CH364775A

CH364775A - Verfahren zur Herstellung von 1-Steroiden

Info

Publication number: CH364775A
Application number: CH2982056A
Authority: CH
Inventors: Weintraub Adolph; Hillel Eppstein Samuel; Dietrich Meister Peter
Original assignee: Upjohn Co
Priority date: 1955-03-09
Filing date: 1956-02-13
Publication date: 1962-10-15
Also published as: DK103938C

Description

Verfahren zur Herstellung von d i-Steroiden Vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Ver fahren zur Herstellung von dl-Steroiden, die in 3- Stellung eine Sauerstoffunktion aufweisen, das da durch gekennzeichnet ist, dass man entsprechende in 1,

2-Stellung gesättigte Steroide unter aeroben Bedin gungen der Einwirkung eines Pilzes der Gattung Septomyxa oder entsprechender Enzyme unterwirft.

Die Dehydrierung im Ring A ohne Ringspaltung ist bisher nur mit einer kleinen Zahl von Organismen beobachtet worden. So zeigen Fried und Mitarbeiter [J. Am.

Chem. Soc. 75, 5764-5 (1935)], dass die Fermentation von Progesteron, 17a,21-Dihydroxy- 4-pregnen-3,20-dion oder Testosteron mit Cylindro- carpon radicola zur Bildung von dl-Dehydrotestolo- lacton führt, wobei gleichzeitig der ursprüngliche Ring D gespalten wird.

Im Gegensatz dazu gestattet die er findungsgemässe Fermentierung von Steroiden mit Septomyxa, dass der Ring D in hohem Masse intakt bleibt.

Bei Verwendung von Ausgangssteroiden, die in 17-Stellung eine Seitenkette tragen, kann, insbeson dere in Gegenwart einer Sauerstoffunktion in 20-Stel- lung, als Nebenreaktion die oxydative Abspaltung der Seitenkette auftreten, wobei dl-Dehydro-androstan- derivate als Nebenprodukte erhalten werden.

Die Herstellung von dl-Steroiden ist bekannt, er forderte aber bisher komplizierte chemische Me thoden, wie Dibromierung eines Steroids zur Herstel lung der 2,4-Dibromverbindung (zusammen mit an deren Isomeren), die dann mit Pyridin unter Halogen wasserstoffabspaltung in ein d1@4-Steroid übergeführt wurden (Fieser und Fieser, Natural Products Related to Phenanthrene, Ed. 3, S.

264, Reinhold Publ. Co. N. Y. 1949 und Djerassi, US-Patent Nr. 2 579 479). Beim vorliegenden Verfahren können die dl-Steroide, z. B. d1,4-Steroide, direkt erhalten werden. Das vorliegende Verfahren ist wertvoll zur Wie dereinführung der dl-Funktion, z.

B. in Fällen, wo diese durch frühere Behandlungen, wie Hefehydro- genasebebrütung, welche z: B. dl-Androsten-3,17-dion in Androstan-3ss,17ss-diol unter Sättigung in 1,2-Stel- lung überführt, zerstört wurde [Butenandt, Ber. 73, 818 (l940)].

Bisher waren direkte Umwandlungen in dieser Gruppe von dl-Steroiden nicht möglich, da eine geeignete Methode zur Herstellung von dl- Steroiden fehlte (Dorfman und Ungar, Metabolism of Steroid Hormones, S. 86, 93, Burgess Publ. Co. Minneapolis, Minn., l953).

Nach dem Verfahren gemäss der vorliegenden Er findung kann man zu einer Vielzahl von Produkten gelangen, die an sich wertvolle Arzneimittel sowie auch wertvolle Zwischenprodukte zur Herstellung von anderen Arzneimitteln sind. Die so hergestellten 1-Dehydrosteroide haben im Vergleich zu den ent sprechenden 1-gesättigten Steroiden einen niedrigeren Schmelzpunkt und erhöhte pharmakologische Wirk samkeit. Sie sind ausserdem wertvolle Zwischenpro dukte in Fällen, wo es erwünscht ist, den Ring A zu aromatisieren.

Als Ausgangsstoffe eignen sich Steroide, die in 3-Stellung eine freie, verätherte oder veresterte Oxy- oder eine Ketogruppe aufweisen. Das als Ausgangs material verwendete Steroid kann weitere Substituen- ten enthalten, z.

