CH363442A

CH363442A - Verfahren zur Herstellung von Kanamycin

Info

Publication number: CH363442A
Application number: CH5017657A
Authority: CH
Inventors: Umezawa Hamao; Ueda Masahiro; Maeda Kenji
Original assignee: Umezawa Hamao; Ueda Masahiro; Maeda Kenji
Priority date: 1956-09-05
Filing date: 1957-09-05
Publication date: 1962-07-31

Description

Verfahren zur Herstellung von Kanamycin Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums Kanamycin durch Fermentation.

Das erfindungsgemäss hergestellte neue Anti biotikum ist wachstumshemmend auf gram-positive, gram-negative und säurefeste Bakterien, wie Myco- bacterium tuberculosis.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch ge kennzeichnet, dass ein Stamm von Streptomyces kanamycetiaus nov. spec. in einer wässrigen Kohle- hydratlösurng, welche stickstoffhaltige Nährsubstanzen enthält, aerob kultiviert wird, worauf das Antibiotikum abgetrennt und gegebenenfalls gereinigt wird.

Die das neue Antibiotikum produzierenden Mikroor-,anismen wurden aus einer Bodenprobe ab getrennt, welche auf dar Nagano-Präfektur in Japan gewonnen wurde.. Sie stellen eine neue Species der Gattung Streptomyces dar, welche Streptomyces kanamyceticu,s genannt wird.

Eine Kultur von Streptomyces kanamyceticus wurde in der Ame-rican Type Culture Collection in Washington D. C. deponiert, wo sie der permanenten Sammlung von Mikroorganismen unter der Bezeich nung A. T. T. C.12853 einverleibt wurde.

Streptomyces kanamyceticus weist folgende cha rakteristischen Eigenschaften auf: Die mikroskopische Beobachtung zeigt, dass das Substrat Mycelium ungefähr 1 ,cc dick und verzweigt ist. Das Luft Mycelium entwickelte sich aus sub- mersen Myceliumzweigen und trägt die Sporenträger am Ende.

Spiralen und Wirtel werden normalerweise nicht beobachtet.

Auf Glycerin-Czapek-Agar (27 C) gezüchtet ergab sich ein Gewächs, das zunächst farblos, später citronengelb war. Die Unterseite Ist heufarbig, das Luft-Mycelium ist weiss bis gelb, gelegentlich mit einem grünlichen oder leicht rosafarbigen Stich. Gelegentlich wird ein schwach braunes, lösliches Pigment beobachtet.

Auf Krainsky-Glucose As.p,aragin-Agar (27 C) gezüchtet, ergab sich: Das Gewächs ist farblos bis gelb und die Rückseite weiss, schwach rosa weiss, gelb oder Neufarben. Das spärlich ausgebildete Luft Mycel:ium entsteht gewöhnlich aus dem Zentrum der Kolbnie und ist weiss, schwach rosaweiss, schwach grünlichgelb oder gelb. üblicherweise wird kein lösliches Pigment gebildet.

Auf Calciummalat Agar (27 C) gezüchtet, ergab sich: Das Gewächs ist kleiner, sonst im wesentlichen gleich wie auf Krainsky-Glucose-Asparagin-Agar. Bisweilen tritt überhaupt kein Wachstum auf.

Auf der Stärkeplatte (27 C) gezüchtet, tritt im wesentlichen dieselbe Erscheinung auf wie auf Krainsky-Glucosa,Asparagin-Agar, jedoch ist der Wuchs eingeschränkt und es entsteht kein Luft- Mycelium. Die Stärke wird hydrolysiert.

Auf einem Kartoffelpfropf (27 ) entsteht ein runzeliges Gewächs mit körniger Oberfläche von schwach gelbbraunem bis gelbem Farbton. Ein Luft Mycelium bildet sich keines oder höchstens nur knapp. Es ist weiss. Es, entsteht kein lösliches Pigment. Der unterhalb dem Gewächs befindliche Pfropf ist normaleTweise dunkel verfärbt.

Auf einem Karottenpfropf (27 C) entsteht nor- malerweise nur ein sparsam ausgebildetes Gewächs, das gegebenenfalls dieselben Ausbildungsformen auf weist wie auf dem Kartoffelpfropf. Auf Pepton- Wasser mit 2% Natriumnitrat (27 C)

entsteht ein m'ngförmiges Oberflächengewächs,, das farblos bis weisslichgellb ist und am Grunde weiss. Das gelegent lich ausgebildete Luft,Mycelium ist ebenfalls, weiss. Aus dem Nitrat entsteht Nitrit.

Es bildet sich. kein lösliches Pigment. Gezüchtet auf Pepton Fleischex rakt Agar (37 C) bildet sich ein runzeliges, weiss bis gelbes Gewächs aus, das kein Luft-Mycelium oder lösliches Pigment entwickelt.

Die Form auf Blut Agar (37 C) ist runzelig, Farbe rötlichbraun mit grauem Stich. Luft-Myceiium oder lösliches Pigment werden nicht ausgebildet.

Auf Milch bei 37 C ergibt sich normalerweise keine Änderung und auf der Oberfläche bildet sich keinerlei Gewächs.

Auf koaguliertem Loeffler-Serum (37 C) ist das Wachstum beschränkt, das Gebilde von weisser bis gelber Farbe. Es bildet sich kein Luft Mycelium oder lösliches Pigment aus. Auf Ei-Substanz (37 C) ent steht runzeliger Wuchs, ohne ein Luft Mycelium.

Auf Gelatine tritt Verflüssigung ohne Bildung eines löslichem Pigments ein.

Als Kohlenstofflieferanten, verwendbar auf einem Czapek-Salz Basis-Medium, kommen folgende Sub stanzen in Frage: Arabinose, Dextrin, Fructose, Galactose, Glucose, Glycerin, Maltose, Mannit, Mannose, Raffinose, Stärke, Saccharose, Succinate. Als Kohlenstofflieferanten nicht geeignet sind:

Inosit, Inulin, Lactose, Rhamnose, Sorbose, Xylose, Acetat. Nur schlecht aufgenommene, kohlenstoffhaltige Sub- stanzen: sind: Aesculin, Salicin, Sorbit und Citrate.

