CH369547A - Verfahren zur Herstellung von Bakteriophagenpräparaten in trockener, fester Form - Google Patents

Description

  
 



  Verfahren zur Herstellung von Bakteriophagenpräparaten in trockener, fester Form
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung therapeutischer Bakteriophagenpräparate in trockener, fester Form.



   Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist also ein Verfahren zur Herstellung verlässlicher und wirksamer Präparate für die Therapie und Prophylaxis der infektiösen Erkrankungen, die von verschiedenen Arten von pathogenen Mikroorganismen, z. B. allen Arten der Dysenterie-, Typhus-, Paratyphusmikroben und anderer Salmonella-Arten, Vibrio cholerae, E. coli und coli 111 B4, 55 B5 und 26 B6, Staphylokokken, Proteus und dergleichen, hervorgerufen werden.



   Der Kampf gegen diese Mikroben wurde bisher durch Anwendung von Chemotherapeutica und Antibiotica geführt, die aber jetzt, hauptsächlich in den chronischen Fällen oder bei den Bazillenträgern, als nicht genügend wirksam betrachtet werden.



   Die Phagotherapie zeigt sich aber demgegenüber als besonders geeigneter Weg für diese Fälle, und die nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Präparate lösen wirksam alle Probleme in vollem Umfang.



   Über die Art der Herstellung von getrockneten und gereinigten therapeutischen Bakteriophagen mittels Tiefkultivation in geeigneter Arzneiform wurden in der Fachliteratur bisher keine Belege gefunden.



   Bisher sind therapeutische Bakteriophagenpräparate im Oberflächenverfahren in flüssigen Nährböden gewonnen worden, wobei sich eine flüssige Arzneiform ergab. Dieses Herstellungsverfahren befriedigt aber für therapeutische Zwecke aus folgenden Gründen nicht:
1. schwierige Herstellung einer grösseren Menge in kurzer Zeit;
2. niedriger Titer der Bakteriophagen und ge ringe Wirksamkeit im Organismus;
3. ungeeignete Arzneiform des flüssigen Präpa rates;
4. leichte Entwertung durch Kontamination mit tels einer fremden mikrobiellen Flora;
5. Unstabilität des Präparates und zeitliche Be grenzung der Wirkung;
6. schwierige Dosierung des Präparates.



   Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man den Bakteriophagen im Submers-Verfahren auf eine dem Bakteriophagen entsprechende Bakterienkultursuspension einwirken lässt und nach erfolgter Phagolyse die Kultursuspension milde erwärmt, inaktiviert und filtriert, aus dem Filtrat das Bakteriophagenmaterial mittels eines anorganischen Salzes ausfällt und den Niederschlag abtrennt und trocknet.



   Das erfindungsgemässe Verfahren ermöglicht bedeutende wirtschaftliche Ersparnisse an Material, Zeit und Arbeit. Die Präparate weisen hohe Wirksamkeit (bis dreifachen bisher herstellbaren Titer) und Stabilität auf. Durch die Anwendung der Präparate wird die Dauer der Krankheit und der Rekonvaleszenz ungefähr um 75   zur    verkürzt. Die Präparate übertreffen in ihrem therapeutischen Effekt die Antibiotica und Chemotherapeutica, wobei sie die Nachteile dieser Arzneimittel nicht aufweisen. Sie erfüllen nach den bisherigen epidemiologischen Erfahrungen alle Vor  aussetzungen    für eine wirksame Phagotherapie der epidemischen Krankheiten des Menschen.



   Als Beispiel sei die Behandlung einer Dysenterieepidemie, Typus Sonne, erwähnt:  
Therapie durch    Bakterio- Chlor- Chemo-    phagen amphenicol   therapeutica    Zahl der Behandelten 27 24 16 Negativ in 24 Stunden 21 19  Negativ in 48 Stunden   6 - -   
Mit Bakteriophagen zu
Ende behandelt
Bei der Herstellung der erfindungsgemässen Präparate geht man zweckmässig wie folgt vor: Die Tiefkultivation der ausgewählten bakteriellen Stämme wird aus flüssigen Nährböden durchgeführt, die in einer besonderen Kultivierungsapparatur mittels Sauerstoff, eines Gemisches von Sauerstoff und Luft oder Luft durchlüftet und unter sterilen Bedingungen gemischt werden. Die Subkulturen der bakteriellen Stämme in dem flüssigen Boden werden in die Kultivierungstanke übertragen, wo die Vermehrung der bakteriellen Suspension vor sich geht.

   Die Zeitdauer dieser Vermehrung ist für jede Bakterienart spezifisch, sonst kann die eigene Kultivation den technologischen Bedingungen angepasst werden. Der vermehrten bakteriellen Suspension wird der spezifische Bakteriophage in einer seinem Titer entsprechenden Menge beigemengt. Der folgende lytische Prozess verläuft unter ähnlichen Bedingungen wie die vorgängige Vermehrung der mikrobiellen Biomasse. Das Ende des lytischen Prozesses ist von einer Erniedrigung der Mikrobenzahl der Biomasse und von einem Klarwerden des Kultivierungsmediums begleitet, welches nach dem Inaktivieren und Filtrieren erst mittels eines geeigneten anorganischen Salzes, z. B. Ammoniumsulfat, durch Ausfällen konzentriert wird. Dieses Konzentrat wird dann im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet.



