Verfahren zur Herstellung eines Autibioticums. Die Erfindung bezieht sich auf ein V er fahren zur Herstellung eines neuen, als Endomyein bezeichneten, gegen Bakterien, Pilze und Hefen wirksamen Antibioticums.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist da dureh gekennzeichnet, dass Streptomy ces endus unter aeroben Bedingungen in einem flüssigen Nii.hrmedium kultiviert und das gebildete l:ndoiny ein isoliert wird.
Enclomyein wirkt in vitro germicid gegen eine grosse Anzahl von Bakterien und Pilzen, die im folgenden angeführt sind. Die in der Aufzählung angegebenen Zahlenwerte bedeu ten die in Verdünnungseinheiten je cm3 an gegebene Menge Endomycin, welche ausreicht, um das Wachstum des betreffenden Organis mus zu verhindern. Dabei ist die Verdün nungseinheit als die kleinste antibiotisch -irksaine Menge je cms definiert, welche das Wachstum von Torula utilis gerade noch ver hindert.
Ftert.gi Selerotinia fructicola 1-5 Torula utilis 1-5 hndoniyces magnusii 1-5 llvcoderma cereviseae 1-5 Candida albicans 5 C.
guilliermondi 25 Mierosporium canis 7,5 Triehophyton interdigitale \?5 T. rubrum <B>25</B> Microsporium audouini 25 Rhizoctonia solani 25 Glomerella eingulata 25 Macrosporium sarcinaeforme 25 Colletotrichum phomoides 25
Fusarium 1y copersici schwach 25 Bacterien Bacillus subtilis 5-10 B. cereus 1-5 Staphlococcus aureus 1-5 Corynebacteritml xerose 1-5 Listerella monocytogenes 1-5 Erysipelothria rhusiopathiae 1-5 Brucella abortus 19 1-5 B.
abortus 1028 1-5 Argobacterium tumefaciens 10 Mycobacterium tuberculosis 10-100 Streptocoeeus faecalis 10-100 Aerobaeter aerogenes 100 Eseherichis coli 100 Pseudomonas aeruginosa 100 Endoinycin ist bei einem pH-Wert von 7 oder mehr leicht wasserlöslich.
Bei einem pIi- Wert von 4,0 bis 6,0 ist es fast wasserunlös lich, während es bei einem pH-Wert von 2 oder niedriger wieder leicht wasserlöslich wird. Die MTasserlöslichkeit bei einem pH-Wert von 7 wird durch die Anwesenheit von 0,1 bis \?,01/o Natriumchlorid oder von Calcium- oder Magnesiumionen stark vermindert. Endomycin, das durch Zusatz von Natrium-,
Calcium- oder Magnesii-imionen aus Wasser gefällt wurde, löst sich nicht mehr leicht in Wasser, aber sehr leicht. in 50oloigem 1Iethylalkohol. In wasserhaltigem Butylalkohol ist, es viel besser löslich als in wasserfreiem.
Wässrige Lösungen von Endomycin haben ausgesprochene Netz- und Reinigungswirkung über den ganzen pH- Bereich. Wässrige Lösungen mit pH-Werten von etwa 7,0 bis 10,0 sind stabil, wenn sie in einem Autoklaven unter Druck auf 110 C erhitzt wurden. Der Organismus, der die netze antibiotisch wirksame Substanz produziert, wurde im Caehe River Valley, Illinois, aus dem Boden isoliert.
Sowohl der natürliche, im Boden gefundene; als auch der durch spontane oder induzierte Mutation dargestellte Organismus gehört so wohl strukturmässig als auch funktionell zu der allgemeinen Gattung Streptomyces. Seine Eigenschaften, auf die später noch näher ein gegangen wird, unterscheiden ihn von den in Bergey's Manual of Determinative Baete- riology, 6.
Auflage, Williams and Wilkins, Baltimore, 1948, angegebenen Arten. Der Or ganismus gleicht dem Streptomyces albus darin, dass er kein lösliches Pigment produ ziert; er unterscheidet sich aber von diesem dadurch, dass er Stärke hydrolysiert, Lakmus- mileh nach der Koagulation nicht peptisiert, eine saure Reaktion gibt und Gelatine nicht leicht verflüssigt, während Streptomyces albus die gegenteiligen Eigenschaften zeigt.
Der neue Organismus wurde als Streptomy ees endus bezeichnet..
