Verfahren zur Herstellung von Vaccinen zur oralen Verabreichung an Haustiere
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Vaccinen, die auf oralem Wege am Haustier verabreicht werden können.
Es ist bekannt, Vaccine herzustellen, die gegen über Krankheiten, welche durch gewisse Microorganismen verursacht sind, einen bestimmten Grad von Immunität zu erzeugen vermögen, indem man die Wirksamkeit der die Infektion verursachenden Organismen vermindert oder ihre Virulenz herabsetzt.
Zum Beispiel wird die Bazillus Calmette-Guerin- Vaccine, welche zur Erzeugung erhöhter Widerstandsfähigkeit gegen Tuberkulose verwendet wird, aus Kulturen lebende. r Bazillen hergestellt, deren Wirksarn- keit geschwächt worden ist, und die Gelbfieber Vaccine ist ein Beispiel einer Vaccine, welche aus einem in seiner Wirksamkeit geschwächten Virus hergestellt wurde. Bis heute war es indessen noch nicht möglich, Vaccine herzustellen, welche einen gewissen Immunitätsgrad gegenüber solchen Krankheiten verleiht, welche durch vielzellige Parasiten bewirkt werden.
Derartige Krankheiten sind an Haustieren schwierig zu heilen und besitzen erhebliche ökonomische Auswirkungen, nicht nur deswegen, weil die infiszierten Tiere verloren sind, sondern auch wegen der Notwendigkeit der Desinfektion des von solchen Tieren begangenen Landes
Die vorliegende Erfindung setzt sich zum Ziel, Vaccine herzustellen, die zur oralen Verabreichung an Haustiere geeignet sind und diesen Tieren einen gewissen Grad von Immunität gegen solche Krankheiten verleihen, welche durch vielzellige Endoparasiten bewirkt werden, wobei diese Parasiten eine Wanderlarvenform oder -formen haben.
Das Verfahren nach der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass ein fur Haustiere pathogener, vielzelliger Endoparasit aus der Gruppe der Nematoden, Trematoden und Cesteden in Form seiner Eier oder im Stadium oder Vorstadium seiner Wander larven einer ionisierenden Strahlung unter solchen Bedingungen ausgesetzt wird, dass seine Wirksamkeit vermindert wird.
Die bestrahlten Organismen können in einem wässrigen Mittel, wie z. B. in physiologischer Salzlösung, suspendiert werden und hierauf als Vaccine Verwendung finden.
Vorzugsweise verwendet man als ionisierende Strahlen Röntgenstrahlen. Indessen können auch andere Quellen ionisierender Strahlen Anwendung finden, wie z. B. Kobalt 60. Der vorzugsweise verwendete Parasit ist Dictyocaulus viviparus.
In gewissen Fällen mag es wünschbar sein, die Parasiten in einem Stadium ihres Lebenszyklus zu gewinnen, welches nicht der für die Bestrahlung geeignete Zustand ist. In diesem Falle kann man sie unter geeigneten Bedingungen lagern, bis sie zum gewünschten Stadium herangereicht sind.
Beispiel 1
Faeces von Kälbern, die mit Dictyocaulus viviparus infisziert sind und die Larven des Parasiten im ersten Stadium enthalten, werden gesammelt und 8 Tage lang in dünnen Lagen bei Zimmertemperatur in einer feuchten Atmosphäre gezüchtet. Die Larven hatten hierauf das dritte oder infektiöse Stadium erreicht und wurden von der Oberfläche der Träger mit Wasser abgewaschen. Die dabei erhaltene Suspension wurde durch ein Sieb von 20 Maschen auf den Zentimeter getrieben und hierauf bei 1500 Umdrehungen pro Minute 3 Minuten lang zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde abdekantiert und der Rückstand verdünnt, wobei sich eine Suspension ergab, die ungefähr 10000 Larven pro ml enthielt.
Diese Suspension wurde in eine Petrischale in einer Schichtdicke von 1 cm gegeben und der Strahlung eines Röntgenapparates ausgesetzt, wobei externe Filter, bestehend aus 0,25 ml Kupfer und 1,0 mm Aluminium verwendet wurden (Halbwertschicht 8 mm Aluminium: entsprechend ungefähr 200 Röntgen pro Minute). Die bestrahlte Suspension wurde hierauf mit Wasser verdünnt, bis 1 ml ungefähr 250 Larven enthielt.
Es erwies sich, dass ein Kalb, welchem eine Suspension von 1000 bis 4000 in ihrer Wirksamkeit verminderter Larven, hergestellt nach dem vorbeschriebenen Verfahren, auf oralem Wege verabreicht worden waren, in hohem Grade widerstandsfähig war gegen eine Dosis von bis zu 4000 infektiösen Dictio cauluslarven, dieses 50 bis 60 Tage nach der Verabreichung der Vaccine.
Beispiel 2
Beispiel 1 wurde nachgearbeitet, unter Weglassen der Kupfer- und Aluminiumfilter. Es ergaben sich dabei ähnliche Resultate wie in Beispiel 1.
