CH294394A

CH294394A - Färbeflüssigkeit für tierisches Gewebe.

Info

Publication number: CH294394A
Authority: CH
Inventors: Inc Technicon Chemical Company
Original assignee: Inc Technicon Chemical Company
Priority date: 1950-05-02
Filing date: 1950-05-02
Publication date: 1953-11-15

Description

Färbeflüssigkeit für tierisches Gewebe.

Die Präparierung von Gewebestücken für die mikroskopische Untersuchung erfordert eine Reihe von Behandlungen, bevor die Schnitte auf dem Objektträger montiert werden. Insbesondere müssen die Gewebe stiieke nacheinander in verschiedene Bänder eingetaucht werden, und zwar zum Fixieren des Gewebes, zum Auswaschen des Fixiermittels, zum Entwässern des Gewebes, bei spielsweise durch Eintauehen in Alkohol oder andere Entwässerungsmittel ; dann muss das Gewebe mit einem Klärungsmittel behandelt und mit einem Einbettungsmittel imprägniert werden. Nach dieser vorbereitenden Behandlung wird das Gewebe in Scheiben der ge wünschten Stärke geschnitten und aus den Schnitten das Einbettungsmittel, z. B.

Paraffin, mit einem Losungsmittel entfernt, worauf die Schnitte auf dem Objektträger gefärbt werden.

Für basophiles Material von tierischen und menschlichen Gewebeschnitten ist Hämatein (oxydiertes Hämatoxylin) der gebräuch- liche Farbstoff. Es wurde gefunden, dass be sonders gute Resultate erzielt werden, wenn die Färbeflüssigkeit ausser einem Farbstoff ein Beizmittel enthält und die genannten beiden Komponenten in dem Mengenverhältnis zugegen sind, welches dem ihrer Äquiva- lentgewichte entspricht. Im Gegensatz dazu enthalten die bereits bekannten Lösungen das Beizmittel in einer Menge, die das 12-bis 25fache des Farbstoffes beträgt.

Gegenstand der Erfindung ist somit eine Färbeflüssigkeit für tierisches Gewebe, ins. besondere für die mikroskopische Unter suchung von Gewebesehnitten, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Farbstoff und mindestens ein Beizmittel enthält. und zwar in dem Mengenverhältnis, das den Äquivalentgewiehten der beiden Komponen- ten entspricht.

Insbesondere im Fall der Verwendung von Hämatein als Farbstoff enthält die Färbeflüssigkeit zweckmässig ausserdem ein Anti oxydationsmittel, um die Oxydation des Hämateins zu verhindern. Vorzugsweise dient das verwendete Antioxydationsmittel zugleich als Träger bzw. Lösungsmittel für das Hämatein. Es ist ferner vorteilhaft, der Färbe ffüssigkeit einen Puffer mit einem pH = 3 beizufügen, wodurch die Annahme der Färbung druch das Gewebe gefördert wird. Es wurde experimentell festgestellt, dass gerade der pH-Wert von 3 der Färbeflüssigkeit eine be- sonders hohe Stabilität verleiht, wodurch sie längere Zeit vervendungsfähig bleibt.

Zur Herstellnng einer Hämatein als Farbstoff enthaltenden Färbeflüssigkeit werden vorzugsweise folgende Komponenten verwendet : Hämatoxylin, C16JH14O6 (mol-Gew. 356, 16) 0, 015 Mol 5,3527 g Kaliumaluminiumsulfat, AlK (SO,) 2. 12 H2O (Mol-Gew. 474, 37) 0, 0075 Mol 3, 5577 g Kaliumpermanganat, KMnO4 (Mol-Gew. 158, 03) ) 0, 010 Mol 1, 5803 g Monokaliumphthalat, KHCsH4O4 (Mol-Gew. 204, 2) 0, 05 Mol 10, 210g Diäthylenglykol, C4H103 250, 0 cm3 Salzsäure, In-HCl-Lösung 69, 7376 cm3 Destilliertes Wasser ad 1000, 00 em3
In diesem Beispiel wird Kaliumaluminium- sulfat als Beizmittel verwendet, doch können auch andere übliche Beizmittel, z. B. Chrom trioxyd, verwendet werden.

Das Kaliumpermangantat dient als Oxyda tionsmittel zur Überführugn des Hähnatoxylins in Hämatein, doch können auch andere Oxydationsmittel, z. B. Natriumkaliumpermanganat, für diesen Zweek verwendet werden.