Streptomyces endus ist. typisch aerob und wächst nicht unter anaeroben Bedingungen. Wenn er in einem günstigen Medium wächst, bildet sich ein Substratmy cel, das selbst keine bestimmte Eigenfarbe hat, aber die Farbe des Mediums annimmt. und ans sich ziemlich gerade verzweigenden Hyphen besteht. Am dritten Tag entwickelt sich ein weisses Luft- mycel, von dem aus seiner ganzen Länge nach und im rechten Winkel dazu Sporophoren wachsen.
Durch fortgesetztes Wachstum kommt es zu einer leichten Krümmung der Sporo- phoren, später zur Verdrehung und zur Bil dung von ausgeprägten Spiralen.
Die Sporo- phore nimmt im Durchmesser zu und ihre Teilung in Sporen beginnt. Mit dem Fort schreiten des -#Vaehstiims dunkeln die Sporen nach, die Spirale wird ;sehr fest und gleicht einer gewiekelten Feder, oft. mit 10 Sehleifen, so dicht gewickelt, dass beim Brechen der Spi ralen jede Windung einem Pfannkuchen ähn- lieh ist.
Die Sporenbildung beginnt im älteren Teil der Kolonie, und zwar oft schon dann, wenn der jüngere Teil am Rand noch wächst, so da.ss die weisse Oberfläche der Kolonie licht grau und später dunkelgrau wird. In alten Kulturen wird das Substratmyeel schwarz und zerfällt. Das charakteristische makroskopisehe Merkmal einer Kultur von Streptomyces endus ist das Grauwerden des 3lycels.
Die junge periphere Hyphe hat einen Durchmesser von 0,7 bis 1,0 ,u., während die ältere Hyphe dicker ist (Durchmesser 1,25 bis 1,50,u). In reifen Teilen der Kolonie findet man auch Durchmesser von 2,0u.. Die Spi ralen messen im Durchmesser 3,5 bis 4,0 ,I < , mit einem offenen Zentrum von ungefähr 1,4 ,u. Die Sporen gehen nicht leicht ab; sie haben das Bestreben, an der Spiralform zu haften.
Folgende Kohlehydrate werden als Zusatz zu alkalischen Czapek-Nährböden, die keine andern Kohlenstoffquellen enthalten, rasch verbraucht: Stärke, Mannose, Dextrin, (Tlu- kose, Arabinose, Maltose und Lävulose. Gela tine und Asparagin können ebenfalls als Koh- lenstoffquelle verwendet. werden.
Spärliches Wachstum erfolgt bei Zusatz von Galaktose, Laktose, Zitronensäure, Bernsteinsäure, Ma leinsäure und Cellulose. Kein Wachstum tritt ein, wenn zum. Medium Rohrzucker, Sorbitol, Dulcitol, Inositol oder Paraffin beigefügt wer den.
Bei Verwendung von Czapelz's Säureag-ar mit Stärke als Kohlenstoffquelle wird nur ein spärliches Wachstum von Streptomyces endus erzielt.
Streptomyees endus koaguliert Lakmus- mileh, wobei saure Reaktion eintritt, aber ohne beobaehtbare Peptonisation von Protein. Es hydrolysiert Stärke sofort, während Gelatine sehr langsam und nur wenig verflüssigt wird.
Bei der Kultur von Streptomyces endus auf Ka.rtoffelschrägböden oder Kartoffel- l)extroseara.r wird gutes Wachstum bei stark zunehmendem Myeel und lichtgrauer Ober fläche erzielt.
Eine Kultur auf Emerson-Agar und Nähragar ergibt sehr gutes Wachstum mit baldiger Graufärbung und Sporulation. Bei Kulturen auf Trypton-CTlueose-A,ar und North's Gelatine-Agar erzielt man gutes Wachstum mit weissem Luftmycel, aber keine #piralbildung; demzufolge bleibt auch die Sporulation aus.
Streptomyces endus produziert nie lösli ches Pigment, weder im natürlichen Milieu noch in chemisch definiertem Medium.
Die Kultivierung des Streptomyees endus erfolgt vorzugsweise submers in einer Nähr lösung, die Kohlehydrate, eine Stiekstoffquelle und anorganische Salze enthält, und zwar bei einem PH-Wert von etwa 6,5 bis etwa 8,5 und bei Temperaturen von etwa. 20 bis etwa. 30 C. Der grössere Teil des auf diese Art. erhaltenen Endomycins ist mit dem Mycel verbunden; es befindet. sieh aber auch etwas davon in der Kulturflüssigkeit. Das Mycel kann z.
