CH374451A - Verfahren zur Anreicherung von Kanamycin aus verdünnten wässrigen Lösungen - Google Patents
Verfahren zur Anreicherung von Kanamycin aus verdünnten wässrigen LösungenInfo
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Description
Verfahren zur Anreicherung von Kanamycin aus verdünnten wässrigen Lösungen Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anreicherung von Kanamycin aus verdünnten wässrige:n Lösungen.
Das neue Verfahren ist für die Gewinnung von Kanamycin höchst bedeutungsvoll und besteht darin, dass man das Kanamycin bei alka lischem pH-Wert mit ,einem kleineren Volumen eines mit Wasser nicht mischbar .en Alkohols,
dem pro Mol Kanamycin zwischen 1 und 10 Molen eines aro@ma- tischen oder eines 4-10 Kohlenstoffatome enthalten den unswbstitu%erten ,aliphatischen Aldehyds zugesetzt wurde, auszieht und gewünschtenfalls den Alkohol auszug mit einem kleineren Volumen;
Wasser bei sau- rem pH-Wert extrahiert.
Das Antibiotikum Kanamycin ist eine neue Ver bindung und wurde beschrieben in J. Antibiotics (Japan) Ser. A. Bd. 10 (1957) 107 (Takeuchi et a1.) und in J. Antibiotics (Japan) Bd. 5 (1957) 181 und 228 (Umezawa et a1.).
Wasserlösliche basische Antibiotika wie Kana- mycin aus verdünnten wässrigen Lösungen, worunter ,auch Fermentationsbrähen und Eluate .aus Ionen- austauscherharzen gehören,
in wirtschaftlich eia- facher Weise und bei gleichzeitig hoher Ausbeute zu gewinnen, ist ein schwieriges Problem. Die üblichen Extraktionsverfahren bei verschiedenen pH-Werten sind unbefriedigend;
dies gilt auch dann, wenn eine Trägersubstanz wie Laurinsäure verwendet wird. Be friedigende Fällungsmethoden, die auch bei so stark verdünnten Lösungen wirksam -sind, gibt es ebenfalls nicht.
Absorption an Ionenaustauscherhaizen und nachfolgende Blution führt zu befriedigenden Ergeb nissen, sofern es sich um die erste Stufe eines Wieder- gewJ:
nnungsverfahrens handelt. Dabei wird eine etwa 10fache Reduktion des Volumens erreicht. Doch kann man auch bei wiederholter Absorption und Blution keine hochkonzentrierten Lösungen erhalten. So beträgt auch die Konzentration eines Eluates aus einer ein zweite smal an Harz absorbierten und nach her mit <RTI
ID="0001.0122"> dem bevorzugten Ammoniak eluiertenLösung nicht mehr -als 10000-20000 mcg/ml. Dabei wird viel Asche eingeführt und ferner müssen solche ver- hältnlamässig verdünnten Lösungen nachträglich bei alkalischen pH-Werten im Vakuum eingeengt wer den.
Diese Behandlung ist sowohl kostspielig wie zeitraubend und führt zur Entfärbung .und Zersetzung des Produktes.
Es ist nun Gegenstand der vorliegenden Erfin dung ein Verfahren zur Anreicherung von Kanamycin aus verdünnten wässrigen Lösungen einschliesslich Fermentationsbrühen und Eluaten von Ionenaus- tauscherharzen. Eia solches Verfahren russ <RTI
ID="0001.0165"> einfach und wirtschaftlich sein; es soll in: einfacher Weise und auf direktem Werg die Bildung sehr reiner und konzentrierter Kanamycin-Lösungen ermöglichen, aus welchen das Kanamycin mühelos als.
Base oder als Salz in kristalliner Form gewonnen werden kann.
