CH368266A - Verfahren zur biologischen Herstellung von Dextranen, insbesondere für klinische Zwecke - Google Patents

Description

  Verfahren zur biologischen Herstellung von     Dextranen,    insbesondere für     klinische    Zwecke    Die Erfindung hat die Herstellung von     Dextranen     mit weitgehend einheitlichem     Molekulargewicht,    ins  besondere für klinische Zwecke, durch eine mikro  biologische Synthese zum Ziel.  



  Neben der allgemeinen bekannten Bedeutung der  Blutkonserven gewinnen künstlich hergestellte Lö  sungen, deren     osmotische    und/oder physiologische  Eigenschaften so geartet sind, dass sie im     Zusammen-          hang    mit der noch vorhandenen Kreislaufflüssigkeit  keine physiologischen Schäden anrichten, zuneh  mendes Interesse. Derartige     Plasma-Expander,    z. B.       isotonische    Lösungen des     Polyvinylpyrrolidons    und  des     Dextrans,    werden heute     vielfach    verwendet.  



  Besonders bei der Herstellung des     Dextrans,    wel  ches durch     Einwirkung    der     Dextransucrase    aus       Saccharose    entsteht, ergibt sich dieses bekannter  massen in polymolekularem Zustand, wobei das       Molekularverteilungsverhältnis    solche Formen auf  weist, dass nur ein geringer     Anteil    desselben     klinisch     verwendet werden kann.

   Bekannt     sind        verschiedene     Vorschläge, um durch hydrolytische     Depolymerisa-          tion    im sauren     oder        alkalischen    Medium bzw. durch  mechanische     Einwirkungen    (Ultraschall) und andere       Einflussnahmen    den klinisch verwendbaren Anteil zu  erhöhen. Allen Vorschlägen gemeinsam ist eine un  befriedigende Ausbeute in bezug auf die     klinisch    ver  wendbaren Anteile und eine schwierige und auf  wendige Verfahrensweise.  



  Neuerdings versuchte man, diese Mängel dadurch  zu beseitigen, dass von geeigneten Mikroorganismen  in     vitro    eine möglichst reine     Dextransucrase    gewon  nen wird, die als Katalysator in einer mit niedrig  molekularem     Dextran    als     Starterreagenz        gelenkten          Polymerisation    eine     Saccharoselösung    unter geeigne  ten Bedingungen umwandelt.

   Zwar konnte gegenüber  den älteren Arbeitsweisen eine     Ausbeutevermehrung     erzielt werden, jedoch ist die Herstellung     einer    als  Katalysator für die     Polymerisation        einwandfrei    ver-    wendungsfähigen     Dextransucraselösung    eine bedeu  tende Erschwerung.  



  Die technologischen Schwierigkeiten zur Gewin  nung aktiver     Dextransucraselösungen    versuchte man  dadurch zu umgehen, dass eine     Lenkung    der     Synthese     direkt in der Kulturlösung     vorgenommen    wird.  



  Die durch die     normalen        saccharosehaltigen        Impf-          lösungen    eingeschleusten hochmolekularen     Dextrane     stören jedoch die Wirkung der     künstlich    angesetzten  Starter so empfindlich,     dass    nur     ein    Teil des gebildeten       Dextrans    in dem gewünschten     Molekularbereioh        liegt.     



  Die     vorliegende        Erfindung        vermeidet        alle    bisher  erwähnten Nachteile und führt zu hohen Aus  beuten an     klinisch        direkt        verwendbaren        Dextranen.     Das     erfindungsgemässe    Verfahren zur     Herstellung     von     Dextranen        mit    weitgehend     einheitlichem        Mole-          kulargewicht,    insbesondere für     klinische    Zwecke,

