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Verfahren zur Herstellung von Dihydronovobiocin Novobiocin [dies ist die allgemeine Bezeichnung für ein Antibioticum, das unter anderem auch unter der Bezeichnung Cathomycin (eingetragene Marke) bekannt ist], wird erzeugt durch Züchten einer bisher unbekannten Art von Mikroorganismen, die als Streptomyces sphaeroides bezeichnet wurde, unter kontrollierten Bedingungen. Diese Streptomyces-Art, welche aus einer Bodenprobe von einem alten Weiderasen in Vermont isoliert wurde, wurde in der Kulturensammlung von Merck & Co., Inc., Rahway, New Jersey, als Streptomyces sphaeroides MA-319 bezeichnet. Eine lebensfähige Kultur davon wurde hinterlegt bei der Fermentation section des Northern Utilization Research Bureau, United States Department of Agriculture in Peoria, Illinois, und in dessen ständige Kulturensammlung aufgenommen als NRRL 2449.
Wässerige Medien, die sich eignen zum aeroben Züchten von Stämmen von Streptomyces sphaeroides zur Bildung von Novobiocin sind im allgemeinen jene, die sich auch eignen für die Herstellung von andern Antibiotica durch Züchten von andern Streptomyces-Mikroorganismen. Solche Medien enthalten Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff, wie z. B. ein Kohlehydrat, assimilierbaren Stickstoff, z. B. Getreideweiche, Caseinhydrolysat, Auszüge aus Destillationsrückständen usw., sowie anorganische Salze, inbegriffen solche von Spurenmetallen, die für den eigenen Stoffwechsel der Mikroorganismen nötig sind.
Vorzugsweise wird während der Zeit, in welcher die Mikroorganismen gezüchtet werden, die gewöhnlich etwa 1-7 Tage ausmacht, eine Temperatur von 24 bis 28 C eingehalten, und es wird eine Belüftung durchgeführt, um ein optimales Wachstum der Organismen und eine optimale Produktion von Novo- biocin zu erzielen. Die in dieser Weise hergestellten Fermentierungsbrühen besitzen eine Aktivität von etwa 150-2000 Novobiocin-Einheiten, wie sie hiernach definiert werden, pro cm3, und die Festanteile der Fermentierungsbrühe haben eine Aktivität in der Grössenordnung von etwa 2,25 Novobiocin-Einheiten pro mg Feststoffe. Der antibiotische Wirkstoff kann gereinigt und mit Hilfe verschiedener Verfahren in reinerer Form gewonnen werden.
Zum Beispiel kann man die gesamte Brühe bei einer Wasserstoffionenkonzentration, welche gewöhnlich etwa einem pH 7,0-8,0 entspricht, filtrieren. Das Filtrat kann man im sauren Bereich unterhalb etwa pH 7,0 extrahieren mit einem neutralen, eher schwach polaren, mit Wasser nicht mischbaren flüssigen organischen Lösungsmittel, das in kalter konzentrierter Schwefelsäure und in kalter sirupartiger Orthophosphorsäure löslich ist.
Der organische Auszug kann extrahiert werden mit einer wässerigen alkalischen Pufferlösung bei einem pH von mindestens 8,0, wobei man eine Lösung erhält, welche Novobiocin-Salz in beträchtlicher Konzentration enthält.
Die beiden Extraktionsschritte können nachfolgend wiederholt werden, wobei man eine noch konzentriertere Lösung erhält, aus welcher durch saures Ausfällen Novobiocin-aktives Material gewonnen werden kann. Das so gewonnene Produkt kann gereinigt werden durch Umkristallisieren aus einer wässerigen sauren Alkohollösung.
Es versteht sich, dass ausser Streptomyces sphae- roides NRRL 2449 auch andere Novobiocin erzeugende Stämme von Streptomyces sphaeroides zur Herstellung von Novobiocin verwendet werden können, beispielsweise Mutationsformen der beschriebenen Organismen, wie sie erhalten werden durch natürliche Auswahl oder durch Einwirkung von Mutations- mitteln, z. B.
Bestrahlung mit Röntgen- oder Ultraviolettstrahlen, Behandeln mit Stickstoff-Lost usw.
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Das neue Antibioticum Novobiocin besteht aus einer Substanz mit der ungefähren Bruttoformel C31H36N2O11. Diese reagiert gegenüber alkalischen Reagenzien als saure organische Verbindung und ist in solchen leicht löslich, beispielsweise in wässerigen Lösungen von Alkalihydroxyden, -carbonaten und -bicarbonaten; sie besitzt zwei besenbindende Gruppen und kann aus alkalischer Lösung ausgefällt werden durch Ansäuern.
Sie ist löslich in niedrigen Alka- nolen, niedrigen aliphatischen Ketonen, Essigsäure, Äthylacetat und Dioxan, und sie ist unlöslich oder nur schwer löslich in Äther, Benzol, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Äthylendichlor, Wasser und Salzsäure.
Reines Novobiocin wurde in zwei kristallinen Modifikationen erhalten; die eine Form kristallisiert rosettenförmig und schmilzt bei etwa 152-l54 C, während eine zweite Form das Aussehen von flachen Nadeln hat und bei etwa 170-172 C schmilzt. Jede dieser kristallinen Formen des Antibioticums kann in eine sogenannte Normalform übergeführt werden, bei welcher es sich vermutlich um eine amorphe oder submikrokristalline Form handelt, indem man die Kristalle in Aceton löst, zu dieser Lösung rasch ein relativ grosses Volumen Petroläther zugibt und das ausgefällte normalisierte Material abfiltriert.
