CH316278A
CH316278A - Verfahren zur Herstellung von Erythromycin

Info

Publication number: CH316278A
Authority: CH
Inventors: L Bunch Robert; M Mcguire James
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1952-05-27
Filing date: 1952-05-27
Publication date: 1956-09-30
Description


  Verfahren zur Herstellung von     Erythromycin       Die vorliegende Erfindung bezieht sich  auf ein Verfahren zur     Erzeugung        eines    neuen  Antibiotikums, das als      Erythromycin     be  zeichnet werden soll.

   Dieses Verfahren ist da  durch     gekennzeichnet,    dass man einen diesen  Stoff erzeugenden Stamm von     Streptomyces          erythreus    in einem Kulturmedium, das     assi-          milierbare    Kohlenhydrate,     assimilierba.ren     Stickstoff und anorganische Nährsalze ent  hält, kultiviert und das gebildete     Erythromy-          cin    aus dem Kulturmedium isoliert..  



  Das     Erythromycin,    eine Stickstoffbase,  sowie auch seine     Salze    mit Säuren sind durch  eine beträchtliche antibakterielle Wirkungs  breite ausgezeichnet. Sie besitzen eine anti  biotische     Aktivität    gegenüber vielen Mikro  organismen, und zwar sowohl Gram-positiven  als auch Gram-negativen. Eine weitere wich  tige antibiotische Eigenschaft der neuen  Verbindung und ihrer Salze liegt in ihrer  Fähigkeit, das Wachstum und die Entwick  lung gewisser     Rickettsien    und grosser Viren,  z. B. des epidemischen Typhus und der     Me-          ningopneumonie,    sowie einiger     Spirochäten     wirksam     zu    unterbinden.

   Die antibiotischen  Eigenschaften von     Erythromycin    im Verein  mit seiner geringen Giftigkeit machen es zu  einem wertvollen Heilmittel.    Die antibiotische Aktivität des     Erythro-          mycins    gegenüber Testorganismen wird in  Tabelle I gezeigt. Die antibiotischen Aktivi  täten wurden entweder mit dem     Agarverdün-          nungs-    oder     Bouillonverdünnungstest    be  stimmt.

   Im ersteren Test wurden die Test  organismen auf einer Reihe von     Agarplatten     ausgestrichen, die     verschiedene    Konzentratio  nen des Antibiotikums enthielten, um die  Mindestkonzentration des     Erythromycins    in  y (Mikrogramm) pro     cm3    Substrat zu bestim  men, die das Wachstum über einen     Zeitraum     von 40 Stunden hemmt. Im letzteren Test  wurden die Testorganismen in Nährbouillon  mit verschiedenen Mengen     Erythromycin    auf  gezogen. Die Anwesenheit von etwa 10  Pferdeserum im Medium hatte keine wahr  nehmbare Wirkung auf die antibakterielle  Aktivität des Antibiotikums.  



  In der Tabelle bedeuten die Buchstaben       (a.)    und (b) nach der hemmenden Konzen  tration die Testmethode     (Agarverdünnungs-          test    bzw.     Bouillonverdünnungstest).    Die     Ery-          thromycinsalze    besitzen antibiotische Aktivi  täten, die den in der Tabelle angegebenen  Werten entsprechen, wenn man die erhöhten       Molekulargewichte    der Salze berücksichtigt.

      
EMI0002.0001     
  
    <I>Tabelle <SEP> I <SEP> -</I>
<tb>  Hemmende
<tb>  Testorganismus <SEP> Konzentration
<tb>  <U>(7lcm$)</U>
<tb>  Mierococcus <SEP> pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,8 <SEP> (a)
<tb>  Micrococcus <SEP> pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> (penicillinresistent) <SEP> . <SEP> 0,4 <SEP> (a)
<tb>  Micrococcus <SEP> pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> (streptomycinresistent) <SEP> 0,8 <SEP> (a)
<tb>  Listeria <SEP> monocytogenes <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,31 <SEP> (b)
<tb>  Bacillus <SEP> subtilis <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,2 <SEP> (a.)
<tb>  Vibrio <SEP> Cholera <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .

   <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,63 <SEP> (b)
<tb>  Mycobacterium <SEP> sp. <SEP> (607) <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 6,2 <SEP> (a)
<tb>  Mycobaeterium <SEP> phlei <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,8 <SEP> (a)
<tb>  Haemophilus <SEP> pertussis <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,31 <SEP> (b)
<tb>  Mycobacterium <SEP> avium <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1,6 <SEP> (a)
<tb>  Mycobaeterium <SEP> smegmatis <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .

   <SEP> 6,2 <SEP> (a)
<tb>  Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 6,2 <SEP> (a)
<tb>  Brucella <SEP> melitensis <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1,56 <SEP> (b)
<tb>  Brucella <SEP> suis <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1,56 <SEP> (b)
<tb>  Neisseria <SEP> intracellularis <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 5,0 <SEP> (b)
<tb>  Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> (sulfaresistenter <SEP> Stamm) <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,02
<tb>  Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .

   <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,02 <SEP> (b)
<tb>  Haemophilus <SEP> influenzae <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1,25 <SEP> (b)
<tb>  Streptococcus <SEP> viridans <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,16 <SEP> (b)
<tb>  Corynebacterium <SEP> diphtheriae <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,02 <SEP> (b)
<tb>  Vibrio <SEP> comma <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .

   <SEP> 6,25 <SEP> (b)       Die im folgenden beschriebenen Versuche  wurden ausschliesslich mit einem bestimmten  Stamm von     Streptomy        Ces        erythreus    durch  geführt.     Streptomy    Ces     ery        threus    gehört zu  der Gruppe der     Actino@myeetales,    gemäss der  Klassifizierung in     Bergeys    Manual of     Deter-          minative        Bacteriology        (6th        edition),    Seite 938.

    In seinen     morphologischenKennzeichenscheint     der in Frage stehende Stamm nahe verwandt  zu sein mit dem von     Waksma.n    zuerst als       Actinomyces    161     [Soil        Sci.ence    8, 71-214  (1919] und später als     S.treptomyces        ery-          threus    bezeichneten Mikroorganismus.

   Wie hier  später noch erläutert werden wird, bestehen       gewisse        Unterschiede    zwischen den Eigen  schaften der Kulturen des von     Waksman    be  schriebenen     Organismus    und denen des hier  verwendeten,     Erythromycin    bildenden Orga  nismus, so dass die Richtigkeit der Bezeieli-         nung         Streptomyces        erythreus     unter Um  ständen bezweifelt werden kann.

       Jedenfalls     wird der in Frage stehende     neue        Organismus     einstweilen als     Streptomyces        erythreus,        Stamm          M5-12559,    bezeichnet.  



