Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein fermentatives Verfahren zur Herstellung von L-Glut- aminsäure durch Züchtung einer neu isolierten Bakte rienart, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen Stamm von Brevibacterium lactofermentus nov. sp. in einer Nährlösung bebrütet, die mindestens 20 y/1 Vitamin Bi, einen Zucker sowie eine Stick stoffverbindung enthält,
die Bebrütung unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 28 bis 37 C durchführt und die gebildete L-Glutaminsäure aus der Fermentationsbrühe abscheidet.
Gemäss der Erfindung kann man die L-Glutamin- säure in hoher Konzentration und rasch in der Nähr lösung erhalten.. und auf diese Weise die fermentative Gewinnung der L-Glutaminsäure in industriellem Massstab erheblich erleichtern.
Das neue Brevibacterium lactofermentus wurde zum ersten Mal aus der Natur isoliert und es konnte festgestellt werden, dass es sich deutlich von allen bekannten Bakterienarten unterscheidet. Die Tat sache, dass das Brevibacterium lactofermentus nov. sp. von allen bisher bekannten L-Glutaminsäure liefern den Bakterien, wie Pseudomonas fluorescens, Esche- richia coli, Aerobacter aerogenes,
Bazillus subtilis, Micrococcus glutaminicus und der Pilze der Gattung Cephalsporium verschieden ist, geht klar aus Ta belle 1 hervor, in welcher die charakteristischen Eigen schaften von Brevibacterium lactofermentus nov. 5p. zusammengestellt sind. Tabelle 2 gibt einen Vergleich der neuen Art mit den vorerwähnten, bekannten L-Glutamin produzierenden Bakterien wieder.
Da Pilze von Bakterien weitgehend verschieden sind, wurde von einer Aufnahme der Gattung Cephalo- sporiurn in der Tabelle 2 abgesehen.
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<I>Tabelle <SEP> 1</I>
<tb> Charakteristische <SEP> Merkmale <SEP> von <SEP> Brevibacterium
<tb> lactofermentus <SEP> nov. <SEP> sp.
<tb> (Nr. <SEP> 2256 <SEP> und <SEP> Nr. <SEP> 2362)
<tb> A. <SEP> Morphologische <SEP> Kennzeichen:
<tb> 1. <SEP> Vegetative <SEP> Zellen:
<tb> Stäbe, <SEP> gewöhnlich <SEP> 0,5-0,9 <SEP> <I>,cc</I> <SEP> mal <SEP> 1,0-1,4 <SEP> <I>,u,</I> <SEP> ein zeln <SEP> und <SEP> in <SEP> Paaren, <SEP> keine <SEP> runden <SEP> Formen <SEP> beob achtet.
<tb> z. <SEP> Beweglichkeit: <SEP> keine.
<tb> 3. <SEP> Sporenbildung: <SEP> keine.
<tb> 4. <SEP> Gramfärbung: <SEP> positiv. B. Züchtungseigenschaften: 1.
Nährbrühe: kein Oberflächenwachstum, leicht getrübt, geringes Sediment.
2. Agarstrich: mässig, trocken, nicht entwickelt, fettig, dumpfe Farbe und opakes Wachstum, fadenförmig und manchmal perlartig. Die Chromogenesis des Aus strichs ist anfangs gewöhnlich gelb bis blassgelb, später tiefer gelb.
3. Agarkolonie: gewöhnlich kleine Kreise, kaum breiter auf Agar- brühe, glatt und manchmal erhöht in der Mitte der Kolonie.
4. Gelatine-Einstichkultur: Wachstum an der Oberfläche längs des Einstichs, keine Verflüssigung.
5. Lackmus-Milchkultur: Säurebildung, Entfärbung und meistens Koagulation. C. Physiologisches Verhalten: 1. Verhalten gegenüber reinem Sauerstoff: praktisch anaerob.
2. Gang der Kohlenhydratumwandlung nach der Methode von Leifson (Journal of Bacteriology, Band. 66, Seiten 24-26, 1953): fermentativer Metabolismus von Glukose und Lactose.
3. pH für Wachstum: Optimum etwa bei 7,0, Wachstum im Bereich von 5,3 bis 8,4.
4. Temperatur für Wachstum: Optimum 30-37 C, kein Wachstum bei 42 C. 5. Nitritproduktion aus Nitrat: positiv. 6. Stärkehydrolyse: negativ.