Alkalische wässerige Lösungen von Novobiocin und Mineralölsuspensionen der Normalform des Anti- bioticums zeigen eine charakteristische Absorption, die ersteren im Ultravioletteil und die letzteren im Infrarotteil des Strahlungsspektrums. Eine Lösung von reinem Novobiocin in 0,1n wässerigem Natriumhydroxyd zeigt eine charakteristische Ultraviolett- Absorptionsspitze bei 3070 A. Diese Absorptionsspitze zeigt ein im wesentlichen reines Material an, mit einer spezifischen Absorption von 600, gemessen bei dieser Wellenlänge unter Verwendung einer Lösung von 1 g reinem Novobiocin auf 100 cm3 Lösung, die enthalten ist in einer Zelle mit einer Absorptionsschichtdicke von 1 cm.
Eine Lösung von reinem Novobiocin in 0,1n wässerig-methanolischer Salzsäure zeigt eine charakteristische Ultraviolett-Absorptionsspitze bei 3240 A mit E #m = 390. Eine Mineralöl Suspension von reinem normalisiertem Novobiocin zeigt charakteristische Infrarot-Absorptionsspitzen bei den folgenden Wellenlängen, ausgedrückt in Mikron: 5,8-6,0 (breit), 6,10, 6,21, 6,30, 6,49, 6,63, 7,4 bis 7,6 (breite Schulter), 7,78, 7,96, 8,27 (schwach), 8,60 (Schulter), 8,7 (Schulter), 9,13, 9,40, 10,0-10,1 (breit), 10,28, 10,60 (breit), 12,0-12,30 (breit), 12,60-12,75 (breit), 13,07 und 13,39.
Die Novobiocin-Einheiten beziehen sich auf die mikrobiologische Aktivität von reinem kristallinem Novobiocin. Die mikrobiologische Aktivität von reinem kristallinem Novobiocin wurde willkürlich festgesetzt auf 5000 Einheiten/mg, und sie wird bestimmt nach der Standard-Schalenplatten-Diffusionsmethode unter Verwendung von Bacillus subtilis ATTC 12,432 als Testorganismus. Nach diesem Verfahren wird eine Kultur von Bacillus subtilis ATTC 12,432 während 24 Stunden bei 37 C auf Hirnmarkinfusionsagar (Difco Manual, 9. Ausgabe, Seiten 90, 91) gezüchtet und dann für eine Dauer von nicht mehr als einem Monat gelagert. Zur Herstellung von Sporen wird ein Inoculum zubereitet durch Zugeben von 5 cm3 sterilem destilliertem Wasser zu einer frischen Zucht von Bacillus subtilis.
Die Zellen werden aseptisch vom Nährboden abgekratzt, gut vermischt und in einen Erlenmeyer- Kolben gegeben, welcher 50 cm3 steriles destilliertes Wasser enthält. Zwei cm3 der Bakteriensuspension werden als Inoculum in einen Roux-Kolben gegeben, weicher ein Medium enthält, das aus 3 % Sojabohnenmehl, 0,2 %o NaCl, 0,4% löslichen Anteilen aus Destillationsrückständen, 0,8%c, Dextrose und 2,00% Agar besteht. Nach Bebrüten während 7 Tagen bei 37 C wird die erhaltene Bakterienzucht suspendiert in 50 cm3 sterilem destilliertem Wasser und während 30 Minuten bei 65 C pasteurisiert. 4 cm3 einer Verdünnung 1 : 50 dieser Sporensuspension werden verwendet pro Liter Versuchsmedium, das bei einem pH von 5,9-6,10,5 % Pepton, 0,3 % Rindfleischextrakt, 0,3 % Hefeextrakt und 1,5 %lo Agar enthält.
Portionen von je 50 cm3, besäten Mediums werden in tiefe Petri-Schalen mit flachem Boden gegeben. Auf das besäte Agar stellt man 6 Zylinder aus rostfreiem Stahl. Abwechselnd werden 3 Zylinder gefüllt mit einer Standard-Lösung von 4 r Novobiocin/cm3 (entsprechend 20 Novobiocin-Einheiten/ cm3) und 3 Zylinder mit der zu bestimmenden Lösung, welche ungefähr auf die gleiche Stärke verdünnt wird mit m/20 Phosphatpuffer bei pH 6,0. Es wird eine tägliche Standard-Kurve hergestellt mit reinem Novobiocin, das auf verschiedene Konzentrationen von 2-16 /tcm3 verdünnt ist.
Nach 18stündigem Bebrüten bei 28 C werden die Durchmesser der Hemmungszonen der unbekannten Lösungen und der Standard-Lösungen auf jeder Schale gemessen. Die Stärke der unbekannten. Lösung wird bestimmt aus einem Nomogramm, basierend auf :dem Empfänglichk.eit.sgrad bei verschiedenen Konzentrationen, der sich aus der täglichen Standard- Kurve ,ergibt.
Novobiocin ist optisch aktiv, [a] D = -270 (C = 1 in 1 n Natriumhydroxyd) und [a] D = -44, (C = 1 in Pyridin).