  Der Mikroorganismus wurde     aus    einer aus       Iloilo    City,     Iloilo,        Phillippinen,        erhaltenen     Bodenprobe isoliert, wobei folgendes     Isolier-          verfahren    angewandt wurde: Eine Probe     des     Bodens wurde in sterilem destilliertem  Wasser suspendiert, die,     Suspension    stark ver  dünnt und eine kleine Probe hiervon auf       Nähragar    plattiert. Die Platte     wurde    bei  etwa 30  C eine     "#%Toche    bebrütet.

   Die winzi  gen, harten, zerstreuten Kolonien von     Strepto-          myces        ery        threus    wurden mit einer Platinöse  abgenommen und zur Impfung von     Agarböden     benutzt, um grössere Mengen des Organismus    zu erzeugen.

        An sich können natürlich auch andere       erythromycinerzeugende    Stämme von     Strepto-          myces        erythreus    angewendet werden, die  durch     Routineisolierungs-    und     Stammodifi-          kationsmethoden    leicht gewonnen werden kön  nen, wobei man eine     Selektionszüchtung    oder  eine Behandlung mit mutierenden Mitteln,  z. B. Röntgenstrahlen, ultraviolettem Licht  und chemischen Mitteln, wie     Stickstofflost-          verbindungen,    vornehmen kann.

   Beispiele für  andere     erythromycinerzeugende    Stämme sind       Streptomyces        erythreus,    Stamm     M5-14641,     M5-14642 und M5-14643. Die Nummern  M5-12559, M5-14641, M5-14642 und  M5-14643 der Stämme von     Streptomyces          erythreus    wurden bei der     Kulturensammlung          der        Northern    Regional     Research        Labora.to-          ries,        Peoria.    (Illinois),

       hinterlegt    und erhiel  ten in dieser Sammlung die Nummern       NRRL    2338,     NRRL    2359,     NRRL    2360 und       NRRL    2361.  



  Zur     Charakterisierung    von     Streptomyees          erythreus,    Stamm M5-12559, wurden zahl  reiche physikalische,     züchterische    und physio  logische Teste durchgeführt, worüber in den  folgenden Abschnitten berichtet. wird. Die  Farben sind meistens nach dem System von       Ridgway,        Color    Standards     and        Nomenclature     (1912), bezeichnet; bei Bezeichnungen nach  diesem System werden die Anfangsbuchstaben  gross geschrieben.  



  Beim Wachsen auf     Nähragar    bildet     Strep-          tomyces        erythreus    ein     verzweigtes        3lyceliiim     mit     Sporenreihen    in geraden oder unregel  mässig sich windenden Ketten, die aber . im  allgemeinen nicht ausgesprochen spiralförmig  angeordnet sind. Das Wachstum ist ausge  sprochen langsam und kärglich, wobei das  Ausmass des vegetativen und     des        Reihen-          Wachstums    mit. dem jeweils benutzten Nähr  medium variiert.  



  Auf einfachen synthetischen     Aga.rmedien     entwickelt sich das vegetative     Mycelium    be  sonders kärglich und flach. Das     Luftmycelium     ist, staubig weiss und in mässiger Menge vor  handen. Mit reifender Kultur wird das in  Luft wachsende     1Iycel    blass rosafarben. Es  bildet sieh ein     lösliches,     Russet-Vinaceous -    Pigment, das mit älter werdender Kultur  nachdunkelt.  



  Wenn der Organismus auf     Agarmedien     gezüchtet wird, die komplexe Stickstoff  quellen enthalten, ist das vegetative     Myeeliuin     im Verhältnis reichlicher vorhanden als das  an der Luft gewachsene. Das vegetative  Wachstum wird charakteristisch verstärkt  und neigt dazu, in das     Agar    einzudringen.  Das     Luftmycel    in solchen Kulturen ist im  allgemeinen dünn zerstreut     und.    weiss. Ausser  dem löslichen      Russet-Vinaeeous -Pigment     wird ein     gewisses    braunes Pigment auf vielen  komplexen Medien gebildet.  



  Der     Organismus    ist physiologisch sehr       aktiv.    Stärke und Gelatine werden leicht     hy-          drolysiert,    Casein jedoch in     La,ckmusmilchkul-          turen    nicht angegriffen. Die meisten gewöhn  lichen     Kohlenstoffquellen    sind für das Wachs  tum gut     verwendbar.    Temperaturen von etwa  30-37  C scheinen für das Wachstum und  die     Sporenbildung    optimal zu sein.  



  <I>Mikroskopische</I>     illorphologie     Morphologie von     Streptomyces        erythreus,     Stamm     M5--12559,    beim Wachstum auf syn  thetischem     Agar    und     Calciummalat-Agar:          Synthetisches        Agar     Hier entsteht ein mässig verzweigtes     Luft-          mycelium,    bei dem die Sporen auf den     Koni-          diophoren    in Form von kurzen, geraden oder  unregelmässig sich windenden und biegenden  Ketten, aber nicht in typischen Spiralen ent  stehen.

   Die Sporen sind eiförmig und etwa  0,5 X     0,8,u    bis 0,8 X 1,0     ,,c    gross. Die     Farb-          reaktion    nach Gram ist positiv.  



       Calciummalat-Agar     Die beobachtete mikroskopische Morpho  logie ist die gleiche wie bei dem auf synthe  tischem     Aga.r    gezüchteten     Organismus,    nur  sind die     Sporenketten    in noch stärkerem Masse  haken- und schlangenförmig, wenn auch nicht  regelmässig spiralig.

           Züchterische        ?Merkmale            Synthetisches        Agar     Mässiges vegetatives Wachstum, schwach  cremefarben, durch die starke Farbe des lösli-           chen    Pigmentes dunkler werdend; beschränk  tes Wachstum des weissen     Luftmycels,    das mit  reifer werdender Kultur eine      Pale        Vina-          ceous-Fa\vn -Fä.rbung    annimmt; mikrosko  pisch wird mässige     Sporenbildung    beobachtet.;

    die Erzeugung des löslichen Pigmentes ist  ausgesprochener als auf andern Medien; die   Russet:     Vinaceous -Färbung    in jungen Kul  turen wird später      Dark        Vinaceous-Brown      und nach langer Impfung fast. schwarz; die  Kolonien messen 4-6 mm im Durchmesser  bei erhöhten Zentren -und flachen, welligen  Rändern; das     Luftmycelium    ist dünn, weit  und fadenförmig.  