Diäthylenglykol wirkt zugleieh als Anti oxydationsmittel und als Lösungsmittel für den Farbstoff.

WIonokaliumphthalat und Salzsäure wirken zusammen als Puffer, es können aber auch andere Puffersubstanzen verwendet werden.

Als Verdünnungsmittel ist frisch destilliertes Wasser zu bevorzugen. Wurde es einige Tage vor der Verwendung hergestellt, soll es zum Austreiben von möglicherweise absorbiertem Kohlendioxyd gekocht werden.

Die erwähnte Färbeflüssigkeit ist durch folgende Eigensehaften charakterisiert : chemisehe Beständigkeit, selektives und spezifisches Färbevermögen, Zuverlässigkeit in der Pärbewirkung ohne Differenzierung, das heisst ohne Überfärbung und, Unterfärbung.

Möglichkeit der Standardisierung der genannten Eigenschaften. Demzufolge sind die Eigenschaften in versehiedenen Bädern, welche zu versehiedenen Zeiten hergestellt werden, wiederholbar, und diese Eigenschaften bleiben alle während der gesamten nützlichen
Lebensdauer der Losungen unverändert be stehen.

Mit dieser Färbeflüssigkeit lassen sich verschiedene Zellbestandteile des Gewebes selektiv färben, z. B. die parietalen und zymo- genen Zellen der Magenschlienahaut.

Ferner kann die Färbeflüssigkeit ohne
Zuhilfenahme von versehiedenen Fixierugs bedingungen als quantitativer Inclikator von basophilen und aeidophilen Verhältnissen dienen.

Von wesentlieher Bedeutung ist, class der
Farbstoff, das Hämatein, und das Beizmittel, das Kaliumaluminiumsulfat, im Verhältnis ihrer Äquivalentgewichte zugegen sind. Da druch wird einerseits das selektive und spe zifische Färbevermögen und anderseits eine weitgehende Stabilität des Beizmittels in der
Lösung bewirkt und damit die nachteilige
Bildung von Niederschlagen vermieden. In folge der Stabilität des Beizmittels wird eine gleiehmässige Beizwirkung erzielt, und zwar während der ganzen Lebensdauer der Farb lösung, dies ist bei Lösungen, bei denen fortgesetzt Ausfällungen des Beizmittels erfol gen, keineswegs der Fall.

Das als Oxydationsmittel verwendete Ka liumpermanganat wird im Verhältnis von
2MolEMnOzu3MolHämatoxylinCigHuOs zugesetzt, so dass entsprechend der Reaktion : 3 C16H14O6 + 2KMnO4 = 3 C16H12O6 + 2 MnOO + 2 KOH + 2 H20 die Gasamtmenge des verfügbaren Hämatoxy- lins in Hämatein übergeführt wird. Demzufolge hat die Lösung eine maximale Farte- kraft in bezug auf die Menge des verwendeten Hämatoxylins. Die Färbeflüssigkeit liefert gleichmässige Färbungen, weil sie im Gegen- satz zu naeh bisher üblichen Vorschriften bereiteten Lösungen kein nieht oxydiertes Hämatoxylin enthält, etwa zufolge zu lang- samer Oxydation.

Da Hämatein der wirksame Farbstoff ist. so ist die vollständige ITmwand- lung des Hämatoxylins zu Hämatein eine we sentliche Bedingung für die Standardisierung der Färbeflüssigkeit. Die vollständige Umwandlung des Hämatoxylins in Hämatein hat ferner den Vorteil, eine Oberflächenoxyda- tion und Sehaumbildung zu verhindern. Kaliumpermanganat bietet als Oxydationsmittel den Vorteil, dass es im Gegensatz zu manehen andern Oxydationsmitteln keine Beizeigen- schaften besitzt. Die Verwendung eines Oxydationsmittels, welches eine zusätzliche Beizwirkung ausübt, würde den heiklen Ausgleich dieser Funkeion stören.

Es zeigte sich, dass die Eigenschaften der Färbeflüssigkeit durch den Zusatz eines nieht flüchtigen Losungsmittels beträchtlich verbessert werden können ; ferner wird das Eindringen der Färbelösung in die Gewebeteile er leichtert, wenn die Färbeflüssigkeit hygroskopisch wirkt. Dadurch wird eine Konzentration der Färbelösung an der Oberfläche verhindert und die Bildung von Oberflächenschaum aus andern Ursachen als der stattfindenden Oxydation verunmoglieht. Diäthylenglykol ist ein Losungsmittel, welches den genannten Anforderungen voll entspricht. Zudem bietet Diäthylenglykol den weiteren Vorteil, als Antioxydationsmittel zu wirken.

