CH344055A

CH344055A - Verfahren zur Aufspaltung von d,l-Steroiden

Info

Publication number: CH344055A
Authority: CH
Inventors: Albert Dr Wettstein; Ernst Dr Vischer; Charles Dr Meystre
Original assignee: Ciba Geigy
Priority date: 1955-07-20
Filing date: 1955-07-20
Publication date: 1960-01-31
Also published as: NL95967C

Description

Verfahren zur Aufspaltung von d,l-Steroiden Es ist bekannt, mit Hilfe von Mikroorganismen in Steroidverbindungen mit der natürlichen Konfi guration Hydroxylgruppen einzuführen. Es wurde nun die überraschende Beobachtung gemacht, dass d,1-Steroide sich diesen Mikroorganismen gegenüber verschieden verhalten, indem im wesentlichen nur die d-Form, das heisst die den natürlichen Steroiden entsprechende enantiomorphe Form oxydiert wird, und die 1-Form unverändert bleibt.

Auf dieser Be obachtung basiert nun das Verfahren gemäss der Erfindung zur Aufspaltung von d,l-Steroiden, bei welchem neben den hydroxylierten d-Steroiden die bisher nur in einzelnen Fällen bekanntgewordenen 1-Steroide erhalten werden.

Das neue Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man auf d,l-Steroide aerobe Kulturen von hydroxylierend wirkende Enzyme produzierenden Mikroorganismen oder die entsprechenden Enzyme einwirken lässt; wobei praktisch nur die d-Form hy- droxyliert wird, und dass man das unveränderte 1-Steroid und/oder das d-Oxy-steroid isoliert.

Als Ausgangsstoffe für das neue Verfahren kommen allgemein gesättigte und ungesättigte, beliebig substituierte d,l-Steroide, beispielsweise der Cholestan-, Koprostan-, Cholan-, Spirostan-, Fur- ostan-, Butanolid-, Cardanolid-, Östran-, insbeson dere solche der Pregnan-, Androstan- und Testan- reihe,

sowie ihre höheren und niederen Homologen, beispielsweise entsprechende A-Nor, D-Homo- und 19-Nor-verbindungen, in Betracht. Doppelbindungen können sich z. B. in 1- und/oder 4-, 5-, 6-, 7-, 9-, 11-, 14-, 15- und/oder 16-Stellung befinden. Als Substituenten kommen besonders in Frage freie bzw.

funktionell abgewandelte Hydroxyl-, Oxo- oder Carboxylgruppen, wie Ester-, Äther-, Thioester-, Thioäther, Thiol- und Thionester-, Acetal-, Mer- captal-, Ketal ; Hydrazon-, Semicarbazon- und Enol- gruppen, z. B. in 2-, 3-, 6-, 7-, 11-, 12-, 16-, 17-, 18-, 19-; 20- und 21-Stellung, ferner Halogenatome, insbesondere Chlor oder Fluor, z.

B. in 9- und 17- Stellung. Von besonderem Interesse ist die Anwen dung des neuen Verfahrens auf d,l-Verbindungen der Pregnan-Reihe, unter anderem d,l-Progesteron, d,1-17a-Progesteron, d,1-16a-Oxy-progesteron, d,1-17a-Oxy-progesteron, d-1-11-Oxo-progesteron, d,1-lla- sowie -11ss-Oxy-progesteron, d,1-9,11- oder -11,12-Dehydro-progesteron, d,1-19-Oxo-progesteron, d,

1-11-Oxo-17a-oxy-progesteron, d;1-11-a- sowie -11ss-Oxy-17a-oxy-progesteron, d,1-9-Chlor- oder -9-Fluor-11ss,17a-dioxy- progesteron, d,1-1 lss,18-Dioxy-progesteron, d,1-11 ss,17,18-Trioxy-progesteron, d;1-1 l;ss-Oxy-1 8-oxo-progesteron, d,1-9-Chlor- oder -9-Fluor-llss-oxy-18-oxo- progesteron, d,l-11,18-Dioxo-progesteron, d;

1-19-Nor-progesteron, d,1-19-Nor-11 ss-oxy-18-oxo-progesteron; d,l-Cortexon, d,1-18-Oxy- und -18-Oxo-cortexon, d,l-Cortison, d,1-Hydrocortison, d,1-17 a-Oxy-cortexon, d,l-Aldosteron, d,l-Pregnenolon, die entsprechenden 1-Dehydroverbindungen, z. B.

d,1-1-Dehydroprogesteron, d,1-1-Dehydro-17a-oxy-progesteron,
EMI0002.0001

tisch einfachste Verfahren ist im folgenden geschil dert: Man züchtet die 'Organismen in Apparaturen und unter ähnlichen Bedingungen, wie sie bei der Antibiotika-Fabrikation als sog. Tieftankverfahren bekannt sind. Nach Entwicklung der Kulturen gibt man die d,1-Steroide in feiner Dispersion oder Lö sung; beispielsweise in Methanol, Aceton oder Äthylenglykol, zu und inkubiert weiter.