B. Keto- oder Hydroxylgruppen in den Stellungen 6, 7, 8, 11, 12, 14, 17 und 21, ins besondere in 11-Stellung, und kann Doppelbindungen in verschiedenen Stellungen, insbesondere in 4,5- und 17(20)-Stellung aufweisen, ohne die Natur der Reak tion in 1,2-Stellung zu beeinträchtigen. So sind z. B. auch Steroide mit aromatischem Ring A erfindungs- gemäss erhältlich.

Beispiele für Ausgangsmaterialien sind: 3a- und 3ss-Oxy-pregnan-20-on, 3a- und 3ss-Oxy-5-pregnan-20-on, 3a- und 3ss-Oxy-pregnan-11,20-dion, 3a,lla-, 3a,11ss-, 3,8,11a- und 3ss,llss-Dioxy- pregnan-20-on, 11-Dehydroprogesteron, 9a-Fluor-, 9a-Chlor- und 9a-Brom-progesteron, 17a-Methyl-dehydrocorticosteron, 17a-Methyl-11-desoxycorticosteron,

17a-Methyl-progesteron, 12a-Oxy-progesteron, Progesteron, 11-Keto-progesteron, 11 a-Oxy-progesteron, lla Acetoxy-progesteron, 1 lss-Oxy-progesteron, 14a-Oxy-progesteron, 17a-Oxy-progesteron, 14a,17a,21-Trioxy-4-pregnen-3,20-dion, 14a,17a-Dioxy-21-acetoxy-4-pregnen-3,2.0-dion, 11a,17a-Dioxy-progesteron, 17a-Oxy-11-keto-progesteron, 3ss,17a,20-Allopregnan-triol,

17a,21-Dioxy-4-pregnen-3,20-dion, 21-Oxy-4-pregnen-3,11,20-trion, Corticosteron, 11-Desoxycorticosteron, Cortison, Cortison-acetat, Hydrocortison, 9a-Chlor-Brom- und -Fluor-l lss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion, 2-Methyl-I 1 ss,17a,21-trioxy-4-pregnen-3,20-dion, 11 a,17a,21-Trioxy-4-pregnen-3,20-dion, 4-Androsten-3,17-dion,

Adrenosteron, 11-Keto-testosteron, l 1a- und l lfl-Oxy-17a-methyl-testosteron, 17a-Äthinyl-testosteron, Pregnan-3,11,20-trion, 17a-Oxy-pregnan-3,11,20-trion, 17a,21-Dioxy-pregnan-3,11,20-trion, Pregnan-3,12,20-trion, Pregnan-3,20-dion, 17a-Oxy-pregnan-3,20-dion, Allopregnan-3,11,20-trion, Allopregnan-3,20-dion, 3a-Oxy-5-pregnen-20-on, 3ss,

11 a-Dioxy-allopregnan-20-on, 3a- und 3ss-Oxy-allopregnan-20-on, Androsteron, 3a, 12a,21-Trioxy-pregnan-20-on, Testosteron, 19-Nortestosteron, 17a-Methyl-testosteron, 11 ss,21-Dioxy-4,17(20)-pregnadien-3-on, 2-Methyl-1 lss,21-dioxy-4,17(20)-pregnadien-3-on, 21-Oxy-4,17(20)-pregnadien-3,11-dion, 11 a,21-Dioxy-4,17 (20)-pregnadien-3-on, 2-Brom-11 ss,21-dioxy-4,17(20)-pregnadien-3-on,

17a-21-Dioxy-4,9 (11)-pregnadien-3,20-dion, 17a,21-Dioxy-4-pregnen-9:llss-oxido-3,20-dion, 2-Methyl-17a,21-dioxy-4,9(11)-pregnadien- 3,20-dion, 2-Methyl-17a,21-dioxy-4-pregnen-9 :11 ss-oxido- 3,20-dion und 2-Methyl-9a-chlor-, -brom- und -fluor-11 ss,17a,21-trioxy-4-pregnen-3,20-dion. Man kann sowohl die freien Oxysteroide als auch ihre Ester als Ausgangssteroide verwenden.