7. MR- und VP-Reaktion: beide positiv.
B. Wachstum in Huckers-Medium: gewöhnlich gering, schwankend mit dem Impf ausmass.
9. Indolproduktion: negativ. 10. H2S-Produktion: negativ. 11. Urease: positiv. 12. Fermentation verschiedener Zucker: Säureproduktion aus verschiedenen Zuckern, aber keine Gasbildung:
Säure aux Xylose, Glucose, Fructose, Galactose, Mannose, Lactose, Sucrose, Maltose, Trehalose, Melezitose, Cellobiose, Raffi- nose, Dextrin, Mannitol, Salicin und Esculin. Bemerkung 1:
Die vorstehend angeführten charakteristischen Merkmale des Brevibacterium lactofermentus sind nach den Vorschriften im Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria (l946), her ausgegeben von der Society of American Bacte- riologists, ermittelt worden.
Bemerkung 2: Das neu aufgefundene Bacterium gehört zur Gat tung Brevibacterium Breed nach der Einteilung in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (1957, 7. Auflage).
Bemerkung 3: MR-Reaktion (vorstehend unter Ziffer 7) bedeu tet den Methylrot-Test, der folgendermassen aus geführt wird: Ein Mikroorganismus wird in einer wässrigen Lösung, die Glukose, Phosphat und Pepton enthält, 3 Tage lang bei einer Temperatur von 30-37 C gezüchtet. Dann wird eine Lösung von 0,1g Methylrot in 300 cm,' Alkohol und 200 cm3 Wasser zugesetzt. Wenn eine Rotfärbung eintritt, wird der Test als positiv bezeichnet, erscheint eine gelbe Färbung, so ist der Test negativ.
Bemerkung 4: VP-Reaktion (vorstehend unter Ziffer 7) bedeutet den Voges-Proskauer-Test, der folgendermassen ausgeführt wird: Ein Mikroorganismus wird wie unter Bemerkung 3 gezüchtet. Dann wird eine 10 laige Kaliumhydroxydlösung zugesetzt und das Gemisch 24 Stunden lang stehengelassen. Wenn eine Eosinrosa-Färbung mit Fluoreszenz auftritt, ist der Test positiv, sonst negativ.
Das neue Bacterium unterscheidet sich klar von anderen Arten, die zur Gattung Brevibacterium ge hören, und zwar sowohl in den besonderen, charakte ristischen Eigenschaften als auch in bezug auf die Lactosefermentation. Es ist daher festgestellt worden, dass es sich um eine neue Art der Gattung Brevi- bacterium handelt und mit Rücksicht auf die Lactose- fermentation ist dem Bacterium die Bezeichnung Brevibacterium lactofermentus gegeben worden.
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<I>Tabelle <SEP> 2</I>
<tb> Vergleich <SEP> des <SEP> Brevibacterium <SEP> lactofermentus <SEP> mit <SEP> anderen <SEP> Mikroorganismen
<tb> Ps. <SEP> fluoreszenz <SEP> E. <SEP> coli <SEP> A. <SEP> aerogenes <SEP> B. <SEP> subtilis <SEP> M. <SEP> glutamicus <SEP> Brev.
<tb> lactofermentus
<tb> Sporenbildung <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> Gramfärbung <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Beweglichkeit <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> Freier <SEP> Sauerstoff <SEP> + <SEP> <SEP> <SEP> + <SEP> + <SEP> +_
<tb> zum <SEP> Wachstum
<tb> Chromogenesis <SEP> gelbe <SEP> uoreszenz <SEP> keine <SEP> keine <SEP> keine <SEP> gelb <SEP> gelb
<tb> Gelatineverflüssigung <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> Lackmus-Milch <SEP> P <SEP> AC <SEP> AC <SEP> P <SEP> - <SEP> AC
<tb> Indolproduktion <SEP> -
<SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> A <SEP> = <SEP> Säure, <SEP> G <SEP> = <SEP> Gas, <SEP> C <SEP> = <SEP> Coagulation <SEP> und <SEP> P <SEP> = <SEP> Peptonisation
EMI0003.0001
<I>Tabelle <SEP> 2</I> <SEP> (Fortsetzung)
<tb> Brev.