       Glucose--4sparagin- < lgar     Kärgliches farbloses vegetatives Wachs  tum mit schwachem     Wachstum    von weissem  bis      Light.        Pinkish-Cinnamon -Luftmyce-          lium,    das sich nur nach langer     Bebrütung    bil  dete; bei     mikrosko:pisehen    Beobachtungen  spärliche     Sporenbildung;    etwas lösliches,        Light        Oehraceous-Salmon -Pigment;    Kolo  nien mit 2-3     mm    Durchmesser, unregel  mässig konvex mit . welligem oder unversehr  tem Rand;

   Oberfläche glatt oder runzelig,     voa          pulverartiger    Beschaffenheit.         Eme-rsons        Agar       Gutes vegetatives Wachstum, schwach  cremefarben, nach     14tägiger    Impfung      Cames          Brown ,    nach 28 Tagen      Hays    Russet ,  dünnes Wachstum des weissen     Luftmy        celiums;     starkes, lösliches      Hazel -farbenes        Pigment;     Kolonien mit 3-5 mm Durchmesser mit. runz  liger und zusammengerollter Oberfläche, er  höhten oder eingesunkenen Zentren und un  regelmässig welligen Rändern;

   die     Morpholo-          gYie    der einzelnen Kolonien ist verschieden  artig , bei einzelnen fehlt das     Luftmyeelium,     während andere mit einer pulverartigen       Sporenkruste    bedeckt. sind.

           Calciitmmalat         < 4gtti-          Kärgliches,    farbloses vegetatives     Wa.chs-          tiim    mit wenig      Pale        Pinkish-Cinna.mon -          Luftmyceliiun;    bei mikroskopischer Beobach  tung geringe     Sporenbildung;    lösliches  Russet-         Vinaeeoits -Pigment,    das nach verlängerter       Bebrütung         Army        Brown     nachdunkelt;

   Ko  lonien mit 1-3 mm Durchmesser mit erhöh  ten Zentren und fadenförmigen Rändern; die  Oberfläche der     Sporenkruste    ist von feiner,  pulverförmiger Beschaffenheit; mikroskopisch  kleiner Kornkreis von sehr kärglichem Luft  wachstum ganz an der Aussenseite der Ko  lonie.

           Gliccose-Agar     Mässiges     vegetatives        Wachstum,    schwach        Deep    Olive     Buff     über      Roods        Brown      nach      Tawny     wechselnd;     Luftmycelium    in  der Menge mässig; weisses, lösliches      Roods          Brown -Pigment,    das dem auf     Emersons          Agar        gebildeten    ähnelte, aber schwächer war;

    Kolonien mit     \?--4    mm Durchmesser, erhöht,  unregelmässig zusammengerollt, mit welligem  Rand; Oberfläche pulverförmig.  



       Nähragar     Kärgliches vegetatives     Mycelium,    schwach   Chamois ; mässig weisses     Luftmycelium,     ohne lösliches Pigment; Kolonien klein, be  schränkt, 2-3 mm im Durchmesser, unregel  mässig     konvex    mit, ganzem Rand und pulver  förmiger Oberfläche. Grössere Kolonien haben  oft in der     Mitte    eine sternförmige Einsen  kung.  



  <I>Kartoffelpfropf</I>  Reichliches vegetatives     l@Zycelium    mit reich  liehem      Drab-Gray -Luftmycelium    unter Bil  dung eines Pfropfes, der an der Spitze fast  schwarz war und zur     Grundfläehe    hin all  mählich in Braun und     Rötlichbraun    überging.  <I>Gelatine</I>  Mässiges weisses Wachstum in Kolonien mit  in 14 Tagen fast vollständiger und in 20  Tagen bei     @25     C vollständiger Hydrolyse; hell  braunes, lösliches Pigment.

           Glucosebouillon       Schweres Wachstumshäutchen mit spät  sich bildendem, mässigem, weissem     Luftmyce-          lium;    lösliches, ungefähr      Ocher        Red -Pig-          ment.              Nährbouillon          Spärliches    Wachstum, das die Form eini  ger weniger schwimmender Kolonien an  nimmt, einige davon mit weissem     Luftmyce-          lium;    wenig     tropfenförmiges    Sediment und  kein lösliches Piment.

      <I>Physiologische Merkmale</I>         Lackmusmilch     In     Lackmusmilch    ist     das    Wachstum bei  30  C spärlich, es     erscheint    nur in einem  Ring an der Wand der Röhre. Hydrolyse oder       Peptisierung    findet nicht statt, aber     es    ent  wickelt sieh langsam eine alkalische Reaktion  (14 Tage).  



  Bei 37  C ist das     Wachsdun    ähnlich dem       bei    30  C, nur sind Wachstum und     übergänge     weniger deutlich.  
EMI0005.0015     
  
    <I>Verwertung <SEP> von <SEP> Kohlenstoffquellen</I>
<tb>  a) <SEP> gut <SEP> verwertbar:
<tb>  1.j <SEP> (+ <SEP> )-Arabinose <SEP> D <SEP> (+ <SEP> )-Raffinose <SEP> Stärke
<tb>  L(+)-Rhamnose <SEP> Inulin <SEP> Na.triumacetat
<tb>  D <SEP> (-)-Fructose <SEP> Mannit <SEP> Natriumcitrat
<tb>  D <SEP> (+ <SEP> )-Galaktose <SEP> D <SEP> (-) <SEP> -Sorbit <SEP> Natriummalat
<tb>  D <SEP> (-) <SEP> -Glucase <SEP> Mesoinosit <SEP> Natriumsuceinat
<tb>  D(+)-Maltose <SEP> Dextrin <SEP> Asparagin
<tb>  Sa.ccharose
<tb>  b) <SEP> schlecht <SEP> verwertbar:

   <SEP> c) <SEP> wenig <SEP> oder <SEP> gar <SEP> nicht <SEP> verwertbar:
<tb>  D <SEP> (+) <SEP> -Xylose <SEP> und <SEP> Salicin. <SEP> . <SEP> D <SEP> (+) <SEP> -Lactose, <SEP> Dulcit, <SEP> Natriumformiat,
<tb>  Natriumtartrat.            Verwertung   <I>von</I>     anorganischen   <I>Stickstoffquellen</I>    a) gut verwertbar:       Ammoniumsulfat    und     Ammoniumnitrat.     b)     Natriumnitrit    ist nicht verwertbar.  Selbstverständlich sind die obigen Teste  bezüglich der Verwertung von Energiequellen       unter    besonderen     Wachstumsbedingungen     ausgeführt worden.

   Wenn die     Aktinomycete            Pyrosinbouillon     Spärliches, flockiges     Wachstum    unter der  Oberfläche mit Spuren von     tropfenförmigem     Wachstum an der Oberfläche und keinem  löslichen     Pigment.            Stärkeagar     Die Stärke wird stark     hydrolysiert.     



       Cellulose   <I>(Filterpapierstreifen)</I>  Weder bei Ammonium- noch bei Nitrat  Ionen als Stickstoffquelle findet Wachstum  statt.  