Im Verfahren der vorliegenden Erfindung kön nen die Arbeitsbedingungen, Reaktionsweisen und Einzelheiten die gleichen sein, wie sie bei der Be handlung von Steroiden mit Mikroorganismen bereits bekannt sind, und von Murray und Mitarb. im US- Patent Nr.

2 602 769 beschrieben sind, jedoch unter Verwendung eines Pilzes der Gattung Septomyxa. Die Gattung Septomyxa gehört zur Klasse Deuteromycetes (Fungi imperfecti), der Ordnung Melanconiales und der Familie Melanconiaceae. Unter den Species der Gat tung Septomyxa, die sich für die Fermentierung von Steroiden eignen, befinden sich Septomyxa affinis, Septomyxa sesculi,

Septomyxa corni, Septomyxa sali- cina und Septomyxa tulasnei.

Typische, sich für die Durchführung der vorlie genden Erfindung eignende Stämme sind folgende: Septomyxa affinis (Sherb.) Wr., ATCC 6737; Septo- myxa affinis, Centraalbureau voor Schimmelcultures in Barn, Niederlande (Stamm von v.

Eck und von Wollenweber); Septomyxa corni Oud., Centraalbureau voor Schimmelcultures in Barn, Niederlande (Stamm von v. Arx); Septomyxa affinis (Sherb.) Wr., Quarter- master 40 b.

Die Kultur der Pilze für die Zwecke der vorlie genden Erfindung erfolgt in oder auf einem für deren Entwicklung günstigen Medium. Man kann feste Medien verwenden, vorzugsweise solche, welche eine Massenkultur unter aeroben Bedingungen gestatten, z. B. feuchte, feste Medien in Partikelform, wie Kleine, Zerealienhörner, Zerealiengriess, Holzschnit zel, Späne, Sägemehl, Maishülsen, Faserstoffe, wie Kopra, Kastanien oder Lupinensamen.

Zur Entfernung unerwünschter Verunreinigungen und wachstumshemmender Stoffe kann man sie vor der Fermentation mit Alkohol, Äther oder anderen organischen Lösungsmitteln extrahieren. Den Medien können gewünschtenfalls Wachstumsfaktoren und Nährstoffe zugesetzt werden. Sie können in Schichten in Schalen, mit oder ohne zusätzliche Belüftung, und in Türmen, wie beim Essigverfahren, oder unter Be wegung, z. B. in einer rotierenden Trommel, verwen det werden.

Auch flüssige Medien, z. B. Bierwürze, eignen sich zum Arbeiten in aerober Schicht oder speziell unter submersen aeroben Bedingungen. Zweckmässig sollten die Medien Stoffe enthalten, welche genügend Kohlenstoff, Stickstoff und Mineralien zur Verfügung stellen, obschon natürlich auch unter nicht optimalen Bedingungen ein merkliches Wachstum und Entwick lung stattfinden kann.

, Der verfügbare Kohlenstoff kann aus Kohlehydra ten, Stärken, gelatinierten Stärken, Dextrin, Zucker, Melassen von Rohr-, Rüben- und Sorghumzucker, Glukose, Fruktose, Mannose, Galaktose, Maltose, Saccharose, Lactose, Pentosen, Aminosäuren, Pep tonen oder Proteinen stammen, wobei die Hexosen bevorzugt werden. Weitere Kohlenstofflieferanten für den Energiebedarf der Pilze sind niedere und höhere Fettsäuren oder Fette.

Manchmal sind Mischungen verschiedener Kohlenstoffquellen vorteilhaft.

Assimilierbarer Stickstoff kann von löslichen oder unlöslichen animalischen oder vegetabilischen Pro teinen, z. B. von Proteinen des Sojamehls, Lactalbumin, Kasein und Eieralbumin, von Peptonen, Polypeptiden, Aminosäuren, Säureamiden, Harnstoff, Ammonium salzen, z. B. Ammoniumchlorid von in Basenaus- tauschharzen oder Zeoliten haftendem Ammoniak, Nitraten, wie Natrium- und Kaliumnitrat, oder von Morpholin herstammen.

Molke, wasserlösliche An teile des Rückstandes der Alkoholdestillation aus Maische, Maisquellwasser oder Hefeextrakt haben sich als besonders geeignet erwiesen.

