CH323770A - Verfahren zur Darstellung des Kreislaufhormons Kallikrein - Google Patents

Description

  Verfahren zur Darstellung des Kreislaufhormons     Kallikrein       Es wurde gefunden,     da.ss    man das Kreis  laufhormon     Kallikrein    aus Eiweiss enthalten  den     Kallikreinlösungen    dadurch gewinnen  kann, dass man solche Lösungen mit wässeri  gen Lösungen solcher Metallsalze versetzt, die  befähigt. sind, Eiweiss in Form eines     Kallikrein          adsorbierenden        Komplexes        auszufällen,    wo  durch das     Kallikrein    niedergeschlagen wird',  und dass man dieses aus dem Niederschlag  durch     Elutionsmittel    wieder freisetzt.

   Beson  ders geeignet. sind wässerige Blei- und Zink  salzlösungen.  



  Die so gewonnenen Hormonpräparate sind  von grosser Reinheit, so dass sie nach Dialyse  ohne weiteres für Injektionszwecke in der       Therapie    Verwendung finden können. Die  Ausbeuten betragen bis zu     10J     /o.  



  Die Lösungen können gegebenenfalls wei  ter gereinigt werden.     !So    lassen sich - gege  benenfalls nach Dialyse - daraus haltbare  Trockenpräparate durch Fällung mit organi  schen Lösungsmitteln, wie     Aceton,    Alkohol  oder     Misehungen    derartiger organischer Lö  sungsmittel, gewinnen.  



  Die     Adsorption    des Wirkstoffes an die       Metallsalzfällungen    ist eine weitgehend spe  zifische und war nicht     vorauszusehen.    Die  Fällung bzw.     Adsorption    tritt nicht ein bei  Verwendung von Salzen der folgenden Me  talle:

   Mg, Ca,     Sr,        Ba.,    Cd,     Hg,        Cu,    Fe", Fe"'  und     Mn.       Das Auftreten der Fällungen ist weit  gehend unabhängig vom     pA.        Beispielsweise     wurden aus der gleichen Lösung durch Blei  fällung bei     pH        .1,2    bzw.     7,0,    nach     Elution    mit       Diammonphosphatlösung    2:2     8@00@    bzw. 18 600  Einheiten gewonnen.  



  Die Wahl der     Elutionsmittel    bestimmt in  hohem Masse Ausbeute und Reinheit. Gute       Ergebnisse    werden beispielsweise erzielt mit       Phosphatpufferlösungen,    Soda,     Bicarbanat     oder     verdünntem    Ammoniak. Aber auch an  dere aus d er     Fermentchemie    bekannte     Eluen-          tien    sind, brauchbar.  



  Das Verfahren gemäss vorliegender Erfin  dung hat gegenüber den bekannten Reini  gungsverfahren für     Kallikrein    grosse     tech          nische    Vorteile. Die Durchführung ist sehr  einfach und der Reinigungseffekt sehr gross.  Bei     Harn-Kallikrein    ist der Reinigungseffekt       100fach,    bei     Pankreasthermoylsaten    80- bis       90fach;    die Ausbeute liegt zwischen 60 und  100 %. Das in grosser Verdünnung anfallende       Kallikrein    kann ohne Verwendung einer Va  kuumdestillation auf ein kleines Volumen     kon-          zentriert    werden.

   Das Verfahren lässt sich so  wohl für     Harn-Kallikrein    als auch für     Pan-          kreas-Kallikrein    durchführen und verzichtet  auf die Verwendung des teueren und schwer  zu beschaffenden     Uranylacetates        ass        Fällungs-          mittel.         Man hat schon mehrfach versucht,     Blei-          und    Zinksalze zur Reinigung von     Kallikrein     zu benutzen.  



  F.     Bischoff    und A. J.     Elliot    [Journal of.       Biol.        Chem.    109,     423        (19-35]    setzten     harn-          kallikreinhaltigen    Lösungen bei einem     pH    zwi  schen 7,4 und 9,2 fertige Suspensionen von       Zinkhy        droxyd    zu.

