Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums Gegenstand :der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Avil- amycin, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man den Stz@mm Streptomyces viridochromogenes A 23575 oder eine Variante dieses Stammes unter aeroben Bedingungen züchtet und das Antibiotikum Avil- amycin hierauf isoliert.
Das Antibiotikum Avilamycin entsteht bei der Kultur eines neuen Aktinomyceten-Stammesder Gat tung Strep:tomyces, der im folgenden als Strepto- myces viridochromogenes A 23575 beschrieben wird.
Er wurde aus eigner in Caracas, Venezuela, gesam melten Bodenprohe isoliert und wird in unseren Laboratorien und in der Eidg. Technischen Hoch schule, Institut für spezielle Botanik, Zürich, unter dieser Bezeichnung aufbewahrt.
Streptomyces viridochromogene,s A 23575 bildet ein hellblaues Luftmycel. Die Sporenkettenbilden zahlreiche offene, meist regelmässige Spiralen mit monopodialen Verzweigungen und langer, gerader Hauptachse. Die Sporen sind elliptisch bis oval. Die Oberfläche .der einzelnen Sporen ist mit etwa 0,2 ,u langen Stacheln bedeckt, die an der Basis breit sind und eine Spitze bilden.
Beim Wachstum auf pepton- haltigen Nährsubstraten verursacht der Stamm A 23575 eine dunkle melanoide Verfärbung des Nährbodens. Das Wachstum des Stammes ist relativ wenig abhängig von der Temperatur, sowohl bei 18 als auch bei 40 entwickelt sich der Pilz .gut, doch liegt das Optimum zwischen 25 und 32 .
Zur weiteren Charakterisierung wird ,im folgen den das Wachstum von Streptomyces viridochromo- genes A 23575 auf verschiedenen Nährmedien be schrieben. Die Nährmedien 1-7 und 10 wurden nach W. Lindenbein, Arch. Mikrobiol. 17, 361 (1952) hergestellt. 1.
Synthetischer A,gar: Wachstum anfangs dünn, schleierartig und weiss gelb, später runzelig und hellgelb; Luftmycel einen staubigen Überzug bildend, kreideweiss.
2. Synthetische Lösung: Grundwachstum und Sediment punktförmig, milchweiss, .selten Sediment als Flocken; spärliche, farblose Pellikula.
3. Glukose-Agar: Wachstum dünn, schleierartig bis runzelig, hell- braun bis kastanienbraun; Luftmycel sammetig bis wollig, hellblau; Substrat kastanienbraun.
4. Glukose-Asparagin Aga:r: Wachstum :dünn, schleierartig, hellgelb bis grün- lichgelb; Luftmycel wenig wollig, weiss, ,teilweise hellblau.
5. Calciummalat-Agar: Wachstum dünn, schleierartig, hellgelb; Luftmycel anfangs sammetig und weiss, stellenweise .nach 10 bis 15 Tagen sammetig und hellblau.
6. Gelatinestich (18 ): Wachstum :sehr langsam und spärlich; Substrat kastanienbraun bis dunkelbraun; Verflüssigung nach 15 Tagen etwa 1 :cm. 7. Stärkeplatte: Wachstum dünn, -schleierartig, weissgelb bis hell gelb; Luftmycel sammetig bis wollig, mehlweiss; Hydrolyse nach 5 Tagen 5 mm, nach 12 Tagen 13 nun.
B. Kartoffel: Wachstum pustelig, hellbraun; Luftmycel dick wollig, anfangs weissgrau, später hellblau; Substrat kaastanienbraun bis dunkelbraun.
9. Karotte: Wachstum ispärlich, punktförmig bis pustelig; Luftmycel spärlich, kreideweiss. 10. Lackmusmilch: Wachstum in Form einer dicken, zusammenhän- genden, runzeligen Oberflächendecke, kastanien- braun bis :dunkelbraun bis bräunlich-pechschwarz; Luftmycel spärlich, grauweiss;
starke Peptonisie- rung, aber nur sehr schwach,. Koagulation; Substrat dunkelbraun.