B. durch Filtration von der Kulturflüssigkeit getrennt und das Antibiotlcum aus dem Filtrat durch Extraktion, z. B. mit Butylalkohol, gewonnen werden. Das im Mycel enthaltene Antibioticum kann - wie noch eingehender beschrie ben werden wird - ebenfalls gewonnen wer den. Bevorzugterweise wird der das Mycel enthaltende Fermentationsliquor vor der Fil tration auf einen p11-Wert von etwa 4 bis 6 angesäuert.
Dadurch wird das Endomyein in der Kulturflüssigkeit unlöslich, so dass nur ein ganz kleiner Teil des Antibioticums im Filtrat erscheint und dieses ohne nennens werten Endomyeinverlust entfernt werden kann. Zur Filtration verwendet. man am besten Filter mit Diatomeenerde, wodurch ein Verstopfen des Filters dureh das lulycel und damit eine starke Verminderung der Filt.ra- tionsgeschwindigkeit vermieden wird.
Das Endomy ein kann aus dem das Myeel enthaltenden Filterkuchen durch einen Alko hol niederen Molekulargewichtes extrahiert werden. Man kann wasserfreien Methyl- oder ;lthylalkohol verwenden; die Propyl- und Butylalkohole sind jedoch schlechte Lösungs mittel für Endomycin, wenn sie nicht mit Wasser gemischt sind.
Als Extraktionsmittel bevorzugt werden Mischungen von aliphati- schen Alkoholen mit niederem Molekularge- wicht und Wasser, welche 30 bis 9011/o Alkohol und 10 bis 7011/o Wasser enthalten. Das op timale Verhältnis von Alkohol zu Wasser ist von dem jeweils verwendeten Alkohol ab hängig. Im übrigen wird zweckmässig wie folgt verfahren: Nach der Extraktion des mycelhaltigen Filterkuchens wird das Extrakt unter vermin dertem Druck konzentriert, bis der grösste Teil des Alkohols verdampft ist.
Wenn die Extraktionslösung einen hohen Alkoholgehalt. hat, so muss Wasser zugegeben werden, um den Verlust während der Konzentration zu erset zen. Das entstandene, im,wesentlichen wäss- rige Konzentrat von, Endomycin wird mit einem Fettlösungsmittel, wie Chloroform oder Petroläther, extrahiert, um die während des Fermentationsprozesses zugesetzten Anti- sehaummittel zu entfernen.
Diese würden die folgenden Reinigungsprozesse stören und auch die therapeutische Verwendbarkeit des Endo- mycins beeinträchtigen. Die wässrige Lösung oder Suspension wird mit Alkalihydroxyd, -ea.rbonat oder -bicarbonat, z. B. mit Natriuni- hydroxy d, Kaliumhydr oxyd, Natriumcarbonat und dergleichen, auf einen pH-Wert von etwa 8 bis 11, vorzugsweise von 8,5 bis 9, einge stellt.
Die Mischung wird dann filtriert und das geklärte Filtrat auf einen pH-Wert von 3,5 bis 5, vorzugsweise von 4,8, angesäuert., wobei Endomycin ausfällt. Das ausgefällte Endomycin wird getrocknet.
Es kann weiter gereinigt werden durch Extraktion des trok- kenen Produktes mit einem niederen, alipha- tischen Alkohol, Filtrieren und Ausfällen des Endomycins durch Zusatz eines unpolaren Lösungsmittels, wie Äther, Benzol, Amylace- tat, Chloroform und dergleichen, wovon Amyl- acetat bevorzugt wird. Das ausgefällte Endo- mycin ist nach Trocknung für therapeutische Verwendung geeignet.
Die Prüfung des Endomveingehaltes von rohen Kulturflüssigkeiten erfolgt am besten durch eine Verdünnungsreibe mit Torula utilis als Testorganismus. Gereinigte Präparate wer den am besten durch die Beeher-Schalen- Methode geprüft.
Bei der Verdünnungsmethode wird das Ergebnis in den eingangs definierten Verdün nungseinheiten angegeben, und es wird die stärkste Verdünnung einer kompletten Fer- mentationsbrühe samt Mv cel, die das W, achs- tum von Torula utilis verhindert, experi nientell bestimmt.
Die Becher-Sehalen-14lethode gibt einen Vergleich zwischen der Stärke einer unbekann ten Lösung und einem Präparat III - 30 - III mit. 25% Isopropv lalkoliol als Lösungsmittel. Das Präparat III - 30 - III wurde als Test lösung von teilweise gereinigtem Endomv ein mit einer Stärke von 1000 Verdünnungsein heiten je Milligramm willkürlich festgelegt.