   Das getrocknete Gemisch kann in eine geeignete Arzneiform übergeführt werden. Es kann z. B. unter Zusatz von Füllmitteln tablettiert und die Tabletten können mit einer säurefesten Schicht überzogen werden, oder das getrocknete Gemisch kann in säurefeste Kapseln eingefüllt werden. Für eine eventuelle parentrale Anwendung kann das Konzentrat ausgesalzen und lyophilisiert werden.



   Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Bakteriophagenpräparate in trockener, fester Form zeichnen sich durch eine hohe, spezifische und schnelle Wirkung im Organismus aus. Sie rufen keine unerwünschten klinischen Nebenwirkungen hervor und vernichten die nützliche Darmflora nicht; sie verursachen auch keine Entwicklung resistenter Stämme. Die Präparate bewahren ihre biologische Aktivität lange Zeit.



   Einen grossen Vorteil für die behandelten Kranken stellt die mühelose und bequeme Applikation und Dosierung ohne die Notwendigkeit einer strengen ärztlichen Kontrolle dar.



   Die getrockneten Bakteriophagenpräparate können jederzeit zur weiteren Kultivation verwendet werden.



   Beispiel
Herstellung des dysenterischen Bakteriophagen, Stamm Sonne:
In einem Kultivierungstank werden 8000 ml eines sterilen Nährbodens (pH 7,6) 350-400 ml einer Suspension des dysenterischen Stammes Sonne beigemengt, der statisch in einem flüssigen Boden durch Sstündige Kultivation bei   37)    C vermehrt worden ist. Es wird bei   37 C    unter Rührung und Lüftung kultiviert. Die Kontrollmuster werden 90 bis 120 Minuten nach der Inokulierung abgenommen.



  Bei den Mustern wird der pH-Wert gemessen und gegebenenfalls auf 7,6 eingestellt. Nach 3stündiger Kultivation, bei einer Mikrobenzahl von ungefähr 2,5 Milliarden/ml, werden 400-500 ml des spezifischen Dysenteriephagen Typus Sonne zugegeben, der durch statische oder submerse Phagolyse des Stammes Sonne auf dem flüssigen Boden gewonnen worden ist.



  Die Phagolyse wird in 2stündigen Intervallen bewertet. Das Ende der Phagolyse wird einerseits visuell auf Grund des Klarwerdens des Kultivierungsmediums, anderseits auf Grund der Erniedrigung der Mikrobenzahl in 1 ml und schliesslich durch die biochemische Verfolgung des Stickstoffgehaltes in 1 ml bestimmt. Dann wird die Bakteriophagenkultur unter aseptischen Bedingungen aus dem Tank abgelassen, in einem Wasserbad bei 560 C inaktiviert und mittels eines Seitzfilters filtriert. Es wird der Wirkungstest des nativen Bakteriophagen nach der staatlichen Vorschrift durchgeführt. Dieses Filtrat wird konzentriert und gereinigt, auf   0O C    abgekühlt und durch Zugabe von festem Ammoniumsulfat bis zur vollkommenen Sättigung gefällt. Der pH-Wert wird mit 4n Salzsäure auf 6,9 eingestellt, und das Ganze wird im   Kühlraum über Nacht bei 4 C stehengelassen.

   Der    entstandene Niederschlag wird bei niedriger Temperatur zentrifugiert oder abfiltriert. Zu dem Nieder   schlag werden 10 10ovo seines feuchten Gewichtes Cal-    ciumglukonat gegeben, und das Gemisch wird im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet. Die trokkene Masse wird mit Füllmitteln tablettiert und mit einer säurefesten Schicht überzogen oder wird in säurefeste Kapseln eingefüllt. Die optimale Menge des Bakteriophagen, der in einer Tablette enthalten ist, wird für jede einzelne Charge durch Titration bestimmt. Je nach der Menge des Bakteriophagen  pro Tablette ist es möglich, die Anwendungsdosis zu regeln.



   Ganz analog kann man auch die spezifischen Bakteriophagen anderer Mikrobenarten, wie z. B. der Typhus-, Paratyphus- und übrigen Salmonella, Vibrio cholerae, E. coli und coli 111 Be, 55 B5 und 26 B6, Staphylokokken, Proteus und dergleichen, kultivieren und verarbeiten.   

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung therapeutischer Bakteriophagenpräparate in trockener, fester Form, dadurch gekennzeichnet, dass man den Bakteriophagen im Submersverfahren auf eine dem Bakteriophagen entsprechende Bakterienkultursuspension einwirken lässt und nach erfolgter Phagolyse die Kultursuspension milde erwärmt, inaktiviert und filtriert, aus dem Filtrat das Bakteriophagenmaterial mittels eines anorganischen Salzes ausfällt und den Niederschlag abtrennt und trocknet.

   UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man als anorganisches Salz Ammoniumsulfat verwendet.

   2. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man das Fällen bei niedriger Temperatur durchführt.

   3. Verfahren nach Patentanspruch und Unteranspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man das Fällen bei OG C durchführt.

   4. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man das getrocknete Bakteriophagenmaterial mit Calciumglukonat vermischt.