Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen, wasserlöslichen, basische Eigenschaften aufweisenden Antibiotikums, das im folgenden mit A 7907 bezeichnet wird.
Das Antibiotikum A 7907 entsteht bei der Kultur einer neuen Actinomyceten-Art der Gattung Streptomyces, die mit keiner der in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology , 6. Aufl., oder in Actino- mycetes and their Antibiotics von Waksman und Lechevalier, 1953, aufgeführten Arten identisch ist und im folgenden unter der Bezeichnung Streptomyces A 7907 n. sp. beschrieben wird. Streptomyces A 7907 wurde aus einer in Zuoz, Kanton Graubünden (Schweiz), gesammelten Bodenprobe isoliert und wird in unseren Laboratorien sowie in der Eidg. Technischen Hochschule, Institut für spezielle Botanik, Zürich, unter dieser Bezeichnung aufbewahrt.
Streptomyces A 7907 bildet ein zimtbraunes bis rötlichgraues Luftmycel und trägt Konidienketten, die ein typisches Merkmal der Gattung Streptomyces darstellen. Das Pigment ist nicht deutlich löslich. Das Wachstum ist relativ wenig temperaturabhängig, sowohl bei 18 als auch bei 400 entwickelt sich der Pilz gut, doch liegt das Optimum zwischen 25 und 32". Streptomyces A 7907 zeigt gewisse Ahnlichkeiten mit S. xanthophaeus Lindenbein sowie mit S. cinnamoneus Benedict, Pridham et Lindenfelser, ist mit diesen beiden Organismen jedoch nicht identisch.
Für die Herstellung des Antibiotikums A 7907 können auch Abarten der Gattung der Streptomyces A 7907 verwendet werden, wie sie z. B. durch Selektionierung oder Mutation, insbesondere unter der Einwirkung von Ultraviolett-oder Röntgenstrahlen oder von Stickstoff-Senfölen gewonnen werden. Ein solcher Streptomyceten-Stamm wird, z. B. in wässriger, Kohlenhydrate, stickstoffhaltige Verbindungen sowie anorganische Salze enthaltender Nährlösung aerob gezüchtet, und das Antibiotikum A 7907 hierauf isoliert.
Die Züchtung erfolgt also beispielsweise in ruhender Oberflächenkultur oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttelflaschen oder den bekannten Fermentern. Als Temperatur eignet sich z. B. eine solche zwi schen 18 und 40 . Eine wesentliche antibakterielle Wirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach ll/ó5 Tagen.
Als assimilierbares Kohlenhydrat kann z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Stärke sowie Glycerin verwendet werden. Die Nährlösung kann stickstoffhaltige Nährstoffe und gegebenenfalls wachstumfördernde Stoffe enthalten, z. B. Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte wie Pepton oder Trypton, ferner Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekörnern, wie Mais und Weizen, von Destillationsrückständen der Alkoholherstellung, von Hefe, Bohnen, insbesondere der Soyapflanze, von Samen, beispielsweise der Baumwollpflanze usw., aber auch Nitrate. Von andern anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate von Alkalien, Erdalkalien, Magnesium, Eisen, Zink und Mangan enthalten.
Das Antibiotikum A 7907 stellt einen wasserlöslichen Stoff oder ein Gemisch von solchen Stoffen dar. Es ist in organischen Lösungsmitteln, vor allem Lipoidlösungsmitteln, vollkommen unlöslich. Das Antibiotikum ist basisch und bildet Salze, die zum Teil, z. B. das Hydrochlorid, in gewissen organischen Lösungsmitteln, z. B. in niederen aliphatischen Alkoholen, löslich sind. Das Antibiotikum findet sich bei der Züchtung in wässrigen Medien fast vollständig in der Nährlösung, während das von dieser abgetrennte Mycel praktisch keine biologische Aktivität aufweist.
Man kann zwecks Gewinnung des Antibiotikums A 7907 aus einer Kulturlösung dieses nicht mit organischen Lösungsmitteln extrahieren. Es lässt sich dagegen vorteilhaft bei neutraler oder schwach alka- lischer Reaktion mit Adsorptionsmitteln aus der Nähr- lösung entziehen und aus den Adsorbaten mit sauren, zweckmässig ein pH unter 4 aufweisenden Elutionsflüssigkeiten extrahieren, wobei als Adsorptionsmittel einerseits Aktivkohle, z. B. Nomit (eingetragene Marke), anderseits Kationenaustauscher, namentlich solche, die Carboxylgruppen enthalten, wie z. B. das im Handel befindliche Austauscherharz Amberlite IRC-50 (eingetragene Marke), in Frage kommen können.
Wird Aktivkohle als Adsorptionsmittel verwendet, so eignen sich als Elutionsflüssigkeiten sowohl saure wässrige Lösungen als auch Säuren enthaltende, mit Wasser mischbare Lösungsmittel, wie niedere aliphatische Alkohole und Ketone. Eine Mischung von gleichen Volumenteilen Methanol und ln Ameisensäure hat sich als besonders vorteilhaft erwiesen. Da ausser dem Antibiotikum von der Aktivkohle noch grössere Mengen, zum Teil gefärbte Verunreinigungen aus der Kulturlösung adsorbiert werden, wäscht man die Adsorptionskolonne vor der Elution des Antibiotikums bei sonst unveränderten Bedingungen vorteilhaft mit Äthanol, wobei ein grosser Teil der Begleitstoffe entfernt, das Antibiotikum jedoch nicht extrahiert wird.