Schliesslich trennt man vom Mycel ab, extrahiert das Filtrat und/oder die Mycelmasse und isoliert aus dem Extrakt die d-Oxy-steroide und/oder die 1-Steroide in an sich bekannter Weise, z. B. durch Entmi- schungsverfahren, Adsorption, Chromatographie, Kristallisation, Überführung in funktionelle Derivate, wie Girard-Verbindungen und dergleichen.

Man kann auch die wirksamen Enzyme aus den aeroben Kulturen der genannten Organismen abtrennen und unter Ausschluss der wachsenden Kulturen verwen den. So kann man z. B. das Mycel abtrennen, in Wasser oder Pufferlösungen suspendieren, die d,1- Steroide diesen Aufschlämmungen zugeben und inkubieren.

Sollen in einem Arbeitsgang mehrere Mikro organismen zur Einwirkung gelangen, so kann man beispielsweise wie folgt vorgehen: Nach Entwicklung der Kulturen des ersten Organismus gibt man die d,l-Steroide in feiner Dispersion oder Lösung, bei spielsweise in Methanol, Aceton oder Athylenglykol, zu und inkubiert weiter, bis die maximale Reaktion erreicht ist. Dann gibt man, ohne vorher zu filtrieren oder das Oxydationsprodukt zu isolieren, zum Re aktionsgemisch eine ausgewachsene Kultur des zwei ten Organismus und nötigenfalls entsprechende Nähr substanzen und Wachsstoffe zu und fährt mit der Inkubation fort. Gegebenenfalls wird diese Operation mit einem dritten Mikroorganismus wiederholt.

Der Verlauf der einzelnen Oxydationen kann papier- chromatographisch verfolgt werden.

Die Verfahrensprodukte können als Heilmittel Verwendung finden oder als Zwischenprodukte zu ihrer Herstellung dienen. Besonders wertvoll hat sich das neue Verfahren bei der Aldosteron-Synthese erwiesen. So erhält man z. B. bei der Einwirkung einer aeroben Kultur von Ophiobolus herpotrichus auf d,1 - 44 - 3,18,20-Trioxo-11-ss-oxy-pregnen bzw. sein 18,11-Cyclohalbacetal in einem einzigen Schritt in guter Ausbeute d-Aldosteron. Bei Anwendung rein chemischer Verfahren sind für diese Synthese, ausgehend vom gleichen Ausgangsstoff, etwa sieben Stufen erforderlich.

Allgemein ist die Racematspaltung nach. dem neuen Verfahren besonders einfach, weil die hy- droxxlierten Derivate des einen Antipoden sich vom unveränderten andern Antipoden infolge ihrer höheren Polarität leicht abtrennen lassen.

Bereits seit den klassischen Untersuchungen von Pasteur hat man zwar gelegentlich mikrobiologische Methoden zur Gewinnung des einen Antipoden aus Racematen angewandt. Dabei wurden gewöhnlich Pilze oder Bakterien verwendet, die die Ausgangs- Stoffe assimilierten, und zwar den natürlichen (d) Antipoden rascher als den unnatürlichen (1). Nach diesem Verfahren masste also, um ein optisch reines Präparat zu erhalten, so lange mikrobiologisch behan delt werden, bis mindestens die eine Form, und zwar meist die biologisch interessantere, völlig zerstört war.

Demgegenüber liefert das neue Verfahren auch bei nur teilweiser Umsetzung den umgewan delten Antipoden, der meist den biologisch interessan teren darstellt, in optisch reiner Form, und zwar als Derivat, das an sich oder für weitere Synthese zwecke praktisch wertvoll sein und chemische Um wandlungen ersparen kann. Wird beim neuen Ver fahren der eine Antipode völlig umgesetzt, so fällt auch der andere in optisch reiner Form an.

Beispiel 1 In fünf Erlenmeyerkolben von 500 cm3 Kapazi tät werden je 120 cm3 70 e/oige wässrige Bierwürze sterilisiert und mit Ophiobolus herpotrichus beimpft. Die Kolben werden bei 27 geschüttelt. Nach 4 Tagen gibt man zu den gut entwickelten Kulturen unter sterilen Bedingungen je eine Lösung von 30 mg d,1 Progesteron in 1,5 cm3 Aceton und lässt weiter bei der gleichen Temperatur schütteln. Nach 4 Tagen wird das Mycel abgetrennt und mit Wasser und Essigester gewaschen.