Das Medium kann von Natur aus vorhandenes oder zugesetztes, aus mineralischen Bestandteilen ver fügbares Aluminium, Calcium, Chrom, Kobalt, Kup fer, Gallium, Eisen, Magnesium, Molybdän, Kalium, Scandium, Uran und Vanadin enthalten.

Schwefel kann aus Sulfaten, Alkylsulfonaten, Sulfoxylaten, Sulfamaten, Sulfinaten, Hyposulfiten, Persulfaten, Thiosulfaten, Methionin, Cystin, Cystein, Thiamin, Biotin oder in Form von freiem Schwefel zur Verfü gung stehen.

Phosphor, vorzugsweise fünfwertiger, zweckmässig in 0,001-0,07 molarer, insbesondere in etwa 0,015-0,02 molarer Konzentration, kann in Form von Salzen oder Estern der Ortho-, Meta- oder Pyrophosphorsäure, Phytin, Phytinsäure, Phyta- ten, Glycerophosphaten, Natriumnucleinaten und/oder Maisquellwasser, Kasein,

Lecithin oder Ovovitellin zugegen sein. Spuren von Bor, Jod und Selen können vorteilhaft wirken. Bor kann in Form von Borsäure oder Natriumborat von Anfang an vorhanden sein oder kann nach der Keimung oder dem Frühwachs tum des Pilzes zugegeben werden.

Nach Bedarf oder Wunsch können andere zusätz liche Wachstumsfaktoren und Wachstumsstimulantien vorgesehen werden.

Von den festen und flüssigen Medien werden die flüssigen bevorzugt, da sie das Mycelwachstum be günstigen.

Als Schutz vor Infektionen kann das Fermentie- rungsmedium antiseptische oder antibiotische Zusätze, wie Benzoate, Sulfite, Penicillin oder Tetracychn, ent halten.

Dispersionsmittel oder Mycelträger, wie Filter erden, Filterhilfen, feinverteilte Cellulose, Holzschnit zel, Bentonite, Calciumkarbonat, Magnesiumkarbonat oder andere suspendierbare feste Materialien, Methyl- cellulose, Carboxymethylcellulose, Alginate oder Poly- vinylalkohol können zur Erleichterung der Fermenta tion, Belüftung und Filtration ebenfalls zugesetzt wer den.

Das Medium besitzt vor der Beimpfung vorzugs weise ein pH von etwa 4 bis etwa 7, das aber auch niedriger oder höher sein kann. Zur Kultur von Septomyxa wird ein pH zwischen etwa 5 und 6 be vorzugt. Die Beimpfung des das Pilzwachstum unter stützenden Mediums mit dem gewählten Septomyxa- Stamm kann in irgendeiner geeigneten Weise erfolgen. Septomyxa wachsen in einem Temperaturbereich von etwa 20-38 C, wobei eine Temperatur von etwa 20-35 C bevorzugt wird.

Die Entwicklungszeit des Pilzes, die erforderlich ist, ehe man das zu fermentierende Steroid dem Pilz aussetzt, scheint nicht kritisch zu sein. So kann man das Steroid entweder vor der thermischen oder ander weitigen Sterilisation des Mediums, bei der Beimpfung des Mediums mit der gewählten Septomyxaart oder irgendwann, z. B. 24 oder 48 Stunden später, zuset zen.

Das zu fermentierende Steroid kann in jeder ge eigneten Konzentration zugesetzt werden, doch ist aus praktischen Gründen eine Steroidkonzentration im Substrat von etwa oder bis zu etwa 0,5 g/1 oder sogar 0,8 g/1 zweckmässig und 2 g/1 sind noch anwend bar, obschon man je nach dem speziellen Steroid auch höhere Konzentrationen verwenden kann. Der Zu satz des zu fermentierenden Steroids kann in jeder geeigneten Weise geschehen, speziell derart, dass eine grosse Kontaktfläche zwischen Steroid und Pilz ent steht, z.

B. indem man das Steroid entweder allein oder in einem Dispergierniittel oder in Lösung in einem organischen Lösungsmittel mit dem Pilzmedium mischt, so dass eine Dispersion bzw. Suspension des Ste- roids im Pilzmedium entsteht. Man kann entweder submerse oder Oberflächenkulturen anwenden, doch werden submerse Bedingungen bevorzugt.