I) er Zusatz eines Puffers erfüllt zwei wiehtige Funktionen, nämlich die Erhaltung des für die Stabilitä der Losung und für ein optinales Färbevermögen geeigneten PH-Wertes. Dies soll nicht besagen, dass der richtige pH-Wert allein ausreichend ist. Die richtige Ionenkonzentration bei einem gegebenen pH Wert ist ebenfalls wichtig. Hat der Puffer eine zu hohe Konzentration, so können die chemischen Bestandteile des Gewebes nicht in geeigneter Weise mit der Färbelosung rea- gieren.

Dies ist wichtig, weil eine Hämatoxy- linlösung auf Gewebe nicht sofort die ge wünschte Färbung liefert, sondern, zunächst in einen unlösliehen Lack des gewünschten Farbtons übergeführt werden muss, was wiederum von der Art des Beizmittels abhängig ist, da Hämatoxylin ein polygenetischer Bei zenfarbstoff ist. Daher ist der richtigepn- Wert und die richtige Ionenkonzentration des Puffers für die gleichmässige Bildung eines konstanten Farbwertes wiehtig. Zweickmässig wird hierfür ein Alkali von konstantem Wert verwendet. Leitungswasser ist zu vermeiden, da es den Nachteil einer veränderliehen Alka linität aufweist.

Als Träger wird am besten destilliertes Wasser verwendet, weil es ein ge meinsames Losungsmittel für alle Bestandteile darstellt und zudem ein Medium ist, in dem die Ionenbeweglichkeit befriedigend ist.

Zur Herstellung einer Färbeflüssigkeit der genannten Art werden zunäehst Hämat oxylin und Kaliumaluminiumsulfat getrennt in kleinen Mengen destilliertem Wasser destilliertem löst, die beiden Lösungen vermiseht und das Ganze auf 300 cm3 mit destilliertem Wasser ergänzt. Diese Lösung wird 20 Minuten ge- kocht und dann der Abkühlung überlassen.

Der Einfachheit halber soll sie mit A bezeiehnet werden.

Das Kaliumpermanganat wird in destilliertem Wasser aufgelöst, zu 150 cm3 ergänzt und allmählieh unter ständigem Umrühren der Lösung A beigefügt. Hierbei erfolgt, wie oben erwähnt, die Oxydation des Hämatoxylins. Die erhaltene Farblösung wird mit B bezeichnet.

Diäthylenglykol wird unter ständigem Umrühren der Lösung B allmählich zugesetzt.

Die erhaltene Losung wird mit C bezeichnet.

Zu dieser Lösung C werden die Puffersub- stanzen, Monokaliumphthalat und Salzsäure, nacheinander gegeben, wobei das Phthalat zu nächst unter ständigem Umrühren in destilliertem Wasser aufgelöst wird. Nach dem Abkühlen des Ganzen auf Zimmertemperatur wird das Volumen mit destilliertem Wasser auf 1000, 00 cm3 ergänzt. Es ist zweck- mässig, die fertige Färbelösung eine Stude umzurühren.

Nach dem Färben des basophilen Materials der Gewebeschnitte kann eine andere Färbelösung, gewöhnlich eine Eosinlösung, zum Färben des aeidophilen Materials oder des Cytoplasmas verwendet werden. Bisher wurden in der histol9igischen Technik Lösungen mit einem Mindestgehalt von 0, 5 bis 1, 0 O/o Eosin verwendet, und es wurden oft höhere Konzentrationen verwendet, weil gewöhnlieh angenommen wird, dal3 eine grössere Menge Farbstoff für einen starken Farbeffekt-not- wendig ist. Dies ist keineswegs zutreffend, weil eine gute Färbung nur unter geeigneten Bedingungen erreicht werden kann.

Für eine Färbelosung gemäss der Erfin ding, welche als Farbstoff Eosin enthält, wird vorzugsweise eine Kombination von Beizmitteln verschiedener Art mit der Fähigkeit, Doppelfarblacke zu liefern, verwendet. Geeigente Beizmittel sind Calciumacetat und Chromtrioxyd, doch können auch andere Beizmittel verwendet werden. Der gebildete Doppelfarblack hat den Vorug, am. Gewebe besser zu haften als ein einfacher Farblack. Cal ciumacetat wirkt als Beizmittel in der ersten Phase, das heisst bei der Kondensation des Eosinmoleküls mit dem Beizmittelmolekül.