Man schüttelt die ver einigten Filtrate viermal mit je 200 cm3 Essigester aus. Die vereinigten Extrakte werden mit Wasser gewaschen, getrocknet und eingedampft. Der Rück stand (160 mg) enthält gemäss papierchromatogra- phischer Auswertung ungefähr gleiche Mengen von zwei Verbindungen, die sich wie Cortexon (11- Desoxy-corticosteron resp. Progesteron) verhalten.

Er wird mittels eines präparativen Papierchromato- grammes mit dem System Bush B 3 aufgetrennt. Die dem Cortexon entsprechenden Zonen werden aus geschnitten und mit 400 cm3 50 0/eigem Methanol eluiert. Das Methanol wird darauf im Vakuum ent fernt.

Man schüttelt die zurückbleibende wässrige Lösung viermal mit je 50 eins Chloroform aus und wäscht die vereinigten Extrakte mit Wasser, trocknet sie und dampft sie im Vakuum ein. Der Rückstand wird aus Aceton-Äther kristallisiert, wobei man das d-Cortexon vom F. = 140-143 in reiner Form erhält. [a]D = 1-180 (Äthanol).

Die dem Progeste ron entsprechenden Zonen des präparativen Pa- pierchromatogrammes werden in gleicher Weise aufgearbeitet. Man erhält 92 mg Rohextrakt, woraus man durch mehrmalige Kristallisation aus Aceton- Petroläthergemischen reines 1 -Progesteron gewinnt. F. = 122-125 , [a]D = -190 (Aceton).

Beispiel 2 In einem Schüttelgefäss werden 500 cm3 sterile Bierwürze mit Cunninghamella Blakesleena beimpft und drei Tage bei 27 geschüttelt. Dann gibt man zur gut entwickelten Kultur unter sterilen Bedin gungen eine Lösung von 150 mg d,l-Cortexon in 8 cm3 Aceton.

Gleichzeitig beeimpft man in einem zweiten Gefäss 500 cm3 sterile Bierwürze mit Tri- chothecium roseum. Beide Kulturen werden 3 Tage bei 27 geschüttelt und dann unter sterilen Bedin gungen vereinigt, worauf weiter bei der gleichen Temperatur geschüttelt wird. Nach drei Tagen trennt man das Mycel ab und wäscht es mit Wasser und Essigester.

Die vereinigten Filtrate werden wie in Beispiel 1 beschrieben extrahiert. Der erhaltene Rück stand (165 mg) besteht gemäss papierchromatographi- scher Auswertung zur Hauptsache aus drei Verbin dungen, die dem, Cortexon, Hydrocortison resp. Corti- son entsprechen.

Er wird an 8 g Silicagel nach der Durchlaufmethode chromatographiert, wobei zuerst mit Chloroform, dann mit Chloroform-Aceton (99:1) und schliesslich mit Chloroform-Aceton (1 : 1) eluiert wird. Die einzelnen Fraktionen (je 20 cm3) werden papierchromatographisch untersucht.

Die mit Chloro form eluierten Anteile enthalten Verunreinigungen, während in den Chloroform-Aceton-(99:1)-Frak- tionen eine dem Cortexon entsprechende Verbin dung vorhanden ist. Diese Fraktionen werden ver einigt und eingedampft. Durch Kristallisation aus Aceton-Ather-Gemischen erhält man das 1-Cortexon. F. = 138-142 , [a]D = -l75 (Äthanol).

Die weiteren, mit Chloroform-Aceton (1 :1) eluierten Anteile bestehen zur Hauptsache aus d-Hy- drocortison und d-Cortison. Sie werden vereinigt, eingedampft und mittels eines präparativen Papier chromatogrammes (System Propylenglykol-Toluol) aufgetrennt. Die Aufarbeitung der das d-Hydro- cortison resp. das d-Cortison enthaltenden Papier zonen geschieht wie in Beispiel 1 beschrieben.

Durch Kristallisation der beiden Extraktionsrückstände aus @ Aceton-Isopropyläther-Gemischen erhält man d-Hydrocortison vom F.= 205-210 ,[a]D = -r165 (Äthanol), neben d-Cortison vom F. = 210-216 , [a]D = +195 (Dioxan).

Beispiel 3 Eine Nährlösung wird hergestellt, die auf einen Liter Leitungswasser 20 g Pepton, 5 cm3 Maisquell wasser (Comsteepliquor) und 10g Rohglukose ent hält und deren pA auf 6,3 eingestellt wird. Davon werden je 120 cms in vier Erlenmeyerkolben von 500 cm?, Kapazität sterilisiert und mit Wojnowicia graminis beimpft.

