CH268688A - Procédé pour la préparation de la streptomycine. - Google Patents

Description

  Procédé pour la préparation de la streptomycine.  
EMI0001.0001     
  
   
EMI0001.0002     
  
       Les préparations A,     Bl    et Al, aussi     bien     que la préparation B, sont aptes à fournir,  après traitement;     subséquent,    de la strepto  mycine sous une forme fortement purifiée ou  sensiblement pure.  



  La     nature    de l'acide employé ne doit pas  avoir un effet qualitatif 'sur l'extraction, et  des acides inorganiques (entre autre l'acide  chlorhydrique et l'acide sulfurique) et. des  acides     organiques    (par exemple l'acide citri  que) peuvent être utilisés; cependant, les  acides citrique et sulfurique (ce dernier spé  cialement) sont préférés, parce qu'ils facilitent  la filtration des extraits. L'extraction à l'acide  de la streptomycine peut aussi être effectuée  à     diverses    valeurs de pH, l'extraction à     -Lus    pH  dé 5,6 ou 1,1, par exemple, ayant     fuse    pleine  efficacité.

   En général,     l'activité    de l'extrait       augmente    au fur et à mesure de la diminution  du pH, l'extraction à un pH d'environ 1 à 3  (spécialement à un pH d'environ 1,5-2) étant  préférée.  



  La     durée    requise pour l'extraction de la  streptomycine à partir des solides dépend de  la température de l'extraction; par exemple,  en général, plus la température est élevée,       moins    il faut de temps. Ainsi, l'activité obtenue  par extraction à<B>500</B> C pendant une heure est  presque deux fois celle obtenue par extraction  à la température ambiante pendant 18 heures.  Une     courte    extraction (par exemple     d'environ     1/2 à 3 heures) à une température relativement  élevée (par exemple     d'environ    45 à<B>550</B> C) est  préférée du point de vue du rendement en  produit antibiotique.  



  Les exemples suivants vont illustrer l'in  vention. L'unité de potentiel mentionnée est  définie par la     quantité    de streptomycine né  cessaire pour inhiber complètement la multi  plication de 500-1000 cellules de K.     pneu-          moniae,    dans des conditions standardisées et  dans un milieu de culture contenant     111/o    de       tryptone.     



       Exemple   <I>1:</I>  1800 litres d'un milieu aqueux contenant       1,5%        de        farine        de        soja,        1,0%        de        dextrose,          0,5        %        d'extrait        de        viande        et        0,

  5        %        de        chlorure       de sodium sont placés dans un bac de  6000 litres et ensemencés avec des spores       d'Actinomyces        griseus,    et le milieu est soumis  à une incubation à<B>250</B> C sous une pression de  50 à 75 cm (air passant à travers le milieu),  tout en agitant (à une vitesse de 130     t/min.).     



  Au bout de 120 heures d'incubation, la cul  ture (qui a un<B>pH</B> de 7,0 et un potentiel de  120     unités/ml.)    est ajustée à un pH de 3,5 en       ajoutant        de        l'acide        chlorhydrique    à     37%,        et     la culture acidifiée est agitée pendant mie  nouvelle période de 48 heures à<B>50</B> C (sans  aération). La culture (dont le potentiel a été  élevé, par ce traitement, à 173,5 unités/ml.)  est centrifugée; la fraction qui surnage (I) est  utilisée pour en extraire la streptomycine.  



  D'autre part, le sédiment     (mycelium,    spores  et autres solides dans le milieu) recueilli est  lavé deux fois à l'eau distillée par centrifu  gation. Les solides lavés sont alors traités avec  de l'acide chlorhydrique N/10 (qui a été réglé  à un pH 2,0 avec de l'hydroxyde de sodium)  en secouant le mélange pendant 16 heures à  la température ambiante (24o C); l'extrait  (II) est séparé par centrifugation. L'extrac  tion récupère 20 unités     d'activité    par mg de  solides secs (séchés à<B>1000</B> C) et une nouvelle  extraction portant, sur les solides dans les  mêmes conditions (extrait III) récupère en  core 5 unités     supplémentairés    par mg. de so  lides secs.