Die vorstehend erwähnten Charakteristiken sind hinreichend, um den Mikroorganismus: von bisher bekannten StreptomyceS Arten zu unterscheiden und zu zeigen, dass der Stamm K2-J zu einer neuen Species gehört. Variation oder Mutation der oben beschriebenen Organismen kann normalerweise er wartet werden, da :dieses Verhalten eine albgemeine Eigenschaft der Organismen der Streptomycearten ist.

Es können somit auch alle natürlichen oder künstlichen Varianten oder Mutanten von Strepto- myces kanamyceticus verwendet werden.

Die Charakteristiken dieser Species können fol gendermassen zusammengefasst werden: Das Gewächs der Kolonie ist farblos bis gelb, mit oder ohne grünlichem oder rosafarbenem Stich. Die Rückseite der Kolonie auf synthetischem Agar ist farblos, weiss, schwach rosaweiss, weisslichgelb 'oder heufarben. Das Luft-Mycelium ist weiss bis gelb und\ Spiralen oder Wirtel werden daran nicht ausgebildet. Gelegentlich entsteht ein schwach braunes, lösliches Pigment auf synthetischen Nährmedien.

Gelatine wird verflüssigt und Stärke hydrolysiert.

Streptomyces kanamyceticus (K24) kann z. B. in Schüttelflaschen in folgender Weise gezüchtet werden: Als Nährmedium diente folgende Zusammenstellung: 0,75 0/0 Fleischextrakt, a,750/0 Pepton, 0,3 % NaCI, mit 1% Stärke, Dextrin, Maltose, Glucose,

Lactose, Saecharose oder Glycerin, ferner ein zweites Nähr- medium, bestehend aus 2 % Sojabohnenmehl, 0,05 0/a KCl, 0,05119 MgS04 ' 7H20, 0,51/o NaCl, 0,20/9 NaN0-, mit 1,

0 0/0 Stärke, Dextrin, Maltose, Glucose, Lactose, Saccharose oder Glycerin. Der Ausgangs- pH-Wert aller Medien wurde auf 7,0 eingestellt. Nach 24-48 Stunden Schütteldauer war der pH-Wert in einigen Fällen auf ungefähr 6,0-6,8 abgefallen, stieg jedoch nach 72-l20 Stunden wieder an und erreichte schliesslich den Wert 7,5-8,6.

Im zweiten., vorstehend erwähnten Nährmedium, dem 2 % Stärke zugesetzt wurden, stieg der pH-Wert nach 3 Tagein Schütteldauer auf 8,2 an und es ent- stunden 250 mog Kanamycin pro ml.

In einer Tank kultur mit einem Medium, welches 2 0i0 Stärke, 0,5 % Glucose, 1,2 % Sojabohnenmehl, 0,05 % KCl, 0,051)/o MgS04 - 7H20, 0,1% Kafumphosphat (K2HP04), 0,3 % Kochsalz, 0,

3 % Pepton und 0,3 0/0 Calciumcarbonat enthielt, wurde der pH-Wert zu Beginn leicht erniedrigt (6,6) und stieg hierauf wie der, nach 43 Stunden, bis auf 8,0 an. Hierbei wurden 273 mcg Kanamycin pro ml im Verlauf von 78 Stun den gebildet.

Als Nährmedium können die oben beschriebenen Fermentationsibrühen sowie Rohprodukte, welche aus denselben gewonnen wurden, verwendet werden.

Geeignete Stickstofflieferanten sind Sojabohnen mehl, Baumwollsamenmehl, Erdnussmehl, Fleisch extrakt, Pepton, Kornpresssaft oder Hefeextrakt. Als Kohlenstofflieferanten kommen Stärke, Dextrin, Maltose, Glucose, Saccharose, Lactose und Glycerin in Frage.

Als eine der besten Kombinationen hat sich eine Zusammenstellung von Stärke und Sojabohnen mehl erwiesen, wobei sich die Zugabe von Korn- presssaft, Pepton, Hefeextrakt oder Nitraten zu dieser Kombination als fördernd auf die Bildung von Kana- mycin erwies. Fördernd wirkte ferner die Zugabe von Magnesiumsulfat, Man!ganchlorid oder Zinksulfat.

Optimale Ausbeuten wurden erhalten, wenn der pH- Wert :der Kulturbrühe während der Züchtung schwach alkalisch wurde. Die kann in weiten Grenzen, z. B. zwischen 25 und 35 , variiert werden, jedoch ist es vorzuziehen, im Temperatur bereich von 27-32 C zu arbeiten. Es ist vorteilhaft, die Züchtung so lange fortzusetzen, bis sich eine wesentliche Menge von Kanamycin im Medium ge bildet hat. In einer tiefen, belüfteten., submersen Kul tur sind im allgemeinen 2-7 Tage notwendig, bis eine optimale Bildung des Antibiotikums erfolgt ist. Die günstigste Züchtungsdauer liegt bei 3-5 Tagen.

Das Kanamycin findet sich in flüssigem Anteil der Fermentationsbrühen vor.

Für die experimentelle Durchführung des erfin dungsgemässen Verfahrens haben sich folgende Ar beitsweisen als geeignet erwiesen: Schüttelkultur: 150 ml des wässerigen Mediums werden in einer Flasche von 500 ml Volumen unter gebracht und sterilisiert. Das Medium wurde hierauf mit den Mycelium und Sporen der Kanamycin pro duzierenden Organismen auf dem Agar Medium oder mit Mycelium, erhalten aus einer 48stündigen Schüttelkultur, geimpft und hierauf auf einer Schüttelmaschine (l20 Hübe pro Minute von 8 cm Amplitude)

unter Luftzutritt bei 27-29 geschüttelt.

Tankkultur: Ein rostfreier Stahlfermentator von 400 Liter Volumen wird verwendet. In demselben werden 180 oder 200 Liter des wässrigen Nähr- mediums untergebracht und bei 120^ C während 20 bis 30 Minuten sterilisiert. Die Belüftungsrate betrug 200 Liter pro Minute und die Umdrehungszahl des Rührers war 200 pro Minute. Als Antischaummittel wurden Silicone, Sojabohn,enäl oder Paraffinöl ver wendet.

Zur Gewinnung des in der flüssigen Phase der Fermentationsbrühe enthaltenen Kanamycins kann man diese vorzugsweise mit Butanol in Gegenwart einer Trägersubstanz, wie Laurinsäure oder Stearin- säure, extrahieren. Hierbei geht das Antibiotikum bei einem pH-Wert von 7-8 in das Butanol über und wird anderseits bei einem pH-Wert von 2-4 aus dem organischen Lösungsmittel in die wässrige Phase übergedrängt.