Beispiel 3
Faeces von Rindern oder Schafen, welche mit Nematodirusarten infisziert waren und die die Eier solcher Arten enthielten, wurden angefeuchtet und mit Tierkohle vermischt. Diese Kultur wurde in einer feuchten Atmosphäre aufbewahrt, bis die Entwicklung der infektiösen Larven Platz gegriffen hatte, worauf letztere abgetrennt und mit Röntgenstrahlen, wie in Beispiel 1, bestrahlt wurden, um den erwünschten Grad verminderter Wirksamkeit zu erzielen. Die bestrahlten Larven wurden in physiologischer Salzlösung aufge schlemmt.
Beispiel 4
Aus der Galle von Rindern oder Schafen wurden Eier von Fasciola hepatica gewonnen. Die aus diesen Eiern erhaltenen Miracidia wurden zur Infektion von Schnecken der Species Linnaea trunculata verwendet.
Die in der Folge von diesen Schnecken abgesonderten Cercarien wurden gesammelt und, wie in Beispiel 1, einer Bestrahlung mit Röntgenstrahlen unterworfen, um auf diese Weise den gewünschten Grad verminderter Wirksamkeit zu erreichen. Die vermindert wirksam gemachten Cercarien wurden anschliessend in physiologischer Salzlösung aufgeschlemmt.
Beispiel 5
Uteri weiblicher Ascaris lumbricoides wurden eingeweicht und das Produkt mit gesättigter Sacharoselösung vermischt. Die an der Oberfläche schwim menden Eier wurden abgenommen und in 2 0/obiger, wässriger Lösung von Formalin suspendiert und hierauf 45 Tage lang bei einer Temperatur von 30O C inkubiert. Die Eier wurden hierauf, wie in Beispiel 1, Röntgenstrahlen-exponiert und schliesslich in Wasser für orale Verabreichung suspendiert.
Beispiel 6
Faeces von Kälbern, die mit Dictyocaulus viviparus infisziert worden waren und die Larven im ersten Stadium enthielten, wurden gesammelt und 8 Tage lang in dünnen Schichten bei Zimmertemperatur in einer feuchten Atmosphäre kultiviert. Die Larven hatten hierauf das dritte oder infektiöse Stadium erreicht und wurden von der Trägeroberfläche mit Wasser abgewaschen. Die derart erhaltene Suspension wurde durch ein Sieb von 20 Maschen je cm getrieben und anschliessend mit 1500 Umdrehungen pro Minute 3 Minuten lang zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde abdekantiert und der verbleibende Rückstand zu einer Suspension gelöst, welche ungefähr 10000 Larven pro ml enthielt. Diese Suspension wurde einer Strahlung von radioaktivem Kobalt 60 ausgesetzt, wobei die Bestrahlung so lange fortgesetzt wurde, bis eine Dosis von 40000 Röntgen erreicht war.
Die Suspension wurde hierauf mit Wasser verdünnt, bis jeder ml ungefähr 20Larven enthielt.
Beispiel 7
Schnecken, die mit Fasciola gigantica infisziert waren, wurden in einem Behälter untergebracht, welcher mit einem transparenten Cellulosepapier, verkauft unter der registrierten Handelsmarke Cello plan ausgekleidet war, worauf ein Stück Cellophan auf der Oberfläche des Wassers aufgebracht worden war. Von den Schnecken wurden Cercarien abgesondert und am Cellophan eingekapselt. Das Cellophan wurde hierauf entfernt und in einer dunklen, feuchten Atmosphäre während wenigen Tagen aufbewahrt, bis die Cercalien das infektiöse Stadium erreicht hatten.
Sie wurden hierauf der Strahlung eines Röntgenapparates ausgesetzt, bis sie eine Dosis von 5000 Röntgen erhalten hatten. Die bestrahlten Cercalien wurden in Wasser aufgeschlemmt, so dass jeder ml 10 Cercalien enthielt.
Beispiel 8
Kleine Teile gravider Segmente von Taenia saginata wurden in physiologischer Salzlösung untergebracht, um die Eier freizusetzen. Die Eier wurden gesammelt, indem man die Suspension durch ein feines Sieb passierte, welches die Eier durchliess, jedoch die anderen festen Anteile zurückhielt. Die derart erhaltene Suspension von Eiern wurde durch Zentrifugieren konzentriert. Die konzentrierte Suspension wurde der Strahlung eines Röntgenapparates ausgesetzt, bis sie eine Dosis von 60000 Röntgen erhalten hatten. Die Lösung wurde hierauf mit Wasser verdünnt, bis jeder ml ungefähr 20000 bestrahlte Eier enthielt. Das derart hergestellte Produkt war eine Vaccine, welche sich geeignet erwies zur Immunisierung von Hornvieh gegen Cysticercosis.
