Verfahren zur Herstellung von 11a,17a-Dioxy-progesteron Die Erfindung bezieht sich auf ein Ver fahren zur Herstellung einer neuen Verbin dung, das lla,17a-Dioxy-progesteron,' wel ches in der Synthese von Cortison und an derer in der 11-Stellung oxydierter Steroide verwendbar ist und überdies auch selbst eine pharmakologische Wirksamkeit aufweist.
Dieses Verfahren ist dadurch gekenn zeichnet, dass man 17a-Oxy-progesteron einer biochemischen Oxydation mittels Enzymen unterwirft, die von einer Pilzart der Gattung Rhizopus erzeugt werden. Vorzugsweise wer den lebensfähige Pilze mit dem Steroid unter Fermentationsbedingungen in Gegenwart eines Nährmediums für den Pilz zusammen gebracht, wie z. B. in den folgenden Aus führungsbeispielen näher erläutert ist.
Beispiel <I>1</I> Es wurde eine Lösung von 5 cm3 Mais quellwasser (corn steep liquor), 20 g eines Lactalbumin-Auszuges ( Edamin ) und 50 mg Dextrose ( Cerelose ) auf 1 Liter Leitungs wasser hergestellt und auf einen pH-Wert von ungefähr 5,5 bis 5,9 eingestellt.
Auf 4 Liter dieser Lösung, welche eine 24 Stunden bei Raumtemperatur unter Belüftung entwik- kelte Kultur von Rhizopus arrhizus (ATCC Nr. 11145) enthielt, wurde 1 g 17a-Oxy-pro- gesteron in 50 cm3 Methanol zugesetzt.
Nach einer Incubationszeit von 48 Stunden bei Raumtemperatur und Belüftung wurde das Fermentationsmedium mit 2 Liter Methylen- chlorid und hierauf sukzessive dreimal mit 1 Liter Methylenchlorid extrahiert.
Die Ex trakte wurden vereinigt und hierauf zweimal mit 500 em3 einer 2%igen Natriumbicarbo- natlösung'gewaschen. Die Methylenchlorid- Extrakte wurden hierauf vereinigt und zwei mal mit je 500 cm3 destilliertem Wasser ge waschen. Die vereinigten und gewaschenen Methylenchloridextrakte wurden mit einer minimalen Menge von Natriumsulfat ent wässert und hierauf durch Vakuumdestil lation vom Methylenchlorid befreit.
Der ge samte Rückstand von' 1,8849 g wurde in Benzol gelöst und über A1203 ehromato- graphiert, wie Tabelle I zeigt. Fraktion B ergab 307 mg festen Rückstandes. Daraus wurden beim Umkristallisieren aus. 1 cm3 heissem Methanol nach Kühlung 61 mg Kri stalle mit einemSchmelzpunktvon 178---210 C erhalten. Die wiederholte Umkristallisation aus 0,5 cm3 Methanol ergab 25 mg Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 219-222 C.
Durch die nochmalige Umkristallisation er hielt man reine Kristalle von l la, 17a-Dioxy- progesteron mit einem Schmelzpunkt von 220-223 C.
Analyse
EMI0001.0053
Berechnet <SEP> für <SEP> <B>C21H3004:</B> <SEP> C, <SEP> 72,8 <SEP> ; <SEP> H, <SEP> 8,60
<tb> Ergebnis: <SEP> C, <SEP> 73,01; <SEP> H, <SEP> 8,65.
EMI0002.0001
<I>Beispiel 2</I> Es wurde eine Lösung von 20 g eines enzymatischen Lactalbuminauszuges (enzy matisches Edamin ), 3 g Maisquellwasser und 50 g technischer Dextrose auf 1 Liter Leitungswasser bereitet:
und auf einen pH- Wert von 4,3-4,5 eingestellt. 2 Liter dieses sterilisierten Mediums wurden mit einem Rhizopus nigricans minus (ATCC Nr. 6227 B) beimpft und 24 Stunden bei Temperaturen von 28 C bebrütet, wobei eine Belüftung und ein Rühren in solchem Ausmass erfolgte, dass die Sauerstoffaufnahme 6,3-7 Millimol pro Stunde und Liter Na2S03 erfolgte, ent sprechend der .Methode von Cooper, Fern strom und Miller, Ind. Eng. Chem., 36, 504 (1944).