Weiter reduziert der Stamm A 23575 Nitrate lang sam zu Nitriten.
Gemäss Ettlinger et a1. [Archiv Mikrobiologie,<I>31,</I> 326 (l958)] werden :die Arten der Gattung Strepto- myce,s charakterisiert durch Farbe des Luftmycels, Morphologie .der einzelnen Sporen und der .Sporen- ketten und schliesslich durch die melanoide Verfär bung von peptonhalti.gen Nährsubstraten.
Der Stamm A 23575 stimmt in diesen vier Merkmalen mit Streptomyces viridochromogenes (Krainsky) Waksma:n et Henrici überein und wird deshalb vor läufig dieser Art zugezählt.
Aus der Literatur ist bekannt, dass Stämme von Streptomyces viridochromo.genes das Antibiotikum Chartreusin bilden. Chartreusin ist eine gelb gefärbte Säure und hat völlig andere Eigenschaften als das farblose, neutrale Avilamycin.
Zur Herstellung des Antibiotikums Avil,amycin können auch Varianten, wie sie z. B. durch Selek- tionierung oder Mutation, insbesondere unter der Einwirkung von Ultraviolett oder Röntgenstrahlen oder von Stickstoffsenfölen, gewonnen werden, Ver wendung finden.
Der Streptomyceae.nstamm A 23575 kann z. B. in wässriger, anorganische Salze, eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle enthaltender Nährlösung gezüchtet werden, beispielsweise in ruhender Oberflächenkultuir oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttelflaschen oder den bekannten Fermentern. Als Temperatur eignet eich eine solche zwischen 18 und 40 .
Eine wesentliche antibakterielle Wirkung zeigt die, Nähr lösung dabei im allgemeinen nach 11/2-5 Tagen.
Die Nährlösung enthält als anorganische Salze beispielsweise Chloride, Nitrate, Carbonate, Sulfate von Alkalien, Erdalkalien, Magnesium, Eisen, Zink, Mangan. Als Stickstoff- und Kohlenstoffquelle und wachstumsfördernde Stoffe seien z.
B. genannt: Aminosäuren und ihre Gemische, Peptide und Pro teine sowie ihre Hydrolysate, wie Pepton oder Tryp- ton, Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Ge treidekörnern, wie Mais und Weizen, von Destilla- tionsrückständen bei der Alkoholherstellung, von Hefe, Bohnen, insbesondere der Sojapflanze, von Samen, beispielsweise der Baumwollpflanze oder von Erdnuss und Kokosnuss, ferner Glukose,
Saecharose, Lactose, Stärke, Mannit, Glycerin usw.
Zur Isolierung des Antibiotikums dienen z. B. folgende Verfahren: man trennt das Mycel vom Kulturfiltrat ab, wonach die Hauptmenge des Anti biotikums im Kulturfiltrat gefunden wird. Es bleiben aber trotzdem namhafte Mengen des Antibiotikums am Mycel adsorbiert. Es ist daher vorteilhaft, letzteres gut auszuwaschen. Dazu eignen sich beson ders organische, mindestens teilweise wasserlösliche Lösungsmittel, wie Alkohole, z.
B. Methanol, Ätha- nol und Butanole, oder Ketone_, z. B. Aceton und Methyläthylketon. Die Mycelextrakte werden ent weder direkt oder nach vorheriger Konzentration im Vakuum zum Kulturfiltrat gegeben. Man extrahiert das Gemisch mit einem mit Wasser nicht mischbaren, organischen Lösungsmittel, wie Ester niederer Fett säuren, beispielsweise Äthylacetat oder Amylacetat, Kohlenwasserstoffen, z. B.
Benzol, chlorierten. Koh- lenwasserstoffen, z. B. Äthylenchlorid, Methylen- chlorid oder Chloroform, Ketonen, z. B. Methyl- pro:pylketon, Methylamylketon oder Diisobutyl.keton, Alkoholen, wie Butylalkoholen oder Amylialkoholen, Äthern, z.