Novobiocin ist wirksam zur Hemmung des Wachstums in erster Linie von grampositiven Mikroorganismen, zeigt jedoch auch eine gewisse Wirkung gegenüber gramnegativen Mikroorganismen. Es hemmt u. a. das Wachstum der folgenden Orga- nismen:
M. pyogenes vor. albus M. pyogenes vor. aureus Diplococcus pneumoniae Corynebacterium .diphtheriae Typus gravis Corynebacterium diphtheriae Typus intermedius Corynebacterium diphtheriae Typus mitis Corynebacterium xerose
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Corynebacterium renale Neisseria meningitidis Sarcina lutea (VD) M. pyogenes var. aureus (resistent gegenüber Aureomycin) M. pyogenes var. aureus (resistent gegenüber Streptomycin-Streptothricin) M. pyogenes var.
aureus (resistent gegenüber Penicillin). Novobiocin-Salze haben ebenfalls antibiotische Wirkung. Beispielsweise zeigte sich. beim Agarstreifen- lösungsversuch, dass das Natriumsalz von Novobiocin das Wachstum verschiedener Stämme von M. pyogenes var. aureus, M. pyogenes var. albus, Neisseria menin- gitidis (Nr. 274) und Sarcina lutea (VD) bei Konzentrationen von weniger als 0,5 /cm3 hemmt. Auch andere Mikroorganismen werden durch Novobiocin oder dessen Salze in unterschiedlichem Masse geschädigt.
Es wurde nun gefunden, dass beim Zusammenbringen von Novobiocin mit Wasserstoff in Gegenwart eines Hydrierungskatalysators im Verhältnis von 1 Mol Wasserstoff pro Mal Novobiocin bzw. Novo- biocin-Salz in sozusagen quantitativer Ausbeute ein Dihydro-Derivat entsteht als neues synthetisches Produkt. Bei diesem Produkt handelt es sich um Di- hydronovobiocin bzw. einem Salz davon, je nach dem verwendeten Ausgangsmaterial oder nach den Bedingungen, unter welchen das Produkt erhalten wurde. Dieses Dihydronovobiocin-Produkt ist ungefähr antibiotisch so aktiv wie das Novobiocin selbst, indem es in reinem Zustand eine Aktivität von etwa 5000 Novobiocin-Einheiten pro mg aufweist, und ist ebenfalls zur klinischen Verwendung geeignet.
Zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird beispielsweise so vorgegangen, dass man Novo- biocin oder ein Salz von Novobiocin in einem geeigneten Lösungsmittel löst, z. B. in einem niedrigen Alkanol, einer niedrigen Fettsäure oder einer wässerigen alkalischen Lösung, in welchem ein Hydrie- rungskatalysator suspendiert ist, setzt das Gemisch bei Atmosphärendruck oder höherem Druck einer Wasserstoffatmosphäre aus und schüttelt oder rührt so lange, bis ungefähr ein Mol Wasserstoff pro Mol Novobiocin bzw. Novobiocin-Salz aufgenommen ist.
Geeignete Hydrierungskatalysatoren sind katalytische Massen aus Platin, Palladium, Ruthenium und Rhodium sowie Oxyde dieser Edelmetalle, ferner feinzerteiltes Nickel oder Cobalt, z. B. Raney Nickel oder Raney-Cobalt. Die Katalysatoren können mit oder ohne Träger und mit oder ohne Beschleuniger verwendet werden. Im allgemeinen verläuft die Hydrierung rascher mit Platin als mit den andern genannten Edelmetall- oder Edelmetalloxyd-Katalysatoren, wenn die verwendeten Katalysatormengen gleich sind. Genügende Reaktionsgeschwindigkeiten werden bei Verwendung von Edelmetall- oder Edelmetalloxyd-Katalysatoren bei niedrigeren Drucken und Temperaturen erreicht als bei Verwendung von Nichtedelmetall- Katalysatoren, wie Raney-Nickel oder Raney-Cobalt.
Bei Verwendung eines Edelmetalls oder eines Edelmetalloxyds als Hydrierungskatalysator verläuft die Reaktion mit befriedigender Geschwindigkeit bei gewöhnlicher Zimmertemperatur und geringem Druck, das heisst einem solchen von wenig über Atmosphärendruck. Bei Verwendung anderer Hydrierungskatalysatoren, wie Raney-Nickel oder Raney Cobalt können mit Vorteil etwas höhere Temperaturen von etwa l00 C oder mehr, jedoch nicht über etwa 150 C, und etwas höhere Drucke von etwa 70-154 kg/cm2 angewendet werden. Die zur vollständigen Durchführung der Reaktion nötige Zeit kann verkürzt werden, wenn man die Reaktion bei erhöhten Drücken durchführt. Die Reaktion verläuft befriedigend bei Zimmertemperatur, doch können, wenn erwünscht, auch höhere Temperaturen angewendet werden, die im allgemeinen jedoch etwa 150 C nicht überschreiten sollen.
Im allgemeinen ist der Typus des verwendeten Katalysators nicht ausschlaggebend, indessen wird die Reduktionsgeschwindigkeit erhöht oder herabgesetzt bei Vergrösserung oder Erniedrigung der Katalysatormenge.