Das Chromtrioxyd hat ebenfalls eine Beizwir kung. doch wird es hauptsächlich wegen der Oxydationswirkung verwendet. Es ist vorteilhaft, der Eosinlösung ein Quellmittel beizugeben, z. B. Harnstoff, um das Eindringen des Färbemittels in das Gewebe zu erleich- tern. Ferner ist auch der Zusatz eines Netz- mittels, z. B. Natriumdioktylsulfouschnt, vorteilhaft. Als Puffer werden vorzugsweise Monokaliumphosphat nnd Dinatriumphosphat verwendet, wobei der pH-Wert der Eosinlösung 6 beträgt.

Eine bevorzugte Zusammensetzung einer solchen Eosin-Farbeflüssigkeit ist die fol zende : Eosin (Natrium-Tetrabromfluoresecin), C20H6O5Br4-Na2, Farbreinheit 91% G, 0015 Mol 1, 0989 g Caleiumacetat, Ca (CH3COO)2. H2O 0,00075 Mol 0, 1321 Chromtrioxyd, Crois 0, 00075 Mol 0, 0750 g Monokaliumphosphat, KH2PO4 0,01 Mol 1, 3620 g Dinatriumphosphat, Na2HPO45. 7 H2O 0, 6166 g Harnstoff, NH2. CO. NH2 3,000 g Natriumdioktylsulfosuccinat, 5%ige wässerige Lösung 1, 0 CM3 Destilliertes Wasser ad 1000, 00 em3
Die Losung wird z.

B. wie folgt herge- stellt : Die genannten Bestandteile werden getrennt in kleinen Mengen dest. Wassers ge- lost. Die Eosinlosung wird vorsichtig 25 Minu- ten gekocht, wobei destilliertes Wasser zum Ausgleich des Verdampfungsverlustes, jedoch nicht über ein Volumen von 150 cm3 zugesetzt wird. Dann wird die Caleiumaeetatlösung zu- gegeben und die Mischung weitere 2 Stunden gekocht, wobei gegebenenfalls destilliertes Wasser zur Erhaltung des Volumens von 150 em3 zugefügt wird. Naehdem die Losung auf 60 C abgekühlt ist, wird das Chromtrioxyd allmählieh unter Umrühren zugesetzt.

Nachdem die Losung etwa eine Stunde gestanden ist, wird Zlonokaliumphosphat unter I7mrühren zugefügt und dann Dinatrium- phosphat. Zu der auf 40 C abgekühlten Losung wird nacheinander Harnstoff und das Netzumittel in genannter Reihenfolge unter ständigem Rühren zugefügt. Zu der auf Zim- mertemperatur abgekühlten Lösung wird schliesslich bis zum Volumen von 1000 cm3 destilliertes Wasser zugesetzt.

Zum Entfernen des Paraffins aus dem Gewebe und zum Färben der Sehnitte wird vorzugsweise der unter dem geschützten Namen Autotechnicon im Handel erhältliche automatische Tauchapparat verwendet, der z. B. im USA-Patent Nr. 2341198 von Edwin C.

Weiskopf beschrieben ist.

Bei der Behandlung der Gewebestüeke zur Entfernung des Paraffins und zum Färben der Sehnitte wurden bisher niedrige Alkohole, z. B. Äthanol, dazu verwendet, das als Losungsmittel für das Paraffin verwendete Xylol zu entfernen und vom Gewebe den übersehüssigen Eosinfarbstoff auszuwaschen.

Alkohole haben jedoch nachteilige Eigen schaften. Sie wirken entfärbend, da sie an scheinend durch chemische Aktivität einen Teil der acidophilen und in manchen Fällen aueh der basophilen Färbung vom Gewebe entfernen. Ihre Hygroskopizität führt zur Attfnahme von Wasser aus der Atmosphäre und damit zu einer Verdünnung. Äthylalkohol verdunstet bei Zimmertemperatur rasch ; demzufolge haben die auf den Objektträgern montierten Schnitte die Neigung, mehr oder weniger auszutrocknen bei der Cberführung von einem in das andere Bad. Es wurde gefunden, dass die erwähnten Nachteile behoben werden können durch Verwendung von Di- äthylenglykol-monoäthylätheracetat für den genannten Zweek.