Dieses Verfahren besteht darin, dass man Kana- .mycin bei alkalischem pH-Wert mit einem geringeren Volumen eines mit Wasser nichtmischbaren niederen Alkohols,
welcher pro Mol Kanamycin in der wäss- sigen Lösung 1-10 Mole eines aromatischen oder eines zwischen 4 und 10 Kohlenstoffatome enthalten den urisubstituierten aliphatischen Aldehydes enthält, extrahiert, die alkoholische Phase abtrennt,
das in. der alkoholischen Lösung in Form seines Kondensations produktes mit dem Aldehyd enthaltene Kanamycin bei:
. sauren pH-Werten mit einem geringeren Volumen einer wässrgenSäure auszieht und die so .erhaltene koazentnerte w'ässrige Kanamycin=Lösung abtrennt. Dabei wird das intermediär gebildete Kondensations- produkt aus Kanamycin und dem Aldehyd <RTI
ID="0001.0236"> als :solches jedoch nicht isoliert, sondern dient lediglich dazu, das Kanamycin aus der sehr verdünnten wässrigen Ausgangslösung in den -beiden- vorstehend beschrie benen Extraktionsschritten zu konzentrieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren so durchgeführt, dass die verdünnte wäss- rige Kanamycin Lösung bei alkalischem pH-Wert mit einem -geringeren Volumen n Butanolwelches für jedes in der ursprünglichen Lösung enthaltene <RTI
ID="0002.0025"> Mol Kanamycin zwischen 1 und 10 Mole eines mono- cyclischen aromatischen Aldehyds oder eines unsub- stituierten zwischen 4 und 10 Kohlenstoffatome ent haltenden aliphatischen Aldehydes enthält, extrahiert wird,
wonach man die alkoholische _Phase .abtrennt und darauf das Kanamycin in der besagten alko- holischen Lösung bei :
einen. pH-Wert unter 4,0 mit einem nochmals kleineren Volumen einer wässrigen Säure auszieht und die so erhaltene konzentrierte wässrige KanamycinLösung abtrennt.
Von den in diesem Verfahren verwendbaren, mit Wasser nicht mischbaren Alkoholen ist n Butanol bevorzugt, doch kann man .auch ein Pentanol oder ein Hexanol verwenden.
Überraschenderweise sind bestimmte Lösungsmittel, die oft mit n-Butanol ver- tauschbar sind, wie z.
B. Methylisobutyllketon, Äthyl- aeetat, Amylacetat, Chloroform oder Benzol ent weder fast nicht oder Überhaupt nicht verwendbar. Die im vorliegenden Verfahren bevorzugten aroma tischen Aldehyde sind substituierte und ursubstituierte monocyklische aromatische Aldehyde;
es- gehören also- dazu Fural, Zimtaldehyd, 5 Nitrofuräl, 2-, 3- und 4-Formylpyridin, 2- und 3-Formylthiophen, Benzaldehyd, Alkylbenza@ldehyde, wie z. B. p- Methyl- benzaldehyd und p-Isopropydbenzaldehyd, Alkoxy- benzaldehyde, wie z.
B. Anisaldehyd und Verährum- aldehy d, Halogenbevzaldehyde, wie z. B. p-Chlor- benzaldehyd, Hydroxybenzaldzhyde, wie z.B. Vanillin und Salicylaldehyd, sowie Alkylaminobenzaldehyde, wie z.
B. p-D,ün:ethylaminobenzaldehyd. Zu den all.- phatischen Aldehyden, welche im erfindungsgemässen Verfahren verwendet werden können, gehören die umsubstituierten aliphatischen Aldehyde, welche von 4-10 Kohlenstoff atome enthalten, wie z.
B. nrButyr aldehyd, Isobutyraldehyd, n Heptaldehyd, 2: Äthyl- hexanal, Caprmasdehyd, n Valerald:
ehydundIsovaIer- aldehyd. Das Wort unsubstituert betrifft also Alkylgruppen so lange -nicht, als sie Aden Kohlenstoff gehalt des Aldehydes nicht über 10 Kohlenstoff atome ansteigen lassen, wie dies z.
B. dusch 2-Äthylhexanal belegt ist: Wie experimentell festgestellt wurde, beträgt die bevorzugte Aldehydmenge so viel, da.ss auf 1 Mol Kanamycin mindestens 4 Mole Aldehyd entfallen; Mol Verhältnisse von 4 : 1 bis 8 : 1 ,sind besonders zweckmässig.