Die Kulturen werden 4 Tage lang bei 27 geschüttelt; worauf unter sterilen Be dingungen Lösungen von je 30 mg (18 ->. 11ss) Lakton der d,l-d4-3,20-Dioxo-llfl-oxy-pregnen-18- säure in 1,5 cm-9 Methanol zugegeben werden. Dann lässt man weiter bei der gleichen Temperatur schüt teln. Nach 8 Tagen trennt man das Mycel ab, wäscht es mit Wasser und Essigester und extrahiert die vereinigten Filtrate wie in Beispiel 1 beschrieben.

Der Extraktionsrückstand (140 mg) enthält gemäss papierchromatographischer Auswertung ein dem Ausgangsmaterial ähnliches Produkt sowie das (18 -3 11,6)-Lakton der d4-3,20-Dioxo-11ss,21-di- oxy-pregnen-18-säure. Er wird mittels präparativer Papierchromatographie (System Formamid-Benzol- Chloroform) aufgetrennt. Die beiden Komponenten werden, wie in Beispiel 1 beschrieben, aus dem Pa pier eluiert und extrahiert.

Durch Kristallisation aus Aceton-Äther erhält man das (18--> 11ss)-Lakton der d-d4-3,20-Dioxo-11ss,21-dioxy-pregnen-18-säure vom F. = 205-222 , [a]D = 117 (Aceton).

Beispiel 4 Vier Erlenmeyerkolben werden mit je 120 cm3 der in Beispiel 3 beschriebenen Nährlösung beschickt und sterilisiert. Man- beimpft mit Ophiobolus herpo- trichus urld lässt die Kulturen 5 Tage bei 27 schüt teln.

Dann wird zu jeder Kultur unter sterilen Be dingungen eine Lösung von 30 mg d,1-44-3,18,20- Trioxo-llss-oxy-pregnen bzw. seines 18,11-Cyclo- halbacetals in 1,5 cm3 Methanol zugegeben und weiter bei der gleichen Temperatur geschüttelt. Nach 10 Tagen trennt man das Mycel ab, wäscht es mit Wasser und Essigester und extrahiert die vereinigten Filtrate wie in Beispiel 1 beschrieben. Der Extrak tionsrückstand enthält neben einem dem Ausgangs material ähnlichen Produkt eine wie Aldosteron lau fende Verbindung.

Dieser wird mittels präparativer Papiercbromatographie (System Bush C) gereinigt, wobei die Elution und Extraktion gemäss der Be schreibung in Beispiel 1 erfolgt. Aus Aceton-Ätlier erhält man kristallines d-Aldosteron, F. = 162-168 , [a]D = -(-142 (Aceton).

Beispiel S In einem Schüttelgefäss werden 300 cm3 der in Beispiel 3 beschriebenen Nährlösung sterilisiert und mit Wojnowicia graminis beimpft. Nach viertägigem Schütteln hat sich die Kultur gut entwickelt, und man gibt unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 50 mg d,1-d4-3,18,20-Trioxo-llss-oxy-pregnen bzw. seines 18,11-Cyclohalbacetals in 3 cm3 Methanol zu.

Gleichzeitig werden in einem zweiten Schüttelgefäss 300 cm3 sterilisierte Bierwürze mit Trichothecium roseum beimpft. Man lässt beide Kulturen 4 Tage bei 27 schütteln, vereinigt sie dann unter sterilen Bedingungen und lässt weiter bei der gleichen Tempe ratur schütteln. Nach 4 Tagen wird das Mycel abge trennt und mit Wasser und Essigester gewaschen. Die vereinigten Filtrate werden wie in Beispiel 1 beschrieben extrahiert.

Der Extraktionsrückstand (55 mg) enthält neben einer Verbindung, die sich wie Ausgangsmaterial verhält, d-17a-Oxy-aldosteron. Dieses wird nach präparativer Papierchromatogra- phie (System Propylenglykol-Toluol) in einheitlichem Zustand erhalten, wobei die Elution und Extraktion der Papiere gemäss den Angaben in Beispiel 1 vor genommen wird.

Beispiel 6 In einem Schüttelgefäss werden 300 cm3 Bier würze sterilisiert und mit Trichothecium roseum be- impft. Die Kultur wird 4 Tage bei 27 geschüttelt, worauf unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 60 mg d,1-Aldosteron in 3 cm3 Methanol zugegeben wird. Man lässt weitere 4- Tage bei 2711-schütteln, trennt dann das Mycel ab und wäscht es mit Wasser und Essigester. Man extrahiert die vereinigten Fil trate wie in Beispiel 1 beschrieben.

Der Extraktions rückstand, der neben Ausgangsmaterial d-17a-Oxy- aldosteron enthält, wird mittels präparativer Papier chromatographie (System Bush C) aufgetrennt. Das d--17a-Oxy-aldosteron wird durch Elution der ent sprechenden Zonen der Papiere nach den Angaben in Beispiel 1 in einheitlicher Form gewonnen.