Es wurde durch Kultivieren von Streptomvces endus in der unter b) beschriebenen Kultur flüssigkeit und anschliessende Isolierung und Reinigung nach der unter d) 2. näher erläu terten Methode hergestellt. Beispiele: n..) Herstellung einer vegetativen Impfkul tur von Streptomvees endus.
In mehrere 500 em3 fassende Flaschen wurden je<B>100</B> cm33 einer Mischung folgender Zusammensetzung gegeben: Maiszucker 10 g Rindfleischextrakt<B>log</B> Natriumehlorid 5 g Pepton 5 g Wasser (q. s.) 7 Litei Als Maiszucker wurde das unter dein pIandelsnamen Cerelose bekannte Dextrose zucker-Präparat verwendet.
Die Flaschen mit der Mischung wurden durch 20 Minuten lan ges Erhitzen auf 120 C bei einem Druck von 1054,6 g/em2 sterilisiert. Nach dem Abkühlen wurde jede Flasche mit Sporen einer auf Agar gewaehsmen Kultur von Streptomvces endus beschiekt. Die Flaschen wurden in eine hin und her gehende Seliiittelvorriehtung ge geben, in einem Raum, dessen Temperatur auf 21 C gehalten wurde.
Die Sehüttelvorrielitung wurde in Betrieb gesetzt und die Kultur 6 Tage wachsen gelassen. Nach dieser Zeit war sie für die Verwendung gemäss b) bereit.
b) Herstellung einer Inipfkultnr für den Fermentator.
In eine 18,0 Liter fassende Flasche, die mit einem Rührer und einer Belüftungsein- riehtung versehen war, wurden 12 Liter eines Mediums folgender Zusammensetzung gegeben. Maiszucker<B>1001</B> Brauereihefe 10 e Fermentationshilfsstoff (Curba.#- B.
G.) Natriumehlorid 4 g Caleiumcarbonat 1 g Wasser (q. s.) 1 Liter und ein Antisehauminittel, bestehend aus 30 ems Schweinefettöl mit 1.% Steno-. Der genannte Fermentationshilfsstoff (Curbav B.
C@.) ist ein Feststoff mit einem Gehalt an Vitaminen der B- und (T-(Truppe, welcher als Rückstand nach der Fermentierung und De stillation von Melasse erhalten wird.
Die Misehung wurde - wie unter a) an gegeben ist - bei 120 C und einem Druck von 1.051,6 glem2 in einem Autoklaven sterili siert. Das Medium wurde auf etwa. 27 C ge kühlt. und mit einem mit einer Geschwindig keit von 270 Lindreliungen in der Minute rotierenden R.ührer bewegt.
Zum Medium wurden 1.0 cin3 der nach a)@ erhaltenen Kultur von Streptomv ees endus unter sterilen Kaute len zugesetzt. Durch die Belüftungsvorrich- tung wurde Luft am Boden der Flasche in einer 1Ienge von etwa 8 Liter je -Minute ein geleitet, wobei dauernd ein kleiner Druck in der Flasche aufrechterhalten wurde. Die Kul tur wurde .18 Stunden lang unter diesen Be dingungen wachsen. gelassen.
c) Herstellung von Endomvein.
Für die Herstellung von Endompcin wurde ein mit Glas ausgekleideter Tank mit. 378.5 Liter Fassungsraum verwendet. Für die 1)urehmisehung diente ein mit. Heresit (Markenprodukt, ein Phenol-Formaldehyd- liarz) umkleideter Rührer, der mit einer Ge- sehwindigkeit von 270 Umdrehungen in der Minute rotiert.
Die Belüftung wurde durch eine Belüftungsvorrichtung mit Düsen be- sorgt,welche den Luftstrom gegen die Dreh- riehtung des 3lediums richteten. Ein Strom von 8-15)6 Litern steriler Luft in der Stunde bei einem Druck von 351,5.1 gjcm2 wurde dauernd aufrechterhalten.
Um das Schäumen zu verhindern, werden etwa 300 bis 400 ema eines sehaumzerstörenden Mittels (Schweine , fettöl mit 1% Stenol) in der üblichen Weise in den Tank eingetropft.