In Abwesenheit einer Trägersubstanz lässt sich Kanamycin nicht in wesentlichem Ausmass in Butanal, Äthylacetat, Butylacetat, Benzol usw. aufnehmen. Bei Extraktion ohne einen derartigen Träger lässt sich deshalb mit den genannten Lösungs mitteln eine Reinigung der Fermentationsibrühe von anderen coexistierenden Substanzen und Verunreini gungen erzielen.

Zur Abtrennung des Kanamycins aus der Fer- mentationsibrühe kann man auch so vorgehen, dass man die Brühe im Vakuum durch Verdampfen kon zentriert, oder zerstäubt. Aus dem Rückstand kann das Kanamycin mit Wasser, Methanol, Äthanol oder Aceton ausgezogen werden, wobei Ans.äuren mit Salz säure die Auflösung fördert.

Das Antibiotikum kann mit Aktivkohle aus neutraler oder alkalischer wäss- riger Lösung adsorbiert werden und lässt sich in der Folge von der Kohle d@esorbieren, unter Verwendung von wässri:gem oder absolutem Alkohol oder wäss- rigem Aceton, dessen pH-Wert auf 2,0 mit Salzsäure eingestellt ist.

Bei einem pH-Wert von 6-9 lässt sich Kanamycin auch von Kationenaustauscherharzen adsorbieren, wie z. B. einem Copolymeren der Meth@ acrylsäure und des Divinylbenzols. Nach Adsorption an einem Kationenaustauscher lässt sich das Anti biotikum mit wässriger Salzsäure eluieren. Desglei chen kann es mit wässriger Schwefelsäure oder wäss- rigen organischen Lösungsmitteln, z.

B. normaler Salzsäure in 10%i,ge:m, wässrigem Aceton, eluiert werden. Ferner lässt es sich auch mit Ammonium- hydroxyd eluieren.

Das derart erhaltene Eluat kann durch Vakuum verdampfung oder durch Gefriertrocknung konzen triert werden. Aus der konzentrierten Lösung lässt sich das Kanamycin in der Folge durch Zugabe eines Lösungsmittels, in welchem Kanamycin selber oder seine Salze praktisch unlöslich sind, ausfällen.

Zur Reinigung des Kanamycins können auch Chromatograph:iekolonnen mit Tonerde oder Aktiv kohle verwendet werden. Hierbei kann beispielsweise so gearbeitet werden, dass eine wässrige Lösung des Kanamycins vom pH-Wert 8,0, welche aus wieder holter Anwendung eines Kationaustauscherprozesses erhalten wurde, durch eine Kolonne, welche Aktiv kohle enthält, durchsaufen gelassen wird.

Hierauf wird die Kolonne mit destilliertem Wasser ausge- waschen und schliesslich mit 0,5nornnaler Schwefel säure eluiert. Die am meisten aktive Fraktion des Elurates wird; zu Methanol .zugegeben, worauf kristal lines Kanamycinsulfat ausfällt.

Aus den Salzen des Kanamycins, beispielsweise aus dem Hydrochlorid oder dem Sulfat, lässt sich die Kanamycinbase gewinnen, indem man beispielsweise die Lösung des Kanamycinsul@fats mit Baritlawge be handelt.

Kanamycinhydrochlorid ist in Wasser und Metha nol löslich, wenig löslich in Äthianol und unlöslich in Aceton, Äthylacetat, Butylacetat, Benzol, Äther oder Petroläther.

Kanamycins.ulfat ist wasserlöslich, dagegen un löslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Äthylacetat und Benzol.

In Pyridin gelöstes Kanamycin ergibt eine posi tive Ninhydrinreaktion. Die Testreaktionen nach Tollens, Sakaguchi, Fehling, Molisch und Elson- Margan (Gl.ucoseamintest) verlaufen negativ, wobei der Glucoscamintest ebenfalls nach Hydrolyse negativ ausfällt.

Der Rf-Wert des Kanamycins, ausgeführt mit Papiers:treifenchromaatographie (mit Toyo -Fütrier- papier Nr. 50 und 0,20/a p-Toluolsulfonsäure-Butanol gesättigt mit Wasser), ergab 0:

,.21-0,26. Kanamycin ist optisch aktiv, wobei eine 1%%ge, wässrige Lö- sung gereinigten Kanamycinhydrochlorids. den Wert [a]D = + 103 aufweist, während eine 1% ige,

wäss- rige Lösung von der freien Kanamycinbase den Wert [a117 = + 112 . und eine 1%,ige, wässrige Lösung kristallinen Kanamycinsulfats den Wert [a]23 = + 121 ergibt.

Die Analysendaten der freien Base sind fol gende: berechnet für C14H"N3011: C = 40,48,H = 7,04,N =10, 12,0 = 42,370/0 gefunden: C = 43,17,H = 6,95,N = 9,82% Die Analysenwerte des Hydrochlorids sind folgende: berechnet für C14H"N3011. 3 HCl: C = 32,04, H = 6;15, N = 8,01, Cl = 20,27, O = 33,54% gefunden:

C =3,1,3 1, H = 6,07, N =8,2 1, Cl = 18,03 0/0 Analytische Daten für das Kanamycinsulfat (amorph): berechnet für C14H"N3011 "/2 H@S04: C = 29,89, H = 5,73, N = 7,47, s = 8,57, O = 48,35% gefunden:

C = 3 0,20, H = 5,88,N = 7,43% Analysenwerte für N-Acetyl-Kanamycin: berechnet für C14H20N3011 ' 3CH 3C0:

C = 44,36,H = 6,51,N = 7,76,O = 41,36% gefunden: C = 44,39, H = 6,01,N = 7,49% Analysendaten für das Kanamycin-Reineckesalz:

berechnet für C14Hz9N30" - 3.(C4H.N.S4Cr): C = 22,68, H = 3,88, N = 21,37,S = 27,95, Cr = 11,33,O =l2,78 e/o gefunden: C = 21,44,H = 4,31,N = 19,93, Cr = 11,400/0 (aus dem Aschegehalt).

Analysenwerte für kristallines Kanamycinsulfat: berechnet für C14H29N3011 " i/2 HZSO4: C = 3 6,21, H = 6,51,N = 9,05,S = 3,44, O = 44,799o gefunden: C = 35,97, H = 6,51,N = 9,13,S = 3,47 /o. Kanamycinbase zeigt im ultravioletten Spektral- bereich zwischen 220 und 400 m,y keine Absorption.