Diesem Medium, welches eine 24 Stunden entwickelte Kultur von Rhizopus nigricans enthielt, wurde 1 g 17a-Oxy-pro- gesteron zugesetzt, welches, um eine Suspen sion des Steroids in der Kultur zu erreichen, in 25 cm3 Aceton gelöst war. Nach einer weiteren Brutperiode von<B>152</B> Stunden unter gleichen Temperatur- und Belüftungs bedingungen wurden die Würze und das Mycel extrahiert und konzentriert.
Das Mycel wurde abfiltriert, zweimal je mit einem Vo lumen Aceton, das ungefähr dem Volumen des Myceliums entspricht, gewaschen und zweimal mit je einem Volumen Methylen- chlorid, das ungefähr dem Volumen des Myceliums entspricht, extrahiert. Der Ace- tonextrakt und der Methylenchlorid-Extrakt einschliesslich des Lösungsmittels wurden dem Würzefiltrat zugesetzt.
Die gemischten Extrakte und Nährlösungsfiltrate wurden sukzessive zweimal mit ihrem halben Vo lumen von Methylenchlorid und hierauf noch zweimal mit ihrem Viertelvolumen Methy- lenchlorid extrahiert. Die vereinigten Methy- lenchloridauszüge wurden nacheinander zwei mal mit je einem Zehntel ihres Volumens 2 /oiger wässriger Natriumbicarbonatlösung und zweimal in der gleichen Weise mit Was ser gewaschen.
Die Lösung wurde mit 3-5 g wasserfreien Natriumsulfates pro Liter Lö sungsmittel getrocknet, filtriert und sodann das Lösungsmittel abdestilliert. Der Rück stand wurde in möglichst wenig Methylen- chlorid gelöst, filtriert und sodann das Lö sungsmittel im Luft- oder Dampfbad ab- gedunstet. Der Rückstand im Gewicht von 1,685 g wurde in 100 cm3 Äthylendichlorid gelöst und über 150 g Florisil , einem syn thetischen Magnesiumsilikat,
chromato- graphiert. Die Säule wurde vor Aufgabe die ses Extraktes zunächst mit 600 cm3 Aceton und sodann mit 600 cm3 Äthylendichlorid ge waschen. Die Lösungsmittel wurden in 220-cm3-Portionen angewendet. Die Ergeb nisse sind in der folgenden Tabelle 1I wieder gegeben.
EMI0003.0055
<I>Tabelle <SEP> II</I>
<tb> Fraktion <SEP> Lösungsmittel <SEP> Ausbeute <SEP> in <SEP> mg
<tb> 1 <SEP> Äthylendichlorid <SEP> <B>105,5</B>
<tb> Äthylendichlorid-Aceton <SEP> 25:1 <SEP> 177,0
<tb> 4 <SEP> <SEP> <SEP> 15:1 <SEP> 39,0
<tb> 5 <SEP> <SEP> <SEP> 15:1 <SEP> 88,5
<tb> 6-9 <SEP> <SEP> <SEP> 12:1 <SEP> <B>225,5</B>
<tb> 10 <SEP> <SEP> <SEP> 10:1 <SEP> 23,5
<tb> 11,12 <SEP> > > <SEP> <B>10:1 <SEP> 73,0</B>
<tb> 13-16 <SEP> <SEP> <SEP> 8:1 <SEP> 316,5
<tb> 17 <SEP> <SEP> <SEP> 5:1 <SEP> 129,5
<tb> 18-20 <SEP> <SEP> <SEP> 5:1 <SEP> 167,0
<tb> 21-23 <SEP> <SEP> <SEP> 2:
1 <SEP> 134,5
<tb> 24-26 <SEP> ' <SEP> Aceton <SEP> 57,0 Das Chromatogramm wurde wiederholt und die entsprechenden Chromatogramm- fraktionen zum Zweck der Aufarbeitung ver einigt.