In diesen Behälter wurden 240 Liter einer Nährlösung mit folgender Zusammensetzung je Liter eingebracht: Maiszucker 25,0 g Brauereihefe 2,5 g Ammonsulfat 5,0 g Calciumcarbonat 8,0 g Natriumchlorid 4,0 g primäres Kaliumphosphat 0,4- Sojabohnenmehl 7,0 g .Das Medium wurde im Behälter durch 20 Minuten andauerndes Erhitzen auf 120 C bei einem Druck von 105.1,6 g/cm2 sterilisiert.
Nach Abkühlung wurde es mit Streptomyces endus geimpft, indem der entsprechend b) behandelte Inhalt einer<B>18,9</B> Liter fassenden Flasche zugesetzt wurde. Die Temperatur des Mediums wurde während des Wachstums auf 24 C gehalten.
Die Kultivierungszeit und der Endomycin- gehalt in Verdünnungseinheiten sind aus fol gender Tabelle zu entnehmen
EMI0005.0047
Kultivierungszeit <SEP> End-pH-Wert <SEP> Endomycin-Gehalt <SEP> $
<tb> <U>Stunden <SEP> yerdünnungseinheiten/crn</U>
<tb> 44 <SEP> 6,9 <SEP> Spur
<tb> 64 <SEP> 6,7 <SEP> 210
<tb> 88 <SEP> 6,5 <SEP> 496
<tb> 112 <SEP> 7,3 <SEP> 433
<tb> 136 <SEP> 6,8 <SEP> 444 d) die Isolierung und Reinigung des En- domycins (A-214) kann nach einer der fol- äenden Methoden vorgenommen werden.
1. Es wurde von einer Endomycin enthal tenden Mischung ausgegangen, die entspre chend c) hergestellt worden war, mit dem Unterschied, dass an Stelle von Natriumchlorid 4,0 g Kaliumchlorid verwendet worden waren. 205 Liter dieser Mischung mit einem pH- Wert von 8,2 wurden durch Zugabe von 300 cm? konzentrierter Schwefelsäure auf einen p11-Wert von etwa 5,5 angesäuert. In diese angesäuerte Mischung wurden 2,0 kg Di- atomeenerde eingerührt. Diese Suspension wurde mit Hilfe einer Platten- und Rahmen presse filtriert.
Der Filterkuchen wurde mit 10 Liter Wasser gewaschen.
Der Mvcelkuchen wurde aus der Filter presse genommen und in einem Autoklaven 10 Minuten lang unter einem Druck von 703 g/cm2 erhitzt. Der so behandelte Filterkuchen wurde filtriert und mit, Wasser gewaschen. Die ver einigten Filtrate (47 Liter) wurden einmal mit 12 Liter und 4mal mit je 8 Liter Butyl- alkohol extrahiert. Nach der Extraktion des Filtrates wurde jeder Extrakt durch den Mycelkiichen geschickt.
Nach der letzten Buta- nolextraktion wurde der Mycelkuchen mit 10 Liter Wasser gewaschen, um das Butanol zu verdrängen.
Die Butanolauszüge wurden vereinigt und unter vermindertem Druck destilliert. Es er gaben sich 3800 cm3 einer wässrigen Suspen sion, die ausgefroren und getrocknet wurde. Die so erhaltene feste Substanz wog 202 g; die Prüfung ergab eine Stärke von 500 Verdün nungseinheiten je mg.
121 g dieses Materials wurden durch 2- bis 3stiüidiges,=Schütteln in einem Liter Äther suspendiert. Der Äther wurde vom festen Rückstand abgetrennt lind der Vorgang unter Verwendung von 1 Liter bzw. 300 cm3 Äther wiederholt. Der so erhaltene feste Anteil wurde mit. kochendem Benzol extrahiert., wobei 52,1 g eines schwach braun gefärbten, festen Rückstandes erhalten wurden. Dieser wurde durch kräftiges, 4- bis 5stündiges Rühren in 1,5 Liter Wasser suspendiert, wobei sich eine trübe Emulsion bildete. Diese wurde mit Äther so lange extrahiert, bis der Ätherextrakt farblos war.
Die wässrige Emulsion wurde zeiltrifugiert und die sich dabei ansammelnden geringen Mengen eines weissen Niederschlages entfernt. Dann wurde die Emulsion mit Essig säure auf einen pH--#Vert von etwa 4,5 einge stellt. Beim Abstehen über Nacht setzte sich ein dunkelbraunes, gummiartiges Präzipitat ab, von welchem die darübersteliende Flüssig keit abgegossen wurde. Das Präzipitat wurde in 680 ems einer etwa 0,05normalen Natrium- liydroxydlösung gelöst.