Man kann auch die die Steroide fermentierenden Enzyme aus einer Pilzkultur vom Pilz öder Medium abtrennen, mit dem Steroid oder einer Dispersion bzw. Lösung eines solchen vermischen und die Mischung aeroben Bedin gungen aussetzen, um die Fermentation des Steroids zu bewerkstelligen. , Die Temperatur während der Fermentierung des Steroids kann die gleiche sein, die sich für die Kultur des Pilzes eignet.

Sie muss nur in einem Bereich ge halten werden, in welchem das Leben, das aktive Wachstum oder die Enzymaktivität des Pilzes erhal ten bleibt.

Obschon jede Form der aeroben Bebrütung für die Kultur des gewählten Pilzes und die Fermentie- rung des Steroids geeignet ist, hängt der Wirkungs grad der Steroidfermentierung von der Belüftung und Bewegung ab.

Die Belüftung erfolgt in der Regel durch Bewegung und/oder Durchblasen von Luft durch das Fermentationsmedium. Die Belüftung kann durch Oberflächenkultur oder unter submersen Fer- mentationsbedingungen erfolgen. Aerobe Bedingun gen umfassen nicht nur die Verwendung von Luft zur Einführung von Sauerstoff, sondern auch andere Quellen, z. B. Mischungen, die Sauerstoff in freier oder freisetzbarer Form enthalten.

Bei Verwendung von Luft als Belüftungsmedium ist eine erwünschte Belüftungsgeschwindigkeit etwa 4-20 Millimol, ins besondere 9-12 Millimol Sauerstoff pro Stunde und Liter, bestimmt nach der Methode von Cooper, Fern strom und Miller, Ind. Eng. Chem., 36, 504 (1944). Die Belüftung kann durch Anwendung von über- oder Unterdruck verändert werden, z.

B. im Bereiche von 2,1-0,7 Atm. Die Sauerstoffaufnahme kann durch die Gegenwart der verschiedensten Mittel er leichtert werden, wie z. B. Ascorbinsäure, Glutamin säure, Zitronensäure, Milchsäure, Tyrosin oder Tryptophan. Das pH kann durch Zusatz von Alkali oder Phosphorsäure eingestellt werden. Der Zusatz von so viel festem Calciumkarbonat (bei Verwendung von flüssigen Medien), dass ein fester Rückstand ver bleibt, hat sich als zweckmässig erwiesen.

Die für die Fermentierung des Steroids erforder liche Zeit wechselt je nach der Arbeitsweise etwas. Wenn das Steroid,bei der Beimpfung des Mediums zugegen ist, kann man Perioden von 8-72 Stunden anwenden. Wird das Steroid aber dem Pilz zugesetzt, nachdem schon ein wesentliches Wachstum des Pilz- organismus stattgefunden hat, z. B. nach 16-24 Stunden und bei günstigster Temperatur, so beginnt die Umwandlung des Steroids sogleich und man er hält hohe Ausbeuten im Verlauf von 1 bis 72 Stun den, wobei 24 Stunden gewöhnlich befriedigen.

Nach beendigter Fermentation wird das fermen tierte Steroid aus der Reaktionsmischung gewonnen. Eine besonders vorteilhafte Methode hierfür ist die Extraktion der Mischung einschliesslich gegebenenfalls vorhandener Flüssigkeit und Mycel mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel für Steroide, wie Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlen- stoff, Äthylenchlorid, Trichloräthylen, Äther, Amyl- acetat, Benzol usw. Man kann auch z.

B. Fermenta- tionslösungen vom Mycel trennen und beide getrennt mit einem geeigneten Lösungsmittel extrahieren. Das Mycel kann dabei mit wassermischbaren oder nicht wassermischbaren Lösungsmitteln extrahiert werden, wobei z. B. Aceton wirksam ist. Das vom Mycel be freite Reaktionsmedium kann mit nicht wassermisch baren Lösungsmitteln. extrahiert werden.

Die beiden Extrakte können vor oder nach dem Waschen mit einer alkalischen Lösung, wie Natriumbikarbonat, vereinigt werden, wonach man sie zweckmässig, z. B. über wasserfreiem Natriumsulfat, trocknet und das er haltene fermentierte Steroid durch Umkristallisieren aus organischen Lösungsmitteln, durch Zerreiben mit organischen Lösungsmitteln oder durch Chromato- graphie reinigt, um die so erhaltenen Steroide von anderen Produkten der Fermentation zu trennen.