<tb> Ps. <SEP> fluoreszenz <SEP> E. <SEP> coli <SEP> A. <SEP> aerogenes <SEP> B. <SEP> subtilis <SEP> M.
<SEP> glutamicus <SEP> lactofermentus
<tb> HZS-Produktion <SEP> <SEP> <SEP> + <SEP> <SEP> - <SEP> Nitritproduktion <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> aus <SEP> Nitrat
<tb> Methylrottest <SEP> <SEP> + <SEP> - <SEP> <SEP> - <SEP> +
<tb> Voges <SEP> Proskauertest <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> +
<tb> Stärkehydrolyse <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> NH3Bedarf <SEP> zum <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Wachstum
<tb> Catalase <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Glucosefermentation <SEP> A <SEP> AG <SEP> AG <SEP> A <SEP> A <SEP> A
<tb> Lactosefermentation <SEP> - <SEP> AG <SEP> AG <SEP> - <SEP> - <SEP> A
<tb> Xylosefermentation <SEP> - <SEP> AG <SEP> AG <SEP> A <SEP> - <SEP> A
<tb> Dextrinfermentation <SEP> - <SEP> A <SEP> A <SEP> A <SEP> - <SEP> A
<tb> A <SEP> = <SEP> Säure,
<SEP> G <SEP> = <SEP> Gas, <SEP> C <SEP> = <SEP> Coagulation <SEP> und <SEP> P <SEP> = <SEP> Peptonisation Man hat ferner feststellen können, dass die Kon zentration an L-Glutaminsäure auf mehr als 5,0 g/dl ansteigt, wenn Brevibacterium lactofermentus unter aeroben Bedingungen in einem Medium gezüchtet wird, das neben den anderen Bestandteilen noch Vitamin B1 (Thiamin oder dessen Derivate, wie Thiaminpropyldisulfit oder Dibenzoylthiamin) enthält.
Die Tabelle 3 zeigt, welche bedeutenden Wirkungs unterschiede durch den Zusatz von Thiamin zum Züchtungsmedium hervorgerufen werden. Das be- nutzte synthetische Medium enthielt 10 % Glucose und die Kultur wurde 40 Stunden lang in einer Schüttelflasche behandelt.
Die Bedingungen waren die gleichen wie im nachstehend angeführten Beispiel 1, jedoch mit der Ausnahme, dass anstelle von 2% Ammoniumsulfat als Stickstoffquelle 2,4 % Harn- stoff angewendet wurden.
EMI0003.0035
<I>Tabelle <SEP> 3</I>
<tb> <I>Vitamin <SEP> BI <SEP> 200 <SEP> y/l</I>
<tb> Brevibacterium <SEP> Wachstum <SEP> Zuckerverbrauch <SEP> L-Glutaminsäure
<tb> lactofermentus <SEP> (Trübung) <SEP> (%) <SEP> <U>(%</U>)
<tb> Nr.2362 <SEP> 0,69 <SEP> 99,2 <SEP> 54,4
<tb> Nr.2256 <SEP> 0,76 <SEP> 98,1 <SEP> 53,2
<tb> <I>Vitamin <SEP> B, <SEP> 0 <SEP> 7/l</I>
<tb> Nr.2362 <SEP> 0,25 <SEP> 14,2 <SEP> 4,2
<tb> Nr.2256 <SEP> 0,60 <SEP> 65,1 <SEP> 24,3 Wie sich aus dem Vergleich ergibt, erleichtert die Zugabe von Vitamin B, das Bakterienwachstum, be schleunigt den Zuckerverbrauch und erhöht die Pro duktion von L-Glutaminsäure ganz erheblich.
Wie wohl in bezug auf die Produktionskraft von L-Glut- aminsäure zwischen den Stämmen 2362 und 2256 ein gewisser Unterschied besteht, wenn kein Vitamin Bi zugefügt wird, ist es doch klar, dass man Aus beuten an L-Glutaminsäure von mehr als 50,1/o und eine Konzentration von mehr als 5 g/dl nur in Gegen wart von Vitamin B1 erreichen kann.
Diese unterschiedlichen Wirkungen, die man ge mäss vorliegender Erfindung durch Verwendung von Brevibacterium lactofermentus und Vitamin B1 erzie len kann, lassen sich auch feststellen, wenn andere Zucker, wie Fructose, Saccharose, Lactose oder der gleichen anstelle von Glucose als Zuckerquelle benutzt werden, was aus Tabelle 4 hervorgeht.
