CH378897A

CH378897A - Verfahren zur Herstellung von L-Lysin

Info

Publication number: CH378897A
Application number: CH169660A
Authority: CH
Inventors: Sorelle Gorton Bert; Laurance Hause Norman
Original assignee: Du Pont
Priority date: 1960-02-16
Filing date: 1960-02-16
Publication date: 1964-06-30

Description

Verfahren zur Herstellung von L-Lysin Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von LLysin durch Umsetzung che misch synthetischer Diaminopim@elinsäure. Das Pro dukt wird in hohen Ausbeuten erhalten.

Diaminopimelinsäure ist eine bekannte Verbin- :du.ng, welche aus biologischen Verfahren erhalten wird, und ist auch synthetisch aus Dibrompimelin- säure und aus Phthalimid erhalten worden, wie E.Wo:rk et a1., J.

Am. Chem. Soc. 77, 1916 (1955) berichtet. Neuerdings isst eine kommerziell interessante chemische Synthese entdeckt worden, in welcher Glutaraldehyd in Trimethylen-bis-(5,5')-hydantoin durch Reaktion mit Cyanwasserstoff, Ammoniak und Kohlendioxyd in Lösung umgesetzt wird und dieses dann durch HydTolyse die u,s-Diaminopinelinsäure ergibt.

Die synthetische Diaminopimelinsäure ist ein Gemisch von Isomeren, welche, im Gegensatz zu der auf biologischem Wege erhaltenen, eine ansehnliche Menge von D-Diaminopimelinsäure-Isomer enthält. Das Lysin isst eine wertvolle Aminosäure. Eine Mono- decarboxylierung von .L-Dia:

minopimelinsäuxe liefert das L Lysin, wie die folgende Reaktionsgleichung veranschaulicht:
EMI0001.0040
Dewey, Haare und Work beschreiben im Biochemical Journal 58, 523 (1954) die Isolierung von Diamino- pimedinsäu,redecarboxyl:

ase aus Aerobacter aerogenes und die Benützung dieses Monodecarboxylierungs- enzyms zur Monodecarboxylierun.g von Diamino- pimelinsäure zu L Lysin. Sie stellen fest, dass es im wesentlichen möglich ist, theoretische Erträge von LLysin aus der biologisch hergestellten Diamin:o- pimelinsäure, aber Ausbeuten von nur 45-48 o/0 aus ,der synthetischen Diaminopimelins:

äure zu erhalten. Die D-Diaminopimelinsäure, welche im synthetischen Produkt zu 50 % vorhanden ist, wird nicht durch die Enzyme angegriffen und kann unverändert zurück gewonnen werden.

Der enzymatische Prozess führt zwar zum D-Lysin-freien L-Lysin, würde aber nicht wirtschaftlich sein, falls :die unveränderte Diamino- pimelinsäure auf dem Markt keinen Absatz fände.

Da ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin, wel- .ches von der chemisch :synthetisierten Diamino- pimelinsäure -ausgeht, ein kommerziell praktisches Verfahmen ist, ist es wichtig, die Ausbeute von L-Lysin, welche aus diesem synthetischen Ausgangs material erhalten werden kann, zu verbessern.

Es .ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Ver besserungen im enzymatischen Verfahren zur Her stellung von LLysin zu erreichen, welche es :ermög lichen, hohe Ausbeuten aus der synthetischen Diaminopimelinsäure zu erhalten.

Es ist nun .gefunden worden, dass die Haupt menge der synthetischen Diaminopimelinsäure, welche nicht in das LLysin durch Monodecamboxylierungs- enzyme umgesetzt wurde, unverändert wieder gewon nen werden kann und durch Racemisierung in ver dünnter wässriger, saurer Lösung, vorzugsweise bei 125-230 C, eine Form von Diamino:pimelinsäure liefert, welche in das L-Lysin mit Ausbeuten von 62 .bis 7011/o oder höhere, durch :

das enzymatische De carboxylierungsverfahren umgesetzt werden kann. Überdies kann dieses Verfahren wiederholt werden und im wesentlichen die .ganze chemisch syntheti- siegte Diaminopimelinsäure in das L-Lysin umgesetzt werden.

Das Erhitzen der unveränderten D-Diamino- pimelinsäure in saurer Lösung führt zur Racemisie- rung; die Kombination dieses Vorganges mit der enzymatischen Decarboxylierung liefert, im Vergleich mit den Ergebnissen analogen Verfahren, hohe Aus beuten.