Beispiel 1 12 1 eines wässrigen Mediums, das 1% Dextrose Cerelose (Markenprodukt) und 2% Maisquell- wasser mit 60% Feststoffen enthält,

werden mit Na- triumhydroxyd auf pH 4,9 eingestellt. Zur Verhinde rung des Schäumens werden 10 cm3 Specköl, das 0,1-2,0% Octadecanol enthält, zugesetzt. Das Me- dium wird mit Dampf bei einem Druck von1,05 Atm. während 30 Minuten sterilisiert.

Nach dem Abkühlen wird das sterile Medium mit einer 24stündigen Kultur von Sporen von Septomyxa affinis (ATCC 6737) ge impft. Das Medium wird bewegt und mit steriler Luft in einer Menge von 1 Liter/Minute belüftet. Nach 24 Stunden Kultivierung bei Zimmertemperatur ist das pH 7,35. Zu dieser Kultur gibt man nun 2 g 17a,21-Dioxy-4-pregnen-3,20-dion in 100 cm3 Ätha- nol gelöst. Man fermentiert 24 Stunden, wonach das pH 8,1 beträgt.

Die Fermentationsbrühe wird durch Gaze filtriert, um das Mycel abzutrennen. Es wird einmal mit 1 1 Aceton und zweimal mit je 1 1 Methy- lenchlorid gewaschen. Die Aceton- und Methylen- chloridwaschlaugen werden mit weiteren 4 1 Methy- lenchlorid vereinigt und zur Extraktion des Filtrats verwendet. Dieses wird noch zweimal mit je 3 1 Me- thylenchlorid extrahiert.

Alle Extrakte werden ver- einigt, mit 1200 cm3 2%iger Natriumbicarbonat- lösung, dann mit 1200 cm,' Wasser gewaschen. Der gewaschene Extrakt wird dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum einge dampft.

Die Extrakte wiegen 3 g. Sie werden in 360 cm3 Äthylendichlorid gelöst und an einer Säule aus Ma gnesiumsilikaten < Florisil (Markenprodukt) mit 360-cm3-Portionen folgender Lösungsmittel entwickelt: Äthylendichlorid: 3 Portionen; Äthylendichlorid-Ace- ton (25:l): 2 Portionen; Äthylendichlorid-Aceton (15:1): 3 Portionen; (12:1): 3 Portionen, (10: 1):

3 Portionen (Fraktionen 12-14),(8: 1): 3 Portionen (Fraktionen 15-17), (5: 1): 3 Portionen, (2: 1): 3 Portionen; Aceton: 6 Portionen und Methanol: 3 Portionen. Die Rückstände der Eluatfraktionen 12 bis 17 (0,8 g) werden vereinigt und dreimal aus Metha- nol-Chloroform 1:1 umkristallisiert. Man erhält 400 mg 17a,21-Dioxy-1,4-pregnadien-3,20-dion vom Schmelzpunkt 238-242 C;

[a]D' = +70 (CHC13); AmäX = 245 m@C (E = 13068). Beispiel 2 Man arbeitet wie im Beispiel 1, verwendet aber statt 17a,21-Dioxy-4-pregnen-3,20-dion das 4-Andro- sten-3,17-dion und erhält 1,4-Androstadien-3,17-dion und als Nebenprodukte 1-Dehydrotestosteron und 1-Dehydrotestololacton.

Beispiel 3 Man arbeitet wie im Beispiel 1, verwendet aber als Ausgangssteroid Testosteron und erhält haupt sächlich 1-Dehydrotestosteron sowie 1,4-Androsta- dien-3,17-dion.

Beispiel 4 Septomyxa affinis wird 18 Stunden im Nähr medium kultiviert, das gleich wie im Beispiel 1 zu sammengesetzt ist. Das Mycel wird vom Medium abzentrifugiert und 6mal durch Zentrifugieren mit destilliertem Wasser gewaschen. Das gewaschene Mycel wird in destilliertem Wasser suspendiert. Zu einer entsprechenden Portion wird Phosphorsäure bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 2,0 zugegeben. Dann werden 40 mg Progesteron, in 1 cm3 Aceton gelöst, zugesetzt.