Aus dem sauren Eluat lässt sich ein stark angereichertes Präparat des Antibiotikums in Form eines weissen Pulvers gewinnen, indem man das Eluat z. B. im Vakuum auf ein kleines Volumen konzentriert, wobei das organische Lösungsmittel sowie die Hauptmenge der Ameisensäure entfernt werden, und hier- auf das wässrige Konzentrat, vorteilhaft nach Ver dünnung mit 4-5 Volumen Methanol, am besten mit Aceton versetzt und die enstandene Fällung mit diesem Lösungsmittel wäscht und zuletzt trocknet. Da das Kohleeluat, besonders von Kulturen mit Calciumcarbonat enthaltenden Nährlösungen, erhebliche Mengen Ca-Ionen enthält, wird vor der Fällung des Antibiotikums aus dem Konzentrat das Calcium zweckmässig mit Oxalsäure ausgeschieden.
Zur Adsorption des Antibiotikums mit einem Kationenaustauscher wird dieser vorteilhaft in der H-form verwendet. Die Elution kann mit verdünnter wässriger Säure erfolgen, gegebenenfalls nach Vorwaschung der Kolonne mit destilliertem Wasser, wobei inaktive Begleitstoffe eliminiert werden. Als Elutionsmittel ist besonders 0, 2n Salzsäure geeignet. Das Antibiotikum ist im Eluat in Form eines Salzes enthalten. Kationenaustauscher-Eluate können als solche oder nach Konzentrierung im Vakuum, gegebenenfalls nach vorausgehender Neutralisierung, zur Herstellung weiter angereicherter Präparate des Antibiotikums dienen.
Zur Isolierung des reinen Antibiotikums A 7907 oder aus durch Kohle-oder Ionenaustauscheradsorption vorgereinigten Präparaten, versetzt man zweckmässig ihre wässrige, auf ein pH von 6, 5-7, 0 eingestellte Lösung mit einem zur vollständigen Fällung gerade ausreichenden Volumen einer wässrigen Lösung des Salzes eines Sulfonsäuregruppen enthaltenden Azofarbstoffs und isoliert das entstandene schwerlösliche Farbstoffsalz des Antibiotikums. Verwendet man dabei als Azofarbstoffsalz das unter der Bezeichnung Helianthin oder Orange III im Handel befindliche Natriumsalz der 4'-Dimethylamino-azobenzol-4- sulfonsäure, so scheidet sich das Farbstoffsalz (Helianthat) des Antibiotikums A 7907 ganz oder teilweise in kristallisierter Form aus.
Das Helianthat des Antibiotikums kann aus Wasser oder Methanol oder Mischungen dieser, aber auch aus Formamid und Wasser umkristallisiert werden. Umkristallisiert stellt es mikroskopisch ein rotbraunes Pulver dar. Unter dem Mikroskop betrachtet, bildet es gelbe, geschichtete Blättchen oder Stäbchen, die bei 186-188 unter Zersetzung schmelzen.
Um das Antibiotikum aus dem Farbstoffsalz zurückzugewinnen, kann man dieses in wässrigem oder alkoholischem Medium mit dem Salz aus einer anorganischen Säure und einer organischen Base umsetzen, wobei sich das Salz des Antibiotikums der betreffenden Säure und das Farbstoffsalz der Base bilden. Verwendet man z. B. Triäthylaminsulfat zu dieser Umsetzung und führt sie mit einer wässrigen Suspension des Antibiotikum-Helianthates aus, so erhält man das in Wasser lösliche Sulfat des Antibiotikums sowie das unlösliche Helianthat des Triäthylamins, wobei das letztere in Lösung geht, wenn man genügend Methanol zur Reaktionslösung zusetzt, während sich das nur in Wasser lösliche, in niederen Alkoholen dagegen vollständig unlösliche Antibiotikum-Sulfat ausscheidet und z. B. mittels Filtration isoliert werden kann.
Die Umsetzung kann aber auch in alkoholischer oder wässrigalkoholischer Lösung vorgenommen werden, wobei das Sulfat sofort ausfällt und von der Farbstofflösung abgetrennt werden kann. Das so erhaltene Sulfat des Antibiotikums A 7907 stellt ein farbloses, in Wasser und Formamid leicht lösliches, in organischen Lösungsmitteln, wie Alkoholen und Ketonen dagegen unlösliches Pulver von hoher antibiotischer Wirksamkeit dar.
Aus dem Sulfat kann z. B. das Hydrochlorid des Antibiotikums durch Umsetzung in wässriger Lösung mit Bariumchlorid und Isolierung aus der von Bariumsulfat befreiten Lösung als kaum gefärbtes, in Wasser sowie Methanol leicht, in Athanol schwerer lösliches Pulver gewonnen werden. Anderseits ist es auch möglich, das Hydrochlorid direkt aus dem Helianthat des Antibiotikums herzustellen, indem man zur Lösung bzw. Suspension des letzteren in Methanol konzentrierte Salzsäure oder eine Lösung von gasförmiger Salzsäure in Methanol im Uberschuss zusetzt, das gebildete Hydrochlorid mit Ather niederschlägt und isoliert.