B. Äthyläth:er, Diisopropyläther, Dibu;tyl- äthern oder Glykoläthern und dergleichen. Anstelle einer Lösungsmittelextraktion der Kulturen, oder in Kombination mit einer solchen als weitere Reini gungsoperation, kann man das Antibiotikum auch durch Ad;sorption gewinnen, beispielsweise an Aktiv kohle oder an aktivierten Erden, wie Fullererde oder Floridin, und anschliessende Extraktion des Adsor- bates, z.
B. mit einem in Wasser wenigstens teil weise löslichen organischen Lösungsmittel, wie Aceton, Buta;nol oder Methyläthylketon.
Man kann auch die Kulturen direkt, ohne vor gängige Abtrennung des Mycels, in der angegebenen Art und Weise extrahieren.
Eine weitere Anreicherung lässt sich dadurch erzielen, dass man die antibiotiku:mh altigen orga nischen Extrakte zuerst mit einer sauren wässrigen Lösung mit einem pH unter 5 und dann mit einer alkalischen wässrige:
n Lösung mit einem pH über 8 wiederholt auszieht, wobei die Hauptmenge der anti biotischen Aktivität in der organischen Phase bleibt. Aus dieser wird .das Antibiotikum Avilamyci.n ent weder direkt mittels Krista disaition oder nach vorhe riger Anreicheiling in reinem Zustand isoliert.
Ein gutes Anreicherungsverfahren für das neue Antibiotikum stellt die Verteilung zwischen einer alkoholischen wässrigen Lösung und einem mit Was ser ,nicht mischbaren Lösungsmittel dar. Zweck mässig erfolgt die Verteilung nach dem Gegenstrom verfahren in entsprechenden Apparaten. Auch Chro- matographie z. B. an Aluminiumoxyd ist zur Anrei cherung sehr geeignet. Die Gewinnung des reinen Antibiotikums in kristalliner Form nimmt man z. B.
aus organischen Lösungsmitteln, wie aus Aceton, Methanol, Äthanol, Chloroform, Aceton-Methanol- Gemischen, Ace;ton-Äth:er-Gemischen oder Aceton- Petroläther-Gemisch.en vor. Zum Umkristallisieren dienen dieselben Lösungsmittel oder auch wässrig organische Lösungen, wie verdünnte Alkohole, ver dünntes Aceton.
Das neue, neutrale Antibiotikum erhält man als farblose Kristalle, die bei der Verwendung von aceton-haltigen Lösungsmitteln als Nadeln ausgebil det :sind. F. 188-189,5 , MM = + 0,8 (in Fein- sprit) und -7,7 (in Chloroform). Die Elementar- analyse liefert folgende Werte: C = 5l,24 0/0, H = 6,54 0/a, Cl = 4,93,1/03 CH30 = 8,79 0/0, (C)CH3 = 8,97 0/0 und akt. H = 0,68 %.
Nach der Methode von Signer wurde ein Molgewicht von 708 gefunden. Diese Werte weisen auf die For mel C"H47017C1 hin, wobei die Substanz keinen Stickstoff und keinen Schwefel enthält. UV.- und IR.-Absorptionsspektrum siehe Fig. 1 und 2.
Mit alkoholischer äFerritchlorid-Lösung zeigt das neue Antibiotikum keine Farbreaktion. Die Jodo- formprobe ist stark, der Legal-Te:st nur schwach positiv. Tetranitromethan wird nicht verfärbt.
Bei der alkalischen Hydrolyse des neuen Anti biotikums werden 1,80 Mol einer flüchtigen Säure abgespalten, die im Papierchromatogramm (System Äthanol-Ammoniak-Wasser 8:1:1) etwas weiter wandert als Essigsäure (RL = 1,20, bezogen auf Essigsäure = 1).