   Das     Ka.llikrein    wird bei den  bis zu viermal hintereinander durchgeführten       Adsorptionsversuchen     gewöhnlich nicht we  sentlich durch     Zinkhydroxyd        adsorbiert .     Die  erhaltenen Produkte sind meist unstabil:>,  während die erfindungsgemäss hergestellten  Lösungen wochenlang unverändert haltbar  sind.

   Der grundsätzliche Unterschied der  beiden Verfahren besteht. darin, dass     Elliot     Begleitstoffe oder     Wirkstoffe    an suspendier  tes     Zinkhydroxyd        adsorbiert,    während erfin  dungsgemäss das     Kallikrein    an dem durch  Zusatz der genannten wässerigen Metallsalz  lösungen ausgefällten Eiweiss     adsorbiert    wird.  



  H. Kraut, E. K. Frey, E.     Baiser    und F.  Schultz [Zeitschrift     physiol.        Chem.,    20:5, 99  (1932) ]     erzeugten    in Lösungen von Harn  Kallikrein Niederschläge von Bleiphosphat,  um daran entweder     Kallikrein    oder seine     Be-          gleitstoffe    zu     adsorbieren.    Die schwierig durch  zuführenden Operationen (siehe Seite 106)  ei-wiesen sieh als technisch nicht. brauchbar.

    Das     erfindungsgemässe    Verfahren unterschei  det sich von     dieser    bekannten Arbeitsweise  dadurch, dass der Wirkstoff nicht. durch Blei  phosphat gebunden     wird,    sondern durch Zu  satz wässeriger Lösungen     solcher    Metallsalze,  die     befähigt.    sind, Eiweiss in Form eines     Kal-          likrein        adsorbierenden    Komplexes auszufällen,  niedergeschlagen und aus diesem Nieder  schlag durch     Elutionsmittel    wieder freige  setzt wird.  



  <I>Beispiel 1</I>  25 Liter frischer     Menschenharn    vom     PH     6,5 werden mit 4 Liter 10prozentiger     Blei-          aeetatlösung    versetzt. Der entstehende Nieder  schlag wird abgetrennt und mit 3 Liter  destilliertem Wasser gewaschen.     Dann        rührt.     man den Niederschlag mit. 1;3 Liter Wasser an  und lässt unter ständigem Rühren allmählich  1,3 Liter einer     10prozentigen    Diammonphos-         phatlösung    langsam einfliessen. Das     p,1    be  trägt 7;2.

   Nach halbstündigem Rühren wird  der Niederschlag     abzentrifugiert    und die Lö  sung 48 Stunden gegen fliessendes Wasser  dialysiert.  



  Die Ausbeute beträgt 5000 Einheiten =       100        %,        der        Reinheitsgrad        900        y        pro        Einheit.     <I>Beispiel</I>  90 Liter     Pankreasthermolysat    (gemäss deut  schem Patent Nr.     8908'.57),    enthaltend     900.000     Einheiten     Kallikrein,    werden unter Rühren mit  1\3,6 Liter einer     10prozentigen        Bleiacetat-          lösung    versetzt.

   Der entstehende Niederschlag  wird abgesaugt, mit '5 Liter Wasser gewaschen  und wiederum abgetrennt. Dann rührt man  den Rückstand mit 3 Liter destilliertem Was  ser an und lässt unter weiterem Rühren  2,5 Liter einer 16prozentigen     Diammonphos-          phatlösung    zufliessen. Nach einer Stunde wird  zentrifugiert und die klare Lösung 72 Stun  den lang gegen fliessendes Wasser dialysiert.  



  Ausbeute: 720 000 Einheiten; Reinheits  grad: 1 Einheit = 6,0 y.  