Aus dem lnfrarotabsorptionsspektrum des kristalli nen Kanamycin-hemisulfats, welches mit Kalium- bro@mid tablettiert wurde, ergibt sich, dass das neue Antibiotikum offensichtlich eine neue und charakte ristische Konfiguration aufweist.

Die charakteristi schen Absorptionsbanden im Infrarot haben folgende Wellenlängen in Micron: 2,85, 3,03, 3,20, 3,30, 3,43, 3,63, 3,70 3,83, 4,70 (breit), 6,05, 6,17, 6,27, 6,60, 6,90,7,15, 7,35, 7,52, 7,60, 7,95, 8,18, 8,76, 8,95, 9,08, 9,40, 9,70, 10,20, 10,48, 10,75, 11,13, 11,50, 11,90,12,35, 12,80 und13,15. Unter den bekannten Antibiotika weisen Neomycin B und C, Neamin und Catenulin gewisse gemein same Charakteristiken mit dem Kanamycin auf, jedoch unterscheidet sich das Kanamycin eindeutig von den genannten Antibiotika.

Der für Neomycin ausgewiesene Glucosamintest, welcher im Buch Assay Methods of Antibiotics von D. C. Grove und W. A. Randall (Medical Encyclopedia Inc. New York) beschrieben wurde, verläuft mit Kanamycin negativ.

Diese Reaktion ist für die Neomycine und das Cate- nulin positiv. Papierchromatographie mit 2 % p- To@luols.ulfosäure-Butanol, gesättigt mit Wasser, unter scheidet das Kanamycin vom Neamin. Mit Toyo. - Filterpapier Nr.

50 betrug der Rf-Wert des Kana- mycins 0,21-0,26 und derjenige des Neamins 0,75 bis 0,85. Im Testversuch mit verdünnten Fermenta- tionsbrühen inhibierte Kanamycin das Wachstum von Klebsiena pneumoniae bei 3 meg/ml, Neamin bei 25 mcg/ml, Neomycin B bei 3 mcg/ml und Catenulin bei 1,

5 mcg/ml. In der Zylinderplattenmethode mit B. subtilis waren für die Ausübung einer Inhibition von 20 mm Durchmesser 30 mcg pro ml Kanamycin 25 meg/ml Neamin, 170 mcg/ml Neomycin B, 250 mcg/ml Neomycin C oder 18 mcg/ml Catenulin erforderlich.

Sowohl diese genannten Charakteristiken als auch die Eigenschaft geringer Toxizität und die empirischen Formeln bestätigen die Tatsache, d'ass Kanamycin sich von den Neomycinen, dem Neamin und dem Catenulin .unterscheidet und ein neues Anti biotikum ist.

Getestet nach der Agar-Verdünnungsmethode zeigte das Kanamycin folgendes antibakterielles Spektrum:
EMI0004.0097

Minimale
<tb> Konzentration
<tb> Mikroor;anismen <SEP> zur <SEP> vollständigen
<tb> Inhibition
<tb> meg/ml
<tb> S. <SEP> lutea <SEP> PCI-1001 <SEP> 1,8
<tb> M. <SEP> Pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> 209-P <SEP> 2,2
<tb> M. <SEP> Pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> Terajima <SEP> 0,4
<tb> Micrococcus <SEP> flavus <SEP> 9,0
<tb> B. <SEP> subtilis <SEP> PCI-219 <SEP> 4,5
<tb> B. <SEP> subtilis <SEP> NRRL-558 <SEP> 4,5
<tb> B. <SEP> su,btilis <SEP> Tracy <SEP> 9,0
<tb> E. <SEP> coli <SEP> 2,2
<tb> S. <SEP> paratyphi <SEP> A <SEP> 3,1
<tb> S.

<SEP> dysenteriae <SEP> 1,6
<tb> Proteus <SEP> vulgans <SEP> 6,2
<tb> Mycobacterium <SEP> 607 <SEP> 3,1
<tb> Mycobacterium <SEP> phlei <SEP> 2,2
<tb> Saecharomyces <SEP> Bake <SEP> 300
<tb> Sacch <SEP> aromyces <SEP> 300
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> 300
<tb> Aspergillus <SEP> niger <SEP> 300 In Kirchners Medium verhinderte es den Durch bruch des Mycobacteriums tuberculosis. H., bei 2 mcg/ml. Das stre:

ptomycinresistente E. coli und streptomycinfeste Mycobacterium tuberculosis homi- nis waren auf Kanamycin empfindlich.

Mäuse ertrugen intravenöse Injektion von 150 mg/kg. Die LD,DO-Dosen betrugen bei Mäusen, Ratten und Kaninchen150-250 mg/kg. Mäuse ertrugen, tägliche, subcutane Injektionen in der Dosis von 200 mg/k- während 30 Tagen.

An Hunden wurden keine Nebenerscheinungen beobachtet, wenn ihnen tägliche Injektionen von 100-200 mg/kg an Kanamycin verabfolgt wurden während einer Dauer von 30 Tagen.

Intraperitoneale Injektion von mehr als 50 mcg pro Maus alle 4 Stunden schützten die Mäuse, welche mit 10000 MLD von Diplococcus pneumoniae oder 1000 MLD von Salmonella typhosa infisziert worden waren.

Tägliche subkutane Injektion von 100 mg/ kg Kanamycin ergab einen Inhibitor- effekt an mit Mycobacterium tuberculosis (Ravenel- Stamm) infizierten Mäusen. Beispiele 1.

Zu einem wässrigen Basismedium, das 0,750/ö Fleischextrakt, 0,75 e/e Pepton und 0,3 % Natrium- chlorid enthielt, wurden Glucose, Glycerin, Lactose, Maltose, Saccharose, Stärke oder Dextrin im Anteil von 2% zugesetzt,

das Gemenge hierauf sterilisiert und der pH-Wert nach der Sterilisation auf 7,0 einge stellt. Das Gemenge wurde hierauf inokuliert mit einer auf Glycerin CzapekAgar befindlichen Kultur von Streptomyces Kanamyceticus und bei 27-29 C unter Luftzutritt geschüttelt.