Als Ausgangsmaterialien können unreine Konzentrate von Novobiocin oder Novobiocin-Salzen verwendet werden, doch geht man gewöhnlich vorzugsweise von reinen Ausgangsmaterialien aus, wenn solche zur Verfügung stehen. Geeignet sind Alkalisalze, z. B. das Mononatriumsalz von Novobiocin.
Man kann die Reaktion in einem Lösungsmittel vornehmen, in dem das als Ausgangsmaterial verwendete Novobiocin oder Novobiocin-Salz löslich ist und welches die Hydrierung des Novobiocins nicht stört. Beispielsweise können alkalische wässerige Lösungen, wie wässerige Natrsumhydroxydlösung oder wässerige Kaliumhydroxydlösung, niedrige Alkanole, wie Methanol oder Äthanol, sowie niedrige Fettsäuren, wie Eisessig, verwendet werden.
Nach Beendigung der Reduktion, das heisst nachdem eine äquimolekulare Menge Wasserstoff mit Bezug auf das Novobiocin oder Novobiocin-Salz, das als Ausgangsmaterial dient, aufgenommen wurde, wird der Katalysator am besten durch Filtrieren aus dem Reaktionsgemisch entfernt und das Dihydro- novobiocin isoliert, vorzugsweise durch Abdampfen des Lösungsmittels aus .dem Filtrat unter Vakuum.
Das Dihydronovobiocin kann als solches aus dem Reaktionsgemisch gewonnen werden; falls man von einem Salz von Novobiocin ausgeht, kann so vorgegangen werden, dass man eine Lösung des erhaltenen Dihydronovobiocin-Salzes mit einer Säure, beispiels- weise einer der gebräuchlichen Mineralsäuren, wie Schwefelsäure, versetzt und das ausgefällte Dihydro- novobiocin abfiltriert.
Gleicherweise lassen sich Salze von Dihydronovo- biocin als .solche erhalten, indem man die Hydrierung in einem geeignet ,gewählten basischen wässerigen Medium durchführt.
Man kann Dihydronovobiocin in einfacher Weise durch Umsetzung mit geeignet ausgewählten Basen in ihre einbasischen oder zwei- basischen Salze Überführen. In dieser Weise können
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Alkalisalze von Dihydronovobiocin, wie das Natrium- oder das Kaliumsalz, Erdalkalisalze, wie das Calciumsalz, sowie die Salze quaternärer Stickstoffbasen, wie Ammoniumsalze und Salze organischer Amine gewonnen werden.
Beispiele von organischen Aminen, welche mit Dihydronovobiocin Salze bilden, sind Chinin, Procain, Guanidin, Noformicin, N-Benzyl-ss- phenyl-äthylamin, N,N Dibenzyl-äthylendiamin, Cyclo- hexylamin, N Äthyl-piperidin, Triäthylamin, Dicyclo- hexylamin, Arginin, Histidin und Lysin.
Die Salze von Dihydronovobiocin können, wenn erwünscht, gereinigt werden durch Umkristallisieren nach den üblichen Methoden. Beispielsweise kann man sie in einer minimalen Menge eines niedrigen Alkanols, wie Methanol oder Äthanol, lösen und die Lösung teilweise eindampfen, um ein Ausfallen des gereinigten kristallinen Materials hervorzurufen, oder man kann der alkoholischen Lösung ein Lösungsmittel wie Aceton zusetzen, um eine Trübung einzuleiten, wonach, nachdem man einige Zeit stehengelassen hat, das ausgefallene gereinigte kristalline Produkt gewonnen werden kann.
Wie oben erwähnt, scheint dem Novobiocin auf Grund der zur Zeit vorliegenden Daten die Bruttoformel C31H36N2O11 zuzukommen, woraus folgt, dass das Dihydronovobiocin, welches zwei Wasserstoffatome pro Novobiocin-Molekül mehr besitzt, die Formel C31H38N2O11 aufweisen dürfte. Obschon die genaue chemische Struktur des Novobiocin- und des Dihydronovobiocin-Moleküls zur Zeit noch nicht vollständig geklärt ist, nimmt man auf Grund experimentalchemischer Untersuchungen an, dass das Novobiocin-Molekül unter anderem einen Benzolring enthält, an welchen eine Dimethylallyl-Kette mit der Gruppierung
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geknüpft ist, welche bei der Hydrierung in eine Dimethylpropyl Kette der Gruppierung
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übergeht als Substituent des genannten Benzolrings im Dihydronovobiocin.
Die Tatsache, dass Novobiocin in Gegenwart eines geeigneten Hydrierungskatalysators mit Wasserstoff reagiert unter Bildung einer neuen Verbindung und die Tatsache, dass diese Reaktion mit äquimolaren Mengen Wasserstoff und Novobiocin verläuft, können bewiesen werden, indem man die Reaktion durchführt unter Verwendung des Wasserstoffisotops Deuterium anstelle von gewöhnlichem Wasserstoff, und dann das Reaktionsprodukt analysiert zur Bestimmung von dessen Deuteriumgehalt.