Es kristallisiert aus einem Aceton-Äther-Gemisch. Aus den dem Ausgangsmaterial entsprechenden Zonen erhält man durch Kristallisation aus Äther-Aceton das 1-Aldosteron vom F. = 162-168 und der Drehung [a]D = -142 (Aceton).

Beispiel 7 In einem Schüttelgefäss werden 300 cm3 sterile Bierwürze mit Ophiobolus herpotrichus beimpft und bei 27 geschüttelt. Nach 5 Tagen gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 60 mg d,l-d4- 3,20-Dioxo-11ss,18-dioxy-pregnen in 4 cm3 Me thanol zu und lässt weiter bei der gleichen Tempera tur schütteln. Nach 6 Tagen wird das Mycel abge trennt und mit Wasser und Essigester gewaschen. Die vereinigten Filtrate extrahiert man wie in Bei spiel 1 angegeben.

Der Extraktionsrückstand besteht gemäss der papierchromatographischen Auswertung aus einer dem Ausgangsmaterial ähnlichen Verbin dung sowie aus d-44-3,20-Dioxo-11,B,18,21-trioxy- pregnen, welche mittels präparativer Papierchro- matographie (System Propylenglykol-Toluol) ge trennt werden.

Das d-d4-3,20-Dioxo-11,B,18,21-tri- oxy-pregnen kristallisiert aus Aceton-Äther-Gemisch. Beispiel 8 Man bereitet eine Nährlösung, die auf 1 Liter Leitungswasser 2,6g Weinsäure, 2,6 g Ammonium- tartrat, 0,17g Ammoniumsulfat, 0,4 g sek. Ammo- niumphosphat, 0,4 g Kaliumcarbonat, 0,27g Ma- gnesiumcarbonat, 50 g Glukose und 1 g Hefeextrakt (Difco) enthält und stellt das pn auf 5;

0 ein. 120 cm3 dieser Lösung werden in einem Erlenmeyerkolben sterilisiert, mit Rhizopus nigricans beimpft und bei 27 geschüttelt. Nach 2 Tagen gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 30 mg d,1-Progesteron in 1,5 cm3 Aceton zu und lässt weitere 2 Tage bei 27 schütteln. Dann wird das Mycel abgetrennt und mit Wasser und Methylenchlorid gewaschen.

Man schüttelt die vereinigten Filtrate fünfmal mit Methy- lenchlorid aus, wäscht die Extrakte mit Wasser, trocknet sie und dampft sie ein. Die papierchromato- graphische Untersuchung des Extraktionsrückstandes zeigt, dass dieser zu ungefähr gleichen Teilen aus Verbindungen besteht, die dem Progesteron resp. dem 1 l a-Oxy-progesteron entsprechen.

Mittels prä- parativer Papierchromatographie wird das Gemisch aufgetrennt und man erhält durch Umkristallisation aus Aceton-Petroläther-Gemischen einerseits 1-Prog- esteron vom F. = 118-120 , [a]D = -l87 (in Dioxan); und anderseits d-lla-Oxy-progesteron vom F. = 169-171 , [a]D = -f-176 (in Chloroform).

Beispiel 9 Man bereitet eine Nährlösung; die auf 1 Liter Leitungswasser 10 g Rohrzucker; 10 g Difco-Tryp- ton; 2 g Natriumnitrat, 1 g .sek. Kaliumphosphat, 0,5g Magnesiumsulfat, 0,5g Kaliumchlorid und 10 mg Ferrosulfat-heptahydrat enthält, stellt das pH auf 7,0 ein und gibt dann 2,5g Calciumcarbonat zu.

120 cm3 dieser Lösung werden in einem Erlen meyerkolben sterilisiert, mit Curvularia lunata be- impft und bei 27 geschüttelt. Nach 2 Tagen wird das Mycel abgetrennt, mit wenig Wasser gewaschen und in 120 cm3 dest. Wasser suspendiert. Zu dieser Suspension gibt man eine Lösung von 30 mg d,l- Cortexon in 1,5 cms Aceton und lässt sie 30 Stun den bei 27 schütteln. Dann wird das Gemisch vier mal mit Essigester ausgeschüttelt.

Die Extrakte wäscht man mit Wasser, trocknet sie und dampft sie ein. Der Extraktionsrückstand besteht gemäss papier- chromatographischer Auswertung zur_ Hauptsache aus zwei Substanzen, die dem Cortexon resp. dem Corticosteron entsprechen.

Mittels präparativer Pa- pierchromatographie und anschliessender Kristallisa tion aus Aceton-Petroläther-Gemischen erhält man 1-Cortexon vom F. = 138-141 ; [ab = -l75 (in abs. Alkohol), und d-Corticosteron vom F. = 178 bis 181 , [a]D = +2200 (in abs. Alkohol).