Die Bildung des Kana-
EMI0005.0005

maximale <SEP> Produktion <SEP> End-pH-Wert <SEP> und <SEP> Anzahl <SEP> Tage
<tb> Kohlenstofflieferant <SEP> von <SEP> Kanamycin <SEP> zur <SEP> Ausbildung <SEP> maximaler
<tb> mcg/ml <SEP> Produktion
<tb> Stärke <SEP> 250 <SEP> 7,8 <SEP> 5 <SEP> Tage
<tb> Dextrin <SEP> 200 <SEP> 8,0 <SEP> 5 <SEP>
<tb> Maltose <SEP> 130 <SEP> 7,8 <SEP> 4 <SEP>
<tb> Glucose <SEP> 200 <SEP> 8,2 <SEP> 4 <SEP>
<tb> Lactose <SEP> 100 <SEP> 8,6 <SEP> 4 <SEP>
<tb> Saccharose <SEP> 100 <SEP> 8,4 <SEP> 4 <SEP>
<tb> Glycerin <SEP> 100 <SEP> 8,0 <SEP> 4 <SEP> Wenn eines der angegebenen Kohlehydrate zu einem Basismedium,

enthaltend 1% Sojabohnenmehl-, 0,05 /o KCI, 0,05 % MgS04 - 7 H20 und 0,3 % NaCI,
EMI0005.0023

maximale <SEP> Produktion <SEP> End-pH-Wert <SEP> und <SEP> Anzahl <SEP> Tage
<tb> Kohlenstofflieferant <SEP> von <SEP> Kanamycin <SEP> zur <SEP> Ausbildung <SEP> maximaler
<tb> mcg/ml <SEP> Produktion
<tb> Stärke <SEP> 250 <SEP> 7,

6 <SEP> 4 <SEP> Tage
<tb> Dextrin <SEP> 250 <SEP> 8,0 <SEP> 4 <SEP>
<tb> Maltose <SEP> 130 <SEP> 7,8 <SEP> 4 <SEP>
<tb> Glucose <SEP> 100 <SEP> 8,2 <SEP> 4 <SEP>
<tb> Lactose <SEP> 100 <SEP> 8,4 <SEP> 3 <SEP>
<tb> Saccharose <SEP> 150 <SEP> 8,4 <SEP> 4 <SEP>
<tb> Glycerin <SEP> 70 <SEP> 8,2 <SEP> 4 <SEP> 2. Ein wässriges Medium, enthaltend 2 % Stärke, 1,2% Sojabohnenmehl, 0,051119 KCl, 0,

0511/o Ma S04 * 7H0, 0,1% K2HP04, 0,3 % NaCI, 0,3 % Pepton und 0,5 % CaCO3, dessen Anfangs-pH-Wert 7,0 betrug, wurde mit einer ausgewählten Kultur von S.

kanamyceticus (Stramm K24) auf Glycerin; Czapek- Agar geimpft und unter Luftzutritt gezüchtet.

Nach 4 Tagen Schütteldauer betrug der pH-Wert 8,2 und der Zylinderplattenversuch mit B. subtilis und Myco- bakterium 607 ergab die Produktion von 550 mcg/mI Kanamycin.

3. 180 Liter eines wässrigen Mediums, enthal- tend 2,0% Stärke, 1,0% Glukose, 1,2% Soja-
EMI0005.0082

Stunden <SEP> PH <SEP> Kanamycin <SEP> Reduzierender <SEP> Zucker <SEP> 0 <SEP> Ammoniak-N,
<tb> mcg/ml <SEP> /o <SEP> in <SEP> der <SEP> Flüssigkeit <SEP> mg <SEP> /0 <SEP> in <SEP> der <SEP> Flüssigkeit
<tb> 0 <SEP> 6,6 <SEP> - <SEP> 2,20 <SEP> 2,5
<tb> 24 <SEP> 6,9 <SEP> - <SEP> 1,50 <SEP> 10,7
<tb> 36 <SEP> 7,6 <SEP> 150 <SEP> 0,4 <SEP> 1,2
<tb> 48 <SEP> 7,6 <SEP> 200 <SEP> 0,3 <SEP> 1,2
<tb> 60 <SEP> 8,0 <SEP> 220 <SEP> 0,3 <SEP> 6,

0
<tb> 72 <SEP> 8,2 <SEP> 210 <SEP> 0,25 <SEP> 12,0 mycins wurde nach der Zylinderplattenmethode mit Mycobakterium 607 kontrolliert, wobei sich folgende Resultate ergaben: zugageben wurde, ergaben sich die folgenden Resul tate:

bohnenmehl, 0,3 % NaCI, 0,05 % KCI, 0,05 0/0 MgS04 ' 7H20, 0,1% K2HP04, 0,21% CaC03, 0,3 % NaN03, 0,

002 % MnS04 * 7 H20 und 0,002 % ZnS04 * 7 1120 wurde in einem: Fermentator von 400 Liter untergebracht, sein pH-Wert auf 7,4 einge stellt und schliesslich 30 Minuten lang bei 120 sterilisiert.

Es wurde geimpft mit 1000 Liter einer 40 Stunden lang geschüttelten Brühe von S. kanamyce- ticus (eine ausgewählte Unterkultur des Stammes K24) und unter Belüftung im Tank bei 27-29 C gezüchtet.

Als Antischaummittel wurde Sojabohnenöl (0,04 %) und Silicon (0,04 %) zugefügt. Es ergaben sich folgende Resultate:

4. 200 Liter eines wässrigen Mediums, enthaltend 2,0 % Stärke, 1,011/o Sojabohnenmehl, 0,0511/o KCl, 0,0511/o MgS04 * 7 H20, 0,311/o NaC1, 0,2 % NaN03, wurden in:

einem 400-Liter Fermentator unterge bracht, der pH-Wert auf 7,5 eingestellt, das Medium sterilisiert, worauf der pH-Wert 7,0 betrug und im übrigen gemäss Beispiel 3 weiterbehandelt. Nach 48 Stunden enthielt die Brühe 250 mcg/ml Kana- mycin. In der Folge veränderte sich die Konzen tration des Kanamycins in der Brühe nicht mehr wesentlich. Nach 65 Stunden Fermentation wurde die Brühe filtriert. Hierbei wurden 160 Liter filtrierte Brühe erhalten.