Dies kann wie folgt geschehen: In einen geeigneten Hydrierungsapparat gibt man etwa 515 mg Novobiocin und 71 mg Natriumhydroxyd zu einem Gemisch von 50 mg Platinoxyd und 10 cm3 Deuteriumoxyd unter einer Atmosphäre von Deuterium und rührt das Gemisch unter einem Deuteriumdruck von etwas, mehr als 1 Atmosphäre während etwa 2 Stunden. Dann setzt man etwa 35 mg weiteres Natriumhydroxyd zu, um eine vollständige Auflösung des Novobiocins zu gewährleisten, und gibt nochmals 50 mg Platinoxyd zum Gemisch. Um die Wasserstoffionenkonzentration der Lösung zu erniedrigen und dadurch eine Hydrolyse zu verzögern, gibt man etwa 0,5 cms Äthylacetat zu und rührt dann das Gemisch unter der Deuterium-Atmosphäre während etwa weiteren 9 Stunden.
Dann filtriert man das Gemisch zur Entfernung des Katalysators und säuert das Filtrat an durch Zugabe von Salzsäure, wobei das Deuterium-Isologe von Dihydronovobiocin ausfällt, welches abgetrennt, mit Wasser gewaschen und getrocknet wird. Bei der Analyse findet man, dass das Produkt 5,0 Gew.%a Deuterium enthält (berechnet: 5,6 %).
Die Anwesenheit von Deuterium im Produkt dient dazu, dasselbe als neue chemische Verbindung zu unterscheiden von dem als Ausgangsmaterial verwendeten Novobiocin, und sie beweist, dass eine Wasserstoffaddition stattfindet, wenn man Novobiocin in Gegenwart eines Hydrierungskatalysators wie oben beschrieben einer Hydrierung unterwirft. Der bei der Reaktion aufgenommene und im Reaktionsprodukt anwesende Deuterium-Anteil beweist, dass die Reaktionsteilnehmer in äquimolarer Menge an der Reaktion teilgenommen haben.
Eine biologische Untersuchung dieses Deuterium-Isologen von Dihydro- novobiocin ergibt, dass dieses genau denselben Grad von antimikrobiologischer Aktivität besitzt wie Novo- biocin und Dihydronovobiocin., und d'ass sich seine Wirksamkeit auf das gleiche bakterielle Spektrum erstreckt wie diejenige von Novobiocin und Dihydro- novobiocin.
Während sich die beiden Gruppen von antibiotischen Substanzen, nämlich Novobiocin und .seine Salze einerseits und Dihydronovobiocin und seine Salze anderseits, durch gewöhnliche chemische Analyse kaum unterscheiden lassen,- und während auch die gewöhnlichen physikalischen :Messungen, wie diejenigen der Absorption im Infrarot- oder Ultraviolett- Bereich des Strahlungsspektrums, eine derartige Unterscheidung nicht ohne weiteres zulassen, können die Glieder der beiden Gruppen leicht unterschieden werden durch Papierchromatographie, sowie auf Grund ihres Verhaltens gegenüber gewissen chemischen Reagenzien, insbesondere Perjodsäure.
Was die erste Unterscheidungsmethode betrifft, wird gewöhnlich das mit umgekehrter Phase arbeitende Chromatographieverfahren angewendet, wobei man Capryl:alkohol als stationäre Phase und eine wässerige Lösung als bewegliche Phase verwendet.
Ein Blatt Filterpapier (Whatman Nr. 1) wird behandelt zur Entfernung von Wasser aus dem Papier.
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Die Behandlung besteht darin, dass man das Papier bei 110 C unter Hochvakuum (1 mm Hg) über Nacht trocknet. Hierauf wird das Papier behandelt zum Schutz gegen Wiederabsorption von Wasser. Diese Behandlung besteht darin, dass man das Papier in ein Gemisch aus einer Siliconflüssigkeit (z. B. Dow Cor- ning 200 Fluid) mit einer Viskosität von 12500 und Äthyläther mit einem Verhältnis von 5 g Silicon- flüssigkeit auf 100 cm3 Äthyläther eintaucht und dann während 10 Minuten an der Luft trocknet. In diesem Zustand können die Papiere bis zu ihrer Verwendung in einem Exsikkator gelagert werden.
Bei der Verwendung des Papiers wird das Novobiocin oder Dihydronovobiocin nahe dem einen Ende des Streifens aufgetupft, wonach man das Papier in ein Gemisch von Caprylalkohol und Methanol (Volumenverhältnis 1:5) eintaucht. Nach dem Eintauchen wird das Papier abgelöscht zur Entfernung von überschüssiger Flüssigkeit und dann in einem geschlossenen Zylinder aufgehängt, wobei jenes Ende, an welchem die Verbindungen aufgetragen wurden, oben ist. Dieses Ende des Papierstreifens wird in eine wässerige Lösung von Natriumphosphat (0,1-molar) mit einem pH von 8,4 eingetaucht. Eine zusätzliche Menge der gleichen Lösung wird am Boden des geschlossenen Zylinders aufgestellt, so dass das Ab- dunsten der Lösung vom Papier beim Hinunterwandern durch dasselbe möglichst Gering gehalten wird.
Beim Hinunterwandern der beweglichen (wässerigen) Phase durch das Papier bewegt sich das Novo- biocin rascher als das Dihydronovobiocin. Innert 6 Stunden bewegt sich die Lösungsmittelfront etwa 18 cm vorwärts und führt zu einer befriedigenden Auftrennung der beiden Verbindungen. Die getrennten Lagen der beiden Flecke sind auf dem Papier sichtbar, wenn man es in einem Ultraviolettgerät betrachtet. Lässt man das Chromatogramm über Nacht laufen (etwa 17 Stunden), so bewegt sich die Lösungs- mittelfront um etwa 45 cm, und es erfolgt eine entsprechend grössere Trennung zwischen den beiden Flecken.