Um geringe farbige Verunreinigungen aus dem nach diesen Methoden hergestellten Hydrochlorid zu entfernen, filtriert man zweckmässig dessen methano lische Lösung durch eine Kolonne von Aktivkohle, vorzugsweise Gasruss, wobei das Hydrochlorid nach der Verdampfung des Lösungsmittels aus dem Filtrat als reinweisses Pulver erhalten wird, das sich bei sehr langsamem Verdunsten aus wässriger oder methanolischer Lösung teilweise in kristalliner Form ausscheidet.
Die Isolierung des Antibiotikums A 7907 in reiner Form kann auch in der Weise erfolgen, dass dieses aus wässrigen Lösungen mit einer organischen Säure vom Typus der Pikrinsäure, wie z. B. Pikrinsäure selber, Styphninsäure oder Pikrolonsäure, als schwerlösliches Salz gefällt und letzteres durch Behandlung mit Säuren, z. B. Salzsäure oder Schwefelsäure, in wässrigem Medium oder in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel wie Methanol oder Aceton in das entsprechende Salz überführt und als solches isoliert wird. Nach diesem Anreicherungsverfahren kann das Antibiotikum z. B. aus dem über das Helianthat gereinigten Sulfat, aber auch aus den Eluaten der Kohle-sowie der Kationenaustauscheradsorbate gewonnen werden.
Die freie Base des Antibiotikums A 7907 ist leicht aus ihren Salzen zugänglich, aus dem Sulfat z. B. durch Umsetzung in wässrigem Medium mit Bariumhydroxyd, Neutralisierung des überschüssigen Baryts mit Kohlendioxyd sowie Abtrennung des Bariumcarbonat-und Bariumsulfat-Niederschlags und Isolierung der Antibiotikum-Base mittels Gefriertrocknung. Einfacher erfolgt die Herstellung aus den Salzen unter Verwendung eines stark basischen Anionenaustauschers, z. B. der OH-Form des unter der Bezeichnung Dowex-2 (eingetragene Marke) im Handel befindlichen Produkts.
Das Antibiotikum A 7907 ist eine farblose Base, die in Wasser und wässrigen Medien leicht löslich, in organischen Lösungsmitteln dagegen unlöslich ist.
Die wässrige Lösung der Base reagiert alkalisch. Eine 1 /o Lösung eines mittels Ionenaustauscher isolierten Präparats zeigt ein pH von 10, 5.
Mit Säuren bildet das Antibiotikum A 7907 Salze, von denen z. B. das farblose Sulfat und Hydrochlorid in Wasser sehr leicht löslich sind. Das Hydrochlorid löst sich ausserdem in niederen aliphatischen Alkoholen, besonders in Methanol. Das Farbsalz der Base mit der 4'-Dimethylamino-azobenzol-4-sulfonsäure (Helianthat) ist sowohl in wässrigen als auch in alkoholischen Medien schwer löslich. Aus solchen heiss gesättigten Lösungen scheidet es sich in gelb gefärb- ten, lappigen, geschichteten Blättchen ab, die nach der Umkristallisation einen Zersetzungspunkt von 186-188 zeigen. Beim sehr langsamen Verdunsten wässriger oder methanolischer Lösungen kann auch das Hydrochlorid des Antibiotikums in kristalliner Form erhalten werden.
Das Hydrochlorid des Antibiotikums A 7907 hat folgende Elementarzusammensetzung : C = 39, 5 /o, H = 7, 2 /o, N = 15, 5 O/o,, O = 19, 8 O/o, Cl = 17, 2 O/o. [a] 2D = + 21 .
Andere Salze des Antibiotikums A 7907 leiten sich ab z. B. von der Essigsäure, Palmitinsäure, Bern steinsäure, Zitronensäure oder Pantothensäure.
Das Antibiotikum A 7907 hat, wie aus dem Infrarotspektrum, den Farbreaktionen sowie auch aus der Elementarzusammensetzung hervorgeht, Polypeptid Charakter. Wie die vergleichende papierchromatographische Untersuchung ergibt, ist es verschieden von den bekannten wasserlöslichen, farblosen, gegen grampositive und gramnegative Bakterien wirksamen Antibiotika Streptomycin, Streptothricin und Neomycin. Trotz der Ähnlichkeit des das neue Antibiotikum produzierenden Stammes Streptomyces A 7907 mit dem das Antibiotikum Geomycin bildenden Organismus Streptomyces xanthophaeus Lindenbein und der sehr ähnlichen Elementarzusammensetzung der Hydrochloride von Antibiotikum A 7907 und Geomycin (vgl. H. Brockmann und H.
Musso : Naturwissenschaften Band 41, Seite 451 [1954], Chemische Berichte Band 87, Seite 1779 [1954]) ist das Antibiotikum A 7907 mit Geomycin nicht identisch, da es im Gegensatz zu diesem keine Ninhydrinreaktion und auch nur eine äusserst schwache Farbreaktion nach Sakaguchi gibt. Anderseits zeigt es im Unterschied zu Geomycin eine kräftige Biuretreaktion, die letzterem fehlt.