Die dort ange führten Versuche wurden gleichfalls in Schüttelkolben während 40 Stunden unter Verwendung eines Züch- tungsmediums vorgenommen, das 10 % des betreffen- den Zuckers enthielt, in Anwendung der gleichen Bedingungen wie im nachstehenden Beispiel 1, nur mit dem Unterschied,
dass anstelle von 2 % Ammo- niumsulfat 2,4 % Harnstoff benutzt wurden.
EMI0004.0001
<I>Tabelle <SEP> 4</I>
<tb> <I>Vitamin <SEP> B1 <SEP> 200 <SEP> y/1</I>
<tb> Bakterienwachstum <SEP> Zuckerverbrauch <SEP> L-Glutaminsäure
<tb> Zuckerart <SEP> (Trübung) <SEP> (%) <SEP> (%)
<tb> Glucose <SEP> 0,69 <SEP> 99,2 <SEP> 54,4
<tb> Fructose <SEP> 0,59 <SEP> 87,2 <SEP> 36,3
<tb> Maltose <SEP> 0,51 <SEP> 33,0 <SEP> 15,4
<tb> Saccharose <SEP> 0,61 <SEP> 85,5 <SEP> 29,
9
<tb> Lactose <SEP> 0,43 <SEP> 79,3 <SEP> 32,9
<tb> Stärkehydrolysat <SEP> 0,68 <SEP> 92,3 <SEP> 51,8
<tb> <I>Vitamin <SEP> BI <SEP> 0 <SEP> 7/l</I>
<tb> Glucose <SEP> 0,25 <SEP> 14,2 <SEP> 4,2
<tb> Fructose <SEP> 0,22 <SEP> 11,3 <SEP> 3,2
<tb> Maltose <SEP> 0,17 <SEP> 9,1 <SEP> 2,8
<tb> Saccharose <SEP> 0,21 <SEP> 11,9 <SEP> 4,1
<tb> Lactose <SEP> 0,18 <SEP> 12,0 <SEP> 4,3
<tb> Stärkehydrolysat <SEP> 0,33 <SEP> 21,3 <SEP> 6,4 Die Wirkung verschiedener Konzentrationen von Vitamin Bi auf die Produktion von L-Glutaminsäure wurde gleichfalls geprüft und es wurde, wie aus Tabelle 5 hervorgeht, festgestellt, dass mindestens so 20 y pro Liter für die industrielle Fermentation nötig sind.
EMI0004.0006
<I>Tabelle <SEP> 5</I>
<tb> Vitamin <SEP> B<U>i <SEP> (y/1)</U> <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 20 <SEP> 100 <SEP> 1000 <SEP> 10000
<tb> Ausbeute <SEP> an <SEP> L-Glutaminsäure <SEP> (oh) <SEP> 1,2 <SEP> 3,2 <SEP> 34,9 <SEP> 49,3 <SEP> 53,8 <SEP> 52,1
<tb> Zuckerverbrauch <SEP> (o/o) <SEP> 20,4 <SEP> 32,9 <SEP> 80,3 <SEP> 97,3 <SEP> 98,2 <SEP> 99,3 Die Versuchsbedingungen waren dieselben wie im Beispiel 1, nur mit dem Unterschied, dass als Stick stoffquelle anstelle von 211/o Ammoniumsulfat 2,411/o Harnstoff verwendet wurden.
Bei Versuchen, die unter Benutzung von Deriva ten des Thiamins, wie Thiaminpropyldisulfit, anstelle von Thiamin als solchem vorgenommen wurden, wur den ähnliche Wirkungen festgestellt, was aus Tabelle 6 hervorgeht. Die Versuchsbedingungen waren die selben wie bei den vorstehend beschriebenen Unter suchungen, bei denen das Vitamin Bi selbst verwen det worden war.
EMI0004.0015
<I>Tabelle <SEP> 6</I>
<tb> Thiaminp<U>ro</U>pyldisulfit <SEP> (yjl) <SEP> 0 <SEP> 200 <SEP> 1000 <SEP> 10000
<tb> Ausbeute <SEP> an <SEP> L-Glutaminsäure <SEP> (o/a) <SEP> 3,6 <SEP> 45,9 <SEP> 49,8 <SEP> 47,5
<tb> Zuckerverbrauch <SEP> (o/o) <SEP> 11,7 <SEP> 87,9 <SEP> 94,3 <SEP> 91,9 Ein anderes neben der Kohlenstoffquelle erfor derliches Rohmaterial bei der fermentativen Herstel lung von L-Glutaminsäure ist die Stickstoffquelle.