Quantitativ ausgedrückt, bewegt sich Novobiocin mit einer Wanderungsgeschwindigkeit entsprechend einem Rf-Wert von 0,30. Unter Bezugnahme auf die Beweglichkeit von Novobiocin als Standard von 1,0 besitzt das Dihydronovobiocin eine Wanderungsgeschwindigkeit von 0,68.
Bei der andern Methode zur Unterscheidung von Novobiocin und seinen Salzen und Dihydronovobiocin und seinen Salzen, bei welcher Novobiocin oder ein Novobiocin-Salz mit Perjodsäure zur Reaktion gebracht wird, wird ein zusätzliches Mol dieses Reagens pro Mol Novobiocin aufgenommen im Vergleich zur Menge des Reagens, die aufgenommen wird bei der Reaktion mit einer äquimolaren Menge Dihydro- novobiocin. Dies kann leicht wie folgt gezeigt werden: Man behandelt Lösungen von gemessenen Mengen Novobiocin und Dihydronovobiocin in Dioxan mit einem bekannten Überschuss an Perjodsäure in Wasser. Die Lösungen werden über Nacht stehen gelassen.
Der Überschuss an Perjodsäure wird in jedem Fall bestimmt durch Titrieren mit Natriumarsenit- Normallösung. Die Differenz des Titrationswertes dieses Überschusses und der zu Beginn des Versuches anwesenden Perjodsäuremenge ergibt in beiden Fällen die Perjodsäuremenge, welche von den Verbindungen aufgenommen wurde. Es wird gefunden, dass Novobiocin pro Mol verwendeter antibiotischer Verbindung etwa 1 Mol Perjodsäure mehr aufnimmt als Dihydronovobiocin.
Novobiocin und seine Salze einerseits und Di- hydronovobiocin und seine Salze anderseits unterscheiden sich auch in ihrer Aktivität gegenüber gewissen Mikroorganismen, wie aus der folgenden Tabelle hervorgeht, welche auf in vitro-Versuchen mit Standard-Verdünnungsreihen beruht.
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<tb> Tabelle <SEP> 1
<tb> Vergleich <SEP> von <SEP> Novobiocin <SEP> und <SEP> Dihydronovobiocin
<tb> Kultur <SEP> Hemmungs-Konzentration <SEP> /cm3
<tb> Novobiocin <SEP> Dihydronovobiocin
<tb> C. <SEP> diphtheriae <SEP> (gravis) <SEP> ATCC <SEP> 9674 <SEP> 0,39 <SEP> 0,19 <SEP> oder <SEP> <
<tb> C. <SEP> diphtheriae <SEP> (intermediate) <SEP> ATCC <SEP> 9675 <SEP> 0,39 <SEP> 0,19 <SEP> oder <
<tb> C. <SEP> diphtheriae <SEP> (mitis) <SEP> ATCC <SEP> 9673 <SEP> 0,39 <SEP> 0,19 <SEP> oder <
<tb> C.
<SEP> pseudotuberculosis <SEP> 545 <SEP> 25 <SEP> 6,25
<tb> C. <SEP> renalis <SEP> 506 <SEP> 0,39 <SEP> 0,19 <SEP> oder <
<tb> C. <SEP> xeroxis <SEP> C. <SEP> U. <SEP> 1,56 <SEP> 0,78
<tb> C. <SEP> pseudodiphtheriticum <SEP> 259 <SEP> 50 <SEP> 12,5
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> V.D. <SEP> 0,19 <SEP> 0,19
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<tb> Kultur <SEP> Hemmungs-Konzentration <SEP> /cm3
<tb> Novobiocin <SEP> Dihydronovobiocin
<tb> M. <SEP> pyogenes <SEP> vor. <SEP> albus <SEP> 0,19 <SEP> 0,19
<tb> M. <SEP> pyogenes <SEP> vor. <SEP> aureus <SEP> Sm <SEP> 0,19 <SEP> oder <SEP> < <SEP> 0,19 <SEP> oder <
<tb> D. <SEP> pneumoniae <SEP> I-37 <SEP> 0,39 <SEP> 0,19
<tb> D. <SEP> pneumoniae <SEP> II-807 <SEP> 3,12 <SEP> 1,56
<tb> D. <SEP> pneumoniae <SEP> I1-6302 <SEP> 1,56 <SEP> 0,78
<tb> Strep. <SEP> pyogenes <SEP> C-203 <SEP> 1,56 <SEP> 1,56
<tb> Strep.
<SEP> pyogenes <SEP> S-23 <SEP> 1,56 <SEP> 0,78
<tb> Strep. <SEP> fecalis <SEP> 12,5 <SEP> 12,5
<tb> N. <SEP> catarrhalis <SEP> 7900 <SEP> 12,5 <SEP> 6,25
<tb> N. <SEP> intracellularis <SEP> 274 <SEP> 0,39 <SEP> 0,78
<tb> N. <SEP> intracellularis <SEP> 2333 <SEP> 0,39 <SEP> 0,39
Es ist zu beachten, dass Dihydronovobiocin gegen- über den Testmikroorganismen mindestens so aktiv und in den meisten Fällen aktiver ist als Novo- biocin, insbesondere gegenüber wichtigen Krankheitserregern, und dass eine mehr als zweifache Verbesserung der Aktivität festzustellen ist gegenüber zweien von diesen, nämlich C. pseudotuberculosis 545 und C. pseudodiphtherificum 259.