    durch eine gelenkte biologische Synthese, insbeson  dere     mit    aktiven Stämmen von     Leucono.stoc        mesente-          roides,    ist nun dadurch gekennzeichnet, dass für die       Gewinnung    der     Impfkulturen    als     Kohlenstoffquelle          in    der Nährlösung nur solche     organische    Verbindun  gen     Verwendung    finden, welche eine hohe     Virulenz     und ein     optimales        Dextranbildungsvermögen    der       Bakterien    gewährleisten,

   ohne selbst als Starter für  die     Dextransynthese    zu dienen oder unter dem Ein  fluss des     Fermentsystems    Starter zu bilden, und dass  diese Impfkultur auf     saccharosehaltige        Synthese-Nähr-          lösung    mit oder     ohne        Starterzusatz        überimpft    und  die Lösung fermentiert wird.  



  Als für die Entwicklung des     Leuconostocs          mesenteroides    notwendige     Kohlenstoffquellen    dürfen  im Sinne des beanspruchten Verfahrens nur solche       organische        Kohlenstoffquellen    verwendet werden,     die     sich nicht toxisch auf die     Bakterien        auswirken    und  die auch nach     mehrmaligen    Passagen der Bakterien  über derartige Kulturböden oder     -lösungen    die Be  reitschaft     für    die Bildung des     Enzyms    Dextran-           suerase    erhalten.

   Als derartige     Kohlenstoffquellen          -ignen    sich besonders solche     organische    Verbindun  gen, die dem Stoffwechsel des gewählten     Bakterien-          stammes    nahestehen, wie organische Säuren - hier  sind besonders die des     Zitronensäurezyklus    und die       -rsten    Glieder der flüchtigen Fettsäuren zu nennen   und die niederen Alkohole, wie Äthanol,     Propanol     und     Butanol.     



  Als     Kohlenstoffquellen,    die in der Impflösung  nicht vorkommen dürfen, sind solche zu verstehen,  die     entweder    selbst als Starter wirken können, wie  besonders die Zucker der     Matose,    und     Isomaltose-          reihe,    und solche, die unter dem     Einfluss    des Ferment  systems     starterwirksame    Verbindungen bilden kön  nen, wie besonders     Saccharose.     



  Zucker mit geringer     Starterwirkung,    wie Glukose  und besonders Fructose, können die     Virulenz    der       Bakterienstämme        beträchtlich    heben. Um einen  merkbaren     Einfluss    auf die     Dextransynthese    hinsicht  lich eines gewünschten     Molekulargewichtes    zu ver  meiden, muss ihre Konzentration jedoch geringer     ge-          halten        werden,

          das        heisst        nicht        grösser        als        0,5        %.     



  Damit die Impflösung tatsächlich frei von Sub  stanzen     mit    direkter oder indirekter     Starterwirkung     ist, müssen einige oder mehrere Passagen     über    Nähr  böden mit geeigneter, oben näher angeführter Kohlen  stoffquelle gemacht werden.  



  Somit     erfüllt    also eine solche Impflösung drei  wesentliche Bedingungen: Sie ist     starterfrei    und er  möglicht eine     virulente    Bakterienpopulation bei un  geschwächtem     Dextranbildungsvermögen.        überimpft     man derartige     Impflösungen    auf die eigentliche,  übliche zusammengesetzte Syntheselösung, der eine       bestimmte,    vorher berechnete Menge Starter zugesetzt  wird, so wird<I>eine</I> störungsfrei verlaufende gelenkte  Synthese des     Dextrans    erreicht,

   die überraschender  weise einer enzymatischen gelenkten Synthese hin  sichtlich der Ausbeuten des gewünschten Produktes       beträchtlich    überlegen ist. Zudem ist das Verfahren  robust und einfach und     ermöglicht    eine technologische  Anwendung mit einfachen     Mitteln.     



  Gegenüber dem     herkömmlichen    hydrolytischen  Verfahren zur Gewinnung des klinischen     Dextrans     weist das     erfindungsgemässe    Verfahren der gelenkten  Synthese wesentliche     Fortschritte    auf.