Die letztere enthielt 150 mcg/ml Kanamycin und ihr pH-Wert betrug 8,2. Das Filtrat wurde durch einen Kationenaustauscher durchlaufen gelassen. Die Kolonne des letzteren wies 15 cm Durchmesser auf und enthielt 6 Liter IRC-50 in der Natriumform (das heisst regeneriert mit Natrium hydroxyd) bei pH = 8,0.

Amberlit ICR-50 (Mar kenprodukt) ist ein Kationenaustaucher vom Carboxyl- säuretyp. Es ist ein Copolymeres der Methacrylsäure und des Divinylbenzols.. Das Filtrat wurde mit einer Durchsatzgeschwindigkeit von 16 Liter pro Stunde durch die Kolonne duschgeschickt. Im Durchlauf er gab sich bei Prüfung nach der Zylinderplatten me;thod''e keinerlei antibakterielle Aktivität gegen Mycobacterium 607.

Die Kolonne wurde hierauf mit ungefähr 10 Liter .destilliertem Wasser gewaschen, wobei dieselbe Durchlaufgeschwindigkeit zur Anwen dung kam wie bei der Brühe. Hierauf wurde normale Salzsäure mit einer Durchsatzgeschwind'igkeit von 0,8 Liter pro Stunde durch die Kolonne d'urchge- schickit. Das Eluat wurde in 2-Liter-Portionen ab schnittweise gesammelt. Nach der 7. Portion wurde das Eluat sauer und das Kanamycin wurde in der 7.-10. Portion wieder gefunden.

Die Kanamycin enthaltenden Portionen wurden vereinigt und die erhaltenen, gesamthaft 8 Liter mit 1011/oiger Natron lauge auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt, hierauf durch Vakuumdestillation bei ungefähr 50 C auf 300 ml eingeengt.

Die konzentrierte Lösung wurde einer Gefriertrocknung unterworfen. Das auf diese Art erhaltene braunweisse Pulver im Gewicht von 500 g enthielt 8 g Kanamycin. Dieses Produkt wurde in 2 Liter Methanol gelöst und, nachdem der un lösliche Anteil abgetrennt wurde, wurden 20 Liter Aceton zugegeben, worauf sich 80 g des braunweissen Pulvers erneut abschieden. Dieses Pulver enthielt immer noch 8 g Kanamycin. 20 g des Pulvers wur den in 40 ml destilliertem Wasser gelöst und wässrige Reineckesalzlösung zugefügt.

Die schwach .rosafarbige Fällung, welche zuerst sich bildete und 50 g wog, wurde abgetrennt, hierauf mehr Reineckesalzlösung zugegeben, bis sich keine weitere Fällung mehr bil dete. Die rosafarbene Fällung wurde abgetrennt und aus destilliertem Wasser umkristallisiert, worauf kristallines, rosafarbenes Kanamycin-Reineckesalz (300 mg) erhalten wurde. Im Schmelzversuch färbte es sich bei 191-193 C dunkel und zersetzte sich bei 211-213 C. Das zuerst ausgefallene, schwach rosafarbene Produkt enthielt ebenfalls Kanamycin.

5. Ein in einem 400-Liter-Fermentator aus rost freiem Stahl befindliches wässriges Medium von 200 Liter Volumen wurde mit S. kanamyceticus (einer ausgewählten Subkultur des K2-J-Stammes) geimpft und fermentiert.

Das Medium enthielt 2,011/o Stärke, 1,011/o Glucose, 1,211/o Sojabohnenmehl, 0,311/o Kochsalz, 0,0511/o KCl, 0,05 0/0; MgS04 ' 7 H20, 0,111/o KZHP04, 0,211/o CaC03 und 0,311/o Pepton. Der pH-Wert des Mediums betrug nach Sterilisation 7,0.

Als Antischaummittel wurde 0,111/o Sojabohnenöl zugegeben. Nach 65 Stunden Kultivation unter Be lüftung enthielt die Brühe 220 mcg/ml Kanamycin. Ihr pH-Wert betrug 8,0. Sie wurde filtriert, wobei 170 Liter Filtrat mit einem Gehalt von 210 mcg/ml Kanamycin erhalten wurden. Das Filtrat wurde durch eine Kationenaustauscherkolon.ne geschickt.

Der Aus- tauscher bestund aus 6 Litern Amberlit IRC-50 in der Natriumform bei einem pH-Wert von 8,0 und befand sich in einer Kolonne von 15 cm Durchmesser. Die Durchflussmenge betrug 30 Liter pro Stunde, das heisst 1/1Z Liter des Harzvolumens pro Minute. Im weiteren wurden 30 ml Wasser durch die Kolonne geschickt, wobei die Durchsatzgeschwindigkeit 30 Liter pro Stunde betrug.

Das vom Harz absorbierte Kanamycin wurde hierauf mit normaler Salzsäure eluiert, wobei die Durchsatzgeschwind'igkeit 3 Liter pro Stunde betrug. Das erste Eluat (6,5 Liter) ent hielt keinerlei Aktivität. Die folgenden Eluate ent hielten Kanamycin: 90 /o des adsorbierten Kanamy- cins erschienen im Eluat wieder, wobei dessen pH- Wert höher als 2,0 war.

Das die Aktivität enthal tende Eluat (16 Liter) wurde auf einen pH-Wert von 7,5 mit 10 %iger Natronlauge eingestellt. Es wurde hierauf auf 80 Liter verdünnt. Die. Ausbeute des Brühefiltrates betrug 8311/0. Die verdünnte Lösung wurde wiederum durch eine Harzkolonne durchlaufen gelassen.

Diese Kolonne enthielt 2 Liter IRC-50 - Harz in der Natriumform mit einem pH-Wert von 7,5. Der Durchmesser der Kolonne betrug 5 cm. Die Durchsatzgeschwindigkeit lag bei 10 Litern pro Stunde. Die Kolonne wurde mit 20 Litern Wasser mit einer Durchsatzgeschwindigkeit von 10 Litern pro Stunde ausgewaschen, hierauf wurde das ad'sor- bierte Kanamycin mit normaler Salzsäure eluiert. Die Durchsatzrate betrug hierbei 3,0 Liter pro Stunde.

Wie in der vorgängigen Eluierung, .erschien das Kanamycin im Elüat, dessen pH-Wert höher als 2,0 lag. Das aktive Eluat (4,5 Liter), wurde auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt, indem diesem ein Anionaustauscherharz Amberl.it -IR-4B (Marken produkt) in der Hydroxy1form zugegeben wurde.