Das Antibiotikum A 7907 ist aber auch nicht identisch mit dem wasserlöslichen Polypeptid Cinn amycin, das von dem mit Streptomyces A 7907 gleichfalls ähnlichen Streptomyces cinnamoneus Benedict, Pridham et Lindenfelser produziert wird, da Cinnamycin in seinem Molekül Schwefel enthält und übrigens nur gegen grampositive, nicht aber gegen gramnegative Bakterien wirksam ist.
Das Antibiotikum A 7907 besitzt eine sehr hohe antibiotische Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Testorganismen. Verwendet man als Testmethode in vitro Verdünnungsreihen (Zehnerpotenzen) in Glukosebouillon, die während 24 Stunden bei 37 bebrü- tet werden, so ergeben sich folgende noch hemmende Konzentrationen :
Hemmende Testorganismen Konzentration g/cm3 Micrococcus pyogenes, var. aureus 10 Micrococcus pyogenes, var. aureus penicillin-resistent 100 Streptococcus pyogenes 100 Streptococcus viridans 100 Corynebacterium diphtheriae 1 Escherichia coli 100 Escherichia coli, streptomycin resistent 100 Escherichia coli, chloromycetin resistent 100 Salmonella typhosa 10 Salmonella schottmuelleri 10 Shigella sonnei 100 Pseudomonas aeruginosa 100 Klebsiella typ. A 100 Pasteurella pestis 100
Hemmende Testorganismen Konzentration g/em3
Vibrio cholerae el Tor 100
Bacillus megatherium 1
Bacillus subtils 10
Candida vulgaris 10
Endomyces albicans 10
In vivo ist das Antibiotikum A 7907 ebenfalls wirksam.
Bei sechsmaliger subkutaner Verabreichung von 50 mg/kg an mit Escherichia coli infizierte Mäuse werden 100 lo tJberlebende beobachtet. Bei gleicher Applikation zeigt sich dieselbe Wirkung bei Mäusen, die mit Klebsiella Typ. A, ebenso ein Effekt bei solchen, die mit Salmonella typhi murium infiziert sind.
Die Toxizität des Antibiotikums ist gering. Die subkutane Applikation von sechmal 50 mg/kg wird z. B. von Mäusen ohne Schädigung ertragen. Höhere Dosen wurden noch nicht geprüft.
Das Antibiotikum oder dessen Salze können als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die enterale, parenterale oder lokale Applikation geeigneten pharmazeutischen organischen oder anorganischen Träger- material. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den neuen Verbindungen nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Ole, Benzylalkohole, Gummi, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. als Tabletten, Dragees, Pulver, Salben, Cremen, Suppositorien, oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen.
Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netz-oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.
In den nachfolgenden Beispielen sind die Temperaturen in Celsiusgraden angegeben.
Beispiel 1
Die Züchtung des Streptomyces A 7907 wird nach dem Submersverfahren durchgeführt. Man verwendet eine Nährlösung, die pro Liter Leitungswasser folgende Zusatzstoffe enthält :
Lactose 10 g
Soyamehl 10 g
Natriumchlorid 5 g
Natriumnitrat 1 g
Calciumcarbonat 10 g
Die Nährlösung wird in den Impfkolben oder in den Fermentern während 20-30 Minuten bei 1 atü sterilisiert. Die sterilisierte Nährlösung zeigt ein p. von 7, 5 bis 8, 0. Die Animpfung erfolgt mit bis zu 100/o einer teilweise sporulierenden vegetativen Kultur des Organismus. Man inkubiert unter gutem Schütteln oder Rühren bei 27 , wobei Kulturen in Fermentern mit etwa 1 Vol. steriler Luft pro Vol.
Lösung in der Minute belüftet werden. Nach 70 bis 120 Stunden Bebrütung hat die Kulturlösung den grössten Hemmwert gegenüber den Testorganismen (B. subtilis, B. megatherium, Staph. aureus. Esch. coli, Candida vulgaris) erreicht, Man unterbricht die Kultur und trennt das inaktive Mycel sowie andere feste Be standteile von der das Antibiotikum enthaltenden Lösung mittels Filtration oder Zentrifugieren ab, wobei gegebenenfalls der Kulturlösung vor der Filtration etwa 1 I/o eines Filterhilfsmittels, z. B. Hyflo Super cel (eingetragene Marke), zugesetzt wird. Das pH des Kulturfiltrats ist in der Regel im Vergleich mit der sterilisierten Nährlösung nicht oder nur wenig ver ändert.
Verwendet man anstelle der oben angegebenen Nährlösung solche, die pro Liter Leitungswasser die unter a) bis f) angeführten Mischungen von Nähr- stoffen aufweisen, so erhält man nach analoger Züchtung und Aufarbeitung Kulturfiltrate von ähnlich hoher antibiotischer Wirksamkeit. Anstatt durch einen Zusatz von Hyflo Supercel oder eines andern solchen Filterhilfsmittels kann man eine rasche Filtration der Kulturlösung auch dadurch erzielen, dass man diese vor der Filtration mit Salzsäure auf PH 5 und hierauf durch Zugabe einer wässrigen Lösung von Aluminiumsulfat auf eine Konzentration von 0, 5"/o dieses Salzes einstellt.
