Verfahren zur Darstellung gereinigter Polysaccharide aus Mikroorganismen.
Es ist bekannt, dass man durch wiederholte fraktionierte Behandlung von gramnegativen und grampositiven Bakterien mit 90-bis 95% igem Phenol und anschliessend mit Wasser aus dem wässrigen Extrakt hochantigene somatisehe Glycoproteide isolieren kann (J. W. Palmer und T. D. Gerlough, Science 92, 155, 1940 ; W. T. J. Morgan und S. M. Patridge, Biochem. J. 35, 1140, 1941 ; M. Heidelberger und Mitarb., Journal Exp.
Med. 83, 304, 1946). Es ist ferner bekannt, dass man auch durch Behandlung der Bakterien mit PhenollWasser-Emulsionen in der Kälte in einer Stufe derartige Glycoproteide extrahieren und nach Entmischung der Emulsion aus der wässrigen Phase isolieren kann (0. Westphal, Angew. Chem. 57, 57, 128, 1944 ; 62, 27, 1950). Bei diesen Extraktionsverfah- ren erhält man Produkte, in denen die spezifi- sehen Bakterienpolysaccharide jeweils an mehr oder weniger Proteinmaterial gebunden sind, doeh gelingt nach dem ersten Verfahren letzten Endes eine Trennung in undegradiertes Polysaccharid und einfaches amphoteres Protein.
Es wurde nun gefunden, dass man durch Behandlung der Mikroorganismen mit homogenen PhenollWasser-Mischungen in der Wärme, anschliessender Kühlung und Trennung der Phasen wässrige Extrakte erhält, welche die proteinfreien spezifischen Polysaccharide in undegradierter Form und praktisch quantitativer Ausbeute enthalten.
Die bakteriellen Polysaccharide sind in der Bakterienzelle bekanntlich an Proteine und Lipoide chemisch gebunden. Bei der Einwirkung eines PhenollWasser-Gemisches werden nun die Bindungen zwischen Polysaccharid einerseits und den bakteriellen Proteinen und Lipoiden anderseits chemisch aufgespalten. Dabei findet eine Dissoziation der genuinen bakteriellen Polysaccharid-Symplexe unter Abspaltung der undegradierten wasserlöslichen Polysaccharide statt. Die Proteine und Lipoide werden dann beim Abkuhlen der Mischung auf Grund ihrer Loslichkeitseigen- schaften vom Phenol aufgenommen, während das Polysaccharid in der wässrigen Schicht gelöst ist. 2
Zur Terminologie vgl. W. T. J. Morgan und S. M. Partridge, Biochem. J. 34, 169 (1940) ; 35, 1140 (1941), Brit. J.
Exp. Pathol. 23, 51 (1942).
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von proteinfreien, reinen, wasserlöslichen Polysacchariden aus Mikroorganismen ist dadurch gekennzeichnet, dass man die Mikroorganismen bei erhöhter Temperatur mit einer homogenen PhenollWasser-Mischung extrahiert, wobei aus dem ursprünglich vorhandenen Symplex die Polysaccharide abgespalten werden, dann die erhaltene Extraktionsmischung abkühlt, die entstandenen Schichten trennt und aus der wässrigen Phase die reinen Polysaccharide isoliert.
Man geht so vor, dass die getrockneten Mi kroorganismen oder das feuchte Sediment in Wasser suspendiert und unter Rühren auf erh¯hte Temperatur, vorzugsweise 55 bis 68 C, gebracht werden. Hinzu gibt man ein etwa gleiches Volumen von auf die gleiche Tem peratur vorgewärmtem 75-90%igem Phenol.
Es entsteht eine homogene Mischung, welche man während 5-30 Minuten auf die Bakterien einwirken lasst. Anschliessend wird gekühlt, wobei die Flüssigkeitsmischung zweiphasig wird und sich nach Zentrifugation in eine obere wässrige und eine untere phenolische Phase auftrennt. Die wässrige Phase wird abgehoben, von gelöstem Phenol durch Dialyse oder Xtherextraktion befreit und unter vermindertem Druck konzentriert. Durch Eingiessen in mit Wasser miselibare organische Fällungsmittel, wie Methanol, Athanol, Aeeton oder Mischungen derselben, vorteilhaft unter Zusatz von Natriumacetat, erhält man eine flockige Fällung, welehe die spezifischen somatischen Bakterienpolysaccharide praktisch quantitativ neben Nucleinsäuren enthält.