Das Reaktionsgefäss wird 24 Stun den bei Raumtemperatur geschüttelt; danach zeigt das Gemisch einen pH-Wert von 2,1. Die Würze wird dann 4mal mit 25-cm3-Portionen Methylenchlorid extrahiert. Jeder Extrakt wird dann mit 2o/oiger Na- triumcarbonatlösung und destilliertem Wasser gewa schen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrock net und eingedampft. Die Rückstände werden Papier- chromatographisch analysiert, wobei man 75 g 1-Dehydroprogesteron pro 200 g Extrakt erhält.

Das 1-Dehydroprogesteron zeigt erhöhte progestationale Wirksamkeit.

In gleicher Weise erhält man durch Ersatz des Progesterons durch 19-Nortestosteron unter Verwen dung von gründlich ausgewaschenen Zellen, die auf pH 7 gepuffert sind, 1-Dehydro-19-nortestosteron, das in Säure zum Östradiol umgelagert werden kann. Beispiel S Septomyxa affinis wird auf Malz-Agar-Schrägkul- turen, bestehend aus 50 g trockenem Malzextrakt,

5 g enzymatisch abgebautem Lactalbumin Edamine (Markenprodukt) und 20g Agar, mit Leitungswasser auf einen Liter verdünnt und auf pH 6,5-7,0 ein gestellt, kultiviert. Mit dieser Kultur werden Erlen meyerkolben, die100 cm3 des obigen Malz-Agar- mediums enthalten, geimpft und 4-7 Tage bei Zim mertemperatur gehalten, um Sporen zu bilden.

Die Sporen werden in 100 cm3 1% iger steriler Salzlösung suspendiert.

In fünf Kolben von 250 cm3 Inhalt, die je 100 cm3 des im Beispiel 1 verwendeten Nähr mediums enthalten, dessen pH auf 4,8-5,0 einge stellt ist, gibt man je 5 cm3 der Sporensuspension. Die Kultur wird 24 Stunden bei Zimmertemperatur mit 1 1/Min. belüftet.

Diese sechs Liter Saatkultur wer den dann, wie im Beispiel 1, zu 100 Liter Medium gegeben und 24 Stunden bei Zimmertemperatur kul tiviert, wobei man bewegt und mit 2 1/Min. belüftet. Zu dieser 24 Stunden alten Kultur gibt man 25 g in 500 cm3 Aceton gelöstes 11ss,21-Dioxy-4,17(20)- pregnadien-3-on und bewegt und belüftet weitere 24 Stunden mit 1 1/Min.

Man filtriert vom Mycel ab, wäscht es mit 20 Liter Wasser und gibt das Waschwasser zum Filtrat. Das gewaschene Mycel wird zweimal. mit je 12 Liter Aceton und dann zweimal mit je 12 Liter Methylen- chlorid aufgeschlämmt und suspendiert.

Die so er haltenen Aceton- und Methylenchloridextrakte wer den vereinigt und zu den Extraktlösungen aus dem Filtrat gegeben, die durch viermaliges Extrahieren desselben zusammen mit dem Waschwasser erhalten wurden, wobei man je 24 Liter Methylenchlorid ver wendete. Die Extrakte werden zweimal mit je 12 Liter 2o/oiger Natriumbikarbonatlösung und zweimal mit je 12 Liter Wasser gewaschen. Dann wird auf 3 Liter konzentriert und hernach auf dem Wasserbad an der Luft zur Trockne eingedampft. Man erhält 54,3 g eines rohen kristallinen Rückstandes.

Dieser wird dreimal mit je 25 cm3 Diäthyläther unter Verreiben ausgezogen. Die verbleibenden Kristalle wiegen 20,9 g. Man löst sie in heissem Methanol, filtriert und kühlt auf Zimmertemperatur ab. Man erhält 11,7g Kristalle, die bei 181,5-183,5 C schmelzen. 305 mg dieser Kristalle werden in 6 cm3 siedendem Äthylendichlorid gelöst.