Es hat sich gezeigt, dass die kontinuierliche Zufuhr von Ammoniakgas zu dem Züchtungsmedium während der aeroben Behandlung gleichzeitig vier verschie denen Zwecken dienen kann, nämlich der Zufuhr des für das Zellwachstum erforderlichen Stickstoffes, der Abgabe von NH.- Stickstoff für den Aufbau des L-Glutaminsäuremoleküls, der Neutralisation der fermentativ entstandenen L-Glutaminsäure und der als Nebenprodukte auftretenden organischen Säuren, und schliesslich der Aufrechterhaltung des optimalen pH im Züchtungsmedium.
Die bekannten Mittel zur Sicherstellung dieser vier Wirkungen, wie die Anwendung von Ammonium salzen und Kalk, von Ammoniumsalzen und Ammo- niakwasser, von Harnstoff und Ammoniakwasser oder dergleichen, haben Nachteile, wie geringe Ausbeute an Glutaminsäure, Verlangsamung des Zuckerver brauchs, Verlängerung der Fermentationszeit oder dergleichen, und die Produktion der L-Glutaminsäure wird dadurch unvorteilhaft beeinflusst. Die Tabelle 7 zeigt, wie sehr die Verwendung von Ammoniakgas der Verwendung anderer Stickstoffverbindungen über legen ist.
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<I>Tabelle <SEP> 7</I>
<tb> Fermentations- <SEP> Änderung <SEP> Konzentration <SEP> an <SEP> Ausbeute <SEP> an
<tb> Stickstoffquelle <SEP> Neutralisator <SEP> zeit <SEP> des <SEP> pH <SEP> während <SEP> der <SEP> L-Glutaminsäure <SEP> L-Glutaminsäure
<tb> (Stunden <SEP> Fermentation <SEP> (g/dl) <SEP> (%)
<tb> Ammonium- <SEP> CaCOs <SEP> 5 <SEP> % <SEP> 50 <SEP> 5,0-6,8 <SEP> 1,63 <SEP> 7,4
<tb> Sulfat <SEP> 2 <SEP> 0/0
<tb> Harnstoff <SEP> 2,5 <SEP> %- <SEP> keiner <SEP> 50 <SEP> 6,5-8,7 <SEP> 2,32 <SEP> 19,3
<tb> Harnstoff <SEP> 0,8 <SEP> % <SEP> Ammoniakwasser <SEP> 50 <SEP> 6,8-8,3 <SEP> 4,13 <SEP> 36,1
<tb> 6 <SEP> ml/dl
<tb> Ammoniakgas <SEP> Ammoniakgas <SEP> 40 <SEP> 7,6-7,8 <SEP> 5,98 <SEP> 49,6 Die vorstehend angeführten Versuche wurden unter denselben Bedingungen durchgeführt,
wie sie weiter unten im Beispiel 4 beschrieben sind, nur mit dem Unterschied, dass als Kohlenstoffquelle anstelle von l2,83 % der durch die Hydrolyse von Kartoffel- stärkehydrolysat erhaltenen Zucker 1211/o Glucose benutzt wurden.
Die Konzentration des verwendeten Ammoniakwassers betrug 28%,. Die Ursache der Überlegenheit der Ammoniakgasmethode muss wahr scheinlich in dem Umstand gesucht werden, dass sie in einfacher Weise gestattet, dauernd das optimale pH in der Brühe aufrechtzuerhalten. Ausserdem steigt dieser Effekt mit der Erhöhung der benutzten Zucker konzentration, und diese Tatsache ist besonders wich tig für die Herstellung der Glutaminsäure im tech nischen Massstab.
Die Einführung des Ammoniak gases in das Züchtungsmedium kann einfach dadurch erfolgen, dass man das Gas der Luft beimischt, die man einleitet, um die Brühe unter aeroben Bedingun gen zu erhalten. Das Ammoniakgas wird auf diese Weise durch die Luft verdünnt, die für die aerobe Kultur notwendig ist, und infolgedessen wird der vorbestimmte pH-Bereich genau eingehalten.