Die Trennung der Polysaccharide von Nucleinsäuren kann durch fraktionierte Fällung mit organischen Mitteln oder durch Elektrophorese durchgef hrt werden.
Nach dem beschriebenen Verfahren kann man die wasserlöslichen Polysaccharide sowohl von gramnegativen als auch von grampositiven Bakterien aus Pilzen und andern Mikro- organismen in einer Stufe und mit praktiseh quantitativer Ausbeute extrahieren.
Die erhaltenen Polysaccharide dienen als Impf-und Reizstoffe sowie als Zwischenpro- dukte zu Impf-und Reizstoffen.
Beispiel 1 :
10 g Colibakterien (bezogen auf Trocken- substanz) werden bei 65-68 C (Wasserbad) in 350 cm3 Wasser suspendiert und unter Rühren mit 350 cm. s auf 68 vorgewärmtem 90% igem Phenol versetzt. Es wird unter R h ren 20-30 Minuten lang bei 65-68¯C belassen, ansehliessend mit Eiswasser auf 5 bis 10 C gekühlt und zentrifugiert. Die obere wässrige Phase wird abgehoben und die untere Phenolschicht noehmals bei 68 mit 300 cm3 Wasser während weniger Minuten gerührt.
Nach erneuter Kühhin g und Zentrifugation werden die wässrigen Lösungen vereinigt und gegen dest. Wasserdialysiert. Die schwach opalisierende Innenlosung wird im Vakuum auf 10-15 em3 Volumen eingeengt, von geringen Mengen ungelöster Substanz abzentri fugiert und in die 6-l0faehe Wenge Alkohol unter Zusatz von etwas Natriumacetat eingegossen. Die Substanz fällt in weissen Floeken, welche mit Alkohol und Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet oder in wenig Wasser aufgenommen und lyophil-getrocknet werden, an. Ausbcute 0,8-1,3 g (Rohextrakt).
4 g Rohextrakt werden in 200 em3 Was- ser gelöst und die Lösung unter Rühren mit 200 em3 ¯thanol versetzt. Die Fällung wird abzentrifugiert ; sie enthält hauptsächlich Nucleinsäuren (2, 1-2, 3 g). Die lIutterlauge wird im Vakuum auf 30 em3 Volumen ein geengt und mit 30 em3 Athanol versetzt. Die geringe Fällung (100-150 mg) wird durch Zentrifugation entfernt. Das Filtrat lässt man in das sechsfache Volumen Alkohol unter Zusatz von etwas Natriumacetat einfliessen.
Die feinflockige FÏllung wird abzentrifugiert und mit Alkohol/Aceton gewaschen oder lyophil getroeknet ; sie enthält die Polysaccharide neben etwa 5% Nucleinsäure. Ausbeute : 1, 2 bis 1, 4 g. Durch Wiederholung der Fraktionierung erhÏlt man 0, 9-1, 1 g reine Poly- saccharidfraktion, deren Stiekstoffgehalt von 0, 7-1, 0% vollständig auf den Gehalt des PrÏparates an Hexosamin entfällt. Diese Polysaccharidfraktion fÏllt aus 4% ig wässriger Lösung bei Alkoholkonzentrationen zwischen 78 und 82% praktisch vollständig aus. Die Substanz bildet mit Wasser schwach opaleszierende Losungen.
Nach der gleichen Vorsehrift kann man andere Mikroorganismen mit Phenolf/Wasser extrahieren und erhält jeweils nach Fraktionierung die reinen, proteinfreien, wasserlöslichen Polysaccharide.
Beispiel 2 :
10 g Pneumokokken Typ III (bezogen auf Trockensubstanz) werden wie im Beispiel 1 mit 350 em3 Wasser und 350 cm3 90% igem Phenol bei 65-68 C während 20-30 Minuten behandelt. Nach Aufarbeitung des Ansatzes analog Beispiel 1 werden 0, 8-1, 2 g Rohextrakt erhalten. Die weitere Reinigung erfolgt wie in Beispiel 1, wobei aus 4 g Rohextrakt 0, 7-0, 9 g reine Polysaccharid-Fraktion erhalten wird.