CH348508A - Verfahren zur Gewinnung von Insulin - Google Patents

Description

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    Verfahren   zur    Gewinnung   von    Insulin   Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung des    antidiabetischen   Hormons Insulin, das dadurch gekennzeichnet ist, dass Pankreasdrüsen, z. B. vom Schwein, Rind oder Pferd, mit angesäuertem Alkohol    extrahiert   werden, und dass der Alkoholextrakt mit einem    Kationenaustauscher   behandelt wird, der dem Extrakt das Insulin    entzieht,   worauf das Insulin    eluiert   wird. Der    Kationenaus-      tauscher   kann aus einem synthetischen oder natürlichen, hochmolekularen,    karboxylgruppenhaltigen      Kat-      ionenaustauscher,   z.

   B.    Oxyzellulose,      Pektinsäure,      Alginsäure   oder     Amberlite      IRC   50  (Markenprodukt) bestehen. Die Extraktion wird zweckmässig mit einer solchen Menge Säure    durchgeführt,   dass der endgültige    p1,-Wert   des Extraktes nicht unter 3 liegt. 



  Beim Vorgehen gemäss der Erfindung erzielt man nicht nur den    Vorteil,   dass die Einengung des Alkoholextraktes durch Verdampfung sich erübrigt, sondern auch, dass    verunreinigendes      Fett   im Alkoholextrakt verbleibt. 



  Als Alkohol kann man zweckmässig    Methyl-   oder    Athylalkohol   verwenden; die Alkoholmenge kann nach den Angaben in der Literatur bemessen werden. Wie gesagt wird am besten so vorgegangen, dass der    pH-Wert   des Extraktes nicht unter 3 liegt, d. h. also, dass der Extrakt weniger sauer reagiert, als bisher üblich. Zum Ansäuern des Alkohols kann man anorganische Säuren, wie    Salzsäure   oder Essigsäure, verwenden. Während man nach früheren Verfahren 35-60 ml    konz.      Salzsäure   pro kg Drüse    zugesetzt   hat, genügen beim vorliegenden Verfahren 16-20    ml      konz.   Salzsäure. Bei der Verwendung von Essigsäure werden am besten etwa 40 ml pro kg Drüse zugesetzt.

   Die Extraktion gefrorener feingemahlener Drüsen erfolgt    zweckmässig   bei Zimmertemperatur während 4-5 Stunden.    Zentrifugierung   und Filtrie-    rung   des Drüsenmaterials lassen sich leichter durchführen, so dass ein klarer Extrakt erhalten wird, wenn der Alkohol mit einer organischen Säure, wie z. B. Essigsäure, Zitronensäure oder    Oxalsäure,      ange-      säuert   wird. 



  Vor der    Behandlung   mit dem    karboxylgruppen-      haltigen      Kationenaustauscher   wird der Extrakt zweckmässig mit Ammoniak zu neutraler oder schwach    alka-      lischer   Reaktion    versetzt,   um Eiweissverunreinigungen und    Neutralsalze      auszufällen,   wobei auch bei der Verwendung gewisser organischer Säuren ein wesentlicher Teil der    zugesetzten   Säure als in 70    fl/a      igem   Alkohol unlösliches    Ammoniumsalz      entfernt   wird. 



  Zur Entfernung der restlichen    Ammoniumionen   und zur Vermeidung von Salzbildung beim Einstellen der für die    Aufnahme   auf dem    karboxylgruppenhal-      tigen      Kationenaustauscher   zweckmässigen sauren Reaktion behandelt man dann den Alkoholextrakt am besten    (zweckmässig   stufenweise) mit einem    sul-      fonierten      Kationenaustauscher   starker    Vernetzung,   z. B. mit     Dowex   50  (Markenprodukt) in einer solchen Menge, dass sich der PH-Wert auf etwa 3 einstellt. 



  Durch diese Massnahmen wird die Aufnahme auf dem    karboxygruppenhaltigen      Kationenaustau-      scher   erleichtert, so dass eine    wesentlich   bessere Ausbeute an Insulin erhalten wird und eine kleinere Menge    karboxylgruppenhaltigen      lonenaustauschers   verwendet werden kann. 



  Als    Kationenaustauscher   hat sich eine    wässrige      Aufschwemmung   von 40-60 g    Alginsäure   pro kg Pankreas als am zweckmässigsten erwiesen. Die Aufnahme auf dem    Ionenaustauscher   erfolgt vorzugsweise bei    Zimmertemperatur      während   2 Stunden. Eine vorherige    Entfernung   von Fett und Proteinstoffen durch    Kühlung   des Extraktes auf - 5  C und Zentrifu- 

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    gierung      erleichtert   die Aufnahme auf den    Ionen-      austauscher.   