   Ces extraits (II et III) peuvent être  traités à part pour en récupérer la strepto  mycine, ou ils peuvent être combinés avec la  fraction I obtenue à partir de la même cul  ture. Ces liquides peuvent encore être traités  selon les méthodes de purification décrites  ci-après, pour obtenir la streptomycine sous  une forme très purifiée ou sensiblement pure.  



  Le liquide contenant la streptomycine est.  neutralisé, et celle-ci est alors purifiée comme  suit  1  Traitement de l'extrait neutralisé avec.  un charbon     activé,    qui adsorbe sélectivement  la streptomycine.  



  2      Elution    de la streptomycine du char  bon, avec de l'acide chlorhydrique dilué, à en  viron<B>700</B>     C.         3  Traitement de     l'Éluat    avec de l'acide       phosphotungstique.     



  4  Décomposition fractionnée du     phospho-          t.ungstate    précipité avec de l'hydroxyde de  baryum.  



  La solution de streptomycine partiellement  purifiée ainsi obtenue (ou le solide obtenu à  partir de cette solution par séchage par con  gélation) peut être utilisée comme agent     chi-          miothérapeutique    sans nouvelle purification,  ou peut être purifiée à nouveau comme indiqué  ci-après. En utilisant un extrait ayant un po  tentiel de 220 unités/ml., on peut obtenir un  produit séché par congélation ayant un poten  tiel de 345 unités/mg.  



  Ce produit partiellement purifié peut être  purifié à nouveau     par:     1  Réaction du produit. avec de l'acide pi  crique dans une solution aqueuse.  



  2  Dissolution dans l'acétone du picrate  résultant de la réaction.  



  3  Passage de la solution à travers une co  lonne d'adsorption     chromatographique    à alu  mine activée.  



  4      Elut,ion    des parties riches en strepto  mycine du chromatogramme avec de l'acétone  aqueux.  



  5  Décomposition de     1.'éluat    avec de l'acide  sulfurique.  



  6  Séparation de l'acétone et de l'acide pi  crique du sulfate de streptomycine.  



  On peut ainsi préparer, à partir de la strepto  mycine obtenue conformément à l'invention,  un sulfate de streptomycine fortement purifié,  ayant un potentiel de 490 unités/mg; ce sul  fate peut être utilisé comme agent     chimio-          thérapeutique    sans nouvelle purification, ou  transformé en base libre en vue de son emploi,  ou encore il peut être purifié à nouveau comme  indiqué ci-après.  



  De ce sulfate fortement purifié, on peut  obtenir un dérivé cristallisé par réaction avec  un sel de     Reinecke    dans une solution aqueuse  et, par récupération, du     Reineckate    pur cris  tallisé (groupes de folioles fines ayant un po  tentiel de 240     unités/mg    et se décomposant à  159-1610C [non corrigé] ).

   Une analyse du       Reineckate    cristallisé (après séchage dans le    vide à     700C    pendant deux heures) révèle la       présence        de        27,09%        de        carbone,        4,65%        d'hy-          drogène,        21,431)/o    d'azote,     20,821/o    de soufre  et 8,53% de chrome.  



  De ce     Reineckate    cristallisé pur, on peut  obtenir la base sensiblement pure et les déri  vés de la streptomycine par  1  Décomposition du     Reineekate    avec du  sulfate d'argent en solution aqueuse.  



  2  Séparation du     Reineckate    d'argent pré  cipité.  



  3  Récupération du sulfate de strepto  mycine sensiblement pur résultant de la ré  action.  



  Le sulfate sensiblement pur ainsi obtenu  peut être utilisé comme agent     chimiothérapeu-          tique,    ou peut être transformé en base libre  sensiblement, pure, ou peut encore être trans  formé en divers autres dérivés sensiblement  purs de la streptomycine.  



  <I>Exemple 2:</I>  1800 litres d'un milieu aqueux contenant       1,5%        de        farine        de        soja,        1,0%        de        dextrose        et          0,

  5%        de        chlorure        de        sodium        sont        placés        dans     un bac de 6000 litres et     ensemencés    avec un  mélange de spores et de     mycelium        d'Actino-          myces        griseus,    puis le milieu ensemencé est,  soumis à une incubation à 25  C sous une pres  sion de 50-75 cm (de l'air passant à travers  le milieu) tout en agitant (à une     vitesse    de  130 t/min.).  