Mit anderen Worten, vom eingesetzten Aldehyd wird vorzugsweise die gewichtsmässig den Kanamycinentsprechende Menge bis zum Doppelten dieser Menge eingesetzt. Die Extraktion mit Butanol wind bei alkalischen p11-Werten durchgeführt,
das heisst bei p11-Werten über 7;0;- aber im allgemeinen unter 11;0. Zweckmässig und bevorzugt sind <B>pH-</B> Werte zwischen 8,5 und 10,5. In., diesem Fall stellt man die Lösung in einfacher und billiger Weise mit Natriumhydroxyd ein.
Die Rückextraktion aus dem Alkohol in das Wasser erfolgt bei sauren pH-Werten (das heisst mit verdünnten wässrigen Säuren) z. B. bei einem: pH-Wert vorn 4 oder weniger. Man verwendet z.
B. verdünnte Essigsäure oder vorzugsweise ver dünnte Schwefelsäure. Wenn nötig, setzt man weitere konzentrierte Säure zu, um den pH-Wert unter 4 zu halten. Das Volumen des verwendeten Alkohols be trägt weniger -als die Hälfte, vorzugsweise 1/.4 oder weniger des Volumens der ursprünglichen wässrigen Lösung.
Wenn die alkoholische Kanarnycin Lösung zurückextrahiert wird, wählt man das Volumen des angesäuerten Wassers kleiner als i/.1,
vorzugsweise 1/0 oder weniger des Alkoholvolumens. In jeder dieser Extraktionen ist derRTI ID="0002.0251" WI="33" HE="4" LX="1652" LY="894"> Verteilungskoeffizient ausserordentlich günstig gelegen und beträgt sogar 1000 und mehr.
Dies ermöglicht sehr starke Volu- menverklenerungen. In der Tat kann das Volumen an wässriger Säure bei der zweiten Extraktion .so knapp :bemessen werden, dass praktisch jede ge- wünschte Kanamycin-Konzentration erreichbar ist.
De Isolierung von reinem kristallinem Kanamycin aus dem Schlussextrakt ist ausserordentlich einfach. Nachdem die Schlussextraktion mit verdünnter Schwe felsäure beendet ist, braucht man bloss z.
B. durch Zusatz von Ammoniumhydroxyd den Extrakt auf einen pH-Wert von<B>8,2</B> einzustellen und sorgfältig Methanol zuzusetzen (z. B. 1-4 Volumteile, vor- zugsweise nur 1 Volumteil), um das reine kristahi!ne Kanamycin-Sulfat zu fällen.
Das erfindungsgemässe Verfahren ;ist, wie unten näher ausgeführt wird, auf jede wässrige Kanamycin- Lösung einschliesslich, Fermentationgbrühen anwend- bar. Es ist besonders wirksam bei,
Eluaten aus Harz- austauschern mit einen Gehalt ;an Kanamycin von 1000-10000 mcg/ml. <I>Beispiel 1</I> Ein sehr zweckmässiges Verfahren zur Gewinnung von reinen kristallinem Kanamycin aus Gärbrühen im grossen Massstab beginnt mit der <RTI
ID="0002.0333"> Abtrennung des Myeeliums durch Filtration. der mit Schwefelsäure auf einem pH-Weut von 4,5-5 :angesäuerten Brühe.
Falls erwünscht, wird diese Filtration erleichtert, indem man die Brühe 12 Stunden bei Zimmertempe ratur oder 30 Minuten bei 54 hält;
die so erreichte Verdünnung, oder Verflüssigung wird der Wirkung ,der vorhandenen Enzyme zugeschrieben. Die sauer filtrierte Brühe wind dann mit Natriumhydroxyd zu einem pH-Wert von 6-7 neutralisiert und. an einem Ionenaustauscher (Bezeichnung IRC-50)
in der Na- irsumforrn absorbiert. In Abänderung dieser Stufe kann:
.die Filtration weggelassen werden und die ver flüssigte Brühe mit einem gleichen Wasservolumen verdünnt werden, wonach man, sie zwecks Abschei dung von Teilchen der Maschenweite 20 und darüber in. einem Abscheider behandelt,
neutralisiert und an der Austauseherkolonne absorbieret. Nach dem Waschen der Kolonne mit Wasser wird das Kanamycin mit 1n oder 5 1/oiger Schwefelsäure eluiert, wobei man etwa eine 10fache, Volumenverrin gerung erreicht.