  Von dem auf einem Saugfilter gesammelten    karboxylgruppenhaltigen      Ionenaustauscher   wird das Insulin am besten mit einer verdünnten Mineralsäure, z. B. Schwefelsäure oder Salzsäure,    eluiert.   Wenn    Alginsäure   als    Ionenaustauscher   verwendet wird, kann die    Eluierung   bei Zimmertemperatur mit etwa 100 ml 0,3-n    Salzsäure   pro 10g    Alginsäure   stattfinden. Das Insulin kann aus dem    Eluat   durch    Sättigung   mit    Kochsalz   gefällt werden, worauf der erhaltene Niederschlag weiterer Reinigung nach bekannten Verfahren unterworfen werden kann. 



  Beispiel 1 Extraktion 1 kg Pankreas vom Kalb wird in 2 Liter    95'o/oigen   Äthylalkohols, enthaltend 200    ml   Wasser und 12    ml      konz.   Salzsäure    (spez.   Gewicht 1,19), gemahlen. Die Extraktion erfolgt bei    Zimmertemperatur   während 4 Stunden unter Rühren. Die    Drüsenrückstände   werden durch    Zentrifugierung      abgetrennt,      und   die    Flüssigkeit   wird nach    Zusatz   einer geringen Menge     Hyflo-Supercel    (Kieselerde, Markenprodukt) auf einem    Saugfilter      klarfiltriert.   Der pH-Wert der Lösung ist 4,8. 



  Danach wird eine erneute Extraktion der Drüsenrückstände mit 1,5 Litern    70'o/oigen   Äthylalkohols, enthaltend 4    m1      konz.      Salzsäure,   unter    Rührung   während 1 Stunde    vorgenommen,   worauf    Zentrifu-      gierung   und    Klarfiltrierung   stattfinden. Die    Filtrate   werden vereinigt. Das gesamte Volumen beträgt 3300    ml.   Der    pH-Wert   beträgt 4,7. 



     Aufnahme   auf    den      Kationenaustauscher   und    Elution   Als    lonenaustauscher   wird    Alginsäure   verwendet, die mit 0,2-n Salzsäure und wiederholt mit destilliertem Wasser gewaschen und mit Alkohol getrocknet worden ist. 60 g des trockenen Pulvers, die in    de-      stilliertem   Wasser aufgeschwemmt worden sind, werden dem Extrakt    zugesetzt,   worauf 2 Stunden bei Zimmertemperatur    gerührt   wird. Die    Alginsäure   wird auf einen    Saugfilter   aufgenommen, wonach man mit insgesamt 600 ml 0,3 Salzsäure unter Rühren während 20 Minuten bei Zimmertemperatur    eluiert.   



  Das salzsaure    Eluat   wird zum Ausfällen des Insulins mit Kochsalz bis zur    Sättigung   versetzt. Beispiel 2 Extraktion 1 kg Pankreas vom Pferd wird in 2 Liter    95o/o,igen      Äthylalkohols,   enthaltend 200    ml   Wasser und 40 ml Eisessig, gemahlen. Die Extraktion erfolgt bei Zimmertemperatur    während   4 Stunden unter    Rühren.   Die Drüsenrückstände werden entweder durch Zentrifugieren oder    Filtrieren   nach Pressung gegen    Gaze   abgetrennt. Der    pH-Wert   der Lösung ist etwa 4,8. 



  Darauf erfolgt eine erneute Extraktion der Drüsenrückstände mit 1,5 Litern    70 /o-igen      Äthylalkohols,   enthaltend 5 ml Eisessig,    während   1 Stunde, worauf Zentrifugieren oder    Filtrieren   stattfindet. Die Filtrate werden vereinigt. Der    pH-Wert   beträgt etwa 4,8. Darauf wird der Extrakt auf - 5  C    abgekühlt   und der Niederschlag durch    Filtrieren   mit Hilfe einer geringen Menge     Hyflo-Supercel    abgetrennt. Das gesamte Volumen beträgt etwa 3300 ml. 



  Aufnahme auf denn    lonenaustauscher   und    Elution   Als    Ionenaustauscher   wird    Alginsäure   verwendet, die mit 0,2-n Salzsäure und wiederholt mit destilliertem Wasser gewaschen und mit Alkohol getrocknet worden ist. 60 g des trockenen Pulvers werden in Wasser    aufgeschwemmt   und dem Extrakt zugesetzt, worauf man 2 Stunden bei Zimmertemperatur rührt. Die    Alginsäure   wird auf einem Saugfilter gesammelt. Die    Eluierung   erfolgt mit etwa 600 ml 0,3-n Salzsäure unter    Rühren   während 20 Minuten. 