Viele andere Versuche, welche zur Prüfung des vorliegenden Verfahrens ausgeführt wurden, führten zu dem Ergebnis, dass der bevorzugte pH-Bereich für das Züchtungsmedium zwischen 7,4 und 8,3 liegt und dass der optimale Bereich 7,6 bis 7,8@ beträgt, wie aus der Tabelle 8 hervorgeht.
Die Versuchsbedin gungen waren die gleichen wie in nachstehend ange gebenem Beispiel 3, nur mit dem Unterschied, dass anstelle von 10,3 % an Zucker, welche durch die Hydrolyse von Kartoffelstärke erhalten waren, 10% Glucose zugesetzt wurden.
EMI0005.0046
In einem typischen Beispiel, welches gemäss vor liegender Erfindung ausgeführt wurde und bei wel chem der pH-Wert innerhalb von 7,6-7,8 gehalten wurde, waren die Beziehungen zwischen dem Wachs tum der Zellen von Brevibacterium lactofermentus, der Anhäufung von L-Glutaminsäure und dem Ver brauch von Glucose wie folgt: Das Zellwachstum begann mit dem Einsetzen der Fermentation. Es stieg dann bis auf 0,75 bei Errei chung der Brutzeit von 20 Stunden an, und nach dieser Zeit blieb es auf derselben Höhe.
Der Ver brauch an Glucose zeigte nach etwa 5 Stunden einen plötzlichen Anstieg, der bis zu 25 Stunden anhielt und dann allmählich abfiel. Die Konzentration der Glucose, welche in dem Medium verblieb, betrug ungefähr 1,95 g/dl nach 25 Stunden und etwa 0,3 g/dl nach 30 Stunden. Die Menge an L-Glutaminsäure nahm nach ungefähr 13 Stunden plötzlich zu und stieg dann dauernd an. Die Konzentration von L-Glutaminsäure betrug nach 13 Stunden ungefähr 0,95 g/dl und nach 32 Stunden etwa 5,3 g/dl.
<I>Beispiel 1</I> Ein Kulturmedium, das 10 % chemisch reiner Glucose, 2 % Ammoniumsulfat, 200 y/1 Vitamin Bi, 4,0 y/1 Biotin, 0,
2 % einer Lösung von Aminosäuren (Hydrolysat von Sojabohnen, enthaltend 2,4 % Ge- samtstickstoff), 0,1% KH2P04, 0,04"/o MgS04 7 H20, 0,
001'% FeS04 und 0,0010/a MnS04 enthielt, wurde in einen Schüttelkolben eingefüllt, das pH auf 7,0 ein gestellt und während 10 Minuten bei 115 C sterili siert.
Dieses Medium wurde mit der Bakterienkultur auf Bouillonabstrich 24 Stunden lang mit Brevi- bacterium lactofermentus, Stamm Nr.2362, unter Zusatz von CaCO3, das vorher durch trockene Er hitzung sterilisiert worden war, bebrütet, indem man es bei 311C schüttelte.
Die Kultur wurde nach 40 Stunden unterbrochen, als die Fermentationsbrühe 3,13 g/dl an Glutaminsäure und 1,32 g/dl an verblei bender Glucose enthielt. -Das Verhältnis der ange häuften Menge an L-Glutaminsäure zu dem Zucker verbrauch betrug 36,10/0.
Nach Abtrennung der Bak terienzellen aus der Fermentationsbrühe wurde diese auf ungefähr 20% an Glutaminsäure eingeengt und mit Salzsäure versetzt, um das pH auf 3,
2 einzu- stellen. Man erhielt 83 % kristallisierter Glutamin- säure. <I>Beispiel 2</I> Ein Kulturmedium, welches 10 % chemisch reiner Glucose,
200 y/1 Vitamin B1, 4 y/1 Biotin, 0,2% einer Lösung von Aminosäuren (Hydrolysat von Soja- bohnen, enthaltend 2,4 % Gesamtstickstoff), 0,10/a KH2P04, 0,040/a M9S04 - 7H20, 0,
0010/a FeS04 enthielt und in eine Schüttelflasche eingefüllt war, wurde auf pH 6 eingestellt und 10 Minuten lang bei 115 C sterilisiert, worauf man 0,511o, sterilisierten Harnstoff zusetzte. Es wurde 24 Stunden lang mit einer Bakterienkultur auf Bouillonabstrich von Brevi- bacterium lactofermentus, Stamm Nr. 2256, bebrütet und bei 311C geschüttelt.