Beispiel 9
Faeces von mit Haemonchus contortus infiszierten Schafen wurden 14 Tage lang bei Zimmertemperatur aufbewahrt. Hierauf wurde zu den Faeces Wasser zugegeben und die Mischung 3 Stunden lang stehengelassen. Die in den Faeces vorhandenen Larven wanderten in das Wasser, welches abgetrennt und bei 1500 Umdrehungen pro Minute 3 Minuten lang zentrifugiert wurde. Die überstehende Flüssigkeit wurde abdekantiert und der Rückstand verdünnt, wobei sich eine Suspension ergab, welche ungefähr 10000 Larven pro ml enthielt. Die Larven wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, einer Röntgenbestrahlung ausgesetzt und die Suspension hierauf mit Wasser verdünnt.
Die gemäss Beispiel 1 erzeugte Vaccine wurde an mehr als 1000 Kälber verabreicht, ohne irgendeinen Krankheitseffekt zu beobachten. Die nachfolgend beschriebenen Experimente sollen dazu dienen, den Gebrauch der Vaccine und deren Vorteile näher zu erläutern:
Experiment I
In diesem Experiment wurden 45 parasitfrei aufgezogene Ayrshirekälber verwendet. 15 dieser Kälber dienten als Trägertiere, 15 anderen wurde die gemäss Beispiel 1 hergestellte Vaccine verabreicht und 15 weitere dienten zur Kontrolle, wobei jedoch 3 Tiere der letzteren Gruppe durch Unfall ausschieden. Von einer Untergruppe von 5 Trägertieren wurde jedem eine Dosis von 4000 infektiösen Dictyocaulus viviparus-Larven verabreicht, worauf die Tiere 35 Tage lang auf einer 1,2 Hektaren grossen Weide grasen gelassen wurden.
Durch Bestimmung der in den Faeces dieser Tiere vorhandenen Larven konnte ermittelt werden, dass eine minimale Larvenbevölkerung der Weide von 140 pro dm2 vorhanden sein musste. Der mit der Vaccine behandelten Gruppe von Tieren wurde eine Dosis der Vaccine verabreicht, welche 1000 in ihrer Wirksamkeit verminderte Larven enthielt, dieses 50 Tage, bevor die Tiere zum Grasen ausgelassen wurden. Die mit Vaccine behandelten Tiere, die Kontrolltiere und eine weitere Untergruppe von 10 Trägertieren, welche in derselben Weise wie die erste Untergruppe behandelt worden war, wurden gleichzeitig zum Grasen ausgelassen, 35 Tage, nachdem die erste Untergruppe von Trägertieren ausgelassen worden war. Zehn von den 12 Kontrolltieren starben an parasitischer Bronchitis zwischen dem 27. und 73. Tag, nachdem sie auf die infiszierte Weide gelassen worden waren.
Von den 15 mit Vaccine behandelten Tieren starben jedoch nur 3. Vier Tiere der Trägergruppe gingen ebenfalls ein. Die Gefährdung, der diese Tiere ausgesetzt waren, muss als sehr viel grösser angenommen werden, als sie je unter normalen Weidebedingungen anzutreffen ist.
Experiment 2
Es wurden 91 Kälber verwendet, welche auf 5 Farmen verteilt waren, auf denen überall schwere Ausbrüche parasitischer Bronchitis beobachtet worden waren. Von diesen Tieren wurden 48 mit Vaccine behandelt und 43 zur Kontrolle unbehandelt gelassen.
Nur 3 der mit Vaccine behandelten Tiere zeigten Symptome parasitischer Bronchitis, während 27 der unbehandelten Tiere die Krankheit entwickelten.
Das folgende Experiment 3 soll den Gebrauch und die Vorteile der gemäss Beispiel 8 hergestellten Vaccine erläutern:
Experiment 3
Aus einer Gruppe von 8 Kälbern wurde jedes mit 100000 unbehandelten Eiern von Taenia saginata infisziert und die Anzahl Cysten von Cysticercus bovis, welche bei der Autopsie gefunden wurden, registriert.
Das Mittel je Tier betrug 13,8. Zwei Kälber wurden mit der in Beispiel 8 beschriebenen Vaccine behandelt. In einem der Tiere wurden bei der Autopsie keine Cysten gefunden, im andern bloss ein kleiner faseriger Klumpen, enthaltend eine degenerierte Cyste.
In den Sera von Kälbern, welche mit der Vaccine behandelt worden waren, konnten ausfällende Antikörper gegen Cysticercus bovis gefunden werden.
Experiment 4
Von 5 Schafen wurde jedem eine Suspension verabreicht, welche 10000 Larven von Haemonchus contortus enthielt. Die Tiere wurden nach 35 Tagen getötet und auf Gegenwart der Parasiten untersucht.
Es ergab sich im Mittel ein Gehalt von 3000 erwachsenen Parasiten pro Tier. Jedem von 2 Tieren in drei weiteren Gruppen wurden Suspensionen von 10000 Larven verminderter Wirksamkeit verabreicht, wobei die Larven mit 40000, 60000 und 100000 Röntgen respektiv bestrahlt worden waren. Die Untersuchung der getöteten Tiere ergab folgendes:
40000 Röntgen 250 Parasiten
60000 Röntgen 250 Parasiten
100000 Röntgen 50 Parasiten
Alle in den mit bestrahlten Larven behandelten Tiere gefundenen Parasiten waren unreif.