Zum Beispiel :ergibt die Ra:cemisierung von D-Lysin und die Decarboxylierung zu Cadaverin mit L-Lysin-decarboxylase .eine maximale Ausbeute von nur 50 %,

- da das racemische Lysin nur noch 50 a/o des D-Lysins :enthält, welches durch dieses Enzym nicht beeinflusst wird. Im Verfahren der vor liegenden Erfindung gibt die Racemisierung mit ver- dünnter_alkalischer Lösung statt mit verdünnter :

sau rer Lösung nichtgleichwertige, Ergebnisse; Versuche mit dieser Modifikation ergaben Ausbeuten von LrLysin von nur 15-21 1/a. Es wird von Vorteil sein, die Säurebehandlung als Racemisierungsstufe zube- trachten; diese Behandlung hat eine besondere Be- deutung im vorliegenden Verfahren.

Die Racemisierung wird am geeignetsten so durchgeführt, dass man eine 0,5-50 a/age wässrige Lösung von D-DiäminopimeI.insäu@re in 0,1 bis 12n Säure herstellt und die Lösung auf125-230:>C er hitzt.

Es .ist dabei zubeachten, dass die Geschwindig- keit der Racemisierung bei niedri@gern Temperaturen sehr klein ist, und dass anderseits die Diaminopimelin säure sich bei .höheren Temperaturen zersetzt. Die geeignetsten Temperaturen liegen zwischen 150 bis 200 C.

Eine Behandlung einer 0,5 o/oigen Lösung von Diamino:pimelinsäure in 5:n Salzsäure bei150 bis 200 C während etwa 1 Stunde ist hinreichend, ob wohl auch kürzere Zeiten mit entsprechend niedrige- ren Ausbeuten in der nachfolgenden Umsetzung zu L-Lysi@n benützt werden können; -bei Anwendung längerer Reaktionsdauer wird die Ausbeute entspre chend vexbessert.

Salzsäure wird mit Vorzug verwendet, da sie leicht durch Verdampfen der Lösung entfernt und zum Wiedergebrauch gewonnen werden kann. Es kann aber jede Säure, welche mit den Amiiinos,äuren Salze bildet und welche die Diaminopimelinsäure nicht zerstört, benützt werden.

So ist Schwefelsäure und Phosphorsäure wirksam und beide können durch Bildung der unlöslichen Calcium- oder Bariumsalze entfernt und die Lösung der D,L-Diaminopimelin- säure filtriert werden. Ionenaustauscher in der sauren Form .sind ebenfalls geeignet und können nach Be- hand:lung mit Säure wieder benützt werden.

Die experimentelle Durchführung der Raeemisie- rung ist ähnlich der Racemisierung anderer iso:mere r Verbindungen und ist nicht entscheidend.

So wird die Lösung unter genügend Druck in geeigneten Appara .turen gehalten, um das Kochen und Verluste der benützten flüchtigen Stoffe zu vermeiden. Nach Be endigung der Behandlung wird der Druck aufge hoben und durch Verdampfen bis zur Trockne die Salzsäure entfernt. Es wird hernach eine wässrige Lösung der erhaltenen DL-Diaminopimelinsäure be- reitet und zur enzymatischen Decarboxylie:

rung in das L-Lysin durch Anpassen des pH auf 6,5-8,5 mit Alkali (bzw. Säure) vorbereitet.

Die Monodecarboxyl:ierungsenzympräparate wer den durch übliche Verfahren, wie z. B. nach der von Gale und Epps, Biochem. J. 38, 232 (1944) beschrie benen Ausführungsart, hergestellt. Vorzugsweise wer den die Organismen aus ihrem Wachstumsmedium durch Zentrifugieren gesammelt, mit Wasser einmal gewaschen, mit einem organischen Lösungsmittel ver rührt, durch Dekantieren oder Filtrieren vom orga nischen Lösungsmittel separiert und hernach .getrock net.

Das erhaltene getrocknete Pulver kann in einem Kühlapparat während mehrerer Monate ohne nam hafte Aktivitätsabnahme gelagert werden. Geeignete organische Lösungsmittel sind Aceton und Chloro form. Toluol, Äther oder Glycerin sind viel weniger geeignet.

In einer andern Alternative kann eine Suspension von Zellen m einer wässrigen Lösung eines Phosphat-Puffers bei pH 7,5 einer Ultra schallvibration, mit 10 Kilocyclen während 10 min bei 0,85 Ampere unterworfen werden. Das erhaltene Sonicat ist ebenso aktiv wie .das Trockenpulver mit Aceton hergestellt, muss aber .an dem Tag der Her- stellung benützt werden.

Die :günstige Quelle für Enzyme ist Aerobacter aerogenes, wie z. B. die Stämme ATCC 12409 oder ATCC 8724, aber .auch viele andere Organismen liefern geeignete Enzyme für die Deca .boxylierung synthetischer Diaminopime- linsäure in das L-Lysin. Etwas weniger wirksam sind die Enzyme von Bacillus sphaexicus ATCC 10208

und Stämme von Escherichia coli, welche kein Lysin für ihr Wachstum verbrauchen, wie z. B. der Stamm ATCC 12408. Unter andern wurden auch passende aber weniger wirkungsvolle Stämme wie Sarcina lutea ATCC 1-001 und Sarcina urea ATCC 6473 gefunden.

