CH346975A

CH346975A - Verfahren zur Herstellung von Novobiocin

Info

Publication number: CH346975A
Authority: CH
Inventors: Wallick Hyman; James Wolf Frank; Anthony Kaczka Edward
Original assignee: Merck & Co Inc
Priority date: 1955-04-21
Filing date: 1956-04-21
Publication date: 1960-06-15

Description

<Desc/Clms Page number 1>
Verfahren zur Herstellung von Novobiocin Die Auffindung der erstaunlichen antibiotischen Eigenschaften des Penicillins erregte grosses Interesse und hatte die Entdeckung vieler anderer wertvoller Antibiotika zur Folge, z. B. Streptothricin, Strepto- mycin, Gramicidin, Subtilin, Bacitracin, Chlortetra- cyclin, Oxytetracyclin, Terramycin und dergleichen. Im allgemeinen wirken einige dieser Antibiotika auf bestimmte gram-negative Erreger, andere sind gegen gram-positive Erreger wirksam und andere wiederum sowohl gegen gram-negative als auch gram-positive Erreger.

Gewöhnlich ist jedoch die Aktivität der bekannten Antibiotika auf einige pathogene Erreger beschränkt; man hat fortgesetzt versucht, Antibiotika aufzufinden, die gegen andere Erreger wirksam sind.

Manche Antibiotika haben sich bei der Behandlung verschiedener Krankheiten als unschätzbar erwiesen. Bestimmte Stämme einiger pathogener Organismen werden jedoch bisweilen gegenüber einem bestimmten Antibiotikum resistent; das betreffende Antibiotikum besitzt dann keine Aktivität mehr gegen diese Stämme.

Diese Unzulänglichkeit gewisser bekannter Antibiotika hat nun weitere Forschungsarbeiten mit dem Ziel ausgelöst, Antibiotika aufzufinden, welche sowohl in einem breiteren Bereich pathogener Erreger als auch gegen die resistenten Stämme bestimmter Organismen aktiv sind.

Die Erfindung bezieht sich nun auf ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums, nämlich von Novobiocin, welches gegenüber verschiedenen pathogenen Bakterien, insbesondere gram-positiven Erregern wachstumshemmend wirkt. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man Novobiocin erzeugende Organismen in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen kultiviert. Für die Herstellung des neuen Antibiotikums kommt in erster Linie eine bisher unbekannte Mikrobenart in Betracht, die als Streptomyces sphäroides bezeichnet werden soll. Diese wurde aus einer Bodenprobe aus altem Weideland in Vermont isoliert.

Die neue Mikrobe erhielt die Bezeichnung Streptomyces sphäroides MA-319 in der Kultursammlung der Fa. Merck & Co., Inc., Rahway, New Jersey. Eine Kultur wurde bei der Fermentation Section of the Northern Utilization Research Branch, United States Department of Agriculture in Peoria, Illinois, hinterlegt und in diese Dauerkultursammlung unter der Bezeichnung NRRL 2449 aufgenommen.

Die morphologischen und Kultureigenschaften von Streptomyces sphäroides sind in folgender Tabelle zusammengestellt: Morphologie: (Auf YED, Czapeks Saccharose und Glucose- Asparagin-Agar) Sporen oval, 0,7-1,1 Mikron Breite, l,5-2,0 Mikron Länge. Einige Spiralen sind offen, die Mehrzahl aber liegt geschlossen und kompakt. In einigen Zonen erscheinen die Spiralen kugelähnlich.

Czapeks Saccharose: Schnelles Wachstum des auf der Unterseite der Kolonie zu beobachtenden, eingetauchten Mycels. Reichliches weisses Luftmycel in gelblichweissem bis olivgrauem Farbton. Kein Wachstum in dem Medium. Kein lösliches Pigment. Unterseite weiss, wird strohfarben. Oberflächenwachstum glänzend. Gelatine: Verflüssigung beginnt in 2 bis 3 Tagen. Vollständige Verflüssigung nach 10 bis 11 Tagen. Kein lösliches Pigment. Gelblichweiss gefärbtes, flockiges Sediment.

Glucose-Asparagin-Agar: Reichliche weisse Luftmycelbildung, wird grau. Kein lösliches Pigment.

Glucose-Pepton-Agar: Mässiges gelbes Wachstum. Grauweisses Luft- mycel. Unterseite strohfarben. Kein lösliches Pigment.

Glycosebrühe: Häutchen. Sinkt beim Rühren auf den Boden des Reagenzrohres. Kein lösliches Pigment. Oberflächenhäutchen in alter Kultur.

Milch: 28 C: in 7 Tagen keine Änderung; nach 14 Tagen Ring bei pH 7,0; nach 15 bis 23 Tagen beginnende Koagulation und Peptonisierung; 23 Tage pH = 6,5, Koagulation nach 45 Tagen vollständig.

37 C: kein Wachstum. Kartoffelstopfen: Langsam. Spärliches, weisses Wachstum in 7 Tagen. Nach 14 Tagen schweres graues Wachstum. Graues Luftmycel. Kartoffel wird dunkelbraun. Stärke-Agar: Lösliche Stärke: nach 4 Tagen Stärke hydroly- siert. Schweres Wachstum; weisses Luftmycel. Unterseite gelblichweiss bis strohfarben.

Streptomyces spheroides Stärke-Agar: Kartoffelstärke: nach 4 Tagen Stärke hydrolysiert. Schweres Wachstum; durchscheinendes farbloses Wachstum, wird grau bis grauweiss. Weisses Luft- mycel.