   Der nicht  steuerbare und somit verlustreiche Abschnitt der  Hydrolyse sowie die aufwendige,     mehrfache        Fraktio-          nierung        entfallen.    Das     erfindungsgemäss    hergestellte       Dextran        liegt    bereits nach der Fermentation im ge  wünschten     Molekularbereich    mit enger     Verteilung    vor.

    Gegenüber der Gewinnung von klinischem     Dextran     mit einer möglichst weitgehend gereinigten und ange  reicherten Enzymlösung nach dem Prinzip der gelenk  ten Synthese weist das hier beschriebene Verfahren  den     Vorteil    auf, dass die Lenkung direkt in der  Kulturlösung ohne technologisch aufwendige     Mass-          nahmen    vor sich geht, wie Abtrennung und Anrei  cherung des Enzymsystems.  



  Nach J. A.     Wolff    und Mitarbeitern,     Ind.    Eng.       Chem.,    46 S. 2605 (l954), liegt die Ausbeute an kli-         nischem        Dextran    nach dem     hydrolytischen        Verfah-          ren        zwischen        14        und        30        %        des        eingesetzten.        Nach     dem vorliegenden Verfahren liegen die Ausbeuten       zwischen        60    

      und        70        %.        Die        erfindungsgemäss        durch-          geführte    gelenkte Synthese weist einen weiteren Vor  teil auf. Die Lenkung erfolgt reproduzierbar. In der  nachfolgenden Tabelle sind die Ergebnisse von zwan  zig     aufeinanderfolgenden    Synthesen aufgeführt. Die  Abweichungen sind unbedeutend und liegen grössten  teils innerhalb der Fehlergrenzen der     viskosime-          trischen        Molekulargewichtsbestimmung.     



  Das     Molekulargewicht    wurde nicht durch Frak  tionierung korrigiert.  
EMI0002.0097     
  
    Charge <SEP> Molekulargewicht
<tb>  91 <SEP> <B>65000</B>
<tb>  92 <SEP> <B>76000</B>
<tb>  93 <SEP> <B>72000</B>
<tb>  94 <SEP> 74000
<tb>  95 <SEP> <B>78000</B>
<tb>  96 <SEP> <B>77000</B>
<tb>  97 <SEP> <B>76000</B>
<tb>  98 <SEP> <B>75000</B>
<tb>  99 <SEP> 81000
<tb>  100 <SEP> <B>77000</B>
<tb>  101 <SEP> <B>75000</B>
<tb>  102 <SEP> <B>78000</B>
<tb>  103 <SEP> 81000
<tb>  104 <SEP> <B>78000</B>
<tb>  105 <SEP> <B>80000</B>
<tb>  106 <SEP> <B>75000</B>
<tb>  107 <SEP> <B>77000</B>
<tb>  108 <SEP> <B>76000</B>
<tb>  109 <SEP> <B>63000</B>
<tb>  110 <SEP> <B>75000</B>       <I>Beispiel 1</I>    Von einem mit     Leuconostoc        mesenteroides        be-       <RTI  

   ID="0002.0101">   wachsenen        Agar-Nährboden        (5        %        Saccharose;        0,5        %          NazHP04    -     12H.,0;        0,1%        KCI;        0,1        %        Pepton;        10/0          Hefeautolysat;    3     %        Agar;

          aqua        dest.        auf        100;        pH        7,0     mit     KOH    eingestellt) wird eine Öse Schleim einer  Kulturlösung (Nährlösung 1) folgender Zusammen  setzung     zugeimpft:

       
EMI0002.0127     
  
    <I>Nährlösung <SEP> 1</I>
<tb>  10/a <SEP> Zitronensäure
<tb>  <B>0,5119</B> <SEP> Na..,HP04 <SEP> ' <SEP> 12H,0
<tb>  0,10/a <SEP> KCI.
<tb>  0,1% <SEP> Pepton
<tb>  1,01/o <SEP> Hefeautolysat
<tb>  pH <SEP> 7
<tb>  aqua <SEP> dest. <SEP> auf <SEP> 100       Nach Erreichen der maximalen Trübung wird  von dieser Kulturlösung ein bestimmter Anteil, ein  Zehntel des Volumens einer Kulturlösung, Zusam  mensetzung wie Nährlösung I,     überimpft.     