  Au bout de 100 heures d'incubation, une       portion    de<B>100</B> ml. de culture (qui a un po  tentiel de 27,6 unités/ml.) est ajustée à un     px     de 3,5, en ajoutant' de l'acide chlorhydrique  à     371/o,    et la. culture acidifiée est agitée pen  dant 24 heures à 40 C. La culture (dont le  potentiel est élevé, par ce traitement, à 38,6  unités/ml.) est centrifugée, et la fraction qui  surnage est utilisée pour en extraire la strepto  mycine.  



  Le reste de la culture est centrifugé. La  fraction qui surnage est utilisée pour en  extraire la streptomycine. Le sédiment est  recueilli et lavé avec deux portions d'un litre  d'eau distillée, par centrifugation. (Les eaux  de lavages ont. un potentiel inférieur à 4,5 uni-      tés/ml., et peuvent être écartés pour cette rai  son.) On ajoute un litre d'eau distillée au  sédiment lavé, et le mélange est agité pour for  mer une bouillie     lourde    homogène, contenant       environ    3,7 mg de solides par     ml.     



  Une portion de 100     ml.    de la bouillie lourde       ainsi    obtenue est ajustée à un pH de 0,8 en  ajoutant de l'acide chlorhydrique 5N, et le  mélange est agité à la température ambiante  (240 C) pendant     environ    16 heures (le<B>pli</B>  étant, alors 2,4). Le mélange est ensuite     cen-          trifugé    pour obtenir un sédiment et     une    frac  tion qui surnage (dont le     potèntiel    est de  88     Lmités/ml.)    ; la fraction qui surnage est       utilisée    pour en extraire la streptomycine.  



  Dans des conditions, par ailleurs identi  ques, des extractions à des pH de 5,0 à 5,4,  3,1 à 3,9 et 1,1 à 1,22 donnent des fractions  qui surnagent (extraits) dont le potentiel est  de 35-59, 67 et 72     unités/ml.    respectivement.  



  Le sédiment obtenu comme indiqué ci-des  sus est mis à nouveau en suspension dans une  quantité d'eau distillée suffisante pour rame  ner son vol-Lune à 100 ml.; la suspension est  ajustée à     im        pg    de 2,55 en ajoutant de l'acide  chlorhydrique 5N, puis est agitée pendant  16 heures à la température ambiante.

   La por  tion     qui    surnage, obtenue par centrifugation,  a un potentiel de 35,5 unités/ml. et peut être  combinée avec l'extrait obtenu dans le para  graphe précédent, ou être traitée pour     elle-          même.    Les extraits combinés ont une     activité     totale de 6,175 unités, représentant une récu  pération de 33,1 unités par mg de solides sé  chés extraits.  



  La seconde extraction peut aussi être effec  tuée à     un        pg    de 5,62 ou 1,88 et, dans ces  cas, les portions qui surnagent (extraits) ont  des potentiels respectivement de 15,2 et  23,9 unités/ml.  



  D'autre part, une portion de 75 ml. de la  bouillie lourde mentionnée     puis    haut est ajus  tée à -un pH de 2 avec de l'acide     chlorhydrique-          5N,    et le mélange est agité à 500 C pendant  une heure. Le mélange est alors centrifugé; la  portion qui surnage, dont le potentiel est de  98,5     unités/ml.    (représentant une récupéra-    Lion de 26,5 unités par mg des solides séchés),  est traitée pour en récupérer la streptomycine.  



  Dans des conditions par ailleurs identi  ques, l'extraction pendant 18     heures    à 40 C et  <B>370</B> C donne des portions qui surnagent  (extraits) titrant<B>31,0</B> et 41,4 unités/ml. res  pectivement.  



  Enfin, une portion de 50 ml. de ladite  bouillie lourde est ajustée à un pH de 2,15 avec  de l'acide sulfurique<B>5N,</B> et le mélange est.  agité à<B>500</B> C pendant. une heure. Le mélange  est alors centrifugé, et la portion claire qui  surnage (extrait), dont le potentiel est de  96,2 unités/ml. (représentant une récupération  de 25,8 unités par mg de solides séchés), est  traitée pour en récupérer la streptomycine.  