  Das Insulin in dem    Eluat   wird durch    Sättigung   mit Kochsalz ausgefällt. 



  Beispiel 3 Extraktion 5 kg Pankreas vom Kalb oder Rind werden in 9 Liter 95    o/oigen   Äthylalkohols, enthaltend 1 Liter Wasser und 375g Zitronensäure oder 150 g    Oxal-      säure      (H2C20.1   . 2H20), in 1 Liter Wasser gelöst,    ge-      mahlt.   Die Mischung wird 5 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt und dann durch ein Tuch gesiebt. Eine zweite Extraktion des Drüsenmaterials    erfolgt   mit 7500    ml      70o/oigen      Äthylalkohols,   worauf man durch ein Tuch siebt. Die beiden Extrakte werden vereinigt. Der    pH-Wert   der Lösung beträgt etwa 3,4.

   Reinigung der Extrakte Die vereinigten Extrakte werden mit    wässrigem   Ammoniak bis zu einem PH-Wert von 8,5 versetzt, worauf die gebildete Fällung    abfiltriert   wird. Überschüssige    Ammoniumionen   werden durch Zusatz - unter Rühren - eines    sulfonierten      Kationenaus-      tauschers   mit starker Vernetzung, zweckmässig     Do-      wex   50  in der    Wasserstöff-Form,   in einer Menge, die einen    endgültigen      pH-Wert   von etwa 3 ergibt, entfernt. 



     Aufnahme   auf dem    Ionerttrustauscher   und    Elution   Der sulfonierte    Ionenaustauscher   wird entfernt und mit 70    fl/o      igem   Äthylalkohol gewaschen. 75 g mit Salzsäure und Wasser gewaschener feuchter    Algin-      säure   werden dem Extrakt und dem Waschwasser zugesetzt. Die Aufnahme auf dem    karboxylgruppen-      haltigen      Kationenaustauscher   erfolgt unter Rühren bei    Zimmertemperatur   über die Nacht.

   Man lässt die    Alginsäure   sedimentieren und trennt sie auf einem Saugtrichter ab, worauf sie auf einem    Saugfilter   gesammelt, mit    95o/oigem   Äthylalkohol und Äther gewaschen und zur Entfernung des Äthers gelüftet    wird.   Eine weitere Aufnahme mit derselben Menge    Al   säure wird vorgenommen. Die    Alginsäurefällungen   werden für sich mit je 1 Liter 0,3-n Salzsäure unter Rühren    während   2-3 Stunden bei Zimmertempera- 

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 tun    eluiert.   Die    Eluate   werden vereinigt und das Insulin wird mit Kochsalz gefällt. Darauf wird nach üblicher Methodik zur Reinigung des Insulins verfahren.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH Verfahren zur Gewinnung von Insulin aus Pankreasdrüsen, dadurch gekennzeichnet, dass die Drüsen mit angesäuertem Alkohol extrahiert werden und dass der Alkoholextrakt mit einem Kationenaus- tauscher behandelt wird, der dem Extrakt das Insulin entzieht, worauf das Insulin eluiert wird. UNTERANSPRüCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man einen natürlichen oder synthetischen, hochmolekularen, karboxylgruppenhalti- gen Kationenaustauscher, wie z. B. Oxycellulose, Pektinsäure oder Alginsäure, verwendet. 2.

   Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Extraktion mit einer solchen Menge Säure, z. B. Salzsäure, erfolgt, dass der pH-Wert des Extraktes nicht unter 3 liegt. 3. Verfahren nach Patentanspruch mit Verwendung von Alginsäure als Ionenaustauscher, dadurch gekennzeichnet, dass die Eluierung mit verdünnter Mineralsäure, z. B. Schwefelsäure, erfolgt. 4. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Drüsen mit einem Alkohol, der mit einer organischen Säure angesäuert ist, extrahiert werden. 5. Verfahren nach Unteranspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Extraktion mit einem Alkohol, der mit Essigsäure, Oxalsäure oder Zitronensäure angesäuert ist, erfolgt. 6.

   Verfahren nach Unteranspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Extrakt zur Ausfällung von Eiweissverunreinigungen und Neutralsalzen mit Ammoniak bis zu neutraler oder schwach alkalischer Reaktion versetzt wird. 7. Verfahren nach Unteranspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Extrakt nach der Behandlung mit Ammoniak mit einem sulfonierten Kationen- austauscher starker Vernetzung bis zu einem PH-Wert von etwa 3 versetzt und dann zur Isolierung des Insulins auf dem karboxylgruppenhaltigen Kationen- austauscher aufgenommen wird.