Die Fraktionen 13 bis 17 wurden aus Methanol unter Hinzufügen von Äther um kristallisiert und ergaben 260 mg Ila,17a- Dioxy-progesteron mit einem Schmelzpunkt von 220-222 C und einer optischen Drehung (a) D von +76 (c=1,1323 in Chloroform) -und einer Ultraviolettextinktion k243 von 46,67.
Analyse
EMI0004.0009
Berechnet <SEP> für <SEP> <B>C21H3004.</B> <SEP> C, <SEP> 72,82; <SEP> H, <SEP> 8,73
<tb> Gefunden: <SEP> C, <SEP> 73.18; <SEP> H, <SEP> 8,76.
<tb> C, <SEP> 72,85; <SEP> H, <SEP> 8,47. Die Mutterlaugen der Fraktionen 13-17 und der Fraktionen 11, 12 und 18-2O wurden vereinigt und in derselben Weise über<B>150</B> mg Florisil nochmals chromatographiert. Es wurden weitere 102 mg Ila,17a-Dioxy-pro- gesteron erhalten.
Die Oxydation des thermostabilen lla,17a-Dioxy-progesterons in Eisessig mit Chromtrioxyd ergab 17 a-Oxy-4-pregnen- 3,11- 20-trion.
Process for the production of 11a, 17a-dioxy-progesterone The invention relates to a process for the production of a new compound, the lla, 17a-dioxy-progesterone, 'wel ches in the synthesis of cortisone and others in the 11- Position of oxidized steroids can be used and moreover also has a pharmacological activity itself.
This process is characterized in that 17a-oxy-progesterone is subjected to biochemical oxidation using enzymes produced by a species of fungus of the genus Rhizopus. Preferably, whoever brought the viable fungi with the steroid under fermentation conditions in the presence of a nutrient medium for the fungus, such as. B. is explained in more detail in the following examples from management.
Example <I> 1 </I> A solution of 5 cm3 of corn steep liquor, 20 g of a lactalbumin extract (Edamin) and 50 mg of dextrose (Cerelose) was prepared in 1 liter of tap water and adjusted to pH -Value set from approximately 5.5 to 5.9.
1 g of 17a-oxy-progesterone in 50 cm3 of methanol was added to 4 liters of this solution, which contained a culture of Rhizopus arrhizus (ATCC No. 11145) developed for 24 hours at room temperature with aeration.
After an incubation time of 48 hours at room temperature and aeration, the fermentation medium was extracted with 2 liters of methylene chloride and then successively three times with 1 liter of methylene chloride.
The extracts were combined and then washed twice with 500 cubic meters of a 2% sodium bicarbonate solution. The methylene chloride extracts were then combined and washed twice with 500 cm3 of distilled water each time. The combined and washed methylene chloride extracts were de-watered with a minimal amount of sodium sulfate and then freed from methylene chloride by vacuum distillation.
The entire residue of 1.8849 g was dissolved in benzene and chromatographed on A1203, as Table I shows. Fraction B gave 307 mg of solid residue. This was made during recrystallization. 1 cm3 of hot methanol, 61 mg of crystals with a melting point of 178-210 ° C are obtained after cooling. Repeated recrystallization from 0.5 cm3 methanol gave 25 mg crystals with a melting point of 219-222 C.
The repeated recrystallization gave pure crystals of 11a, 17a-dioxy-progesterone with a melting point of 220-223 C.
analysis
EMI0001.0053
Calculated <SEP> for <SEP> <B> C21H3004: </B> <SEP> C, <SEP> 72.8 <SEP>; <SEP> H, <SEP> 8.60
<tb> Result: <SEP> C, <SEP> 73.01; <SEP> H, <SEP> 8.65.
EMI0002.0001
<I> Example 2 </I> A solution of 20 g of an enzymatic lactalbumin extract (enzymatic edamin), 3 g of corn steep water and 50 g of technical dextrose to 1 liter of tap water was prepared:
and adjusted to a pH of 4.3-4.5. 2 liters of this sterilized medium were inoculated with a Rhizopus nigricans minus (ATCC No. 6227 B) and incubated for 24 hours at temperatures of 28 C, with aeration and stirring to such an extent that the oxygen uptake 6.3-7 millimoles per Hour and liter of Na2S03 took place, according to the .Methode of Cooper, Fernstrom and Miller, Ind. Eng. Chem., 36, 504 (1944).