Nitrat-Agar: 2 Tage: schwache Reduktion zu Nitrit. 4 Tage: schwache Reduktion zu Nitrit. Nähr-Glucose-Agar: Mässiges farbloses Wachstum, reichliche Bildung von weissem Luftmycel. Unterseite schwach strohfarben. Kein Wachstum in dem Medium.

Milch-Agar: Hydrolyse von Kasein nur unter Kolonien. Möhre: Sehr schweres weisses Wachstum. Citrate: Sehr spärliches Wachstum. Optimale Temperatur: 20 bis 26 C: Gutes Wachstum. 28 C: Sehr gutes Wachstum. 37 C: Kein Wachstum.

50 C: Kein Wachstum. Indol: Negativ. Tyrosin-Agar: Reichliche Bildung von weissem Luftmycel. Kein Pigment. 18 Tage: Strohfarbenes Pigment. 60 Tage: Dunkelbraunes lösliches Pigment. Glycerin-Nähr-Agar: Reichliche Bildung von weissem Luftmycel. Strohbis bernsteinfarbenes lösliches Pigment. Kein Wachstum in dem Medium. Unterseite gelblichweiss.

Czapeks Saccharose: Reichliches weisses Wachstum als Häutchen. Wei- sses Sediment am Boden des Rohres, haftet an der Rohrwandung, oben und unten Flüssigkeitsspiegel. Unterseite strohfarben.

Cellulose: Kein Wachstum. Calciummalat: Mässige Bildung von weissem Luftmycel. Mässiges Wachstum in dem Medium. Kein lösliches Pigment. Unterseite nicht gefärbt.

Kohlehydrate: Alkalische Reaktion, keine Gasbildung aus Ado- nit, Arabinose, Cellobiose, Dextrin, Dextrose, Galactose, Lactose, Laevulose, Maltose, Mannit, Mannose, Raffinose, Salicin-Rhamnose, Saccha- rose, Xylose.

Ausser dem dieser Charakteristik entsprechenden Pilz kommen auch noch verwandte Organismen in Frage, wie sie zum Beispiel durch natürliche Auswahl oder durch mutierende Mittel, z. B. Röntgenbestrahlung, UV, 2,2-Dichlor-N-methyl-diäthylamin- hydrochlorid und dergleichen, erhalten werden.

Auf Grund der Tatsache, dass Streptomyces sphä- roides ein Saprophyt und psychrophil bis mesophil ist und auf organischen Medien kein lösliches Pigment produziert, ausser auf stark tyrosinhaltigen Medien, ferner auf Grund der Tatsache, dass reichlich weisses oder farbloses Luftmycel entsteht, ist die am nächsten stehende der in Bergeys Manual of Deter- minative Bacteriology (6. Ausgabe) beschriebenen Arten Streptomyces albus.

Streptomyces sphäroides unterscheidet sich von einigen seit der Veröffentlichung von Bergeys Manual in Actinomycetes and their Antibiotics von Waks- man und Lechevalier beschriebenen verwandten Pilzen wie folgt:

Streptomyces sphäroides unterscheidet sich von Streptomyces globisporus und Streptomyces farinosus darin, dass er dichte Spiralketten von Conidia erzeugt, während diese beiden Arten keine Spiralen erzeugen. Spiralbildung oder fehlende Spiralbildung ist ein Kriterium für die Unterscheidung von Streptomycesarten.

Streptomyces sphäroides unterscheidet sich von Streptomyces longisporus darin, dass er keine zylindrischen Sporen mit scharf geschnittenen Enden aufweist, welche für Streptomyces longisporus charakteristisch sind.

Streptomyces sphäroides unterscheidet sich von Streptomyces annulatus darin, dass er keine konzentrischen Wachstumsringe erzeugt, ein Merkmal von Streptomyces annulatus.

Streptomyces sphäroides unterscheidet sich von Streptomyces albus in zwei physiologischen Merk-

malen. Streptomyces albus reduziert Nitrat zu Nitrit; Nitrite sind dagegen nach dem Wachstum von S. sphä- roides kaum nachweisbar. Auch die Eigenschaften des Wachstums der beiden Kulturen auf einem Kartoffelkeil weichen stark voneinander ab. S. sphäroides erzeugt dichte spiralförmige Conidien, häufig mit so dichten Windungen, dass sie dichte Kugeln oder Spo- renballungen zu bilden scheinen.

Dieses Merkmal tritt ständig auf und ist so charakteristisch, dass sich darnach S.-sphäroides-Kulturen sofort von S: albus-Kul- turen unterscheiden lassen.

Novobiocin ist eine sauer reagierende organische Verbindung und ist in alkalischen Lösungen, z. B. wässrigen Lösungen der Alkalihydroxyde, -carbonate und -bicarbonate, sowie in Methanol, Äthanol, n-Bu- tanol, sec. Butanol, Äthylacetat, Essigsäure, Dioxan, Aceton, Methyläthylketon, leicht löslich, unlöslich oder kaum löslich dagegen in Äther, Benzbl, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Äthylendichlorid, Wasser, Salzsäure. Es wird aus alkalischer Lösung durch Ansäuern ausgefällt.

Novobiocin wird in zwei Kristallarten erhalten. Die eine Kristallart in Form von Rosetten hat einen Schmelzpunkt von etwa 152-154 ; die andere Kristallart in Form flacher Nadeln schmilzt bei etwa 170-172 . Diese zuweilen gemeinsam anfallenden Kristallarten lassen sich mechanisch voneinander trennen.