Beispiel 10 Gibt man zu einer Mycelsuspension von Curvu- laria lunata in 120 cm3 Best. Wasser, die, wie im obigen Beispiel erhalten wurde, eine Lösung von 30 mg d,1-17a-Oxy-cortexon in 1,5 cm- Methanol, und arbeitet man wie beschrieben nach 2tägigem Schütteln bei 27 auf, so enthält der Extraktions rückstand gemäss papierchromatographischer Aus wertung zur Hauptsache zwei Substanzen, die dem 17a-Oxy-cortexon resp. dem 17a-Oxy-corticosteron entsprechen.

Das Gemisch wird mittels präparativer Papierchromatographie aufgetrennt und man erhält einerseits 1-17a-Oxy-cortexon vom F. = 210-214 , [a]D = -140 (in abs. Alkohol), und anderseits d - 17a - Oxy - corticosteron (d-Hydrocortison) vom F. = 209-212 , [a]D = +171o (in abs. Alkohol).

Beispiel 11 120 cms einer sterilisierten Czapek-Dox-Nähr- Lösung werden mit einer Kultur von Trichothecium roseum beimpft und 5 Tage bei 27 geschüttelt. Dann gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lö sung von 30 mg d,l-Aldosteron in 1,5 cm3 Aceton zu und schüttelt weiter bei der gleichen Temperatur. Nach 4 Tagen wird das Mycel abgetrennt und mit Wasser und Essigester gewaschen. Die vereinigten Filtrate extrahiert man wie in Beispiel 1 beschrieben.

Gemäss der papierchromatographischen Untersu chung besteht der Extraktionsrückstand zur Haupt sache aus einem Produkt, das sich wie Aldosteron verhält, und aus 17a-Oxy-aldosterori. Die beiden Substanzen werden mittels präparativer Papier- chromatographie (System Bush C) getrennt. Man er hält 1-Aldosteron und d-17a-Oxy-aldosteron.

Beispiel 12 120 cm-' sterile Bierwürze werden mit einer Kultur von Ophiobolus herpotrichus beimpft und 3 Tage bei 27 geschüttelt.

Dann gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 40 mg d,l-d4- 3;20 - Diketo - 1. 1ss - oxy - pregnen-18 -säure-lakton- (18 -> 11,B) in 1,5 cm3 Aceton zu und lässt weiter bei 27 schütteln. Nach 6 Tagen wird das Mycel ab getrennt und mit Wasser und Essigester gewaschen. Man extrahiert die vereinigten Filtrate wie in Bei spiel 1 beschrieben.

Der Extraktionsrückstand be steht gemäss papierchromatographischer Unter suchung aus einem Produkt, das sich wie das Aus gangsmaterial verhält, und aus d4-3,20-Diketo- 11ss,21-dioxy-pregnen-18 säure-lakton-(18 -@ 11ss,). Mittels präparativer Papierchromatographie werden die beiden Substanzen getrennt und man erhält 1-44 3,

20 - Diketo - 11i3 - oxy - pregnen-18 -säure-lakton- (18 -> l 1ss) ([a]D = -154 ) und d-d4-3,20-Diketo- 11ss,21 - dioxy - pregnen-18-säure-lakton-(18 -> l 1ss) ([a]D = -I-117 ).

Beispiel 13 120 cm3 sterile Bierwürze werden mit einer Kultur von Ophiobolus herpotrichus beimpft und 3 Tage bei 27 geschüttelt. Dann gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 40 mg d,l-d4- 3,18,20 Trioxo-llss-oxy-pregnen bzw. dessen 18,11 Cyclohalbacetal in 1,5 cms .Aceton zu und lässt wei ter bei 27 schütteln. Nach 6 Tagen wird das Mycel abgetrennt und mit Wasser und Essigester gewa schen. Man extrahiert die vereinigten Filtrate wie in Beispiel 8 beschrieben.

Der Extraktionsrückstand besteht gemäss papierchromatographischer Unter suchung aus einem Produkt, das sich wie Ausgangs material verhält; und aus Aldosteron.'Mittels präpa- rativer Papierchromatographie werden die beiden Substanzen getrennt und man erhält 1-44-3,18,20- Trioxo-llss-oxy-pregnen bzw. dessen 18,11-Cyclo- halbacetal und d-Aldosteron ([a]D = -[-142 ).

Beispiel 14 120 cm3 sterile Bierwürze werden mit einer Kultur von Ophiobolus herpotrichus beimpft und 3 Tage bei 27 geschüttelt. Dann gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 40 mg d,1-19- Nor-progesteron in 1,5 cm3 Aceton zu und lässt weiter bei 27 schütteln. Nach 3 Tagen wird das Mycel abgetrennt und mit Wasser und Essigester ge waschen.