Die enzymatische De.carboxylnerungsreaktion zur Bildung von L-Lysin wird in derselben Weise sowohl mit der ursprüng'l'ich chemisch synthetisierten Di- aminopkmelinsäure, wie mit der Diaminopimelinsäure, welche aus der partiellen Umsetzung zurückgewonnen wurde, durchgeführt und gemäss der vorliegenden Erfindung für die weitere Umsetzung behandelt. Eine 0,

1-3 1/o ige wässrige Lösung der Diamino- pimelinsäu:re bei pH von 6,5-8,5 wurde mit 5 bis 20 Teilen des Enzyms .pro 10.00 Teile der Lösung bei einer Temperatur von 20-45 C während meh rerer Stunden gerührt. Der Reaktionsablauf kann durch Messen des entstandenen Kohlendioxyds ver folgt werden.

Die vorteilhaftesten Bedingungen für ,die Reaktion sind: 3 o/oige Lösung der Pimelinsäure, 5 Teüle des Enzympräparates, 1000 Teile der Lösung, pH um 7,5 und eine Temperatur von um 25 C, bei welcher ein Erwärmen oder ein Abkühlen nicht not wendig ist. Unter diesen Bedingungen ist die Reaktion im wesentlichen in 15 Stunden beendet.

Das Reak tionsgemisch wird hernach zum Entfernen der Fest stoffe filtriert und das Filtrat mit einem stark sau ren Katio:nenaustauschharz in der Ammoniumform zum Zwecke der Entfernung von L-Lysin behandelt.

Die unveränderte Diaminopimelinsäure verbleibt in Lösung und wird durch Zusammenbringen der Lö sung mit einem stark sauren Kationenaustauschharz in saurer Form .auf diesem zurückbehalten, die Di- am:inopimelinsäure aus dem Harz mit einer 5 bis 15 %igen Ammonumhydroxydlösung gewonnen und dieses Eluat bis zur Trockne abgedampft.

Die so erhaltene Diaminopimelnsäure besitzt für den Zweck der vorliegenden Erfindung eine genügende Reinheit. Das bei der ersten Harzbehandlung absorbierte L Lysn kann wie das Beispiel (Teil b) veranschau- licht, zurückgewonnen werden.

In einer andern Alter native kann es mit verdünnter Natrium- oder Ka:lium- hydroxydlösungentfernt, das Eluat mit einem Ka- tionenaustauschharz zur Entfernung des Alkahions behandelt, und das L-Lys.in aus der Lösung durch Kristallisieren gewonnen werden.

Eine weitere Reini- gung wird auf :gewöhnliche Art vorgenommen.

Die in der vorliegenden Erfindung als Ausgangs material benützte chemisch synthetisierte Diamino- pimelinsäure kann in jeder passenden Art hergestellt werden.

Eine :geeignete Methode ist ein Druckgefäss mit25 Gewichtsteilen Glutaraldehyd, 200 Gewichts- teilen Wasser, 14 Gewichtsteilen Cyanwasserstoff und 34 Gewichtsteilen Ammoniumcarbonat zu füllen und das Gemisch unter Druck bei 60-100 C während 4 Stunden unter Bildung von Trimethylen bis-(5,5')- hydantoin zu erhitzen:

. Dieses Bis-hydantoin wird aus der erhaltenen Lösung kristallisiert und aus. Äthanol- Wasser rekristallisiert. Es wird eine 90%-ige Aus- beute von Hydantoin, bezogen auf :den Glutaraldehyd, erhalten, welches einen Schmelzpunkt von 232 bis 236 C aufweist;

Analyse: C 45;8; H 5,15; N 22,7 (berechnet für C.H1204N4: C 45;0; H 5,04; N 23;3). Dieses Hydantoin wird in die Dia:mmopimelinsäure durch Erhitzen mit 4-8 Äquivalenten konzentrierter Salzsäure während 4 Stunden bei 150-200 C unter Druck hydrolysiert. Das Produkt wird in über 90%iger Ausbeute, bezogen auf das Hydantoin, durch Absorption auf :

ein stark saures Kationenaus- tauschharz, Herauswaschen der Diaminopimelinsäure aus dem Harz mit einer 15 %gen Ammonium- hydroxydlösung und durch Abdampfen des Eluats bis zur Trockne erhalten.

In den folgenden Beispielen, welche die einzelnen Verwirklichungen der vorliegenden Erfindung ver anschaulichen, bedeuten: Teile, falls nichts anderes angegeben wird, Gewichtsteile.