Novobiocin ist optisch aktiv und zeigt eine Drehung von [a] = -27 (c = 1 in n-Natrium- ; D hydroxydlösung) [a] D = -44 (c = 1 in Pyridin). Eine Lösung von Novobiocin in O,ln-Natrium- hydroxyd zeigt eine charakteristische Ultraviolettabsorption mit einer Spitze bei etwa 307 my (Ei m = 600). Eine Lösung von Novobiocin in 0,1n-Salz- säure in wässrigem Methanol zeigt eine charakteristische Ultraviolettabsorption mit einer Spitze bei etwa 324 m r( (EI, m - 390).

Eine Lösung von Novo- biocin in einer auf p13 7 gepufferten Phosphatlösung hatte Hauptmaxima in den Ultraviolettabsorptions- spektren bei 304 m, < !. (EI' # = 350).

Das Infrarotabsorptionsspektrum von praktisch reinem amorphem oder submikrokristallinem Novo- biocin, in einem Mineralöl (Nujol) suspendiert, wurde in einem Infrarot-Spektrophotometer, Modell 12B Baird Associates mit einem Chlornatriumprisma ermittelt; es zeigte mehrere charakteristische Spitzen, die ausgeprägteren haben folgende Frequenzen, ausgedrückt in Mikron: 5,8-6,0 (breit), 6,10, 6,21, 6,30, 6,49, 6,63, 7,4-7,6 (breite Schulter), 7,78, 7,96, 8,27 (schwach), 8,60 (Schulter), 8,7 (Schulter), 9,13, 9,40, 10,0-10,1 (breit), 10,28, 10,60 (breit), 12,0-12,30 (breit), 12,60-12,75 (breit), 1.3,07 und 13,39.

Das Infrarotspektrum zeigt Fig. 1. Das für die Bestimmung des Spektrums benutzte amorphe oder submikrokristalline Novobiocin wurde aus kristallinem Novobiocin wie folgt hergestellt: Eine Lösung von 1 g kristallinem Novobiocin in 100 cm3 Aceton wurde rasch mit 1 1 Petroläther ver- setzt, worauf sich amorphes Novobiocin aus der Lösung abschied. Der Niederschlag wurde abfiltriert, mit Petroläther gewaschen und unter vermindertem Druck bei 100 C getrocknet.

Praktisch reines, nach dieser Arbeitsweise erhaltenes Novobiocin zeigt das Infrarotabsorptionsspek- trum von Fig. 1. Fig. 2 und 3 bringen das Infrarotabsorptionsspektrum der in Nadeln und in Rosetten kristallisierenden Formen zur Anschauung. Während die beiden kristallinen Formen des Antibiotikums verschiedene Absorptionsspektren aufweisen, wie aus Fig. 2 und 3 hervorgeht, haben die amorphen oder submikrokristallinen Produkte das Absorptionsspektrum von Fig. 1.

Novobiocin besteht aus den Elementen Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff. Die Elementaranalyse von kristallinem Novobiocin ergibt folgende Zusammensetzung: Kohlenstoff 60,24; 60,26 0/0 Wasserstoff 6,56; 6,49 0/0 Stickstoff 4,86 /o Sauerstoff 29,3 % Nach der Mikroanalyse ergibt sich für Novobiocin die Zusammensetzung C3o-32H34-42N201o-12' Novobiocin ist eine saure Substanz, die sich mit Basen zu Salzen umsetzt.

Bei der Umsetzung mit 1 Äquivalent Natriumhydroxyd entsteht das Mononatriumsalz, bei Umsetzung mit 2 Äquivalenten das Dinatriumsalz. Mit anderen anorganischen Basen und mit organischen Basen, z. B. mit Methylamin, ergeben sich ebenfalls die entsprechenden Salze.

Die Acidität von Novobiocin ist charakteristisch für dieses neue Antibiotikum. Beim Titrieren von Novobiocin mit Natriumhydroxyd werden zwei basen- bindende Gruppen festgestellt. Die erste zum Mononatriumsalz führende Bindung erfolgt bei einem pH von etwa 7,0 und hat einen p,;-Wert von etwa 3,8. Die zweite Bindung findet bei einem PH von etwa 11,0 statt und zeigt einen pK-Wert von etwa 9,4.

Die potentiometrische Titration in einem Gemisch aus Wasser und Aceton (3 : 4) zeigte zwei saure funktionelle Gruppen, pI;l etwa 4,7, Äquivalentgewicht 653, und pI;2 etwa 10, Äquivalentgewicht 660-680. Die Bestimmung der sauren Gruppen durch Ultraviolettabsorption ergab die Werte pKl 3,8 und pK2 9,4. Das Molekulargewicht von Novobiocin in einem azeotro- pen Gemisch aus Isopropanol und Wasser ist nach der ebullioskopischen Methode 592 + 25.

Kristallines Novobiocin hat eine mikrobiologische Aktivität von etwa 5000 Einheiten/mg nach den üblichen Schalen-Plattendiffusionsmethoden mit Bacillus megatherium ATCC 9885 bei Verwendung von praktisch reinem Novobiocin als Prüfobjekt.