Ausser der erwähnten Lactose-Nährlösung werden weitere Nährlösungen verwendet mit folgenden Zusatzstoffen pro Liter Wasser : a) Glucose 10 g
Soyamehl 10 g
Natriumchlorid 5 g
Natriumnitrat 1 g b) Glycerin 20 g
Soyamehl 10 g
Natriumchlorid 5 g
Natriumnitrat 1 g
Calciumcarbonat 10 g c) Glucose 10 g
Soyamehl 10 g Corn steep liquor (Maisquellwasser) 20 g
Natriumchlorid 5 g
Natriumnitrat 1 g
Calciumcarbonat 10 g d) Glucose 10 g
Pepton 5 g
Fleischextrakt ( Oxo Lab Lemco , Markenprodukt) 3 g
Natriumchlorid 5 g
Calciumcarbonat 10 g e) Glucose 10 g
Casein 3 g
Kaliumphosphat sek. 2 g f) Stärke 10 g
Pepton 4 g
Trockenhefe 1 g
Kaliumphosphat sek. 2 g
Ein gemäss den obigen Angaben gewonnenes Filtrat bzw.
Zentrifugat einer Kultur des Streptomyces A 7907 weist in der Regel ein pH von 7, 5 bis 8 auf.
Wenn dies nicht der Fall ist, wird für die folgende Anreicherung des neuen Antibiotikums das PH mit Hilfe von lOn Natronlauge auf diesen Wert eingestellt. Das schwach alkalische Filtrat wird hierauf zwecks Adsorption des Antibiotikums mit 1 /01 Aktivkohle ( Norit ) versetzt und die Masse während 1 Stunde mechanisch gerührt, wobei die gesamte antibiotisch wirksame Substanz von der Kohle aufgenommen wird.
Letztere wird durch Filtration, vorteilhaft unter Zugabe von etwas Filterhilfsmittel, wie z. B. Hyflo Supercel , von der vollständig inaktiven, fast wasserhellen Lösung abgetrennt.
Ausser dem Antibiotikum werden von der Kohle noch grosse Mengen anderer organischer, antibiotisch unwirksamer Stoffe, vor allem stark gefärbte Abbauprodukte aus der Nährlösung, aber auch anorganische Salze, adsorbiert. Diese Begleitstoffe werden vorteilhaft vor der Elution des Antibiotikums aus der Kohle entfernt. Dazu wird die abfiltrierte, noch feuchte Kohlemasse in die fünffache Menge 95 ouzo Athanol eingetragen und die Suspension 1/2 Stunde gerührt. Die so vorgewaschene Kohle lässt sich durch Filtration leicht von der Waschflüssigkeit abtrennen.
Das braun gefärbte Filtrat zeigt keine antibiotische Wirksamkeit.
Die Elution des neuen Antibiotikums erfolgt mit angesäuertem wässrigem Methanol, zweckmässig mit einer Mischung von gleichen Volumteilen Methanol und In Ameisensäure, wobei auf 1 g Adsorptionsmittel 2 cmS Elutionsflüssigkeit zur Anwendung kommen. Die Suspension wird 19 Stunde mechanisch gut gerührt, dann filtriert, worauf der Kohlerückstand noch dreimal in gleicher Weise extrahiert wird. Die Eluate, von denen nur das erste schwach gelblich gefärbt, die übrigen farblos sind, zeigen die gesamte antibiotische Aktivität. Sie werden vereinigt und im Vakuum bei niedriger Badtemperatur, z. B. bei 40 bis 60 , auf t/tOO des ursprünglichen Volumens konzentriert, wobei ausser dem Methanol und viel Wasser auch der grösste Teil der Ameisensäure entfernt wird.
Das pn des gelblich gefärbten, jedoch dünnflüssigen Konzentrats ist in der Regel um 4.
Das Konzentrat enthält, besonders wenn die Kultur in der eingangs dieses Beipiels genannten Lactose Nährlösung oder in den Nährlösungen b) bis d) durchgeführt wurde, grössere Mengen Calcium. Man entfernt dieses in Form des schwerlöslichen Oxalats, indem man dem Konzentrat unter Rühren eine 10 ouzo wässrige Oxalsäurelösung zusetzt. Die für die vollständige Fällung erforderliche Menge Oxalsäurelösung wird in einem aliquoten Teil des Konzentrats genau bestimmt.
Für Konzentrate aus Kulturen der Lactose Nährlösung oder den Nährlösungen b) bis d) werden in der Regel zwischen 300bis 500 cm3 Oxalsäurelösung pro Liter Konzentrat benötigt, entsprechend 3 bis 5 cm3 pro Liter ursprüngliches Kulturfiltrat, während Konzentrate aus Kulturlösungen mit geringem Calciumcarbonatgehalt, weniger Oxalsäure zur Abtrennung des Calciums erfordern.