Die heisse Lösung wird fil triert, bei Zimmertemperatur kristallisieren gelassen, dann auf etwa 5 C gekühlt, um die Kristallisation zu vervollständigen. Man erhält so 238 mg Kristalle vom Schmelzpunkt 158-161 C. Nach nochmaligem Um kristallisieren auf die gleiche Weise erhält man 215 mg 11ss,21- Dioxy - 1,4,17(20) - pregnatrien - 3 - an vom Schmelzpunkt 149-153 C.

Die 11,7g Kristalle, die aus Methanol erhalten werden und bei 181,5-183,5 C schmelzen, enthal ten 1-Methoxy-11p, 21-dioxy-4,17(20)-pregnadien-3- on, entstanden aus 11ss, 21-Dioxy-1,4,17(20)-pregna- trien-3-on durch die Einwirkung des heissen Metha nols. Unter weniger strengen Bedingungen oder mit anderen Lösungsmitteln wie Äthylacetat erhält man reines llss,21-Dioxy-1,4,17(20)-pregnatrien-3-on und die 1-Methoxy-Verbindung entsteht nicht.

Beispiel 6 Arbeitet man wie in den Beispielen 1 und 5, ver wendet jedoch 17a,21-Dioxy-4-pregnen-3,11,20-trion als Steroid, so erhält man 17a,21-Dioxy-1,4-pregna- dien-3,11,20-trion, das entzündungs- und arthritis- hemmende Eigenschaften besitzt. Sowohl das freie Produkt als auch dessen 21-Ester, z. B. das 21-Acetat oder -Propionat, sind deshalb therapeutisch wertvoll.

Beispiel 7 Arbeitet man wie in den Beispielen 1 und 5, ver wendet aber als Ausgangssteroid 11ss,17a,21-Trioxy- 4-pregnen-3,20-dion, so erhält man 11ss,17a,21-Tri- oxy-1,4-pregnadien-3,20-dion, das als freie Verbin dung oder als 21-Ester, z. B. 21-Acetat oder -Pro pionat, entzündungs- und arthritishemmende Eigen schaften aufweist, die denjenigen des Hydrocörtisons qualitativ ähnlich sind.

Beispiel 8 Arbeitet man wie im. Beispiel 1, jedoch unter Ver wendung von 19-Nortestosteron als Ausgangssteroid, so erhält man östron und östradiol.

Beispiel 9 Arbeitet man wie im Beispiel 1, unter Verwen dung von 17a-Methyl-testosteron als Ausgangssteroid, so erhält man das 1-Dehydro-17a-methyl-testosteron mit erhöhter anabolischer Wirksamkeit.

Beispiel 10 Arbeitet man wie in den Beispielen 1 bis 9, ver wendet jedoch als Mikroorganismen Septomyxa aesculi, Septomyxa comi, Septomyxa salicina oder Septomyxa tulasnei, so erhält man die gleichen Er gebnisse wie mit Septomyxa affinis.

Claims

PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von dl-Steroiden, die in 3-Stellung eine Sauerstoffunktion aufweisen, da durch gekennzeichnet, dass man entsprechende in 1,2- Stellung gesättigte Steroide unter aeroben Bedingun gen der Einwirkung eines Pilzes der Gattung Septo- myxa oder entsprechender Enzyme unterwirft. UNTERANSPRÜCHE 1.

Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man ein in 1,2-Stellung gesättigtes 3-Keto-steroid in Gegenwart eines Nährmediums der Gärung unterwirft und das entstandene d1-3-Keto- steroid isoliert. 2. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man als Ausgangssteroid ein 3 Keto-pregnan verwendet und das entstandene d1-3 Keto-pregnen isoliert. 3.

Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man ein in 1,2-Stellung gesättigtes 3,20-Diketosteroid in Gegenwart eines Nährmediums der Gärung unterwirft und das entstandene d1-3,20 Diketo-steroid isoliert. 4. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man als Ausgangssteroid ein 3-Keto-androstan verwendet und das entstandene dl-3-Keto-androsten isoliert. 5.

Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man als Ausgangssteroid l.1ss,17a, 21-Trihydroxy-4-pregnen-3,20-dion verwendet und das entstandene llss,17a,21-Trihydroxy-1,4-pregna- dien-3,20-dion isoliert. 6. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man als Ausgangssteroid llss,21- Dihydroxy-4,17(20)-pregnadien-3-on verwendet und das entstandene l lss,21-Dihydroxy-1,4,17(20)-pre- gnatrien-3-on isoliert.