Dieses Losungsmittel hat den Siedepunkt 217, 5 C, so dass es nicht be reitss bei Zimmertemperatur verdunstet. Ferner ist es in jedem Verhältnis mit Wasser, Alkoholen un, d aromatischen Kohelenwasserstoffen misehbar und zudem nicht hygrosko- pisch.

Die Verwendung der besehriebenen Färbeflüssigkeiten wird nachstehend durch ein Beispiel illustriert.

Zur automatischen Durchführung der Eintauchoperationen wird der erwähnte Autotechnieon -Apparat verwendet. Lösungsmittel F bedeutet im folgenden Diäthylenglykol- monoäthylätheracetat.

Die 12 Becher des Autotechnieon -Appa- rates sind an den angegebenen Stellen angeordnet und enthalten die genannten Flüssigkeiten. Die Zeitdauer des Eintauchens ist in minutez angegeben.

Stellung
Behandlungs- Behandlungs der flüssigkeit ziet
Bechers
1 Xylol, rein 2 Min.

2 Lösungmittel F, rein 2 (fur mit Queeksilber eblorid fixiertes Gewebe wird der Lösung 0, 25 /o
Jod zugesetzt)
3 Lösungsmittel F, rein 2
4 Destilliertes Wasser 2 5 Farbefliissigkeit 5 (Hämateinlösung)
6 Destilliertes Wasser 4 7 0, 01 n-Lösung von
Lithiumearbonat 2
8 Destilliertes Waaser 4 ') Färbeflüssigkeit 5 (Eosinlosung)
10 Losungsmittel F, rein 5
11 Lösungsmittel F, rein 5
12 Losungsmittel F, rein 5
Die vom Apparat abgenommenen Schnitte werden schliesslich 5 Minute in einen Becher mit Xylol gelegt.

Die Barder werden zweckmässig wie folgt ausgeweellselt : a) Xylol b) Losungsmittel F in Becher 2 und 3 c) Destilliertes Wasser in Becher 4, 6, 8 d) Lithiumearbonatlösung in Becher 7 c) Lösungsmittel F in Becher 10, 11, 12 f) Färbelösungen in Becher 5 und 9
Die praktische Verwendungsdauer der Bäder wird dureh den Umfang der einschlä gigen Laboratoriumsarbeiten bestimmt.

Claims

jede Woeche alle 10 bis 20 Tage nach jeder Serie von Schnitten alle zwei Wochen alle zwei Wochen wird Becher 10 herausgenommen, die Becher 11 und 12 um eine Stelle zurück versetzt und der mit frischer Lösung gefüllte Becher 10 an Stelle 12 eingesetzt. diese können etwa 4 Monate dauernd verwendet werden, ohne irgendwelcher Wartung zu bedüfen, PATENTANSPRUCH : Färbeflüssigkeit für tierisches Gewebe, insbesondere für die mikroskopische Unter- suehung von Gewebeschnitten, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Farbstoff und mindestens ein Beizmittel enthält, und zwar in dem Mengenverhältnis, das dem Aquiva- lentgewicht der beiden Komponenten entspricht.

UNTERANSPBÜCHE : 1. Färbeflüssigkeit nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Farbstoff Hämatein enthält.

2. Färbeflüssigkeit nach Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie ausserdem einen Puffer enthält, der ihr einen pua-vert von 3 erteilt.

3. Färbeflüssigkeit naeh Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie ausserdem ein Antioxydationsmittel enthält.

4. Färbeflüssigkeit nach Unteranspruch l, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit ein organisches Lösungsmittel in zur Lösung des Hämateins ausreichender Menge enthält.

5. Färbeflüssigkeit nach Unteranspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie Diäthylenglykol als organisches Losungsmittel enthält.

6. Färbeflüssigkeit nach Patentanspruch, dadureh gekennzeichnet, dass sie als Farbstoff Eosin enthält.

7. Färbeflüssigkeit nach Unteranspruch 6, dadureh gekennzeichnet, dass sie ausserdem einen Puffer enthält, der ihr einen pH-Wert von 6, 0 erteilt.

8. Färbeflüssigkeit nach Unteranspruch 6, dadureh gekennzeichnet, dass sie mehrere Beizmittel enthält.

9. Färbeflüssigkeit naeh Unteranspruch 1., dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung einen Puffer enthält, wobei die Ionenkon zentration derart gewählt wird, dass das Färben der Gewebe gefordert wird und die Lösung stabil ist.