Wird dass Antibiotikum mittels verdünnter Säu ren, z. B. mit verdünnter Schwefelsäure, hydrolysiert, so werden drei zuckerartige reduzierende Substanzen abgespalten, die im Papierchromatogramm (System n-Butanol-Eisessig-Wasser 4: 1 :1) Rr-Werte von 0,18, 0,41 und 0,52 aufweisen.
Antibiotika, die, wie das neue Antibiotikum Avila@mycin Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Chlor, hingegen weder Stickstoff noch Schwefel ent halten, sind relativ selten. Das einzige .bekannte Anti biotikum dieser Art ist das von Umezawa et a1. [J. Antibiotics Japan, 5, 466 (1952)] beschriebene Exfoliatin. Obwohl -diese Substanz in gewisser Hin sicht (z.
B. UV-Spektrum) ähnlich ist mit dem Avilamycin, bestehen doch deutliche Unterschiede, die im folgenden aufgeführt werden: Die für Exfoliatin vorgeschlagene Summenformel Cz7H4001.CI stimmt nicht mit den für Avilamycin gefundenen Analysenwerten überein.
Exfoliatin besitzt einen niedrigeren Schmelzpunkt als Avilamycin (172 verglichen mit l89 ). Exfoliatin zeigt im Gegensatz zu Avilamycin eine positive Eisenchlorid-Reaktion.
Die IR: Spektren von Exfoliatin und von Avilamycin zeigen einige deutliche Unterschiede. Exfoliatin und Avilamycin lassen sich durch ihr papierchromatographisches Verhalten gut unterschei den, indem mit dem Fliessmittel Benzol-Chloroform auf mit Formamid imprägniertem Papier Exfoliatm einen Rf-Wert von 0,63, Avila@mycin aber einen sol chen von 0,51 besitzt.
Weiter ist der Produzent von Exfoliatin, Stamm Z-3-5 [Jap. J. Med. Ser. 5, 466 (l952)] deutlich ver schieden von Stamm A 23575. Das Luftmycel des Exfoliatin-Produzenten weist Quirle, aber keine Spi ralen auf, während der Stamm A 23575 keine Quirle, dagegen aber Spiralen bildet. Aus diesen Befunden geht eindeutig hervor, dass Avilamycn nicht identisch ist mit dem bekannten Antibiotikum Exfoliatin.
Das Antibiotikum Avilamycin besitzt eine sehr hohe antibiotische Wirksamkeit gegenüber verschie- denen Testorganismen. Verwendet ,man als Test methode in vitro Verdünnungsreihen (Zehnerpoten- zen) in Glukosebouillon, die während 24 Stundenbei 37 #be#brütet werden, so ergeben sich folgende noch hemmende Konzentrationen:
EMI0003.0103
Hemmende
<tb> Testorganismen <SEP> Konzentration
<tb> <U>,u</U>g/Cm3
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes, <SEP> var. <SEP> aureus
<tb> Penicillin-resistent <SEP> 10
<tb> Streptococcus <SEP> pyo@genes <SEP> 0,1
<tb> Streptococcus <SEP> viridans <SEP> 10
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis <SEP> 100
<tb> Co:rynebacterium <SEP> diphtheriae <SEP> 10
<tb> Pasteurella <SEP> pestis <SEP> 100
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> 10
<tb> Mycobacterium <SEP> tubereulosis" <SEP> 100
<tb> Trichomonas <SEP> foetus <SEP> ** <SEP> 100 In Kirchners synthetischem Medium mit 5% bovinem Albumin kultiviert; Ablesung des Wachstums nach zwei Wochen.
\-@\ In Bouillon mit 10% Pferdeserum bei 37o kultiviert; Ablesung nach 4 Tagen. In vivo ist .das Antibiotikum Avilamyein ebenfalls ,gut wirksam. Bei fünfmaliger subkutaner Verabrei chung von 100 mg/kg resp. von 33 mg/kg an mit Mioroco,ccus pyo:
genes, var. aureus infizierte Mäuse werden 100 0/a resp. 75 % Überleibende beobachtet. Eine ähnliche Heilwirkung wird bei Mäusen festge stellt, die mit Streptococcus haemolyticus infiziert sind.