Dann wird das E1sat .mit Natnumhydroxyd auf einen pH-Wert von 10 eingestellt und mit dem volu- menmässig viertem Teil n-Butanol extrahiert,
welchem 2 .g Benzaldehyd pro Gramm Kanamycin im Elaat zugesetzt worden sind. Nach der Abtrennung - wird die Butanolphase mit dem zwanzigsten Volumteil von mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2 einge- stellten
Wassers gewaschen. Nach Abtrennung der wässrigen Phase, welche etwa 100000 bis 150000 mcg/ml Kanamycin Sulfat enthält, wird erwünschten- falls mit Kohle entfärbt, mit .ammoniakalischer Lö- sung auf einen, pH-Wert von 8,
2 neutralisiert und zwecks Ausfällung :des kristallinen Kanamycin-Sul- fates 1 Volumen Methanol zugesetzt. <I>Beispiel 2</I> Ein. anderes Verfahren zur Gewinnung von me nem kristallinem Kanamycin aus Gärbrühen im grossen Massstab <RTI
ID="0003.0080"> beginnt mit der Filterabscheidung des Myceliums,nachdem die Brühe mit Schwefel säure auf einen pH-Wert von 4,5-5 angesäuert wurde. Die Filtration wird gewünschtenfalls durch Halten :
der Brühe während 12 Stunden bei Raumtemperatur oder 30 Minuten bei 50o erleichtert; die auftretende Ver- dünnung oder Verflüssigung wird der Wirkung der vorhandenen Enzyme zugeschrieben. Darauf wird die sauer filtrierte Brühe mit Natriumhydroxyd auf
einen pH-Wert von 10 neutralisiert und mit einem Viertel Volumen n-Bu tanol ,extrahiert, welchem pro: Gramm Kanamycin im Eluat 2 g Benzaldehyd zugesetzt wor den :sind.
Nach Abtrennung wird .die butanolsche Phase mit 1/2p Volumen Wasser ;gewaschen', das mit tels Schwefelsäure auf .einen p11-Wert von 2 einge- stellt worden war.
Nach Abtrennung der wässrigen Phase, welche .etwa 100 000 bis etwa 150 000 mcgIml Kanamycin-,Sulfat enthält, wird erwünschtenfalls mit Kohle entfärbt, dann .mit Ammoniaklösung auf pH 8,
2 neutralisiert und zwecks Fällung des kristallinen Kanamycin-Sulfats mit einem Volumen Methanol versetzt.
<I>- Beispiel 3</I> Zu 500 ml einer wässnigen 10 g Kanamycin- Sulfatenthaltenden Lösung gibt man 20 g Benz- .aldehyd in 200 ml -n-Butanol. Nach Einstellung des pH-Wertes auf 10,5 mittels Natniumhydroxyd wird die Mischung während 15 Minuten ;
gerühmt, das Bu- tanol abgetrennt und mit 40 ml mittels Schwefelsäure auf pH 2 eingestellten Wassers extrahiert. Die wäss- rige Phase wird abgetrennt, mit Ammonumhydroxyd auf pH 8 ,
eingestellt und mit einem Vollumen Metha- nol versetzt, wonach 7,8 g kristallines Kanamycin- Sufat ausfallen (750 mcg/mgm im Lebendversuch;
725 mcg/mgm im Fural-Ultnaviolettversuch). Bei wei terem Methanolzusatz erhält man weitere 94/o des Produktes.
<I>Beispiel 4-</I> 500 ml Eluat aus einem Ammoninmhydroxyd- Harzawstausch ,r (9300 mag/ml ,im Lebendversuch) werden mit Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von 10,
5 eingestellt und mit 150 ml 10 g Benzaldehyd enthaltenden n Butanolsextrahiert. Dex Butanol wird abgetrennt und mit 30 ml Wasser, welches varlher mittels Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt worden ist, extrahiert. Die wässrige Phase wird abgetrennt,
mit 0;2 g Kohle behandelt, filtriert, ,mit Ammoniumhydroxyd auf einen pH-Wert von 8 eingestellt und mit 1 Volumen Methanol versetzt, wobei 4,0 g kristallines Kanamycin-Sulfat ausfallen (700 meg/mgm im Lebendversuch;
649 mcg/mgm Fural-Ultraviolettversuch).