  Die folgenden     Kohlenstoff-    und Stickstoff  Verwertungsteste wurden nach einer Methode  ausgeführt, die     Pridham    und Gottlieb, J.     Bac-          teriology    56,     107.-144    (1948),     beschrieben     haben.    gewisse     Energiequellen        unter    den Testbedin  gungen nicht     verwertet    hat, schliesst dies nicht  aus,     da.ss    diese Energiequellen unter andern  Bedingungen verwertet werden.  



  Tabelle     II    zeigt einige Unterschiede zwi  schen     Aetinomyces    161, den     Waksman    be  schrieb, und     Streptomyces        erythreus,        Stamm     M5-12559.

      
EMI0006.0001     
  
    <I>Tabelle <SEP> 1-I</I>
<tb>  Medium <SEP> M5-12559 <SEP> Actinomyces <SEP> 161
<tb>  <I>Mikroskopische <SEP> Morphologie</I>
<tb>  Mässige <SEP> Anzahl <SEP> von <SEP> Sporen., <SEP> die <SEP> auf <SEP> den <SEP> Zahlreiche <SEP> offene <SEP> Spiralen
<tb>  Konidiophoren <SEP> in <SEP> Form <SEP> von <SEP> kurzen, <SEP> ge  raden <SEP> oder <SEP> unregelmässig <SEP> sich <SEP> biegenden
<tb>  oder <SEP> windenden <SEP> Ketten, <SEP> nicht <SEP> in <SEP> typi  schen <SEP> Spiralen <SEP> (14 <SEP> Tage), <SEP> entstehen.
<tb>  <I>Ziichtungsme-rkmale</I>
<tb>  Synthetisches <SEP> 1NIässiges <SEP> bis <SEP> gutes <SEP> vegetatives <SEP> und <SEP> Luft- <SEP> Vegetatives <SEP> Wachstum, <SEP> sich <SEP> ver  Igar <SEP> wachstum.

   <SEP> Luftmycelium <SEP> weiss, <SEP> mit <SEP> der <SEP> breitend <SEP> und <SEP> tief <SEP> in <SEP> das <SEP> Medium
<tb>  Reifung <SEP> teilweise <SEP> rosafarben <SEP> werdend; <SEP> hinein <SEP> entwickelnd. <SEP> Luftmyce  die <SEP> Farbe <SEP> reicht <SEP> anscheinend. <SEP> von <SEP>  Pate <SEP> lium <SEP> dick, <SEP> fest, <SEP> weiss. <SEP> Lösliches
<tb>  Vinaceous <SEP> Fawn  <SEP> bis <SEP>  Light <SEP> Ochraceous <SEP> Pigment, <SEP>  Pomegranate-Purple ,
<tb>  Sa.lmon . <SEP> Bei <SEP> langer <SEP> Bebrütung <SEP> wird <SEP> später <SEP> in <SEP>  Bordeaux  <SEP> überwech  das <SEP> lösliche <SEP>  Russet-Vinaceous -Piainent <SEP> selnd. <SEP> Bei <SEP> wiederholten <SEP> Über    <SEP> Dark <SEP> Vina.ceous-brown <SEP>   <SEP> oder <SEP> fast <SEP> gängen <SEP> wird <SEP> das <SEP> Pigment <SEP> wein  schwarz.

   <SEP> farben.
<tb>  Gelatine <SEP> Kärglich <SEP> braunes <SEP> lösliches <SEP> Pigment <SEP> Kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment
<tb>  Calciummalat- <SEP> Lösliches., <SEP>  Russet <SEP> - <SEP> Vinaceous  <SEP> - <SEP> Pigment, <SEP> Kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment
<tb>  Agar <SEP> das <SEP> bei <SEP> langer <SEP> Bebrütung <SEP>  Army <SEP> Brown 
<tb>  wird.
<tb>  Lackmusmilch <SEP> Spärliches <SEP> Wachstum; <SEP> keine <SEP> Hydrolyse <SEP> Wachstum <SEP> in <SEP> der <SEP> gelblichen
<tb>  oder <SEP> Peptisierung. <SEP> Langsame <SEP> Entwick- <SEP> Oberflächenzone; <SEP> sehr <SEP> langsame
<tb>  hing <SEP> einer <SEP> alkalischen <SEP> Reaktion. <SEP> Koagulation <SEP> (in <SEP> 50 <SEP> Tagen <SEP> nicht
<tb>  -vollständig).

         Zur Kultivierung von     Streptomyees        ery-          threus,    Stamm M5-12559, können recht ver  schieden     zusammengesetzte    Nährmedien Ver  wendung finden. Aus Gründen der Wirt  schaftlichkeit, der Höchstausbeute an Anti  biotikum und der Leichtigkeit der Isolierung  des     Erythromycins    verdienen gewisse Kultur  medien den Vorzug. Als Kohlenhydrate kom  men vor allem Stärke und Glucose in Be  tracht, dann aber auch     Saccharose,        Dextrin,     Melasse und dergleichen.

   Besonders geeignete  Stickstoffquellen sind     Maisweichwasser,    Soja  bohnengrob- oder     -feinmehl    und lösliche  Brauereirückstände, ferner auch Casein,     _'NIi-          schungen    von     Aminosäuren,        Peptone        (Fleisch-          oder        Soja.peptone)    und dergleichen. Auch  anorganische Stickstoffquellen, wie z. B. Ni-         trate    oder     Ammoniumsalze,    können verwendet  werden.  



  Als anorganische     Nährsalze    kommen die  gewöhnlichen Salze, die Natrium-, Kalium-,       Calcium-,    Phosphat-, Chlorid-, Sulfat- und  dergleichen -Ionen zu liefern vermögen, in  Betracht.  



  Wie zum Wachstum und zur Entwicklung  anderer Mikroorganismen erforderlich, soll  ten auch für das Wachstum der in der in Be  tracht stehenden     Aktinomycetes    Spurenele  mente in das Kulturmedium gegeben werden.  Solche Spurenelemente gelangen gewöhnlich  in genügender Menge als Verunreinigungen  mit den andern Bestandteilen, die dem Me  dium zugesetzt werden, in das Nährmedium.      Um     Höchstwachstum    und     -entwicklung    des       Streptomyces        erythreus,    Stamm M5-12559,  zu erreichen, wird das Kulturmedium vor der       Beimpfung    mit dem Organismus auf ein     pH     zwischen 6,0 und 7,5, vorzugsweise auf etwa  6,5, eingestellt..

   Es wurde beobachtet, dass das  Medium während der Wachstumsperiode des       Organismus    und er Erzeugung des Anti  biotikums allmählich alkalisch wird und eine       Alkalitä,t    von etwa.     pH    7,2-8,5 oder darüber  erreicht, wobei das endgültige     pi,    wenigstens  zum Teil vom     Anfangs-pH    des Mediums, den  im Medium anwesenden Puffersubstanzen  und der Dauer der Kultur abhängt.  