Man findet auch, dass Dihydronovobiocin im Vergleich zu Novobiocin bedeutend aktiver ist in vivo gegenüber Infektionen durch Proteus sp., Micro- coccus pyogenes vor. aureus Smith, Streptococcus pyogenes und Diplococcus pneumoniae (Erythro- mycin-resistent), wie aus der folgenden Tabelle hervorgeht:
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<tb> Tabelle <SEP> 2
<tb> Dosis, <SEP> die <SEP> nötig <SEP> ist <SEP> für <SEP> das <SEP> Überleben <SEP> von <SEP> 50 <SEP> %d <SEP> der <SEP> Testtiere, <SEP> die <SEP> geimpft <SEP> wurden <SEP> mit <SEP> einer <SEP> Kultur
<tb> der <SEP> folgenden <SEP> Mikroorganismen-Stämme
<tb> Oral <SEP> durch <SEP> subcutane <SEP> Injektion
<tb> Dihydro- <SEP> DihydroNovobiocin <SEP> novobiocin <SEP> Novobiocin <SEP> novobiocin
<tb> D. <SEP> pneumoniae <SEP> I-37 <SEP> (erythromycin-resistent) <SEP> 4,01 <SEP> 3,44 <SEP> - <SEP> M. <SEP> pyogenes <SEP> vor. <SEP> aureus <SEP> Smith <SEP> 0,434 <SEP> 0,463 <SEP> - <SEP> Proteus <SEP> sp. <SEP> UM <SEP> Nr. <SEP> 2 <SEP> 3,36 <SEP> 1,97 <SEP> - <SEP> S.
<SEP> pyogenes <SEP> C-203 <SEP> 5,42 <SEP> 5,79 <SEP> 3,47 <SEP> 4,91
Geeignete Novobiocin-Salze, aus denen man entsprechende Dihydronovobiocin-Salze erhält, sind solche mit einem oder höchstens zwei Kationen aus der Gruppe der Alkalimetalle, der nichttoxischen Erdalkalimetalle, des Ammoniums oder der quaternären organischen Stickstoffbasen und Amine.
Beispiel 1 In einem geeigneten Hydrierungsapparat und unter Wasserstoffatmosphäre wird eine Lösung von etwa 15,8 mg Novobiocin in 25 cm3 Methanol mit 50 mg Platinoxyd-Katalysator :gerührt. Das das Ge- misch enthaltende Hydrierungsgefäss wird während etwa 3 Stunden kontinuierlich geschüttelt, wobei ein Wasserstoffdruck von 2,80 kg/cm- und eine Temperatur von etwa 25 C aufrechterhalten wird.
Die Wasserstoffaufnahme wird gemessen, und nachdem eine äquimolare Menge Wasserstoff in bezu,g auf das Novobiocin absorbiert worden ist, öffnet man den Apparat, filtriert die im Gefäss befindliche Lösung zur Entfernung des Katalysators und dampft das Filtrat unter Vakuum zur Trockne ein. Der Rückstand zeigt beim mikrobiologischen Versuch eine im wesentlichen gleiche Aktivität wie das als Ausgangsmaterial ver-
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wendete Novobiocin. Bei diesem Produkt handelt es sich um das neue synthetische Antibioticum Dihydro- novobiocin, welches die oben beschriebenen Eigenschaften und antibiotische Aktivität besitzt.
Beispiel 2 Man gibt eine Lösung von etwa 28,4 mg Novo- biocin in 10 cm3 gereinigtem Eisessig in ein geeignetes Hydrierungsgefäss und rührt die Lösung während etwa 3 Stunden mit 27,5 mg Platinoxyd-Katalysator unter einer Wasserstoffatmosphäre von einem Druck von etwas über 1 Atmosphäre und bei einer Temperatur von etwa 25 C. Durch Messen der Wasserstoffaufnahme wird festgestellt, dass eine ziemlich genau äquimolare Menge Wasserstoff mit Bezug auf das als Ausgangsmaterial verwendete Novobiocin absorbiert wird. Der Katalysator wird entfernt und die Lösung wird unter Vakuum zur Trockne eingedampft.
Bei der Prüfung einer methanolischen Lösung dieses Rückstandes beobachtet man Maxima bei Wellenlängen von 2450 A und 3250 A; beim Ansäuern der methano- lischen Lösung auf eine Wasserstoffionenkonzentration von etwa pH 2,0 ist eine Spitze bei 3250 A zu beobachten, und in basischer methanolischer Lösung mit einer Wasserstoffionenkonzentration von etwa pH 10,0-11,0 werden Maxima beobachtet bei 3050-3100 A. Beim Produkt handelt es sich um das oben beschriebene Dihydronovobiocin.