  Dans des conditions par ailleurs     identi-          ques,        mais        en        utilisant,        40        %        d'acide        citrique     à la place de l'acide sulfurique<B>5N,</B> l'extrac  tion donne une portion qui surnage ayant un  potentiel de 93,6 unités/ml.  



       Exemple   <I>3:</I>  3600 litres d'un milieu aqueux contenant       1,5%        de        farine        de        soja,        1,0%        de        dextrose,     0,25% d'extrait de viande et     0,51/o    de chlo  rure de sodium sont placés dans -Lui bac de  6000 litres, et ensemencés avec un mélange de  spores et de mycélium     d'Actinomyces        griseus;     le milieu ensemencé est soumis à une incuba  tion à 250 C sous une pression de<B>50-75</B> cm  (de l'air passant à travers le milieu) tout en  agitant (à 130 t/min.).  



  Au bout de 120 heures d'incubation, la cul  ture (qui a un potentiel de 55 unités/ml.) est  ajustée à un p$ de 1,5 en ajoutant de l'acide       sulfurique    à     1000%;        on.        ajoute        4%        de        terre        de          diatomées        et        1%        d'un        charbon        activé;        ensuite     le mélange est agité à la température ambiante  pendant une demi-heure à une heure.

   La cul  ture (dont le potentiel s'est élevé, par ce     trai-          tement,        d'environ        60    à     70%)        est        centrifugée;     la portion qui surnage est traitée pour en  récupérer la streptomycine.  



  Lors de l'extraction avec de l'acide chlor  hydrique à -Lui     pA    inférieur à 3, la portion qui  surnage (extrait) peut être extrêmement trou  ble; dans ce cas, l'extrait peut être clarifié en      ajustant son pH à environ 3,5, en ajoutant de  l'hydroxyde de sodium 5 N et en séparant par  filtration le précipité lourd et floconneux qui  en résulte (des protéines de soja     probable-          i         ent)    .

Claims (1)

1. REVENDICATION Procédé pour la préparation de la strepto mycine, caractérisé en ce qu'on fait une cul ture d'Actinomyces griseus pour produire de la streptomycine, en ce qu'on soumet les solides de cette culture à une extraction avec un acide aqueux, et en ce qu'on récupère la strepto mycine de l'extrait. SOUS-REVENDICATIONS 1. Procédé selon la revendication, caracté risé en ce qu'on acidifie la culture, en ce qu'on amène en contact intime les constituants solides et: liquides de cette culture, en ce qu'on sépare la fraction solide de la fraction liquide, et en ce qu'on récupère la streptomycine de cette dernière. 2.

   Procédé selon la revendication, caracté risé en ce qu'on sépare les solides de la culture, en ce qu'on les soumet à une extraction avec un acide aqueux et en ce qu'on récupère la streptomycine de l'extrait. 3. Procédé selon la revendication et la sous-revendication 2, caractérisé en ce qu'on utilise de l'acide sulfurique aqueux. 4. Procédé selon la revendication et la sous-revendication 2, caractérisé en ce qu'on utilise de l'eau acidifiée à un pH compris entre 1 et.<B>3</B>. 5. Procédé selon la revendication et la sous-revendiea.tion 2, caractérisé en ce qu'on effectue l'extraction à une température com prise entre 45 et<B>550</B> C. 6.

   Procédé selon la revendication et les sous-revendications 2 et 5, caractérisé en ce qu'on effectue l'extraction pendant une pé riode comprise entre 30 minutes et 3 heures. 7. Procédé selon la revendication et les sous-revendications 2 et 4, caractérisé en ce qu'on utilise de l'eau acidifiée à un<B>pH</B> com pris entre 1,5 et 2. 3. Procédé selon la revendication et les sous-revendications 2, 4 et 7, caractérisé en ce qu'on utilise de l'eau acidifiée avec de l'acide sulfurique. 9. Procédé selon la revendication, caracté risé en ce qu'on sépare les solides de la culture, en ce qu'on les lave avec de l'eau, en ce qu'on soumet les solides lavées à une extraction avec un acide aqueux et en ce qu'on récupère la streptomycine de l'extrait. 10.

   Procédé selon la revendication, carac térisé en ce qu'on amène les solides de la cul ture en contact intime avec un acide aqueux, en ce qu'on sépare les solides dudit acide aqueux, et en ce qu'on récupère la strepto mycine de cet acide aqueux.