  Wie bei der Erzeugung anderer Anti  biotika in grossen Mengen bevorzugt man       aerobe    Kulturen unter der Oberfläche. Zur       Herstellung    begrenzter Mengen können auch  Schüttelkolben- und Oberflächenkulturen in  Flaschen verwendet werden. Ferner bevor  zugt man, wie     geit    bekannt ist, bei Kultivie  rung in grossen     Tanks    die Verwendung der  vegetativen Form des Organismus zur     Be-          impfung    der Erzeugertanks, um eine     Ver7ö-          gerung    der     Erzeugung    des Antibiotikums und  die damit zusammenhängende mangelhafte  Ausnutzung der Anlage zu vermeiden.

   Es ist  demgemäss zweckmässig, zuerst einen vegeta  tiven Impfkeim des Organismus herzustellen,  indem man eine verhältnismässig kleine     1VIenge     des Kulturmediums mit. der     Sporenform    des  Organismus impft, und dann den aktiven  vegetativen Impfkeim aseptisch in die grossen  Tanks überzuführen. Das zur Erzeugung des  vegetativen Impfkeims dienende Medium  kann das gleiche oder aber auch ein anderes  Medium sein als das zur Erzeugung -des Anti  biotikums benutzte.  



       Streptomyces        erythreus,        Stamml115-12559,     wächst     gut    bei Temperaturen zwischen etwa.  25 und 37  C. Die     Höchstausbeute    scheint  sieh bei 26-30  C zu ergeben.  



  Wie     gewöhnlich    bei der Erzeugung von  Antibiotika durch Kultur unter der Ober  fläche wird zweckmässig sterile Luft durch  das Kulturmedium geblasen. Ein gutes  Wachstum des Organismus und eine     gute    Er-         zeugung    :

  des     Antibiotikums    wird erreicht,  wenn das bei der     Tankerzeugung    von     Erythro-          mycin    verwendete Luftvolumen     ansteigend     bis zu 0,1 Volumen Luft pro Minute pro  Volumen Kulturmedium     beträgt,.    Noch besse  res Wachstum des Organismus und eine noch  höhere Erzeugung an Antibiotikum wird er  reicht, wenn das     Luftvolumen        wenigstens    0,4  Volumen Luft pro Minute pro Volumen Kul  turbrühe ausmacht.  



  Die     Geschwindigkeit    der Erzeugung des  Antibiotikums und die Konzentration der  antibiotischen Substanz im     Kulturmedium     können während der     Wachstumsperiode    des  Mikroorganismus leicht verfolgt werden, wenn  man Proben des     Kulturmediums    auf ihre  antibiotische Aktivität gegenüber Organismen  testet, von denen bekannt ist,     da.ss    sie auf das  Antibiotikum reagieren, z.

   B.     Staphylococcus          aureus    und     Mycobacterium        tuberculosis.    .Am  einfachsten stellt man eine Reihe von Ver  dünnungen der Kulturproben her, gibt Teile  der verdünnten Proben zu verflüssigtem       Nä,hragar    zu, verfestigt das     Agar    in einer     Pe-          trischale,    impft mit einer jungen Kultur von  S.     aureus    oder M.

       tuberculosis    und bestimmt  die grösste Verdünnung des Kulturmediums,  die vollständige     Wa.chstiimshemmung        des    Or  ganismus auf dem     Nähragar    bewirkt.  



  Die     Erzeugung    des Antibiotikums kann  ferner auch durch     turbimetrische    Test  verfahren verfolgt werden.  



  Im allgemeinen tritt die     Höchsterzeugung     des Antibiotikums innerhalb von 2-5 Tagen  nach der     Beimpfung    des Kulturmediums ein,  wenn eine     aerobe    Kultur unter der Ober  fläche benutzt wird, und innerhalb von 5 bis  10 Tagen, wenn eine Oberflächen- oder     Schüt-          telkolbenkultur    verwendet wird.  



  Das Antibiotikum kann aus dem Kultur  medium z. B. durch Extraktion oder     Adsorp-          tion    gewonnen werden. Man bevorzugt bei der  technischen Erzeugung die erstere Methode,  weil sie weniger zeitraubend und kostspielig  ist. Zur Extraktion der antibiotischen Ver  bindung aus den Kulturmedium werden mit  Wasser nicht mischbare, polare, organische      Lösungsmittel bevorzugt.;     als    solche sind  unter anderem geeignet:<B>Alk</B>     ylester    von Fett  säuren, z. B.     Äthylacetat    und     Amylacetat,     chlorierte     Kohlenwasserstoffe,    z. B.

   Chloro  form und     Äthylendichlorid,    in     Wasser    leicht  lösliche Alkohole, z. B.     Butanol    und     Amrl-          alkohol,    in     Wasser    leicht lösliche     Ketone,        z.1    B.       Methylamylketon,    und Äther, z. B.     Äthyl-          ä.ther    und     Dibutyläther.    Der organische Ex  trakt kann, vorzugsweise im Vakuum, zur  Trockne eingedampft werden, wobei das Anti  biotikum in roher Form erhalten wird.

   Zur  Isolierung des     Antibiotikums    durch     Adsorp-          tion    sowie auch zu seiner Reinigung durch       Chroma.togra.phie    haben sich     als        Adsorptions-          mittel    z. B. aktivierte Tonerde,     Silicagel,        Ma-          gnesiumaluminiumsilica.t    und dergleichen be  währt. Die     Elution    des Antibiotikums aus  dem     Adsorptionsmittel    lässt sich leicht mit  Hilfe eines polaren organischen Lösungsmit  tels bewirken, in dem die antibiotische Ver  bindung löslich ist.

   Aktivkohle ist für die       ehromatographische    Reinigung des rollen  Antibiotikums weniger geeignet, weil Kohle  das Antibiotikum stark     adsorbiert,    so     da.ss    die       adsorbierte    Substanz nur unter Schwierig  keiten     eluiert    werden kann. Aktivkohle kann  jedoch mit Erfolg benutzt werden, um das  Antibiotikum unmittelbar aus der Kultur  brühe zu     adsorbieren,    wenn die Kohle vorher  z. B. mit Essigsäure behandelt wird, um die  Affinität der Kohle     zum    Antibiotikum  herabzusetzen.  



  Wenn das Antibiotikum der     Kulturfliis-          sigkeit    durch Extraktion entzogen wird, so  wird der Extrakt am besten auf ein verhält  nismässig kleines Volumen eingedampft und  das Antibiotikum alsdann durch Zusatz  eines     Lösungsmittels        ausgefällt,    in welchem  das Antibiotikum nur wenig löslich ist. Die  antibiotische Substanz, die in roher, aber  fester,     zuweilen    sogar kristalliner, Form aus  fällt, kann dann durch Umkristallisation aus  einem oder mehreren Lösungsmitteln oder  deren Mischungen gereinigt werden. Geeignete  Lösungsmittel zum     Umkristallisieren    sind u. a.

         wässriges    Aceton,     wässriges    Methanol,     wäss-          riges    Äthanol und dergleichen.    Eine besonders zweckmässige Art der Iso  lierung des     Erythromycins    besteht darin,  dass man die filtrierte Kulturbrühe auf etwa  PH 9-10, vorzugsweise etwa 9,5, einstellt  und .die alkalische Brühe     alsdann    mit einem       Alkylacetat,    z, B.     Amylaeetat,    extrahiert.