Man extrahiert die vereinigten Filtrate wie in. Beispiel 8 beschrieben. Der Extraktionsrückstand besteht gemäss papierchromatographischer Unter suchung aus einem Produkt, das sich wie Ausgangs material verhält, und aus 19-Nor-cortexon. Mittels präparativer Papierchromatographie werden die bei den Substanzen getrennt und man erhält 1-19-Nor- progesteron ([a]D =-143 )

und d-19-Nor-cortexon. Das aus letzterem in üblicher Weise mittels Pyridin- Acetanhydrid erhältliche 21-Acetat zeigt ein [a]D von -j- 145 .

Beispiel15 120 cm3 sterile Bierwürze werden mit einer Kultur von Ophiobolus herpotrichus beimpft und 3 Tage bei 27 geschüttelt. Dann gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 40 mg d,l-9a- Fluor-llfl=oxy-progesteron in 1,5 cm3 Aceton zu und lässt weiter bei 27 schütteln. Nach 4 Tagen wird das Mycel abgetrennt und mit Wasser und Essigester gewaschen. Man extrahiert die vereinigten Filtrate wie in Beispiel 8 beschrieben.

Der Extrak tionsrückstand besteht gemäss papierchromatogra- phischer Untersuchung aus einem Produkt, das sich wie . Ausgangsmaterial verhält, und aus 9a-Fluor- corticosteron. Mittels präparativer Papierchromato- graphie werden die beiden Substanzen getrennt, und man erhält 1-9a-Fluor-11,8-oxy-progesteron ([a]D = -190 )

und 9a-Fluor-corticosteron. Das aus letz terem in üblicher Weise mittels Pyridin-Acetanhydrid erhältliche 21-Monoacetat zeigt ein [a]D von -f-187 . Beispiel 16 120 cm3 sterile Bierwürze werden mit einer Kultur von Rhizopus arrhizus beimpft und 3 Tage bei 27 geschüttelt.

Dann gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 30 mg d,l-Cortexon (11-Desoxy-corticosteron) in 1,5 cm3 Acetön zu und lässt weiter bei 27 schütteln. Nach 4 Tagen wird das Mycel abgetrennt und das Kulturfiltrat wie in den vorherigen Beispielen beschrieben extrahiert.

Der Extraktionsrückstand besteht gemäss papierchromato- graphischer Untersuchung zur Hauptsache aus einem Produkt, das sich wie Ausgangsmaterial verhält, und aus 6ss-Oxy-cortexon. Mittels präparativer Pa- pierchromatographie werden die beiden Substanzen getrennt. Man erhält 1-Cortexon ([a]D = -175 ) und d-6ss-Oxy-cortexon ([a]D = -f-100 ).

Beispiel 17 120 cm3 sterile -Bierwürze werden mit einer Kultur von Peziza sp. ETH M 26 beimpft und 3 Tage bei 27 geschüttelt. Dann gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 30 mg d,l- Cortexon (11-Desoxy-corticosteron) in 1,5 cm3 Aceton zu und lässt weiter bei 27 schütteln. Nach 4 Tagen wird das Mycel abgetrennt und das Kultur filtrat, wie in den vorherigen Beispielen beschrieben,

extrahiert. Der Extraktionsrückstand besteht gemäss papierchromatographischer Untersuchung zur Haupt sache aus einem Produkt, das sich wie Ausgangs material verhält, und aus 7a-Oxy-cortexon. Mittels präparativer Papierchromatographie werden die bei den Substanzen getrennt. Man erhält 1-Cortexon ([a]D = -173 ) und d-7a-Oxy-cortexon ([a]D = -j-155 ).

Beispiel18 120 cms sterile Bierwürze werden mit einer Kultur von Lenzites abietina beimpft und 3 Tage bei 27 geschüttelt. Dann gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 30 mg d,l-Cortexon- (11-Desoxy-corticosteron in 1,5 cm3 Aceton zu und lässt weiter bei 27 schütteln. Nach 4 Tagen wird das Mycel abgetrennt und das Kulturfiltrat wie in den vorherigen Beispielen beschrieben extrahiert.

Der Extraktionsrückstand besteht gemäss papier- chromatographischer Untersuchung zur Hauptsache aus einem Produkt, das sich wie Ausgangsmaterial verhält, und aus 15f Oxy-cortexon. Mittels präpa- rativer Papierchromatographie werden die beiden Substanzen getrennt. Man erhält 1-Cortexon ([a]D = -170 ) und d-15f-Oxy-cortexon ([a]D = + 141 ).

Beispiel 19 120 cm3 sterile Czapek-Dox-Nährlösung werden mit einer Kultur von Gibberella baccata beimpft und 3 Tage bei 27 geschüttelt. Dann gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 30 mg d,1-Cortexon-(11-Desoxy-corticosteron) in 1,5 cm3 Aceton zu und lässt weiter bei 27 schütteln. Nach 4 Tagen wird das Mycel abgetrennt und das Kultur filtrat wie in den vorherigen Beispielen beschrieben extrahiert.