Dabei ist die Toxizität ;gering, indem eine ein malige subkutane Applikation von 1000 mg/kg bei Mäusen keine Schädigungen hervorruft. Höhere Dosen wurden noch nicht geprüft.
Das Antibiotikum Avilamycin oder seine Um- wandlungs- und Spaltprodukte oder entsprechende Gemische davon können .als Heilmittel, z.
B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die enterale, parenterale oder lokale Applikation geeigneten pharmazeutischen organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen .solche Stoffe in Frage, die mit den neuen Verbindungen nicht reagieren, wie z. B.
Ge latine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkoholz, Gummi, Polyalkylen- glykole, Vaseline, Cholesterin oder andere. bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z.
B. als Tabletten, Drag6es, Pulver, Salben, Cremen, Suppositorien, oder in flüssiger Form .als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und. bzw.
oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisie- rungs-, Netz- oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.
In den nachfolgenden Beispielen sind die Tern peraturen in Celsiusgraden angegeben. <I>Beispiel 1</I> Man bereitet eine Nährlösung der Zusammen- setzung: 20 :g Fleischmehl, 20g Malzextrakt, 10 g Calciumcarbonat und 1 Liter Leitungswasser und stellt sie auf pH 7,2 ein.
Diese, bzw. ein Vielfaches derselben, wird in 500-cm3-Erlenmeyein (mit je 100 cm3 Nährlösung) oder in 500-Liter-Fermentern (mit je 300 Liter Nährlösung) abgefüllt und 20 bis 30 Minuten bei 1 atü sterilisiert. Dann impft man mit bis zu 10 % einer teilweise sporulrierenden,
vege- tativen Kultur von Streptomyces viridochromogenes A 23575 an und irrkubiert unter gutem Schütteln bzw. Rühren und in den Fermentern unter Belüftung (mit etwa 1 Vol. steriler Luft pro Vol. Nährlösung pro Minute) bei 279.
Nach 24-48 Stunden Wachstum filtriert man die Kulturen unter Zusatz von etwa 1,5 % :
eines Filterhilfsmittels je nach Volumen durch eine Nutsche ,oder durch eine Filterpresse oder einen rotierenden Filter und befreit so die antibiotisch wirksame wässri@ge Lösung vom Myoel und anderen festen Bestandteilen.
<I>Beispiel 2</I> Verwendet man anstelle des in Beispiel 1 ange gebenen Mediums die im folgenden beschriebenen Nährlösungen<I>a, b</I> oder c, so erhält man nach analo ger Sterilisation, Beimpfung mit Streptomyces A 23575, Inkubation bei 279 und Filtration wässrige antibiotisch wirksame Lösungen.
a) 10 .g Rohglukose, 5 g Pepton, 3 g Fleisch extrakt (Oxo Lab Lemco), 5 ,g Natrinnichlorid, 10 g Calciumcarbonat und. 1 Liter Leitungswasser; pH vor der Sterilisation 7,5.
b) 40 g Erdnuss-schrot, 10 g Rohglukose, 200 mg sek. Kaliumhydrophosphat, 10 g Calcium- carbonat und 1 Liter Leitungswasser; pH vor der Calciumcarbonatzugabe 7,5.
c) 20 g Kokosnuss=sehrot, 20 g Malzextrakt, 10 g Calciumcarbonat und 1 Liter Leitungswasser; pH vor der Calciumcarbonatzugabe 7,2.
<I>Beispiel 3</I> 25 Liter eines gemäss Beispiel 1 oder 2 erhaltenen Kulturfiltrates werden mit 10 Liter Essigester ausge zogen und der Extrakt im Vakuum auf ein. Volumen von etwa 200 ml eingeengt. Die konzentrierte Lösung schüttelt man dreimal mit je 100 ml 0,5.n wässriger Essigsäure aus. Die abgetrennte wässrige Phase wird mit Natriumcarbonatlösung alkalisiertund wieder mit Essigester ausgeschüttelt.