Novobiocin hemmt in erster Linie gram-positive Erreger, ist aber auch gegen gram-negative Erreger wirksam. Erreger, deren Wachstum schon durch sehr niedrige Mengen von Novobiocin oder seinen Salzen gehemmt wird, sind unter anderem folgende:

M. pyo- genes var. albus, M. pyogenes var. aureus, Strepto-

coccus pyogenes, Proteus vulgaris, Pasteurella mul- tocide, Hemophilus pertusis, Pasteurella avicida, Di- plococcus, pneumoniae, Corynebact. diphteriae in- termedius,

Corynebact. diphtheriae mitis, Corynebact. xerose, Corynebact. renale, Neisseria meningitidis, Sarcina lutea (VD), M. pyogenes aureus resistent gegen Aureomycin, M. pyogenes aureus resistent gegen Streptomycin-Streptothricin, und M. pyogenes aureus resistent gegen Penicillin.

Das Natriumsalz von Novobiocin hemmt bei der Prüfung in altarhaltigen Medien das Wachstum verschiedener Stämme von M. pyogenes var. aureus, M. pyogenes var. albus, Neisseria meningitidis (Nr. 274) und Sarcina lutea (VD) bei Konzentrationen unter 0,5 mcg/cm-. Andere Mikroben werden durch Novo- biocin oder dessen Salze in wechselndem Masse angegriffen.

Novobiocin wird von Mäusen, Ratten und Hunden nach einer oder wiederholten oralen Verabfol- gungen gut vertragen. Bei Mäusen beträgt die LD50 etwa 2,0 g/kg. Bei Ratten oder Hunden traten nach Tagesdosierungen von 0,2 g/kg während 90 bis 140 Tagen keine nachteiligen Wirkungen ein.

Für die Kultivierung von Streptomyces sphäroides eignen sich wässrige Nährmedien, wie sie für die Erzeugung anderer Biotica im Gebrauch sind und welche assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff sowie anorganische Salze enthalten. Ausserdem enthalten die Gärmedien zweckmässig gewisse Spurenmetalle, die jedoch meistens in den anderen Nährstoffen in genügender Menge als Verunreinigungen vorhanden sind.

Im allgemeinen sind Kohlehydrate, wie Zucker, z. B. Dextrose, Saccharose, Maltose, Lactose, Dextrin und dergleichen sowie Stärke geeignete Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff. Die optimale Menge der Kohlenstoffquelle hängt teilweise von den anderen Bestandteilen des Mediums ab; gewöhnlich sind etwa 1 bis 6 Gew /o Kohlehydrate, bezogen auf das Gewicht des Mediums, ausreichend. Diese Kohlenstoffquellen können einzeln verwendet werden, oder man kann mehrere Kohlenstoffquellen miteinander kombinieren.

Eine Reihe von Stickstoffquellen, wie Casein- hydrolysate, Papain, angedautes Sojabohnenmehl, Erd- nussmehl, Erdnussölmehl, lösliche Schlempebestand- teile, Maisquellwasser, Natriumnitrat, Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat und dergleichen werden leicht durch Streptomyces sphäroides assimiliert und können in den Gärmedien zur Bildung des neuen Antibiotikums verwendet werden.

Im allgemeinen sind organische Stickstoffquellen, insbesondere Sojabohnenmehl und lösliche Schlempebestandteile,für die Erzeugung von Novobiocin sehr gut geeignet. Die verschiedenen organischen oder anorganischen Stickstoffquellen können entweder allein oder in Kombination miteinander, und zwar gewöhnlich in Mengen von etwa 0,2 bis 6 Gew /o, des wässrigen Mediums, Verwendung finden.

Der Zusatz von Natriumchlorid zu einem Medium, welches geeignete Quellen von Kohlenstoff und Stickstoff enthält, ist in Mengen von etwa 0,1 bis 1% für die Herstellung des neuen Antibiotikums zweckmässig. Im allgemeinen ist eine Natriumchlorid- menge, die etwa 0,25 Gew. /o des Nährmediums entspricht, sehr gut brauchbar. Beispiele für geeignete Medien für die Kultivierung von Streptomyces sphäroides und Herstellung von Novobiocin sind folgende: 1.

Sojabohnenmehl 21/o Chlornatrium 0,25% Dextrose 1-3 % lösliche Schlempebestandteile 0,750/0 2. Maisquellwasser 2-6% Dextrose 2-4% 3. lösliche Schlempebestandteile 3-6% Dextrose 1-6% 4. lösliche Schlempebestandteile 3-60/9 Die Gärung mittels der Novobiocin erzeugenden Mikroben kann bei etwa 20-37 C erfolgen;

die Optimaltemperatur beträgt 24-28 C. Der günstigste plI-Wert der Nährmedien für das Wachstum von Streptomyces sphäroides und die Erzeugung des Antibiotikums liegt in der Grössenordnung von etwa 5,5 bis 9,0.

Novobiocin kann durch Oberflächengärung und submerse Gärung erzeugt werden; bevorzugt wird die submerse Gärung. Kleinversuche werden zweckmässig in der Weise ausgeführt, dass das Nährmedium in einen Kolben eingebracht und dieser nebst Inhalt durch Erhitzen auf 120 C sterilisiert, der Kolben mit einigen Sporen oder einer vegetativen Kultur eines Novobiocin erzeugenden Stammes von Streptomyces sphäroides geimpft, der Kolbenhals mit Baumwolle lose verschlossen und die Gärung bei konstanter Temperatur von etwa 250 C auf einer Schüttelmaschine während etwa 2 bis 7 Tagen durchgeführt wird.