Nach 18 Stunden wurden 1,8 % Harnstoff zur Brühe zugesetzt und die Be- brütung wurde weitergeführt. Die Fermentation war nach 45 Stunden unterbrochen.
Die Konzentration der L-Glutaminsäure betrug 4,83 g/dl und die Ausbeute war 49,7 %, berechnet auf die Menge der verbrauch- ten Glucose.<I>Beispiel 3</I> Ein Kulturmedium, welches 10,
3 % an Zucker aus der Hydrolyse von Kartoffelstärke, 100 y/1 an Vitamin B1, 3,5 y/1 Biotin, 0,20/G der vorgenannten Säurelösung, 0,1% KH2P04, 0,04 % MgS04 ' 7 H20, 0,001% FeS04 und 0,
001% MnS04 enthielt, wurde in einen Fermentationskolben aus rostfreiem Stahl mit 20 Liter Inhalt eingefüllt, mit Ammoniak neutra lisiert und durch Dampfeinleitung sterilisiert. Es wurde mit<B>5019</B> einer flüssigen Kultur von Brevi- bacterium lactofermentus, Stamm Nr.
2362, bebrütet, der aus einem Kulturmedium erhalten worden war, das 511/o Glucose, 0,8,1/a Harnstoff, 100 y/1 Vitamin B1, 3 y/1 Biotin, 0,2 % der vorgenannten Aminosäure- lösung und die vorgenannten anorganischen Salze ent hielt,
und einer aeroben Kultur unter den Bedingun gen einer Rührung von 600 Umdrehungen pro Mi nute, einem Luftzufluss von 1!4 Volumen der Kultur flüssigkeit pro Minute bei einer Temperatur von 31 C ausgesetzt war. In die Kulturflüssigkeit wurden pH-Elektroden eingesetzt, um automatisch das pH- innerhalb des Bereiches von 7,6-7,8 aufrechtzuerhal ten.
Wenn das pH unter 7,6 sank, fand die Einführung von NH3 Gas in die Kulturflüssigkeit automatisch statt, während, wenn das pH über 7,8 anstieg, die Zufuhr von NH.- Gas automatisch abgestellt wurde. Die Schaumbildung an der Oberfläche der Kultur flüssigkeit wurde durch Zusatz von Siliconharz unter drückt. Die Fermentation war nach 32 Stunden be- endet, die Konzentration an L-Glutaminsäure erreichte 5,03 g/dl und die Ausbeute betrug 50,9 0/0.
<I>Beispiel 4</I> Ein Kulturmedium, welches<B>12,83</B> 0/a Zucker aus der Hydrolyse von Kartoffelstärke, 200 y/1 Vitamin B1, 3,5 y/1 Biotin, 0,2 % der vorgenannten Amino- säurelösung, 0,1 % KH2P04, 0,04"/o M9S04 ' 7H20, 0,
0010/a FeS04 und 0,001% MnS04 enthielt, wurde vorbereitet. 25 Liter dieses Kulturmediums wurden in einen Fermentationskolben aus rostfreiem Stahl mit 40 Liter Inhalt eingefüllt, mit Ammoniak neutrali- siert und durch Dampf sterilisiert.
Es wurde mit 5 0/0 einer flüssigen Kultur von Brevibacterium lactofer- mentus, Stamm Nr.2256, bebrütet, welche dieselbe Zusammensetzung wie in Beispiel 3 hatte und dann der aeroben Bebrütung unter Rühren bei 335 Um drehungen pro Minute, einer Luftzufuhr von 1/. Vo lumen der Kulturflüssigkeit pro Minute und einer Temperatur von 311 C ausgesetzt. Die Regelung des pH und die Einführung des NH Gases wurden auto matisch in derselben Weise durchgeführt,
wie es in Beispiel 3 angegeben ist, und das pH der Kultur flüssigkeit wurde im Bereich von 7,6-7,8 aufrecht erhalten. Die aerobe Fermentation war nach 38 Stun den beendet. Die Konzentration an L-Glutaminsäure zu dieser Zeit betrug 6,43 g/dl und die Ausbeute war 49,6%.