<I>Beispiel 5</I> 20 1 des sauren Eluates pH = 5 eines Harzaus tauschers (4350 mcg/ml im Lebendversuch) werden mit Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von 10,5 eingestellt und ,
mit 15 ml Benzaldehyd in. 300 ml n-Butanol extrahiert. Die Butanol Phase wird abge- trennt und mit 30 ;
ml mittels Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellten Wassers extrahiert, Die wässrige Phase- wird abgetrennt mit Ammonum hydroxyd, auf -pH 8 eingestellt, und mit 1 Volumen Methanol versetzt, worauf - 8,25 ,
g -kristallines Kane,- mycin-Sulfat anfallen (640 mcg/mgm im LebDndver- such rund 610 mcg/mgm im Fura1-Ultraviolettest; Ausbeute gemäss Lebendversuch:
62,24/o). Das nach ,der Bwtanol -Benzaldehydextraktion verbleibende Eluat enthält noch 280 mcg/ml Kanamycüm Das gleiche Vorgehen wird mit weiteren 2,0 1 desselben Eluates wiederholt, wobei, anstelle von frischem Butanol und Benzaldehyd das bereits ,
im vorhergehenden Versuch verwendete benzaldehyd haltige Butanol verwendet wird. Dieser Versuch ver- läuft sehr vorteilhaft, man erhält 8,1 ,
g kxistallimes Kanamycin-Swlfat (700 mcg/mgm im Lebendvemsuch und 597 mcg/mgm im Fural UZtraviölettversuch; Aus beute 66,8 4/e,). .
<I>Beispiel 6</I> 900 ml des sauren Eluates aus einem Harzaus- tauscher wenden zu 15 ml Benzaldehyd in 200 ml n-Butanol gegeben und das pH mit Natriumhydroxyd auf 10,
5 .eingestellt. Die Butanolphase wird mit 20 ml mittels Schwefelsäume auf pH 2 eingestellten Wassers extrahiert.
Mit Ammonumhydroxyd stellt man die wässrige Phase auf pH 8 ein und setzt ein Volumen Methanol zu, um 4,8 ;
g kristallines Kanamycin-Sulfat auszufällen (680 mcg/mgm im Lebendversuch und 657 mcg/mgm im F'aral-Ultraviolettversuch; Aus beute 69;
8 4/a). Das verbrauchte wäBnge Eluat ent hält (nach der Butanol-B@enzaldehydextrakti(on) weni- ge als 30 mcg/mi Kanamycin.
<I>Beispiel ?</I> In einer Versuchsreihie mit Anteilen dergleichen wässrigen -Kanamycin Lösung wind 1 1 Harzaus- tauschereluat (enthaltend 2850 mcg/ml mit 15 ml des unten üngegebenen Aldehydes und 200 ml n-Butanol vermischt,
mit Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von 10,5 eingestellt und 15 Minuten gerührt. Die butanolsche Phase wind darauf abgetrennt und mit 25 ml Wasser extrahiert,
welches vorher mit Schwe- felsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt wurde. Die wässrige Phase wird abgetrennt ,mit Ammoniusn- hydroxyd auf pH 8,2 eingestellt und mit dem glei chen Volumen Methanol versetzt,
um das kristalline KanaTnyoin-Sulfat auszufällen. Es werden folgende Ergebnisse erzielt:
EMI0004.0043
Kanamycin-Gehalt <SEP> in <SEP> mcg/ml
<tb> Verwendeter <SEP> Wässriges <SEP> Angereicherte <SEP> Saurer
<tb> Aldehyd <SEP> Resteluat <SEP> Butanollösung <SEP> vor <SEP> Wasserextrakt
<tb> Säureextrakt
<tb> Sahcylaldehyd <SEP> 540 <SEP> <B>16500 <SEP> 68750</B>
<tb> Benzaldehyd <SEP> 120 <SEP> <B>16000 <SEP> 93750</B>
<tb> Anisaldehyd <SEP> 980 <SEP> 11500 <SEP> 75Ö00
<tb> Zimtaldehyd. <SEP> 620 <SEP> <B>12250 <SEP> 82500</B>
<tb> Fural <SEP> 360 <SEP> <B>16250 <SEP> 100000</B>
<tb> Heptaldehyd <SEP> 100 <SEP> <B>23500 <SEP> 135000</B>
<tb> 2 <SEP> Äthylhexanal <SEP> 100 <SEP> 21000 <SEP> <B>102500</B> <SEP> .
