albumine brute ani male, pour constituer ledit milieu, une farine animale. 6.

   Procédé suivant la revendication et la sous-revendication 1, caractérisé en ce qu'on emploie comme source d'albumine brute végé tale, pour constituer ledit milieu, de l'eau de trempage de maïs, concentrée. 7. Procédé suivant la revendication, carac térisé en ce que ledit milieu contient en outre un lipide. 8. Procédé suivant la revendication, carac térisé en ce qu'on emploie comme hydrate de carbone assimilable du glucose. 9. Procédé suivant la revendication, carac térisé en ce que ledit: hydrate de carbone est présent en une quantité de 1 à 5 010. 10. Procédé suivant la revendication, carac térisé en ce que ladite matière albuminoïde ou lesdits produits de dégradation sont présents en quantités de 0,25-2 0/0. 11.

   Procédé suivant la revendication, ca ractérisé en ce que la température du milieu pendant la culture est maintenue entre 20 et 350 C. 12. Procédé suivant la revendication et la sous-revendication 11, caractérisé en ce que la température du milieu pendant la culture est maintenue entre 26 et 300 C. 13. Procédé suivant la revendication, ca ractérisé en ce qu'on règle le pH du milieu de croissance à -une valeur comprise entre 5,5 et 7,5. 14. Procédé suivant la revendication et la sous-revendication 13, caractérisé en ce qu'on règle le px du milieu de croissance à une va leur de 6,5. 15.

   Procédé suivant la revendication, ca ractérisé en ce qu'on ensemence le milieu avec une culture liquide d' Ashbya gossypii, en quantités de 0,5-2%. 16. Procédé suivant la revendication et la sous-revendication 15, caractérisé en ce qu'on utilise une culture d'Ashbya gossypii âgée d'au maximum 3 jours. 17. Procédé suivant la revendication et les sous-revendications 15 et 16, caractérisé en ce qu'on utilise une culture d'Ashbya gossypii âgée d'un jour.