    Die     Erythromycinbase,    die sich im     Amyl-          acetat    löst, kann dann mit Wasser, das auf  ein     pH    unter 6,5, vorzugsweise etwa PH 5,  eingestellt ist, extrahiert werden. Der     wässrige     Extrakt wird dann zweckmässig durch Ein  dampfen im Vakuum     eingeengt.,    um die Fäl  lung einzuleiten, und dann bis auf etwa PH 9,5  alkalisch gestellt, worauf sich die     Erythro-          mycinbase    in fester, gewöhnlich kristalliner,  Form abscheidet. Die Base kann durch Fil  trieren oder Zentrifugieren isoliert und durch       Umkristallisieren    gereinigt werden.  



  Das     Ervthromvcin    kann in seine Salze  übergeführt werden, indem man eine     wässrige     Lösung der     Erythroniy        cinbase    mit einer äqui  valenten Menge Säure behandelt und die Lö  sung im Vakuum zur Trockne eindampft.  Oder man behandelt die Lösung     des        Erythro-          mycins    in einem organischen Lösungsmittel  mit einer Säure oder deren verdünnter Lö  sung, wodurch das     Erythromycinsa.lz    unmit  telbar aus der Lösung ausgefällt wird.

   Wenn  saure Salze starker Säuren hergestellt werden,  muss während des Säurezusatzes zum Anti  biotikum darauf geachtet     werden,    dass örtlich  hohe Konzentrationen der Säure vermieden  werden, weil     Erythromyein    in Lösungen mit  niedrigem     pH    verhältnismässig unbeständig  ist.  



  Wenn die Kulturbrühe bei einem PH-Wert  unter 9 extrahiert oder mit einem     Adsorp-          tionsmittel    behandelt wird, so     liegt    das     Ery-          thromycin    im Extrakt oder     Adsorba,t    in der  Regel in Form einer Komplexverbindung vor.  Dieser Komplex zeigt die antibiotischen  Eigenschaften der     Erythromycinbase,    weist  aber eine stark verringerte Wasserlöslichkeit  und im allgemeinen auch eine geringere Lös  lichkeit in organischen     Lösungsmitteln    auf..

    Aus dem Komplex kann die     Erythromycin-          base    freigesetzt werden, indem man den      Komplex in Wasser löst oder     suspendiert,    das  PH der     wässrigen    Mischung auf etwa 9,8 ein  stellt und die alkalische Mischung mit einem  organischen Lösungsmittel extrahiert. Die       Erythromycinbase,    die aus dem Wasser in  das organische Lösungsmittel übergeht, wird  alsdann zweckmässig durch Umkristallisation  gereinigt.  



  Das     Erythromycin    .besitzt die folgenden  physikalischen und chemischen Eigenschaf  ten:       Erythromycin    kristallisiert in weissen Na  deln, die auf einem     Kofler-Mikroschmeiz-          punktsblock    unter vorherigem Erweichen, bei  etwa 136-140  C schmelzen. Es ist bis zu  etwa 2 mg pro     cm3    in Wasser löslich und  leicht löslich in Alkohol, Aceton, Chloroform,       Acetonitril    und     Äthy        lacetat.    Es ist schwach  löslich in Äther,     Äthylendichlorid    und     Amyl-          acetat.     



  Eine elektrometrische     Titration    in     Di-          methylformamid-Wasser-Lösung    (2: 1     Voluiri-          teile)    zeigt die Anwesenheit einer     titrierbaren     Gruppe von     pKa'    = 8,8 an.  



  Aus den     Titra.tionswerten    kann man auf  ein     Molekulargewicht    von etwa. 725 schliessen.       Erythromycin        kristallisiert    aus     wässrigein     Aceton in Form von Nadeln und kurzen     Stäb-          chen,    die positive     Elongation    und gerade       Auslöschung    zeigen. Bei Raumtemperatur im.

    Vakuum über     Phosphorpentoxyd    getrocknete       Kristallproben    zeigten in     Natriumlicht    bei  27 C die folgenden Brechungszahlen:         n,    = 1,452       n2    = 1,473    Spezifische Drehung einer bei Raum  temperatur im Vakuum über     Phosphor-          pentoxyd    4 Stunden lang getrockneten Probe:

           c        =        1,99        %        (Cxewicht/Volumen)        in        Äthanol.          [a]25    - - 78   <B>D</B>  Ein Durchschnitt von mehreren Elemen  taranalysen von Proben, die vor der Analyse  bei 60  C im Vakuum 3 Stunden über     Phos-          phorpentoxyd    getrocknet worden waren, er  gab     folgende    Werte:

    
EMI0009.0049     
  
    Kohlenstoff <SEP> 60,40%
<tb>  Wasserstoff <SEP> 9,26%
<tb>  Stickstoff <SEP> <B>2,070/9</B>
<tb>  Sauerstoff <SEP> (aus <SEP> der <SEP> Differenz) <SEP> 28,27 <SEP> 0/0       Eine Probe der     Substanz,    die zu etwa       3,14        %        in        Chloroform        (Gewieht/Volumen)        ge-          löst    worden war, ergab in einem     Infra,rot-          spektrum    über den Bereich     2,4,u-12,O,a    die  folgenden ausgezeichneten Banden:

   2,82 3,32,  5,77, 5,91, 6,86, 7,13, 7,25, 7,42, 7,78, 8,02,  8,54, 8,98, 9,16, 9,32, 9,49, 9,86, 10,23, 10,42,  10,9, 11,17,<B>1</B>1,55 und 11,9.  