  Nach Erreichung der maximalen Trübung wird  hiervon wieder im Verhältnis 1 : 10 in eine Kultur  lösung,     Zusammensetzung    wie Nährlösung I, über  impft. Diese Kulturlösung stellt nach Erreichen der      maximalen Trübung die Impflösung dar, die     jetzt     frei von     Dextran    und Zuckern ist.  



  Sie wird     im    Verhältnis 1:10 einer Synthese  lösung folgender Zusammensetzung     zugeimpft:     
EMI0003.0005     
  
    100/a <SEP> Saccharose
<tb>  2% <SEP> Starter-Dextran,
<tb>  Molekulargewicht <SEP> 20 <SEP> 000
<tb>  Salze <SEP> und <SEP> Eiweisse <SEP> wie <SEP> Nährlösung <SEP> I
<tb>  PH <SEP> 7
<tb>  aqua <SEP> lest. <SEP> auf <SEP> 100       Nach Absinken des     pH-Wertes    auf 3,9 ist die  Synthese beendet.

   Nach bekannten     Methoden    wird       das        Dextran        aufgearbeitet.        Ausbeute:        85        %;        mittleres          Molekulargewicht:    60 000.  



  <I>Beispiel 2</I>  Eine Öse     Schleim    von einer     Leuconostoo-dextra-          nicum-Kultur    wird auf einen Nährboden, der auf dem  Boden eines     Standkolbens    ausgegossen ist und fol  gende Zusammensetzung     besitzt,    ausgestrichen:  
EMI0003.0021     
  
    3,00/a <SEP> Agar
<tb>  0,5 <SEP> % <SEP> Fructose
<tb>  Salze <SEP> und <SEP> Eiweisse <SEP> wie <SEP> Nährlösung <SEP> I       Nach kräftiger Entwicklung des Kolonien wird  mit einer Nährlösung folgender     Zusammensetzung     aufgefüllt:

    
EMI0003.0023     
  
    0,5 <SEP> % <SEP> Propanol
<tb>  Salze <SEP> und <SEP> Eiweisse <SEP> wie <SEP> Nährlösung <SEP> 1
<tb>  pH <SEP> 7
<tb>  aqua <SEP> dest. <SEP> auf <SEP> 100       Nach Erreichung der     maximalen        Trübung    wird  im Verhältnis 1:10 einer Kulturlösung folgender  Zusammensetzung     überimpft:

       
EMI0003.0027     
  
    1,5% <SEP> Propionsäure
<tb>  Salze <SEP> und <SEP> Eiweissanteile <SEP> wie <SEP> I
<tb>  pH <SEP> 7
<tb>  aqua <SEP> dest. <SEP> auf <SEP> 100       Nach Erreichung der maximalen     Trübung    stellt  diese Kulturlösung die Impflösung für die Synthese  lösung dar, die analog dem     Beispiel    1 zusammen  gesetzt sein kann und nach Beendigung der     Dextran-          synthese    in üblicher Weise aufgearbeitet wird.  



  Die hier genannten     Kohlenstoffquellen    (Zitronen  säure, Fructose,     Propanol,        Propionsäure)    können  durch andere geeignete ersetzt werden, wie Äthanol,  Essigsäure, Weinsäure und Milchsäure. Die Zahl der  Passagen über Kulturlösungen mit     Kohlenstoffquellen     ohne     Akzeptorwirkung    oder nur geringe     Akzepto        -          wirkung    (Fructose) kann zwischen 2 und 6 liegen.  Sie     hängt    ab von dem durch die Passagen erreichten  Reinigungsgrad von     Dextran    und Zucker.