Amberlit IR-4B ist ein schwach basischer Anion- austauscher des Typs, wie er in der amerikanischen Patentschrift Nr. 2591573beschrieben ist. Das der art behandelte Eluat wurde im Vakuum bei unge fähr 40 C auf 500 ml eingeengt. Zu dem derart erhaltenen Konzentrat wurden 5 ml Methanol zuge geben und die unlöslichen Teile abgetrennt.

Das Filtrat wurde im Vakuum bei ungefähr 40 C auf 250 ml weiter eingeengt und zur konzentrierten Lö sung 2,5 Liter Aceton zugegeben, wobei 65 g Kanamycin in Form eines leicht braunen Pulvers erhalten wurden. Der Wirkungswert dieses Pulvers betrug 350 nie g/rng.

6. Das bräunlich-weisse Kanamycin (5 g) erhalten nach Beispiel 5, wurde in 50 ml 60%igem, wässrigem Methanol gelöst, der unlösliche Anteil abgetrennt und zum Filtrat 40 tn1 60 /oiges, wässriges Methanol, enthaltend 2000 mg Ammoniumsulfat zugefügt,

worauf das ausgefallene Kanamycinsulfat abfiltriert und mit 50 ml 80 /oigem, wässrigem Methanol ge waschen und getrocknet wurde. Auf diese Weise wurden 4,5g Kanamycinsulfat in Form eines hell braunen Pulvers erhalten. Sein Wirkungswert betrug 370 mcg/mg.

7. Werden die nach der Arbeitsweise des vor stehenden Beispiels 4 erhaltenen salzsauren, kana- mycinhaltigen Eluate des Kationenau,stausch-Pro- zesses im Vakuum eingedampft und -das erhaltene feste Material einer Gefriertrocknung unterworfen, so erhält man rohes Kanamycin-Hydrochlorid.

10 g derart hergestelltes KanamycinrHydro- chlorid, dessen Wirkungswert 535 mcg/rng betrug, wurden in 100 ml 900/uigem, wässrigem Methanol gelöst und durch eine Tonerdekolonne hindurch laufen gelassen. Die Kolonne von 1,5 cm Durch messer enthielt 140 g Tonerde, welche mit Schwefel säure behandelt worden war. Sie wurde mit Methanol entwickelt.

Das erste Eluat von 200 m1 enthielt kein Kanamycin. Das zweite Eluat (128 ml) erwies sich antibakteriell wirksam und wurde im Vakuum ein gedampft, worauf 4,681g Kanamycin-Hydrochlorid in Form eines weissen Pulvers erhalten wurden. Der Wirkungswert dieses Pulvers betrug 560 mcg/mg. Nach demselben Verfahren wurden aus dem dritten Eluat (115 ml) 2,205g festen weissen Kanamycin- Hyd@rochlorids erhalten.

Der Wirkungswert des letzte ren betrug 615 mcg/mg. Danach wurde das gelbe Pigment von der Kolonne ad'sorbiert und das Kana- mycin,-Hydrochlorid in Form eines farblosen Pulvers erhalten.

Das von der Kolonne adsorbierte gelbe Pigment wurde mittels weiterer Eluierung mit 50 % igem, wässrigem Methanol und destilliertem Wasser herausgelösit.

B. 4 g festes Kanamycin@-Hydrochlorid, herge stellt wie in den Beispielen 4 und 7 beschrieben, dessen Wirkungswert 500 mcg/mg betrug, wurden in 200 ml Methanol gelöst und nach Eindampfen auf 80 ml durch eine Kolonne geschickt, welche 5 g Aktivkohle und 25 g pulverförmige Cellulose ent hielt. Die Kolonne wurde mit Methanol entwickelt. Das erste Eluat (50 ml) enthielt kein Kanamycin. Das zweite Eluat (60 ml) wurde eingedampft, wobei 364 mg Kanamycin-Hydrochlorid anfielen.

Der Wir kungswert des letzteren betrug 720 mcg/mg. Das diritt.e Eluat (46 ml) ergab 381 mag Kanamycin- Hydrochlorid in Form von Pulver. Der Wirkungs wert des letzteren lag bei 616 mcg/mg. Aus dem vierten Eluat (55 ml) wurden 1,873 mg weissen Kanamycin-Hydrochlorids erhalten, dessen Wir- kungswert 483 mcg/mg betrug.

Das fünfte Eluat (55 md) ergab 956,6 mg in Form eines weissen Pul vers mit einem Wirkungswert von 410 meg/mg. Alle hierbei erhaltenen festen Substanzen waren farblos.

9. S. kanamyceticus wurde in einer Schüttel kultur unter Luftzutritt 4 Tage lang bei 28 C ge- züchtet, wobei das wässrige Nährmedium 1,0% Stärke, 1,5 % Sojabohnenmehl und 0,3 % Kochsalz bei einem anfänglichen pH-Wert von 7,0 enthielt.

Die Kulturbrühen von 25 Flaschen wurden vereinigt und filtriert. Der pH-Wert des Filtrates betrug 8,2 und das Filtrat enthielt 400 mcg/ml Kanamycin. Das Filtrat (3,100 ml) wurde durch eine Harzkolonne, enthaltend IRC-5,0 durchgeschickt. Die Kolonne enthielt 100 ml des Harzes in dessen Natriumform aus dem pH-Wert 8,0.

Nach der Absorption wurde die Kolonne: mit 500 ml Wasser ausgewaschen und das adsorbierte Kanamycin mit normaler Salzsäure eluiert, wobei das E1uat in Abschnitte von je 20 ml unterteilt wurde. Die antibakterielle Aktivität war im vierten bis zum neunten Abschnitt enthalten. Diese Abschnitte wurden vereinigt und ihr pH-Wert auf 6,0 eingestellt.

Die Lösung wurde im Vakuum auf 12 ml eingeengt und die unlöslichen Verunreinigungen abfiltriert. Zum Filtrat wurde Reineckesalz zugegeben. Die zuerst entstandene Fällung war leicht rosafarben, wog 50 mg, enthielt Kanamycin und wurde abge trennt.

Zum Filtrat wurde weitere Reineckesalz- lösung zugegeben, bis keine Fällung mehr entstund. Die rosafarbenen Fällungen wurden abgetrennt und getrocknet, wobei sich 544 mg Kanamycin-Reinecka- salz ergaben und ungefähr 30 % der antibakteriellen Aktivität in der Lösung verblieben. Die vereinigten Fällungen wurden zu 12 ml destilliertem Wasser zuge geben, auf 60 C erwärmt und filtriert.