Man dampft den ge waschenen und getrockneten Extrakt im Vakuum ein und erhält 19 mg Trockenrückstand, der das Wachstum von B. subtilis und Staph. aureus nicht zu hemmen vermag.
Der, wie soeben beschrieben, von den Basen be freite Essigester-Auszug wird dann dreimal mit wäss- riger NatriumcarbonatLösung ausgeschüttelt, worauf die wässrige Phase mit Salzsäure angesäuert und mit Äthylacetat ausgezogen wird. In gleicher Weise wie oben werden aus dieser Lösung 64 mg antibiotisch unwirksame Säuren erhalten.
Der von Basen und Säuren befreite Rohextrakt wird schliesslich mit Wasser gewaschen, mit Natrium sulfat getrocknet und im Vakuum cinigedampft. Man versetzt den öligen Rückstand mit Petroläther. Der Petro:läther, der nur unwirksame Bestandteile aufzu lösen vermag, wird abdekantiert. Es hinterbleiben 91 mag des rohen Antibiotikums Avilamycin, das die gesamte Aktivität des ursprünglichen Extraktes ent hält.
<I>Beispiel 4</I> 90 Liter reines gemäss Beispiel 1 oder 2 erhaltenen Kulturfiltrates werden mit 20 Liter Essigester extra hiert und der Extrakt auf 400 ml eingeengt. Bei 20stündigem Stehen bei 29 fällt das Avilamycin in Formeines dichten flockigen Niederschlages aus, der abfiltriert wird. Nach dem Trocknen im Exsikkator wiegt der nahezu farblose, aus stark verfilzten Nädel- chen :bestehende Kristallkuchen 3,07 g.
Die Mutter laugen werden auf etwa 200 ml eingeengt und mit der doppelten Menge Äther versetzt. Nach 4 Tagen Stehen bei, 09 kristallisieren weitere 3,28g Avilamycin aus.
3,0 g des Kris:tallisates löst man in 50 ml Aceton. Von einem geringen unlöslichen Schlamm wird ab- filtriert. Dass klare Filtrat wird nun unter Zugabe von Äther kornzentriert. Beim Erkalten scheiden sich 2,0 g farblose Kristalle in feinen Nädelchen ab.
Durch Ein- engen der Mutterlaugen auf :etwa 1i des Volumens können nochmals 0,48g Kristalle gewonnen werden. Zur Analyse wird eine Probe dieser Kristalle noch viermal aus Aceton-Äther umkristallisiert und 20 Stunden im Hochvakuum bei 709 getrocknet.
Das analysenreine Antibiotikum zeigt folgende Eigen schaften: F. 188-189,5 (unter dem Mikroskop be- stimmt). [a]D = + 0,89 (c = 1,165 in Feinsprit) oder - 7,7 (c - 1,083 in Chloroform).
Mit alkoholischer Eisen-(111)-chloridlösung tritt keine Farbreaktion ein. In konz. Schwefelsäure löst eich das Antibiotikum anfangs mit olivbrauner Farbe; später verändert sich der Farbton nach violettbraun. Die Jodoformprobe ist positiv, der Legaltest schwach positiv. Tetranitromethan wird nicht verfärbt.
Die Elementaranalyse gibt folgende Werte: C = 51,24 0/a, H = 6,54 %, Cl = 4,93 %, CH30 - 8,79 %, CH3 (C) = 8,97 0/0,
HRTI ID="0004.0220" WI="6" HE="4" LX="1264"LY="2660"> akt. = 0,68 0/a. Stickstoff und Schwefel sind nicht nachweisbar. Nach der Methode von S:igner in Chloroform mit Azo- be:nzol als Referenzsubstanz wird ein Mokkular- gewicht von 708 gefunden.