   Die ge  ringe     Akzeptorwirkung    der Fructose lässt es zweck  mässig erscheinen, diese nicht am Ende einer Passa  genreihe als     Kohlenstoffquelle    zu verwenden.  



  Die     Lenkung    der Synthese erfolgt nach den     Ge-          setzmässigkeiten    der     Polymerisationskinetik.    Mole  kulargewicht und Zahl der     Startermoleküle    sowie  Zahl der     Saccharosemoleküle    ergeben das Molekular  gewicht des zu erzielenden     Dextrans,    wobei die Aus-    beute, mit anderen Worten die effektiv für die       Dextransynthese    umgesetzten     Glukosyle    der     Saccha-          rose,        berücksichtigt    werden müssen.

   Wenn die Len  kung auf ein     Molekulargewicht    von 40000 erfolgen  soll, kann die Syntheselösung neben     Salzen    und     Ei-          weissanteilen        20        %        Saccharose,        2,5        %        Starterdextran          (Molekulargewicht   <B>10000)

  </B>     enthalten.    Die Ausbeute       der        Fermentation        beträgt        im        Durchschnitt        80%        der     Theorie     (Molekulargewicht    40000).

   Bei     einer    Len  kung auf ein     Molekulargewicht    von<B>75000</B> kann die       Syntheselösung        20        %        Saccharose        und        20/0        Starter-          dextran        (Molekulargewicht   <B>25000)</B> enthalten. Die  Ausbeute der Fermentation beträgt im     Durchschnitt          90%        (Molekulargewicht        75000).     



  Bei einer     Lenkung    auf ein     Molekulargewicht    von       300000        kann        die        Syntheselösung        10%        Saccharose,          1,3        %        Starterdextran        (Molekulargewicht        75        000)        ent-          halten.    Die Ausbeute der Fermentation beträgt im  Durchschnitt 75 0/0     (Molekulargewicht    300 000).  



  Auch für die     Herstellung    von     Dextran    mit einem  maximalen     Polymerisationsgrad    ist die     Methode    der       überimpfung    mit     akzeptorfreier        Impflösung    geeignet,  da sich hier durch das Fehlen     niedermolekularer     Starter     (insbesondere    Zucker) im     wesentlichen    nur  hochmolekulare Anteile     entwickeln    können.

       Wenn     die Lenkung auf ein     höchstmögliches    Molekular  gewicht     erfolgen    soll, enthält die     Nährlösung        lediglich          Saccharose,        möglichst        unter        10'0/0,        etwa        7,

  5        %.        Die     Ausbeute der Fermentation beträgt im     Durchschnitt          90        %        an        hochmolekularem        Dextran.  

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von Dextranen mit weitgehend einheitlichem Molekulargewicht, insbe sondere für klinische Zwecke, durch eine gelenkte biologische Synthese, insbesondere mit aktiven Stäm men von Leuconostoc mesenteroides, dadurch ge kennzeichnet, dass für die Gewinnung der Impfkultu ren als Kohlenstoffquelle in der Nährlösung nur solche organische Verbindungen Verwendung finden,

   welche eine hohe Virulenz und ein optimales Dextr'an- bildungsvermögen der Bakterien gewährleisten, ohne selbst als Starter für die Dextransynthese zu dienen oder unter dem Einfluss des Fermentsystems Starter zu bilden,

   und dass diese Impfkultur auf saccharose- haltige Synthese-Nährlösung mit oder ohne Starter zusatz überimpft und die Lösung fermentiert wird. UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass als Kohlenstoffquelle eine wasser lösliche organische Säure oder ein niedermolekularer aliphatischer Alkohol verwendet wird. 2.

   Verfahren nach Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als organische Säure eine niedere Fettsäure oder eine Di- bzw. Tricarbonsäure ver wendet wird.