To this medium, which contained a culture of Rhizopus nigricans developed for 24 hours, 1 g of 17a-oxy-progesterone was added, which was dissolved in 25 cm 3 of acetone in order to achieve suspension of the steroid in the culture. After another incubation period of 152 hours under the same temperature and ventilation conditions, the wort and mycelium were extracted and concentrated.
The mycelium was filtered off, washed twice with a volume of acetone each time which corresponds approximately to the volume of the mycelium and extracted twice with a volume of methylene chloride each time which corresponds approximately to the volume of the mycelium. The acetone extract and the methylene chloride extract including the solvent were added to the wort filtrate.
The mixed extracts and nutrient solution filtrates were successively extracted twice with their half volume of methylene chloride and then twice with their quarter volume of methylene chloride. The combined methylene chloride extracts were washed in succession twice with one tenth of their volume each with 2% aqueous sodium bicarbonate solution and twice in the same way with water.
The solution was dried with 3-5 g of anhydrous sodium sulfate per liter of solvent, filtered and then the solvent was distilled off. The residue was dissolved in as little methylene chloride as possible, filtered and then the solvent evaporated in an air or steam bath. The residue weighing 1.685 g was dissolved in 100 cm3 of ethylene dichloride and poured over 150 g of Florisil, a synthetic magnesium silicate,
chromatographed. Before applying this extract, the column was first washed with 600 cm3 of acetone and then with 600 cm3 of ethylene dichloride. The solvents were applied in 220 cc portions. The results are given in Table 1I below.
EMI0003.0055
<I> Table <SEP> II </I>
<tb> Fraction <SEP> Solvent <SEP> Yield <SEP> in <SEP> mg
<tb> 1 <SEP> ethylene dichloride <SEP> <B> 105.5 </B>
<tb> Ethylene dichloride-acetone <SEP> 25: 1 <SEP> 177.0
<tb> 4 <SEP> <SEP> <SEP> 15: 1 <SEP> 39.0
<tb> 5 <SEP> <SEP> <SEP> 15: 1 <SEP> 88.5
<tb> 6-9 <SEP> <SEP> <SEP> 12: 1 <SEP> <B> 225.5 </B>
<tb> 10 <SEP> <SEP> <SEP> 10: 1 <SEP> 23.5
<tb> 11.12 <SEP>>> <SEP> <B> 10: 1 <SEP> 73.0 </B>
<tb> 13-16 <SEP> <SEP> <SEP> 8: 1 <SEP> 316.5
<tb> 17 <SEP> <SEP> <SEP> 5: 1 <SEP> 129.5
<tb> 18-20 <SEP> <SEP> <SEP> 5: 1 <SEP> 167.0
<tb> 21-23 <SEP> <SEP> <SEP> 2:
1 <SEP> 134.5
<tb> 24-26 <SEP> '<SEP> acetone <SEP> 57.0 The chromatogram was repeated and the corresponding chromatogram fractions combined for the purpose of working up.
Fractions 13 to 17 were crystallized from methanol with the addition of ether and gave 260 mg of Ila, 17a-dioxy-progesterone with a melting point of 220-222 ° C. and an optical rotation (a) D of +76 (c = 1.1323 in chloroform) and an ultraviolet absorbance k243 of 46.67.
analysis
EMI0004.0009
Calculated <SEP> for <SEP> <B> C21H3004. </B> <SEP> C, <SEP> 72.82; <SEP> H, <SEP> 8.73
<tb> Found: <SEP> C, <SEP> 73.18; <SEP> H, <SEP> 8.76.
<tb> C, <SEP> 72.85; <SEP> H, <SEP> 8.47. The mother liquors from fractions 13-17 and fractions 11, 12 and 18-20 were combined and chromatographed again in the same way over 150 mg Florisil. A further 102 mg of Ila, 17a-dioxyprogesterone were obtained.
The oxidation of the thermostable 11a, 17a-dioxy-progesterone in glacial acetic acid with chromium trioxide gave 17a-oxy-4-pregnene-3,11-20-trione.