Diese Werte sind am besten mit einer Bruttoformel von C.1H47017C1 ver träglich. UV-Absorptionsspektrum in Feinsprit siehe Fig. 1; IR-Absorptionsspektrum in Kaliumbromid siehe Fig. 2.
Bei der alkalischen Hydrolyse werden 1,80 Mol flüchtige Säure abgespalten, die im Papierchromato- gramm (Äthanol-Ammoniak-Wasser 8:l:1) einen einheitlichen Fleck gibt und etwas weiter wandert als Essigsäure und Propionsäure (R, = 1,20 bezogen auf Essigsäure = 1).
<I>Beispiel 5</I> Die vereinigten Mutterlaugen der in Beispiel 4 beschriebenen Kristallisationen werden im Vakuum eingedampft und der Rückstand mit Petroläther ge waschen.
Der in Petroläther unlösliche Anteil von 5,8g wird in Benzol aufgenommen und an einer Säule aus 170<B>g</B> Aluminiumoxyd (Aktivität III) chro- matographiert. 200 ml Benzol, 500 ml abs.. Chloro- form und 500 ml Chloroform-Methanol 99:
1 eluieren nur inaktive Begleitstoffe. Die mit 500 ml Chloroform-Methanol <B>97:</B> 3 und 500 ml Chloroform- Methanol 9 : 1 eluierten Fraktionen enthalten die ge samte Aktivität. Sie hinterlassen beim Eindampfen <B>2,25,g</B> Rückstand, aus dem sich durch Kristallisation 1,04 g reines Avilamycin vom F. 187-188 :gewinnen lassen.
Zur weiteren Charakterisierung werden 2,51 g kristallisiertes Avilamycin mit einer Lösung von 1,5 g konz. Schwefelsäure in 30 ml Wasser versetzt und während 2 Stunden im Wasserbad (etwa 95 ) erwärmt.
Das abgekühlte Reaktionsgemisch wird durch Ausschütteln mit Äther von lipophilen An teilen (850 mg braunes Öl) befreit und die wässrige Phase :anschliessend durch eine Säule aus 70 ml Dowex 3 (OH-Form) perkoliert. Das neutrale Eluat wird im Vakuum zur Trockene verdampft und hinter lässt 1,02 g eines nahezu farblosen zähflüssigen Öls.
Proben von 300 Icg dieses Öls werden auf Filter- papier Whatman Nr. 1 papierchromatographisch untersucht. Als Flie:ssmittcl dient ein Gemisch .aus n-Butanol, Eisessig und Wasser im Volumenverhält nis 4: 1 : 1. Bei der Entwicklung mit Anilin-Phthal- säure sowie mit ammoniakalischer Silbernitratlösung lassen sich 3 reduzierende Zucker nachweisen.
Der eine mit R f 0,18 zeigt eine rötliche, der zweite mit Rf 0,41 eine bräunliche-,gelbe und der dritte mit Rf 0,52 wieder eine rötliche Anilin-Phthalsäure- reaktion.
Die drei Zucker lassen sich präparativ an einer Cellulosepulversäule mit :demselben Lösungsmittel gemisch trennen. Für 1,02- Zuckergemisch wird eine Cellulosepulversäure von 3 cm Querschnitt und 42 cm Höhe verwendet. Die Eluate werden in Frak tionen von 16 ml aufgefangen.
Aus den Fraktionen 19-20 werden 330 mg des papierchromatogmaphisch einheitlichen Zuckers mit Rf 0,52 als zähes Öl ge- wonn:en. Die Fraktionen 21-22 geben 348 mg des selben Zuckers im Gemisch mit denjenigen mit Rf 0,41. Der einheitliche zweite Zucker wird in einer Menge von 93 mg aus den Fraktionen 23 und 24 des Chromato:gramms gewonnen. Von der Verbin dung mit R f 0,18 werden 340 mg aus den Fraktio nen 27-32 :erhalten.