  Das so gewonnene     Dialysat    wird im Va  kuum bei     45     Aussentemperatur auf einen  Liter konzentriert, der ausgeschiedene Rück  stand     abgesaugt    und die Lösung bei     +    3  mit  5 Liter einer     50/50prozentigen    Alkohol-     Aceton-          misehung    gefällt.

   Der Niederschlag     -wird        ab-          zentrifugiert,        mit        ? < ,    Liter Aceton     angerührt.     und auf einer     Nutsclie        abgesaugt.    Man wäscht  mit Aceton, dann mit Äther nach und trocknet  den bröckligen     R.üekstand    einige Stunden an  der Luft, dann im evakuierten     P@05-Exsik-          kator.     



  Ausbeute:     23-;22    g =     5-10    000 Einheiten =  75      /o,    1 Einheit = 43 ; .  



  <I>Beispiel 3</I>  780     cm3        Pankreasthermoly        sat,    enthaltend       7300    Einheiten, werden mit 200     em3        10pro-          zentiger        Zinkacetatlösung    versetzt., der ent  stehende Niederschlag durch Zentrifugieren     e     abgetrennt und mit 100     em3    destilliertem Was  ser gewaschen.

   Nach     Abtrennung    des     Waseli-          wassers    rührt, man den Rückstand abermals  mit     100    ein-' destilliertem Wasser an und lässt      zu dieser Suspension unter Rühren 55     cm3     einer     10prozentigen        Natriumbicarbonatlösung          zutropfen.    Nach einer Stunde wird der un  lösliche Rückstand abgetrennt, die Lösung  neutralisiert und 48 Stunden lang gegen     flie-          ssendes    Wasser dialysiert.  



  Ausbeute: 5100 Einheiten; Reinheit: 1 Ein  heit = 43 y.  



  <I>Beispiel</I>  1 Liter eines     Pankreas-Totalautolysates,     gewonnen durch     72stündige        Autolyse    bei 37 ,  enthaltend 20000 Einheiten     Ka.llikrein,    wird  mit 100     ein-'    zehnprozentiger     Zinkaeetat-          lösung    versetzt.. Der entstehende Nieder  schlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt,  mit 100     em3    destilliertem Wasser gewaschen  und nach abermaligem Zentrifugieren mit  60     em3    Wasser angerührt.

   Dann lässt man  20     em3    10prozentige     Dia.mmonphosphatlösung     zufliessen und trennt, nach einstündigem Rüh  ren das Unlösliche ab. Die Lösung, die nun  mehr das     Kallikrein    enthält, wird neutrali  siert und 40 Stunden gegen fliessendes Wasser  dialysiert.  



  Ausbeute: 12 300 Einheiten; Reinheitsgrad  1 Einheit = 70, y.

Claims (1)

1. <B>PATENTANSPRUCH</B> Verfahren zur Gewinnung des Kreislauf hormons Kallikrein aus Eiweiss enthaltenden Kallikreinlösungen, dadurch gekennzeichnet, dass man solche Lösungen mit wässerigen Lö sungen solcher Metallsalze versetzt, die be fähigt sind, Eiweiss in Form eines Kallikrein adsorbierenden Komplexes auszufällen, wo durch das- Kallikrein niedergeschlagen wird, und dass man dieses aus dem Niederschlag durch Elutionsmittel wieder freisetzt. UNTERANSPRÜCHE 1.

   Verfahren nach Patentanspruch, da durch gekennzeichnet, dass man die gewon nenen Lösungen einer Dialyse unterwirft. 2,. Verfahren nach Unteranspruch 1, da durch gekennzeichnet, dass man das Kallikrein aus den gewonnenen Lösungen durch mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel ausfällt und den erhaltenen Niederschlag trocknet. 3. Verfahren nach Patentanspruch, da durch gekennzeichnet, dass man als wässerige Metallsalzlösungen wässerige Lösungen von Bleisalzen verwendet. Verfahren nach Patentanspruch, da durch gekennzeichnet, da.ss man als wässerige Metallsalzlösungen wässerige Lösungen von Zinksalzen verwendet.