Gärungen mit grösseren Mengen werden vorzugsweise wie folgt durchgeführt: Man verwendet Behälter, die mit einem Rührwerk und einer Belüftungseinrichtung für das Gärmedium ausgestattet sind. Hierbei wird das Nährmittel in dem Behälter bereitet und durch genügend langes Erhitzen auf 1200 C sterilisiert. Das sterilisierte Medium wird nach dem Abkühlen mit einer vegetativen Kultur eines Novobiocin erzeugenden Stammes von Streptomyces sphäroides beimpft. Die Gärung wird in 2 bis 7 Tagen unter Rühren und bzw. oder Belüften des Nährmediums unter Aufrechterhaltung der Temperatur auf etwa 24 bis 270 C vollzogen. Diese Arbeitsweise eignet sich besonders zur Herstellung des Antibiotikums in grossen Mengen.

Wenn die Gärung submers erfolgt, kann ein geeignetes Antischaummittel in geringer Menge, z. B. Sojabohnenmehl, Ricinusöl, Schmalzöl, 1 /o Octa- decanol in Mineralöl oder ein substituiertes Oxazolin, welches die Commercial Solvents Corporation unter dem Handelsnamen Alkaterge C auf den Markt bringt und dergleichen, zugesetzt werden, um die Schaumbildung während der Gärung zu steuern.

Beispiele 1. Ein Medium mit 2 % Sojabohnenmehl, 1 0/0 Dextrose, 0,25 0/0 Chlornatrium und 0,75 % löslichen Schlempebestandteilen wurde in Leitungswasser bereitet. Etwa 25 cm3 Medium wurden in eine 75-cms- Phiole eingebracht und durch Erhitzen auf 120 C während 20 Minuten sterilisiert.

Das Medium wurde danach mit einer vegetativen Kultur von Streptomyces sphäroides MA-319 (NRRL 2449) beimpft und die Phiole mit Baumwolle lose verschlossen. Diese wurde dann 6 Tage auf eine Schüttelmaschine mit einem Ausschlag von 3,8 cm bei 28 C gebracht. Die vergorene Flüssigkeit wurde nach der Zylinderplattenmethode mit Bacillus megatherium ATCC 9885 als Prüfmikrobe geprüft. Die Aktivität wurde zu 600 Ein- heiten/cm-3 oder 30 mcg/cm3 Novobiocin ermittelt.

Bei Vergären eines Mediums aus 2 % Sojaboh- nenmehl, 3 % Dextrose, 0,25 % Chlornatrium und 0,75 0/0 lösliche Schlempebestandteile wurde in der vergorenen Flüssigkeit eine Potenz von 256 mcg/cm3 festgestellt.

Nach Beispiel 1 wurden weitere Versuche mit einer Gärdauer von 7 Tagen angestellt, wobei 3 Medien verwendet wurden: (1) 4 0/0 lösliche Schlempebestand- teile, 5 % Dextrose; (2) 2 0/0 Maisquellwasser, 5 0/0 lösliche Schlempebestandteile, 5 % Dextrose; (3) 2 0/0 gemahlener Roggen, 5 0/a lösliche Schlempebestand- teile, 5 % Dextrose. Folgende Potenzwerte wurden ermittelt:

511 mcg/cm3; 720 mcg/cm3; 740 mcg/cm3 Novobiocin.

2. Grössere Mengen Novobiocin können durch submerse Gärung in Behältern folgendermassen er- zeugt werden: Eine Blake-Flasche mit 25 cm3 eines sterilen wäss- rigen Agarmediums mit 1% Hefeextrakt 1% Dextrose 0,12% Na,HP04 0,07511/o KHiP04 0,0511o Mg904 .

7 H20 21/o Agar wurde mit einer Probe einer Erdkultur von Strepto- myces sphäroides MA-319 (NRRL 2449) beimpft und 4 bis 5 Tage bis zur ausreichenden Sporenbildung bei 26 C bebrütet.

20 cm3 steriles Wasser wurden in die Blake- Flasche eingegossen und die Sporen zu einer Suspension verrieben. Etwa 5 cm3 der Sporensuspension wurden in einen 2-1-Erlenmeyerkolben eingetragen, in dem sich 750 cm3 eines sterilen wässrigen Mediums mit 0,3 % Rindfleischextrakt 1,0 % Caseinhydrolysat ( NZ-amin ) 10 % Dextrose 0,

5 % Chlornatrium mit einem pH-Wert von etwa 7,2 befanden. Der Kolben wurde mit Baumwolle verschlossen und bei 26 C auf einer Rotationsschüttelmaschine 48 Stunden lang bebrütet. Die vegetative Kultur wurde dann in ein 189-1- Gärgefäss aus rostfreiem Stahl eingetragen,

in dem sich etwa 95 bis 113 1 des sterilen Rindfleischextraktmediums der oben angegebenen Zusammensetzung befanden. Nach Zusatz einer 1%igen Lösung von Octadecanol in Mineralöl als Antischaummittel in geringer Menge wurde das Medium bei 26 C während 48 Stunden bebrütet. Das Medium wurde hierbei geschüttelt und sterile Luft mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,085 M3/Minute hindurchgeleitet.