Die so hergestellte Lö sung zeigte einen pH-Wert von etwa 8,4. Nach Abtrennung des ungelösten Rückstandes wur den zur klaren Lösung 12 cm3 Eisessig zuge setzt. Der dabei entstehende Niederschlag wurde über gesättigter Kaliumhydroxydlösung und Phosphorpentoxyd getrocknet. Es wurden so 32,9 g. Endomycin erhalten, die 1750 bis 2000 Verdünnungseinheiten je mg, das sind insgesamt etwa 57 557 000 Einheiten, entspra chen. 11 g dieses Materials wurden 5 Stunden hindurch mit 250 cm, absolutem Alkohol ge schüttelt.
Der unlösliche Anteil wurde abge trennt und die klare Lösung mit acht Volum- teilen Äther versetzt. Nach weiterer dreimali ger Wiederholung dieses Vorganges wurden 2,4 g Endomycin, entsprechend 4000 Verdün nungseinheiten je mg, erhalten.
2. 25 Liter einer 6-Tage-Kultur von Strep- tomy ces endus, mit etwa 150 Verdünnungsein heiten je cm3, wurden zur Trennung des :1Ty celiums von der Kulturflüssigkeit dekan tiert und zentrifugiert.
Das abgetrennte Myeelium wurde achtmal mit je einem Liter Butylalkoliol extrahiert. Die vereinigten Butanolextrakte wurden unter vermindertem Druck und unter Zusatz. von Wasser bis zur Bildung eines braunen Gummis eingedampft.
Dieser Rückstand wurde zweimal mit je 250 em3 Ä thyläther extrahiert. Es blie ben 4,6 g einer schwach braun gefärbten, pul verförmigen, festen Substanz zurück, die<B>1300</B> Verdünnungseinheiten je nig ergaben. Die in der oben angegebenen Weise abge sonderte Kulturflüssigkeit betrug 22 Liter. Sie wurde zweimal mit je vier Liter Butyl- alkoliol extrahiert..
Die Butanolextrakte wur den nach Waschen mit Wasser unter vermin- dertem Druelz bis zur Bildung eines braunen Gummis eingedampft.
Dieser Rückstand be trug nach Extraktion mit 500 cm-' siedeneu Äthers 4,2g und entsprach 500 Verdünnungs einheiten Endomycin im mb. 3. 200 Liter einer nach a) bereiteten 4- g a ge-KLilt-tiv von Streptoniyees endus, entspre- ehend 666 Verdünnungseinheiten Endomyein pro cm3, wurde mit 4 kg Diatomeenerde ( Su per Cel ,
Markenprodukt) als Filtrierhilfs- mittel gemischt. Nach Einstellen der Lösung mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,5 wurde filtriert. Der lly eelliuehen wurde mit 30 Litern Wasser gewaschen; das Filtrat und das Waschwasser wurden entfernt. Der Filter kuchen wurde mit 60 Litern 80 O/o igem Methyl alkohol und dann mit. 24 Litern Methylalkohol behandelt.
Die Auszüge wurden-vereinigt und unter vermindertem Druck so lange destilliert, bis ein im wesentlichen wässriges Konzentrat z#erblieb. Dieses wurde mit. handelsüblieheni Hexan zur Entfernung des Fettes und des während der Fermentation zugesetzten Anti- schaummittels extrahiert. Das wässrige Kon zentrat wurde dann durch Zusatz von 10 g Natriumbiearbonat je Liter (insgesamt 150 g) alkalisch gemacht. Die alkalische Suspension wurde auf 40 C erwärmt, 2 Stunden gerührt und dann filtriert.
Das klare Filtrat wurde mit Essigsäure auf einen pH-Wert von 4,8 ein gestellt und über Nacht bei etwa 5 C stehen gelassen. Der sieh bildende Niedersehlagwurde gesammelt und getrocknet.
Es wurden so 140 g Endomy ein, entsprechend 755 je nig, erhalten. 131 g dieses Produktes wurden mit l300 em3 95%igeni Äthylalkohol gemischt und filtriert. Zum klaren Filtrat wurden unter Rührung allmählich 6500 cm3 Amylacetat zugesetzt, wobei Endomycin ausfiel.
Nach Ab stehen der Mischung über Nacht bei 5 C wurde der Niederschlag gesammelt und unter vermindertem Druck getrocknet.. Es wurden so -19,1 Tnclomyein als braunes Pulver erhal ten, eutspreehend 1480 Beeher-Sehalen-Lin- lieiten ;je insg,.