EMI0004.0044
Kästallines <SEP> KanamycinSulfat
<tb> Verwendeter <SEP> Gewicht <SEP> in <SEP> Gramm <SEP> mcg/mgm
<tb> Aldehyd <SEP> im <SEP> Lebendversuch
<tb> Sah-cylaldehyd <SEP> 2,0 <SEP> 720
<tb> Benzaldehyd <SEP> 2,6 <SEP> 760
<tb> Anisaldehyd <SEP> 1,8 <SEP> 820
<tb> Zimtaldehyd <SEP> 1,84 <SEP> 670
<tb> Fural <SEP> - <SEP> 1,9 <SEP> 910
<tb> Heptalde#hyd <SEP> 2,05 <SEP> 790
<tb> 2 <SEP> Äthylhexanal <SEP> , <SEP> 2;
7 <SEP> - <SEP> 890 Die Verwendung vor- Chloroform oder Methyl lsobutylketon zusammen mit Benzaldehyd isst erfolg- los. Bei: Verwendung von Butanol führt der Ersatz von:
Benzaldehyd durch Chloralhydrcat, Chloracet aldehyd, Formaldehyd, Cyclohexanon oder alpha- Hydroxyadipinaldehyd auch nicht zum Ziel.
<I>Beispiel<B>8 -</B></I> Grundsätzlich wird nach dem Verfahren der vor hergehenden Beispiele :gearbeitet, wobei allerdings die :ganze Brühe (5 11150 mcg/ml) direkt mit einem Liter nB.utanol -und 25 ml Benzaldehyd extrahiert wird.
Man erhält 3,3 ,g kristallines Kanamycin-Sulfat. <I>Beispiel 9</I> Eine Kanamycin FPerrnentationsbrühe wird mit Natrzumhydroxyd auf einen p11-Wert von 10,
5 ein.- gestellt. Sie enthält gemäss Lebendversuch 1200 mcgImI. 5 1 der filtrierten, Brühe werden mit 25 :ml B.enz- aldehyd in einem Liter n-Butanol extrahiert und der Extrakt wie oben beschrieben zu 3,3 g kristallinem Kanamycin-Sulfat ,aufgearbeitet.
Claims (1)
- PATENTANSPRUCH Verfahren zur Anreicherung von Kanamycin aus verdünnten wässrigen Lösungen, dadurch gekenn zeichnet, dass man Glas Kanamycin bei alkalischem pH-Wert mit einem kleineren Volumen eines mit Wasser echt mischbaren Alkohols,dem pro Mol Kanamycin zwischen 1 und 10 Mole eines aroma- tischen oder eines 4 bis 10 Kohlenstoffatome ent haltenden ursubstituierten .aliphatischen Aldehyds zugesetzt wurde,auszieht und den Alkoholauszug mit einem kleineren Volumen. Wasser bei saurem pH- Wert unter Regenerierung des Kanamycins aus sei nem intermediär gebildeten Kondensationsprodukt mit denn. Aldehyd extrahiert.
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| US702832A US2936307A (en) | 1957-12-16 | 1957-12-16 | Process of antibiotic extraction |
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|---|---|
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Family
ID=24822781
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CH5857058A CH374451A (de) | 1957-12-16 | 1958-04-21 | Verfahren zur Anreicherung von Kanamycin aus verdünnten wässrigen Lösungen |
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| US (1) | US2936307A (de) |
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Families Citing this family (2)
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|---|---|---|---|---|
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1958
- 1958-04-21 CH CH5857058A patent/CH374451A/de unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US2936307A (en) | 1960-05-10 |
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