  Eine     Untersuchung    mit     Röntgenstrahlen     unter Verwendung ungefilterter Chrom  strahlung und einer     Wellenlänge    von 2,2896 A  zur Berechnung der     Netzebenenabstände    er  gibt die folgenden Werte:

    
EMI0009.0065     
  
     d (Netzebenenabstand) <SEP> I/I'(RelativeIntensität)
<tb>  14,5 <SEP> 0,.63
<tb>  13,3 <SEP> 1,00
<tb>  10,9 <SEP> 0,06
<tb>  9,9 <SEP> 0,38
<tb>  8,65 <SEP> 0,25
<tb>  7,70 <SEP> 0,38
<tb>  7,10 <SEP> 0,13
<tb>  6,65 <SEP> 0,13
<tb>  5,80 <SEP> 0,25
<tb>  4,95 <SEP> 0,13
<tb>  4,65 <SEP> 0,06       Das     Ultraviolettabsorptionsspektrum    ist  durch eine einzige breite Spitze von schwacher  Intensität gekennzeichnet, die ein     Maximum     bei 280     m,a    (a = 50) bei     pA    6,3 aufweist:

    Wenn     Erythromycin    aus     Petroläther    .oder  einer Mischung von Wasser und Aceton um=  kristallisiert wird,     liefert    es feine     Nadeln,    die  zum     hexagonalen    System gehören. -     -          Ery-thromycinhydrochlorid        kristallisier-äüs          wässrigen    Lösungsmitteln in     @    weissen Nadeln,  die auf einem     Kofler-Mikroscliinelzpunktblöck     bei etwa 170-173  C schmelzen.  



  Der bereits erwähnte     Erythromycinkom-          plex    wird durch die folgenden physikalischen  und chemischen Eigenschaften charakterisiert      Der Komplex     kristallisiert    in weissen Na  deln, die auf einem     Fisher-Johns-Schmelz-          punktsappa.rat    bei etwa. 82-83,5  C     (unkorr.)     schmelzen. Er ist in Aceton, den     niedrigen     Alkoholen,     Chloroform    und     Äthylendichlorid     völlig löslich, aber in den höheren     Ketonen     und     Äthern    nur wenig löslich.  



  Die elektrochemische     Titration    der Base in  einer     Dimethylformamid-Wasserlösung    (2 :1       Volumteile)    ergab die Anwesenheit zweier       ionisierbarer    Gruppen von     pKci    7,6 und       pKa'   <I>8,4.</I>  



  Das     Molekulargewicht,    wie es aus den mit  Röntgenstrahlen erhaltenen     kristallographi-          schen    Daten an einer bei Raumtemperatur im  Vakuum über     Phosphorpentoxyd    getrockneten  Probe bestimmt wurde, errechnet sich zu etwa       1130.     



  Das     Erythromycin    und seine Salze sind  bei     Raumtemperatur    innerhalb des     pH-          Bereiches    von. etwa 5,0-8,5 ziemlich bestän  dig. Bei einem     pH    ausserhalb dieses Bereiches  verschwindet die antibiotische Kraft bald.  Stärkere Säure bewirkt einen schnellen Ver  lust an antibiotischer Kraft, und stärkere     ba.-          sische    Lösungen wirken ebenso, wenn auch  weniger schnell. Die höchste Beständigkeit  von Lösungen der antibiotischen Verbindun  gen wird erreicht, wenn das     pH    der Lösungen  zwischen     pH    6 und 8 gehalten wird.  



       Erythromycin    und seine Salze enthalten  im allgemeinen Wasser, wenn sie aus wasser  haltigen Lösungsmitteln kristallisiert wurden;  sie können Alkohole und ähnliche Lösungs  mittel enthalten, wenn sie aus solche Lösungs  mittel enthaltenden Lösungen kristallisiert  wurden. Der Gehalt an Wasser oder andern  Lösungsmitteln scheint wenigstens zum Teil       -on    den Bedingungen abzuhängen, unter  denen die Kristallisation erfolgte, des wei  teren vom Grad der Trocknung, welchem die  Substanz unterworfen wurde. Die Gehalte  können zwischen einer kleinen Menge und bis  hinauf     zu    mehreren Prozenten schwanken.

    <I>Beispiel 1</I>  Es wird eine     Impfkeimbrühe    hergestellt,  die folgende Zusammensetzung hat:  
EMI0010.0034     
  
    Stärke <SEP> 14,5 <SEP> kg
<tb>  Sojabohnenmehl <SEP> 14,5 <SEP> kg
<tb>  Maisweichwasser-Festkörper <SEP> 4,5 <SEP> kg
<tb>  Natriumchlorid <SEP> 4,5 <SEP> kg
<tb>  Calciumcarbonat <SEP> 2,7 <SEP> kg
<tb>  Wasser <SEP> 950 <SEP> Liter       Die Brühe wird in einen eisernen Tank  von etwa. 1300 Liter     Fassungsvermögen    ein  gebracht und durch     30minütiges    Erhitzen  unter Druck auf etwa 120  C     sterilisiert.    Die  sterilisierte Brühe wird abgekühlt und asep  tisch mit Sporen von     Streptomyces        erythreus,     Stamm M5-12559, beimpft..

   Der Organismus  wird bei etwa 26  C in der Brühe während  45 Stunden wachsen gelassen. Während der  Wachstumszeit wird die Brühe gerührt und  mit steriler Luft in Mengen von etwa 0,5 Vo  lumen     Teuft    pro Volumen Kulturbrühe pro  Minute belüftet.    In einen etwa 6000 Liter fassenden eiser  nen Tank wird eine Gärbrühe eingebracht,  die folgende Zusammensetzung hat:  
EMI0010.0041     
  
    Stärke <SEP> 69,4 <SEP> kg
<tb>  Sojabohnenmehl <SEP> 69,4 <SEP> kg
<tb>  Ma,isweichwasser-Festkörper <SEP> 23,1 <SEP> kg
<tb>  Calciumcarbonat <SEP> 14,96 <SEP> kg
<tb>  Natriumchlorid <SEP> 23,1 <SEP> kg
<tb>  Wasser <SEP> etwa <SEP> 4500 <SEP> Liter       Die Kulturbrühe wird durch etwa 30 .Mi  nuten während des     Erhitzens    unter Druck  auf etwa 120  C sterilisiert.

   Die Brühe wird  abgekühlt und die obige     Impfkeimkultur     aseptisch zugegeben. Der Organismus wird in  der Brühe 4 Tage lang bei einer Temperatur  von 26  C wachsen gelassen. Während der  Wachstumszeit wird die Brühe gerührt, und  es wird sterile Luft mit einer Geschwindig  keit von etwa. 0,5 Volumen Luft pro Volumen  Brühe pro Minute hindurchgeblasen. Am  Ende der Wachstumszeit zeigt die Brühe  eine antibiotische Aktivität von etwa 150       Erythromycin    pro     cm3    Brühe.

   Die Kultur  brühe (etwa 4000 Liter) wird mit 40     o/oiger          Natriumhydroxydlösung    auf ein PH von 9,5  eingestellt und zur Entfernung des     Myceliums     filtriert, wobei die Filtration durch Verwen-      Jung von 3     Q/o         Hyflo        Super-Cel     (Marken  produkt) unterstützt wird. Das klare Filtrat  wird in einer     Podbielniak-Extraktionsa.ppa-          ratur    mit     Amylacetat    unter Anwendung von  1 Volumen     Amylaceta.t    auf 6 Volumen ge  klärter Brühe extrahiert.