Ein Gärgefäss aus rostfreiem Stahl von etwa 7561 wurde dann mit etwa 3781 eines wässrigen Mediums beschickt, das folgende Zusammensetzung hatte: 3 % Sojabohnenmehl (Staleys Spezial- nährmittel aus Sojabohnenmehl 4-S) 2 % Dextrose 0,75 0/0 lösliche Schlempebestandteile 0,25 % Chlornatrium Das Medium hatte einen pH-Wert von etwa 7,1.

Nachdem das Medium mit Dampf bei etwa 120 C während 30 Minuten sterilisiert und gekühlt war, wurde das Gärgefäss mit etwa 8,4 % der vegetativen Impfkultur, die in dem 189-1-Gärgefäss nach obigen Angaben bereitet war, beimpft. Das Gut wurde dann bei 26 C unter Schütteln und 12 CFM Luftdurch- tritt bebrütet. Nach 96 Stunden hatte die Flüssigkeit eine Aktivität von etwa 82 mcg/cm3.

Die Konzentration der neuen antibiotischen Substanzen in den oben beschriebenen Gärmedien beträgt gewöhnlich etwa 30-400 mcg/cm3; die Feststoffe der Gärflüssigkeiten zeigen im allgemeinen eine Aktivität von etwa 1-2 mcg/cm3 Feststoff. Die aktive Substanz kann durch mehrere Verfahren in reinerer Form gewonnen werden. Beispielsweise lässt sich die antibiotische Substanz mittels n- oder sec. Butanol aus dem alkalischen Gärmedium extrahieren.

Zur Gewinnung von Novobiocin in Kristallform wird das rohe Antibiotikum durch Ausfällung aus alkalischer Lösung mittels Säuren, Chromatographie an Aluminiumoxyd und Adsorption an geeigneten Ionenaus- tauschharzen oder durch Kombination mehrerer dieser Verfahren gereinigt. Kristallnovobiocin lässt sich beispielsweise folgendermassen gewinnen: Nach Filtrieren der ganzen Gärflüssigkeit bei einem pH-Wert von 9,0 wurden 2,27 kg Diatomeen- erde-Filtrierhilfsmittel ( Hyflo Supercel , ein Markenprodukt) je 3781 der filtrierten Flüssigkeit zugesetzt.

Sodann wurde mit Salzsäure bis auf einen pH-Wert von 2,0 langsam angesäuert. Nach 10 Minuten langem Schütteln wurde die Masse filtriert und der Filterkuchen mit Wasser gewaschen. In dem sauren Filtrat war kein Antibiotikum nachweisbar. Die ausgefällten Feststoffe, ausschliesslich des Filtrierhilfs- mittels hatten einen Reinheitsgrad von 0,2-0,3 %.

Der Filterkuchen der sauren Fällung wurde zwei- mal mit 85%igem wässrigem Methanol bei einem pH-Wert von 9,0 extrahiert, wobei annähernd 1/1o des ursprünglichen Volumens der Gärflüssigkeit für jede

Extraktion benutzt wurde. Diese Extraktion lieferte insgesamt etwa 80-0/a: der gesamten Aktivität der Gär- flüssigkeit. Die Feststoffe in der Lösung hatten einen Reinheitsgrad von 1-1,5 -1/o.

Die wässrige Methanollösung wurde auf etwa 1/1o des Volumens der ursprünglichen Methanollösung konzentriert. Das pH wurde auf 9,0 mit Atznatron eingestellt und die Lösung zweimal mit gleichen Raumteilen n-Butanol extrahiert. Das scheinbare Verteilungsverhältnis bei einem pH-Wert von 9,0 beträgt etwa 40 : 1. Die Feststoffe des Butanolextraktes hatten einen Reinheitsgrad von 4-6 0/0.

Der Butanolextrakt wurde auf 1/1o des ursprünglichen Volumens eingeengt und in 15 Raumteile Wasser, pH-Wert = 9,0, eingetragen. Danach wurde ein Filtrierhilfsmittel ( Hyflo Supercel ) in einer Menge von 0,5 g je 3,78 1, bezogen auf das ursprüngliche Volumen der Gärflüssigkeit, eingetragen und der pH-Wert langsam durch Zuführung von Salzsäure auf 2,0 eingestellt. Die gesamte Aktivität wurde hierbei auf dem Filtrierhilfsmittel niedergeschlagen. Der Reinheitsgrad der Feststoffe, ausschliesslich des Fil- trierhilfsmittels, betrug etwa 10-12 0/0.

Der Kuchen wurde im Vakuum bei 40 C getrocknet, vermahlen und mit Petroläther verrieben (etwa 180--400 cm3 für die aus je 3,781 Gärflüssig- keit stammenden Feststoffe), bis das Filtrat farblos war. Hierbei wurden 20-25 % der Feststoffe aus- geschieden und die inaktiven öligen Gärungsprodukte, welche in der Masse verblieben waren, entfernt. Durch das Verreiben ging keine Aktivität verloren. Die verbleibenden Feststoffe hatten einen Reinheitsgrad von 12-15 0/0.

Der Kuchen wurde mit wasserfreiem Athanol extrahiert, bis die Extrakte schwach hellgelb gefärbt waren. Die Extrakte wurden vereinigt und auf 15 bis 20,1/o Feststoffgehalt mit etwa 40 000 mcg/cm3 Aktivität konzentriert.

Der Feststoff hatte einen Rein- heitsgrad von 20-30 % und 200-300 meg/mg Ak- tivität. Die konzentrierte Athanollösung wurde an säuregewaschenem Aluminiumoxyd chromatographiert. Ein Aluminiumoxydverhältnis von 50 : 1, bezogen auf die Gesamtmenge an Feststoffen in der Beschickungslösung, muss zur Erzielung einer ausreichenden Reinigung angewandt werden. Die aktive Substanz passiert die Säule, während ein grosser Teil der festen Fremdstoffe an der Säule zurückbleibt.