Beispiel 3 Man suspendiert etwa 25,0 mg Platinoxyd in 20 cm3 Methanol und reduziert mit Wasserstoff in einem geeigneten Hydrierungsapparat. Zur methano- lischen Suspension des Platin-Katalysators gibt man eine Lösung von etwa 66,0 mg Novobiocin in 4 cm3 Methanol und rührt das Gemisch während etwa 44 Minuten unter einer Wasserstoffatmosphäre bei etwas höherem als Atmosphärendruck und bei einer Temperatur von etwa 25 C. Die Wasserstoffaufnahme wird sorgfältig gemessen, und es ergibt sich, dass pro Mol des als Ausgangsmaterial verwendeten Novobiocins 1 Mol Wasserstoff aufgenommen wird.
Nach dem Abtrennen des Katalysators wird die Lösung unter Vakuum eingedampft, wobei man Di- hydronovobiocin als hellgelbes Pulver erhält. Dieses Produkt hat die oben beschriebene mikrobiologische Aktivität.
Beispiel 4 Eine Lösung von etwa 15,0 g des Mononatriumsalzes von Novobiocin in 400 cm3 Methanol wird in ein geeignetes Hydrierungsgefäss gegeben; zu dieser Lösung gibt man 100 mg Platinoxyd. Das Gemisch wird während etwa 50 Minuten unter einer Wasserstoffatmosphäre und bei einer Temperatur von etwa 25 C geschüttelt, worauf man das Gefäss öffnet, die Lösung entnimmt und den Katalysator abfiltriert. Das Filtrat wird unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Beim erhaltenen Produkt handelt es sich um das Mononatriumsalz von Dihydronovobiocin, dessen Aktivität im wesentlichen gleich ist wie diejenige des Dihydronovobiocins, das man in den vorstehenden Beispielen als Produkt erhielt.
Beispiel S Eine Lösung von etwa 1,12g Novobiocin in 20 cm3 Methanol wird mit 25 mg Platinoxyd unter Wasserstoffatmosphäre bei einer Temperatur von 25 C während etwa 36 Minuten gerührt. Die Wasserstoffaufnahme ergibt sich zu einem Mol Wasserstoff pro Mol des als Ausgangsmaterial verwendeten Novo- biocins. Das Gemisch wird filtriert zur Entfernung des Katalysators und das Filtrat wird zur Trockne eingedampft. Der aus Dihydronovobiocin bestehende Rückstand wird in einer minimalen Menge Aceton gelöst, zu welcher acetonischen Lösung man Petrol- äther (30-60 C) zugibt, wobei das Dihydronovo- biocin aus der Lösung in Form eines Niederschlages ausfällt, welcher abfiltriert, mit Petroläther gewaschen und getrocknet wird.
Dieses Produkt ist optisch aktiv: [a] D = -27 (C = 1,68 in 2,5n Natriumhydroxydlösung). Aus Titrationskurven findet man, dass dieses Produkt wie Novobiocin zwei basenbindende Gruppen aufweist, und das Infrarot-Absorptionsspektrum dieses synthetischen Antibioticums gleicht ebenfalls den entsprechenden Daten, die man bei der Prüfung von Novobiocin erhält.
Beispiel 6 Etwa 12,5 g (0,019 Mol) des Mononatriumsalzes von Novobiocin werden in 200 cm3 Methanol gelöst, wobei eine wolkige Lösung entsteht, welche mit etwa 3 g Raney-Nickel während 5 Minuten gerührt wird, worauf man die Lösung filtriert, den Rückstand mit 50 cm3 Methanol wäscht, die Waschflüssigkeit mit dem Filtrat vereinigt und die entstehende klare Lösung über einem Platin-Katalysator hydriert, bis die Wasserstoffaufnahme aufhört. Man findet, dass 0,019 Mol Wasserstoff absorbiert werden.
Man filtriert den Katalysator ab, dampft das Filtrat unter Vakuum zur Trockne ein und löst den Rückstand in etwa 15 cm3 Äthanol. Zu dieser Lösung gibt man so viel Aceton, dass eine beginnende Trübung auftritt, worauf man die Lösung über Nacht bei Zimmertemperatur stehen lässt. Der kristalline Niederschlag des Mononatriumsalzes von Dihydro- novobiocin, welcher sich dabei bildet, wird abfiltriert, mit Aceton gewaschen und getrocknet. Er zeigt die Eigenschaften des oben beschriebenen Mononatriumsalzes von Dihydronovobiocin.
Wenn man eine wässerige Lösung dieses Mononatriumsalzes mit einem geringen überschuss von in Wasser gelöstem Procainhydrochlorid vermischt, so fällt das wasserunlösliche Procainsalz von Dihydro- novobiocin aus.
Beispiel 7 Zu .einer Lösung von 2,0 g Novobiocin in 50 cm3 Methanol gibt man ungefähr einen halben Teelöffel Raney-Nickel-Hydrierungskatalysator (entsprechend etwa 3-4 -g Trockengewicht). Diese Lösung wird
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während etwa 2 Stunden in einer Hydrierungsbombe geschüttelt bei einem Wasserstoffdruck von 154 kg/cm2 und einer Temperatur von 100 C. Die Bombe wird dann gekühlt und der Wasserstoffdruck wird entspannt. Die methanolische Lösung wird filtriert zur Entfernung des Katalysators und das methanolische Filtrat wird im Vakuum konzentriert, wobei man 1,8 g Dihydronovobiocin als festen Rückstand erhält.
Dieses Material hat die Eigenschaften des oben beschriebenen Dihydronovobiocins.