Aus dem von Calcium befreiten Konzentrat wird das Antibiotikum in Form eines stark angereicherten weissen Pulvers gewonnen, indem man das wässrige Konzentrat zunächst mit 4 bis 5 Volumen Methanol verdünnt und hierauf das aktive Material mit 20 Volumen Aceton ausfällt. Der Niederschlag wird abfiltriert, zweimal mit Aceton gewaschen und zuletzt im Vakuum von d'en Lösungsmittelresten befreit.
Man erhält ein reinweisses Pulver, das nahezu die gesamte antibiotische Aktivität des Kulturfiltrats zeigt. Die Ausbeute bewegt sich zwischen 300 bis 500 mg pro Liter Kulturfiltrat.
Beispiel 2
Eine bedeutend stärkere Anreicherung des Antibiotikums A 7907 als nach der in Besipiel 1 beschriebenen Acetonfällung lässt sich über die Darstellung von dessen kristallisiertem Helianthin-Salz erzielen.
Hierzu wird das nach Beispiel 1 gewonnene calcium- freie Konzentrat mit 2 Volumen Wasser verdünnt, das pH der Lösung mit lOn Natronlauge auf PH 6, 7 bis 7, 0 eingestellt und unter kräftigem Rühren und in dünnem Strahl das zur vollständigen Fällung erforderliche Volumen einer nahezu gesättigten wässrigen Lösung von Helianthin, enthaltend 3, 5 g Helianthin (Orange III, Natriumsalz der 4'-Dimethylamino-azo benzol-4-sulfonsäure) im Liter, zugegeben, wobei die Fällungslösung vorteilhaft direkt in die Antibiotikumlösung eingeleitet wird. Das zur vollständigen Fällung benötigte Volumen der Helianthinlösung wird in einem Vorversuch mit einem aliquoten Teil ermittelt.
Es variiert je nach dem Antibiotikumgehalt in der Regel zwischen der 50-bis 150fachen Menge des angewendeten, unverdünnten Konzentrats. Das sich bildende Helianthat (Helianthin-Salz des Antibiotikums) fällt zum grössten Teil in kristallisiertem Zustand, in der Form von dünnen Stäbchen und/oder Plättchen aus. Man lässt die Fällungslösung einige Stunden bei tiefer Temperatur, um 0 , stehen, wobei sich der Niederschlag vollständig absetzt. Hierauf wird die Hauptmenge der klaren überstehenden Lösung durch Dekantieren, der Rest mit Hilfe der Zentrifuge vom Niederschlag abgetrennt. Dieser wird zwecks Waschung einmal mit etwa der gleichen Menge eiskaltem Wasser verrührt und hierauf mit Hilfe der Nutsche isoliert. Die Waschung wird zweimal in gleicher Weise, doch mit Aceton, wiederholt. Das so gewaschene Helianthat des neuen Antibiotikums wird hierauf im Vakuum getrocknet.
Die Ausbeute beträgt zwischen 40 und 70 mg Helianthat/cm Konzentrat. Das Trockenprodukt stellt ein rotbraunes Pulver dar. Es ist in Wasser sowie in Methanol ziemlich schwer löslich, leichter dagegen in Formamid, aber unlöslich oder sehr wenig löslich in Lipoid lösungsmitteln wie Aceton, Ather, Benzol, Chloroform u. a. Es kann sowohl aus Wasser sowie Methanol als auch aus Mischungen dieser Lösungsmittel umkristallisiert werden, wobei es in gelben, lappigen, geschichteten Blättchen anfällt, die bei 186-188 unter Zersetzung schmelzen.
Zur Herstellung des Sulfates des neuen Antibiotikums aus dem Helianthat werden z. B. 10 g des Helianthat-Trockenpulvers in 50 cmS Wasser suspendiert, zur Suspension 16 cm3 einer wässrigen, 80 ouzo Lösung von Triäthylaminsulfat zugegeben und die Masse während 1 Stunde gerührt, wobei sie sich durch das sich bildende schwerlösliche Triäthylamin- salz des Helianthins allmählich rotviolett verfärbt. Die Umsetzung kann durch Erwärmen erheblich beschleunigt werden. Man versetzt hierauf die Reaktionsmischung mit 20 Volumen Methanol, wobei das Sulfat des Antibiotikums als weisser Niederschlag ausfällt, während das Triäthylamin-Helianthat in Lösung geht.
Das durch Zentrifugieren oder Filtration gewonnene Antibiotikum-Sulfat wird durch zweimaliges Umfällen aus Wasser mit Methanol von anhaftendem Farbstoff befreit, zuletzt noch mit reinem Methanol gewaschen und dann getrocknet. Es stellt ein reinweisses, amorphes Pulver dar, das in organischen Lösungsmitteln unlöslich, leicht löslich dagegen in Wasser ist. Aus 10 g rohem Antibiotikum-Helianthat wird etwa 1 g Sulfat gewonnen.
Beispiel 3
Zwecks Umwandlung des nach Beispiel 2 hergestellten Sulfats in das sowohl in Wasser als auch in Methanol leicht lösliche Hydrochlorid des neuen Antibiotikums wird dieses in der 10fachen Menge Wasser gelöst und die wässrige Lösung bis zur vollständigen Fällung mit einer 20"/o Bariumchlorid-Lösung behandelt, wobei etwa 2 cmS je g Sulfat erforderlich sind.