Der Extraktionsrückstand besteht gemäss papierchromatographischer Untersuchung zur Haupt sache aus einem Produkt, das sich wie Ausgangs material verhält, und aus 15a-Oxy-cortexon. Mittels präparativer Papierchromatographie werden die bei den Substanzen getrennt. Man erhält 1-Cortexon ([a]D = -169 ) und d-15a-Oxy-cortexon ([a]D = +195 ).

Beispiel 20 120 cm3 sterile Bierwürze werden mit einer Kultur von Pleospora Gaeumanni beimpft und 3 Tage bei 27 geschüttelt. Dann gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 30 mg dj- Cortexon (11 - Desoxy - corticosteron) üi 1,5 cm3 Aceton zu und lässt weiter bei 27 schütteln. Nach 4 Tagen wird das Mycel abgetrennt und das Kultur filtrat wie in den vorherigen Beispielen beschrieben extrahiert.

Der Extraktionsrückstand besteht gemäss papierchromatographischer Untersuchung zur Haupt sache aus einem Produkt, das sich wie Ausgangs material verhält, und aus 14a-Oxy-cortexon. Mittels präparativer Papierchromatographie werden die bei den Substanzen getrennt. Man erhält 1-Cortexon ([a]D = -l74 ) und d-14a-Oxy-cortexon (lab = -i--179 ). .

Beispiel 21 120 cms einer Nährlösung, die auf 1 Liter Lei tungswasser 10g Rohglukose, 5 g Pepton, 5 g NaCl, 3 g Fleischextrakt ( Oxo Lab Lemco ; Markenpro dukt) und 10 g CaCO3 enthält und mit verd. NaOH auf PH 7,5 gebracht wird, werden sterilisiert -und mit einer Kultur des Streptomyces-Stammes Nr. 7747 (Institut für spezielle Botanik, ETH Zürich) beimpft.

Man lässt 2 Tage bei 27 schütteln und gibt dann unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 30 mg dj-Cortexon in 1,5 cm3 Aceton zu. Man schüttelt weiter bei der gleichen Temperatur und trennt nach 2 Tagen das Mycel ab. Das Kulturfiltrat wird wie in Beispiel 1 beschrieben extrahiert.

Der Extrak tionsrückstand besteht gemäss papierchromatogra- phischer Untersuchung aus einem Produkt, das sich wie Ausgangsmaterial verhält, und aus 16a-Oxy- cortexon. Die beiden Substanzen werden mittels prä- parativer Papierchromatographie getrennt.

Man er hält 1-Cortexon ([a]D = -171 ) und d-16a-Oxy- cortexon ([ab = 1140)- Die als Ausgangsstoffe in Betracht kommenden d,l-Steroide lassen sich nach an sich bekannten Ver fahren ausgehend von den totalsynthetisch zugäng lichen tetracyclischen Zwischenprodukten, z. B. der Cholestan-, Pregnan- oder Testanreihe, herstellen.

Claims

PATENTANSPRUCH Verfahren zur Racematspaltung von d,l-Steroiden, dadurch gekennzeichnet, dass man auf d,l-Steroide aerobe Kulturen von hydroxylierend wirkende Enzyme produzierenden Mikroorganismen oder die entsprechenden Enzyme einwirken lässt, wobei prak tisch nur die d-Form hydroxyliert wird, und dass man das unveränderte 1-Steroid und/oder das d-Oxy- steroid isoliert. UNTERANSPRÜCHE 1.

Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man Mikroorganismen oder ent sprechende Enzyme verwendet, die in 6-, 7-, 8-, 11-, 14-, 15-, 16-, 17- oder 21-Stellung Hydroxyl einzuführen vermögen. 2. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man auf d,l-Progesteron einen in 21-Stellung hydroxylierenden Mikroorganismus oder ein entsprechendes Enzym einwirken lässt. 3. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man auf dj-Cortexon in 11- und 17-Stellung hydroxylierende Mikroorganismen oder entsprechende Enzyme einwirken lässt. 4.

Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man auf das d;l-d4-3,20-Dioxo- 11ss-oxy-pregnen-18-säure-lakton-(18 -> 11) einen in 21-Stellung hydroxylierenden Mikroorganismus oder ein entsprechendes Enzym einwirken lässt. 5.

Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man auf d,1-44-3,18,20-Trioxo- ll,8-oxy-pregnen bzw. sein 18,11-Cyclohalbacetal einen in 21-Stellung hydroxylierenden Mikroorganis mus oder ein entsprechendes Enzym einwirken lässt.