Das derart erhaltene Filtrat wurde abgekühlt und die Kanamycin- Reineckesalzkristalle auf diese Art gewonnen. Zur Mutterlauge wurde Kanamycin-Reineckesalz zugesetzt und nach erneutem Heizen auf 60 C und Abkühlen der zweite Anteil kristallinen Kanamycin-R.einecke- salzes abgetrennt. Dieses Verfahren wurde weitere drei Male wiederholt.

Auf diese Weise wurden 300 mg kristallinen Kanamycin-Reineckesalzes isoliert. 140 mg dieses Salzes wurden zu 105 m1 destilliertem Wasser zugegeben und zur Lösung 2,5 normale Salzsäure in Pyridin tropfenweise zugefügt, bis sich keine Fällung mehr bildete. Die Fällung wurde abzentrifugiert, der Gefriertrocknung unterworfen und mit Aceton gewaschen. Hierbei wurden 60 mg Kanamycin- Hydrochlorid in, Form einer hygroskopischen, weissen, festen Substanz erhalten.

10. 10 g Kanamycin-Hydrochlorid vom Wir kungswert 450 mcg/mg, erhalten gemäss Beispiel 5, wurden in einem Liter destilliertem Wasser gelöst und der pH-Wert auf 6,4 eingestellt. Die Lösung wurde mit einer Durchsatzrate von 10 ml pro Minute durch eine Kolonne von 75 ml IRC-50 Harz in Natriumform bei einem pH-Wert von 6,4 durch laufen gelassen.

Nachdem die Kolonne mit 50 ml Wasser nachgewaschen worden war, wurde das ad sorbierte Kanamycin mit 5 o/oigem Ammonium hyd!roxyd eluiert. Das erste Eluat (80 ml) zeigte keine antibakterielle Aktivität, während das weitere Eluat (130 ml) das Kanamycin enthielt. Der pH-Wert dieses Eluates lag höher als 10,0. Es wurde im Vakuum bei ungefähr 40 C auf 22 ml eingeengt.

Die Ausbeute in dieser konzentrierten Lösung war 97,80/a. Die konzentrierte Lösung wurde durch eine Kolonne, enthaltend 20g Aktivkohle der Maschen zahl 100-250 durchlaufen gelassen. Der Kolonnen durchmesser betrug 2 cm. Die Kolonne wurde hierauf mit 160 ml destilliertem Wasser ausgewaschen und chromatographisch mit 0,5 normaler Schwefelsäure entwickelt. Die durchlaufende Lösung wurde in un gefähr 20 ml umfassende Portionen unterteilt. Das Kanamycin-Sulfat erschien von der fünften Fraktion an.

Die erste bis vierte Fraktion, deren pH-Werte bei 6,2 bis 6,4 lagen, enthielt kein Kanamycin,. Beinahe die gesamte Kanamycinmenge wurde in der fünften bis und mit der achten Fraktion gefunden, wobei sich folgende Werte ergaben:

Fünfte Fraktion pH = 8,2, 22,0 ml, 16,9 mg/ml; sechste Fraktion pH = 8,6, 23,0 rnl, 65,3 mg/ml; siebente Fraktion pH = 8,6, 20,0 ml, 55,0 mg/ml; achte Fraktion pH = 4,6, 22,0 ml, 47,5 mg/ml;

neunte Fraktion pH = 1,0, 22,0 ml, 4,2 mg/ml. Zur sechsten Fraktion wurden 23,0 ml Methanol zugefügt und hierbei kristallines Kanamycin-Sulfat ausgefällt, welches abfiltriert und getrocknet wurde. Es ergaben sich hierbei 1,39 g kristallines Kanamycin- Sulfat. 1,2 g dieses kristallinen Sulfates wurden in 8 ml Wasser gelöst, auf 45 C erwärmt und 6,5 ml Methanol unter Rühren und Kühlung zugefügt.

Hier bei fiel Kanamycin-Sulfat (1;07 g) aus in kristalliner Form. Mikroskopisch betrachtet, erwies es sich als farblose, plattenförmige Kristalle. Es schmolz nicht bis 250 C. Analyse: C = 35,97, 35,89; H = 6,51, 6,56; N = 9,13, 8,92; S = 3,47'%. [a]D = -f- 121 .

Gewünschtenfalls, und wenn die pharmazeutische Verträglichkeit gewährleistet ist, können zu dem erfindungsgemäss hergestellten Antibiotikum andere Medikamente zugemischt werden, wie z.

B. Anti- histaminverbindungen, Sulfadrogen, Stimulantien, Lokalanästhetica, Analgetika, Laxiermittel, Sedativa, Penicillinsalze und andere antibiotische Agentien, wie Streptomycin oder Tetracyclin, ferner Vitamine, Hormone oder antifungal wirkende Agentien.

Claims

PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von Kanamycin, da durch gekennzeichnet, dass man einen Stamm von Streptomyces kanamyceticus nov. spec. in einem Kohlehydrate und stickstoffhaltige Verbindungen ent haltenden wässrigen Nährmedium aerob kultiviert und .das Antibiotikum aus der Fermentationsbrühe abtrennt. UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man submers bei einer Temperatur zwischen 27 und 32 C und während einer Dauer von 3 bis 5 Tagen kultiviert. 2.

Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass ein Nährmedium verwendet wird, welches Stärke und Sojabohnenmehl enthält. 3. Verfahren nach Patentanspruch und Unter anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Nähr- medium 2,0% Stärke und 121/o. Sojabohnenmehl enthält. 4. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass zur Abtrennung des Antibiotikums die Fermentationsbrühe in Gegenwart einer Träger substanz, z.

B. Laurin- oder Stearinsäure, mit Butanol extrahiert wird. 5. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass das Antibiotikum aus der Fermen- tationsbrühe vermittels Adsorption an einem Kat- ionenaustauscherharz abgetrennt wird. 6.

Verfahren nach Patentanspruch und Unter anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, d'ass ein Kat- ionenaustausche.r vom Carboxylsäure-Typ, vorzugs weise ein Copolymeres von Methacrylsäure und Divinylbenzol:, verwendet wird. 7. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass das Kanamycin in ein nichttoxisches Salz, insbesondere in das Hydrochlorid oder Sulfat, übergeführt wird.