Der Niederschlag von Bariumsulfat wird durch Zentrifugieren entfernt und aus der farblosen überstehenden Lösung das Hydrochlorid mittels Gefriertrocknung isoliert. Es werden so etwa 0, 8 g Hydrochlorid je g Sulfat gewonnen. Um eine weitere Reinigung des Hydrochlorids zu erzielen, wird dieses in wenig Methanol gelöst, die konzentrierte Lösung auf eine mit Methanol gewaschene Chromatographierkolonne von Gasruss gegossen und mit dem gleichen Lösungsmittel eluiert. Der Verdampfungsrückstand des Eluats stellt ein reinweisses, in Methanol sowie in Wasser leicht lösliches Pulver dar, das sich aus diesen Lösungs- mitteln beim sehr langsamen Verdunsten teilweise in kristalliner Form ausscheidet.
Anstatt das Hydrochlorid über das Sulfat zu bereiten, lässt sich dieses auch direkt aus dem Helianthat gewinnen. Dazu wird letzteres in trockenem, fein verteiltem Zustand in etwa der l Ofachen Menge absolutem Methanol suspendiert, zur Suspension noch 2 Volumen lOn Salzsäure-Methanol zugesetzt und hierauf kurz aufgekocht. Nach Entfärbung mit etwas Norit -Kohle wird filtriert, das wasserhelle Filtrat dann im Vakuum auf etwa 1i des ursprünglichen Volumens konzentriert und aus dem Konzentrat das Hydrochlorid mit 10 bis 20 Volumen Ather oder Aceton gefällt.
Beispiel 4
Das nach Beispiel 2 als rohes Sulfat gewonnene Antibiotikum wird über das Pikrat wie folgt weiter gereinigt.
Zu einer gut gerührten Lösung von 1 g Sulfat in 20 cm3 Wasser lässt man langsam 130 cm3 gesättigte wässrige Pikrinsäurelösung zulaufen, welche Menge zur vollständigen Fällung gerade ausreichend ist. Es bildet sich ein öliger Niederschlag, der abzentrifugiert, je einmal mit etwas gesättigter Pikrinsäurelösung und Wasser gewaschen und hierauf im Vakuumexsikkator getrocknet wird, wobei sich das Pikrat in eine feste, jedoch nicht kristallisierte Masse umwandelt. Die Ausbeute beträgt 1, 3 g. Zur Umwandlung des Pikrats des Antibiotikums in dessen Hydrochlorid löst man ersteres in warmem, mit konzentrierter Salzsäure angesäuertem Methanol und giesst die Lösung in 10 Volumen Ather, wobei das unlösliche Hydrochlorid als weisse Masse ausfällt.
Dieses wird von noch anhaftenden Resten Pikrinsäure befreit, indem man es in der zur Lösung erforderlichen Menge kochenden Methanols auflöst und die Atherfällung wiederholt. Man erhält so etwa 0, 7 g reinweisses, pulverförmiges Hydrochlorid.
Beispiel S
Anstatt über das bisher nicht kristallisierbare Pikrat kann man das reine Antibiotikum, z. B. als Hydrochlorid, über das kristallisierte Pikrolonat gewinnen, wobei man wie folgt verfährt :
Man lässt zu einer Lösung von 5, 0 g des nach Beispiel 2 gewonnenen Sulfats in 500 cm3 Wasser unter Rühren innert 1 Stunde 2500 cm3 einer nahezu gesättigten wässrigen Lösung von Pikrolonsäure, 2, 7 g im Liter enthaltend, zutropfen. Der ausgeschiedene amorphe Niederschlag des Pikrolonats wird abgenutscht und zwecks Kristallisation in 1700 cm3 kochendem Wasser aufgelöst und die Lösung heiss filtriert. Aus dem Filtrat scheidet sich beim langsamen Abkühlen auf Raumtemperatur das Pikrolonat in teilweise kristallisierter Form aus.
Der Niederschlag wird auf der Nutsche gesammelt, mit wenig eiskaltem Wasser gewaschen und zwecks Umkristallisation in 1500 cm3 kochendem Wasser aufgelöst.
Aus der heiss filtrierten Lösung fällt das Pikrolonat nunmehr vollständig in Form feiner, zu Drusen angeordneter, gelber Nadeln aus, die nach dem Waschen mit wenig kaltem Wasser und Trocknen im Vakuum über Phosphorpentoxyd, nach Sintern bei 205-208 , einen scharfen Zersetzungspunkt von 213-214 aufweisen. Die Ausbeute des zweimal umkristallisierten Pikrolonats beträgt 5, 2 g.
Aus dem vorstehend gewonnenen Pikrolonat wird das reine Hydrochlorid erhalten, indem man zur fein verteilten Suspension von 5, 0 g Pikrolonat in 80 cm3 eiskaltem Methanol unter kräftigem Rühren 3, 5 cm3 einer lOn Lösung von gasförmigem Chlorwasserstoff in absolutem Methanol portionenweise zugibt und nach der vollständigen Umsetzung das gebildete, teil weise ausgeschiedene Hydrochlorid des Antibiotikums durch Versetzen des Reaktionsgemisches mit 10 Volumen absolutem Ather vollständig ausfällt. Das Hydrochlorid wird abgenutscht, auf der Nutsche einmal mit etwas Ather gewaschen und hierauf zwecks Entfernung von noch anhaftenden Pikrolonsäureestern in 20 cm3 Methanol gelöst und erneut mit Ather ausgeschieden und gewaschen.