   Der     Amylacetat-          Extrakt    wird seinerseits schubweise mit  Wasser extrahiert, das durch Schwefelsäure  zusatz auf ein     pH    von etwa 5 gebracht wor  den ist. Es werden zwei Extraktionen     durch-          neführt,    die erste mit 1/2 Volumen und die  zweite mit 1/1 Volumen des mit Schwefelsäure  auf     pH    5 eingestellten Wassers. Die     wässrigen     Extrakte werden vereinigt und mit Natrium  hydroxydlösung auf PH 8,0 eingestellt.

   Die  alkalische Lösung wird im Vakuum auf ein  Volumen von etwa 110 Liter eingedampft,  dann durch Zusatz von     Natriumhydroxy        d-          lösung    auf PH 9,5 eingestellt und stehen  gelassen. Das     Erythromycin        seheidet    sich als  kristalline Substanz aus. Die Kristalle wer  den     abfiltriert,    die Mutterlauge durch Zusatz  verdünnter Schwefelsäure auf ein PH von  etwa 8,0 eingestellt und im Vakuum auf ein  Volumen von etwa 75 Liter eingeengt. Die  Lösung wird auf etwa PH 9,5 eingestellt und  stehengelassen, worauf sich eine zusätzliche  Menge     Erythromyein    in kristalliner Form ab  scheidet.

   Die erhaltene Gesamtmenge     Erythro-          mycin    beträgt etwa 256 g.  



  Das     Erythromy    ein wird durch     mehr--          nia.liges        Umkristallisieren    aus     wä,ssrigem    Ace  ton     (2:1-1Alischung)    gereinigt.  



  <I>Beispiel 2</I>  Herstellung des     Erythromycins    in Schüt  telkolben.  



  Das     Erythromycin    wird aus der Kultur  brühe wie folgt gewonnen:  Die Brühe wird durch     Natriumhydroxyd-          zusatz    bis etwa PH 9,8 alkalisch gemacht. und  zweimal mit. 1/     -Volumteilen        Äthylaceta.t    ex  trahiert.- Die vereinigten     Äthylacetatextrakte,     die das     Erythromycin    enthalten, werden mit  2     volumgleichen    Anteilen. Nasser extrahiert,  das mit Schwefelsäure     auf    etwa PH 5,0 an  gesäuert worden ist.

   Die     wässrigen    Extrakte  werden     vereinigt    und mit     Natriumhydrox,y    d-         lösung    auf etwa PH 7,0 eingestellt. Die neu  tralisierte Lösung wird auf etwa 1/1o ihres       ursprünglichen    Volumens eingeengt, an wel  chem Punkt die Fällung einzutreten beginnt.  Die     wässrige        Mischung    wird mit     Na.trium-          hydroxydlösung    auf etwa     pn    9,5 gebracht und  in der Kälte mehrere Stunden stehengelassen.

    Das sich abscheidende     Erythromyein    wird ab  filtriert und aus     wässrigem    Äthanol     um-          kristallisiert.     



  <I>Beispiel 3</I>       Reinigung    des     Erythromyceins    durch     Chro-          matographie.     



  Eine     wässrige,        Erythroinycin    enthaltende  Lösung, wie sie nach Beispiel 1 durch Extrak  tion der filtrierten Kulturbrühe mit     Amyl-          a.eetat    und durch Extraktion des     Amylacetat-          extraktes    mit Wasser erhalten     wurde,        wird     mit.     wässrigem    Alkali auf PH 9,5 eingestellt  und mit Benzol extrahiert.  



  100     cms    des     Benzolextraktes,der    eine anti  biotische Aktivität entsprechend 10 mg     Ery-          thromycin    pro     em3    Benzol aufweist, wird über  eine Säule aus      Florisil         (Markenprodukt,     ein     lVIg-Al-Silikat)    geschickt, die 2,5 cm im  Durchmesser misst und etwa 30     ein    lang ist.  Die Säule wird mit einer 5     ohigen    Metha,nol  lösung in Benzol gewaschen, um ein in der  Säule erscheinendes braunes Band zu ent  fernen, bis das     Eluat    im wesentlichen farblos  durchläuft.

   Das in der Säule     adsorbierte     Antibiotikum wird durch     Elution    mit einer  50     o/oigen        Metha.nollösung    in Benzol entfernt.  Das     Eluat    wird im Vakuum zur Trockne  verdampft und     Glas    zurückbleibende     Erythro-          mycin    aus     wässrigem    Aceton umkristallisiert.         Beispiel     Herstellung von     Erythromy    ein über den  oben erwähnten Komplex.  



  1 g     Erythromycinkomplex,    erhalten wie  oben angegeben, wird in 100     cm3    Wasser  suspendiert und die Suspension durch Zusatz  verdünnter Salzsäure auf     PH    6,3 eingestellt.  Die     wässrige    Mischung wird mit verdünntem  Chloroform extrahiert und die extrahierte       wässrige    Lösung mit     Natriiunhy        droxydlösung     auf etwa.     pH    9,8 eingestellt.

   Die alkalische Lö-      sing wird zweimal mit gleichen     Volumteilen          Amylaeetat    extrahiert, die     Amylacetatextrakte          vereinigt    und im     Vakuiun    zur Trockene ver  dampft. Die zurückbleibende     Erythromycin-          base    wird aus     wiissrigem        Äthanol        umkristalli-          sier    t..
Claims

<B>PATENTANSPRUCH</B> Verfahren zur Herstellung von Erythro- my cin, dadurch gekennzeichnet., dass man einen eiTthromy einerzeugenden Stamm von Streptomyces eiythreus in einem Kultur medium, das assimilierbare Kohlenhydrate, assimilierba.ren Stickstoff und anorganische Nährsalze enthält, kultiviert und cias gebil- del e Erythromy ein aus dem Kulturmedium isoliert. UNTERANSPRÜCHE 1.

Verfahren nach Patentanspruch, da durch gekennzeichnet, dass der erythromycin- erzeugende Organismus unter aeroben Bedin gungen submers kultiviert. wird. 2. Verfahren nach Patentanspruch und Unteransprueh 1, dadurch gekennzeichnet, dass Streptomy ces erythreus, Stamm M5-12559, verwendet wird. 3. Verfahren nach Patentanspruch und Untera.nspru.eh 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturmedium auf einer Tempera tur von 25-37 C gehalten wird. 4.

Verfahren nach Patentanspruch und Unteransprüchen 1 und 3, dadurch gekenn zeichnet, dass der Organismus 2 bis 5 Tage lang wachsen gelassen wird. 5. Verfahren nach Patentanspruch und Unteransprueh 1, dadurch gekennzeichnet., dass die Kulturbrühe bei einem px von 9-10 mit einem mit Wasser nicht mischbaren,<B>po-</B> laren organischen Lösungsmittel extrahiert wird.