Die A1.03 Säule wurde zur Gewinnung des Novobiocins mit Athanol eluiert. Etwa 95 /o der Aktivität waren in dem 2,5- bis 3fachen Säulenlerraum.
EMI6.65

<tb> Tabelle
<tb> Aktivität
<tb> Vol.

<SEP> a <SEP> b <SEP> c <SEP> Gesamteinheiten
<tb> cm, <SEP> mcg/cms <SEP> mg/cma <SEP> mcg/mg
<tb> Säulenbeschickung <SEP> 1000 <SEP> 44000 <SEP> 265 <SEP> 166 <SEP> 220 <SEP> X <SEP> 106
<tb> Eluat <SEP> 1 <SEP> x <SEP> 1000 <SEP> 92 <SEP> 2,5 <SEP> 37 <SEP> 0,46 <SEP> X <SEP> 106
<tb> 2 <SEP> 1000 <SEP> 8400 <SEP> 19,6 <SEP> 428 <SEP> 42 <SEP> X <SEP> 106
<tb> 3 <SEP> 1000 <SEP> 15200 <SEP> 31,3 <SEP> 484 <SEP> 76 <SEP> X <SEP> 106
<tb> 4 <SEP> 1000 <SEP> 12400 <SEP> 22,3 <SEP> 556 <SEP> 62 <SEP> X <SEP> 106
<tb> 5 <SEP> 1000 <SEP> 7400 <SEP> 13,4 <SEP> 552 <SEP> 37 <SEP> X <SEP> 106
<tb> 6 <SEP> 1000 <SEP> 2600 <SEP> 4,5 <SEP> 604 <SEP> 13 <SEP> X <SEP> 106
<tb> 7 <SEP> 1000 <SEP> 900 <SEP> 1,3 <SEP> 690 <SEP> 4,5 <SEP> X <SEP> 106
<tb> Mittel <SEP> 1000 <SEP> 6700 <SEP> 13,2 <SEP> 504
<tb> a: <SEP> Aktivität <SEP> in <SEP> mcg <SEP> pro <SEP> cm9 <SEP> Lösung
<tb> b:

<SEP> Substanz <SEP> in <SEP> mg <SEP> pro <SEP> cm:' <SEP> Lösung
<tb> c: <SEP> Aktivität <SEP> in <SEP> meg <SEP> pro <SEP> mg <SEP> Substanz
A1203 Vol. = 8 000 cm3; Säulenleeraum = 2 600 cm3; x Erscheinen der charakteristischen gelben Farbe der Substanz.

Was die in der obigen Tabelle angeführten eEin- heiten betrifft, so wurde die mikrobiologische Aktivität von praktisch reinem kristallinem Novobiocin willkürlich zu 5 000 Einheiten/mg angesetzt, bestimmt nach den Standardmethoden der Schalenplattendiffu- sion, unter Verwendung von Bacillus megatherium ATTC 9885 oder vorzugsweise Bacillus subtilis ATTC 12.432 als Testorganismus.

Das Äthanoleluat der A1203 Säule wurde auf etwa 5 % Feststoffe konzentriert. Wasser wurde bis zur Trübung zugesetzt; hierfür wurde etwas mehr als die gleiche Raummenge benötigt; das Produkt wurde zur Auskristallisation des Antibiotikums sich selbst überlassen. Die Kristallbildung verlief sehr langsam. Nach 5 Tagen waren noch bis zu 15 % der ursprünglichen Aktivität in der überstehenden Flüssigkeit.

Rühren bzw. oder Temperaturänderung hat augenscheinlich auf die Geschwindigkeit der Kristallbildung wenig Einfluss. Die Novobiocinkristalle hatten eine Aktivität von etwa 500-6000 mcg/mg.

Der Kristallbrei wurde in wasserfreiem Aceton zu einer 30 % igen Lösung aufgelöst, die mit Aktivkohle ( Darco G-60 ) in der doppelten Gewichtsmenge des

gelösten Kristallbreis behandelt wurde. Darco wurde abfiltriert und mit Aceton wiederholt gewaschen, um die Lösung auf etwa 51110 Feststoffgehalt zu verdünnen.

Petroläther wurde bis zur Trübung zugesetzt und die Kristallbildung von Novobiocin ab- gewartet. 90-95% der Aktivität wurden gewonnen; die Kristalle des Antibiotikums zeigten 900-1000 mcg/mg bei der Probe.

Das Novobiocin lässt sich leicht durch Umsetzung mit Basen in seine Salze überführen, z. B. wie folgt: Mononatriumsalz von Novobiocin Etwa 40 g Novobiocin wurden in 800 cm3 Äthly- acetat bei etwa 80 C gelöst. Nach Abkühlen auf etwa 25 C wurde eine Lösung von 3,43g Natriummethy- lat in 34 cm2 Methanol während 20-30 Minuten zugesetzt.

Der Niederschlag aus Novobiocin-Mono- natriumsalz wurde abfiltriert, mit etwa 200 cm3 Äthylacetat gewaschen und bei 70 C in 6 Stunden unter vermindertem Druck, schliesslich bei 55 C in 24 Stunden unter vermindertem Druck getrocknet.