Das nunmehr reine Hydrochlorid des Antibiotikums stellt nach dem Trocknen im Vakuum ein reinweisses, amorphes Pulver dar. Die Ausbeute ist 2, 2 g.
Beispiel 6
Die Darstellung der freien Base des neuen Antibiotikums aus dessen Sulfat kann sowohl mit Bariumhydroxyd als auch unter Verwendung eines schwach basischen Ionenaustauschers erfolgen. Im ersten Fall versetzt man z. B. eine Lösung von 1 g des nach Beispiel 2 erhaltenen Sulfats des Antibiotikums in 5 cm3 Wasser mit einem geringen Überschuss einer warm gesättigten Lösung von Bariumhydroxyd, das heisst bis die Reaktionsmischung ein PH von etwa 9 aufweist. Man neutralisiert hierauf das überschüssige Bariumhydroxyd sofort, indem man Kohlendioxyd in die Lösung einleitet. Dann wird die Reaktionsmischung zwecks Überführung des gebildeten Bariumbikarbonats einige Minuten im Wasserbad bei 60 gehalten, worauf das ausgefallene Bariumcarbonat zusammen mit dem Bariumsulfat abzentrifugiert wird.
Aus der überstehenden, wasserhellen, alkalischen Zentrifugierlösung isoliert man die freie Base des neuen Antibiotikums mittels Gefriertrocknung. Sie stellt ein weisses, in Wasser mit stark alkalischer Reaktion lösliches, in organischen Lösungsmitteln unlös- liches Pulver dar. Ausbeute 0, 4 g.
Zur Gewinnung der freien Base mit Hilfe eines schwach basischen Ionenaustauschers wird wie folgt vorgegangen :
Man perkoliert eine etwa 20"/o wässrige Lösung von 1 g des nach Beispiel 2 erhaltenen Rohsulfats des neuen Antibiotikums durch eine Kolonne des schwach basischen Ionenaustauschers Dowex-2p, wobei etwa die 30fache Menge des zuvor mit ver dünnter Salzsäure-Wasser-verdünnter Natronlauge Wasser wiederholt in dieser Reihenfolge gewaschenen lonenaustauscherharzes angewendet wird. Die mit der Sulfatlösung beschickte Kolonne wird mit Wasser nachgewaschen, wobei die Base leicht eluiert wird.
Das Eluat wird zwecks Gewinnung der Base wie zuvor vorteilhaft lyophilisiert. Ausbeute 0, 7 g.
Beispiel 7
Eine nach Beispiel 1 gewonnene, vom Mycel befreite Kulturlösung des Antibiotikums A 7907 wird langsam durch eine Kolonne eines schwach sauren, Carboxylgruppen enthaltenden Ionenaustauscher- harzes wie z. B. Amberlite IRC-50 filtriert, wobei je Liter der Antibiotikumlösung 100 g der H-Form des Austauschers angewendet werden, und die Durchflussgeschwindigkeit auf 5 bis 10 Liter je Stunde eingestellt wird. Das Antibiotikum A 7907 wird, zusammen mit inaktiven, zum Teil stark braun gefärbten Begleitstoffen adsorbiert ; die abfliessende, ein p von 3 bis 3, 5 aufweisende Lösung hat nur eine sehr geringe antibiotische Wirksamkeit.
Man wäscht hierauf die Amberlitep-Kolonne mit 1/5 des Volumens der einfiltrierten Kulturlösung destillierten Wassers nach, wobei ein Teil der inaktiven, gefärbten Begleitstoffe entfernt, das Antibiotikum selber jedoch nicht eluiert wird. Um dieses aus dem Adsorbat zu gewinnen, schickt man durch die vorgewaschene Kolonne eine wässrige Lösung von 0, 2n Salzsäure, und zwar total 1/des des Volumens der angewendeten Kulturlösung.
Das Eluat wird in 5 gleichen Fraktionen aufgefangen.
Die Testierung derselben ergibt, dass die Hauptmenge des aktiven Materials, nämlich 80 bis 90 /a, in den ersten beiden Eluaten vorhanden ist, während die übrigen, gleichfalls noch gefärbten Eluate nur eine relativ geringe antibiotische Wirksamkeit aufweisen.
Man vereinigt die beiden stark aktiven, sauren Eluate und neutralisiert sie entweder mit konzentrierter Natronlauge oder mit Hilfe eines schwach basischen Ionenaustauschers in der OH-Form. Die so gewonnene Antibiotikumlösung kann als solche oder nach Konzentrierung im Vakuum und bei niedriger Temperatur als Ausgangslösung zur Herstellung weiter angereicherter Präparate des Antibiotikums A 7907, z. B. nach den in den Beispielen 2-3 oder 4 beschriebenen Verfahren, verwendet werden.