Das Mononatriumsalz wurde dadurch zur Kristallisation gebracht, dass 1,1 g in 3 cm3 Methanol gelöst, die klare Lösung mit 55 cm3 Aceton bis zur Trübung verdünnt, die trübe Lösung mit einigen Kristallen Natriumnovobiocin beimpft und die Lösung bei Raumtemperatur etwa 4 Stunden bzw. bis zur Beendigung der Kristallbildung gerührt wurde. Die ausgefällten Kristalle des Mononatriumsalzes wurden mit Aceton gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet.

Durch Versetzung des Mononatriumnovobiocins mit Spiramycinsulfat, Neomycinsulfat, Dihydro- streptomycinsulfat, Streptomycinsulfat usw. erhält man die Salze des Novobiocins mit den betreffenden basischen Antibiotika. Ferner lässt sich das Mononatriumsalz des Novobiocins zum Beispiel mit Chlorcalciumlösung in das kristalline Calciumsalz (Aqui- valentgewicht, ermittelt durch Titration = 669, EI '% = 528 bei 307 m, . in n/10-NaOH-Lösung) sowie mit Magnesiumchlorid in das Magnesiumsalz überführen.

Durch Versetzung des Novobiocins mit Säuresalzen von Benzyltrimethylammonium, Chinin, Pro- cain, Guanidin, Noformacin, N-Benzyl-,ss-phenyläthyl- amin und N,N-Dibenzyläthylendiamin erhält man die entsprechenden Novobiocinamin- bzw. -ammonium- salze.

Aminsalze erhält man ebenfalls durch Umsetzung von Novobiocin mit einer annähernd äquivalenten Menge eines freien Amins in Äthylacetatlösung (z. B. mit Cyclohexylamin, Chinin, N-Athyl-piperidin, Tri- äthylamin, Dicyclohexylamin, Äthylendiamin und Iso- butylamin) oder in wässriger Methanollösung (z. B. mit Arginin, Histidin und Lysin).

Novobiocin und dessen Salze sind wertvolle Anti- mikrobenmittel. Sie können beispielsweise zur Entfernung von novebiocinempfindlichen Mikroben aus pharmazeutischer Ausrüstung usw. oder zum Abtrennen bestimmter Mikroben aus Mikrobengemische enthaltenden Lösunger dienen. Novobiocin nebst Salzen eignet sich auch für die Behandlung von Tieren, die mit Mikroben infiziert sind, welche auf das neue Antibiotikum ansprechen.

So erwies sich Novobiocin als sehr nützlich bei der Behandlung der Mastitis von Kühen. Mastitissalbe mit 20-100 mg Natriumnovo- biocin auf 7,5 g sind hierfür brauchbar.

Novobiocin sowie dessen Salze sind gegen peni- cillinresistente Staphylococcen, ferner gegen Strepto- coccen und Pneumococcen aktiv. Da die meisten bakteriellen Infektionen der Atmungsorgane auf diese Erreger zurückzuführen sind, kann Novobiocin zur Behandlung dieser Infektionen in der Humanmedizin angewandt werden. Hierfür kann das Natriumsalz oral in Form von Kapseln appliziert werden, die beispielsweise etwa 100-500 mg Antibiotikum bei einer Tagesdosierung von 1-2 g enthalten.

Eine geeignete Dosierung wird durch Einfüllen von 250 mg Mononatriumsalz in eine weiche Gelatinekapsel Nr. 1 erhalten. Novobiocin und dessen Salze können auch in Form von Tabletten verabfolgt werden. Die Tabletten können in der Weise hergestellt werden, dass man pulverförmiges Natriumnovobiocin mit einer geringen Menge einer 511/o igen Lösung des Essigsäure-phthal- säureesters der Cellulose in Methanol-Aceton (50-50) herstellt, das Gut durch ein Sieb Nr. 8 granu- liert, die körnige Masse trocknet, die getrockneten Körner durch ein Sieb Nr.

12 treibt und die Körner unter Zusatz von etwas Magnesiumstearat zu Tabletten komprimiert, die 250 mg Natriumnovobiocin enthalten.

Novobiocin ist auch für die Behandlung von Pflanzenkrankheiten anwendbar, z. B. von Meltau, der durch Xanthomonas phaseoli verursacht ist. Die Pflanzen werden zum Beispiel mit einer wässrigen Lösung besprüht, die etwa 100 Teile Natriumnovo- biocin/Million enthält. Die Spritzmittel können verschiedene Netz- oder Verteilungsmittel und bzw. oder andere aktive Zusätze enthalten und in bekannter Weise hergestellt werden.

Das Antibiotikum Novobiocin ist auch unter der Bezeichnung Cathomycin , Handelsname der Patentinhaberin, bekannt.

Claims

PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von Novobiocin, dadurch gekennzeichnet, dass man Novobiocin erzeugende Organismen in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen kultiviert. UNTERANSPRLICHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man als Novobiocin erzeugenden Organismus Streptomyces sphäroides verwendet. 2. Verfahren nach Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces sphäroides NRRL 2449 verwendet. 3.

Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das Antibiotikum aus der Gärflüssigkeit isoliert wird. <Desc/Clms Page number 8> 4. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces sphäroides NRRL 2449 in einem wässrigen Nährmedium, das assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter aeroben Bedingungen bei etwa 24-28 C 1-7 Tage kultiviert. 5. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man das Novobiocin nachträglich mit einer Base in ein Salz überführt.