Beispiel a) Herstellung des Enzymgemisches Eine Kultur von Aerobacter aerogenes ATCC 12409 wurde während 16 Std. bei 25 C unter hef- tigem Rühren in folgendem Medium, welches vorher in einem Autoklaven während 5 min bei einem Druck von 1 Atmosphäre sterilisiert wurde, wachsen gelassen..

EMI0003.0124

(NH4)2HP04 <SEP> 0,5 <SEP> Gew.O/o
<tb> Maiseinweichflüssigkeit <SEP> 0,5 <SEP> Gew. /o.
<tb> Glucose <SEP> 0,5 <SEP> Gew. /0 Zu diesem Gemisch wurde ein Dow Corning- Antischaummittel A (ein A.ntischaummittel vom Silicon-Typus)

als Schaumbrecher hinzugefügt. Die Aerobader aero.gänes-Zellen wurden aus dar Flüssig keit durch - Zentrifugieren -und durch einmaliges Wäschen mit Wasser gewonnen. Die Zellen wurden unter heftigem Rühren in. 5 Volumen Aceton bei Zimmertemperatur hineingeschüttet.

Das Gemisch wurde hernach während 2 min gerührt und, nach Stehenlassen der Lösung, :bis der grösste Teil der Zellen sich niedergeschlagen hat, wurde die obere Schicht dekantiert. Zu den zurückgebliebenen Fest stoffen wurde :

noch einmal 5 Volumen Acaton hin- zugefügt und nach Filtrieren zu einem Pulver an der Luft getrocknet. Proben dieses Enzymgemisches wur den während mehrerer Monate bei 5 C, ohne be- deutende Aktivitätsabnahme, aufbewahrt.

b) '. Herstellung von L-Lysin und Wiedergewinnung von unveränderter D-Diaminoplmelinsäure Eine Lösung von 3 Teilen synthetischer Diamino- pisuelinsäure in 1000 Teilen Wasser, deren. pH auf 7,5 mit Natriumhydroxyd eingestellt wurde, wurde kräftig wahrend 15 Std.

mit 5 Teilen des hergestellten Enzymgemisches gerührt. Um ein-Bakterienwachstum zu verhindern, wurden 10 Teile Toluol hinzugefügt. Die Lösung wurde ,

anschliessend durch Keselgur als Filterhilfsmittel filtriert und das Filtrat durch 500 Teile eines stark sauren Kationenaustausch- harzes (Handelsmarke Döwex 50 von der Maschen grösse 8 X) ih' der Ammoniumform zur .Gewinnung des sich gebildäten L-Lysins durchfliiess:en; gelassen.

Das Harz wurde zweimal mit Wasser gewaschen, und die Waschflüssigkeit und der Ausfluss durch 500 Teile eines stark sauren Kationenaustauschharzes in der sauren- Form, zur Entfernung der unveränder- ten Diaminopimelinsäure, durchgesetzt. Nach ,

gründ- lichem Waschen dieses Harzes mit Wasser wurde die absorbierte Diaminopimelinsäuredurch Waschen mit 5 % igem Ammoniumhydroxyd wieder gelöst. Die Lösung wurde bis zur TrockneRTI ID="0003.0232" WI="19" HE="4" LX="1619" LY="1819"> abgedampft, wobei sich der Ammoniak verflüchtigte,

und auf diese Art die Diaminopimelinsäure gewonnen. Das in der Am- moniumform am benützten Kationenaustauschharz absorbierte L-Lysin wurde durch Waschen dieses Harzes mit 5 %igem Ammoniumhydroxyd wieder aufgelöst.

Dieser Ausfluss wurde, bis zur vollständigen Entfernung von Amüloniäk konzentriert. Der pH dieser Lösung wurde mit Salzsäure auf 5,1 einge- stellt, und nach Filtrieren mit Kieselsur als Filter hilfsmittel wurde die Lösung konzentriert und,

in 5 Volumen Methanol hineingegossen. Der Nieder schlag wurde gewaschen und getrocknet. Eine chro- matosgraphische Analyse zeigte, dass das Material aus L-Lysin-hydrochlorid .mit nur Spuren von andlern Aminosäuren besteht.

c) Racemisieren der wiedergewonnenen D-Diaminoplmelinsäure und Mono- carboxylierung zu L Lysin.

Eine 5 %ige Lösung der wiedergewonnenen un- veränderten Diaminopfnelinsäure wurde .in 5n Salz- säurehergestellt Diese wurde in einem Druckgefäss dicht verschlossen und auf 180 C während 13 Std. erhitzt.

Nach Öffnen des Gefässes wurde die über schüssige, Salzsäure durch Verdampfen der .Lösung bis zur Trockne entfernt. Der Rückstand wurde in Wasser gelöst und der pH der Lösung auf 7,5 mit Natnumhydroxyd-Lösung eingestellt. Diese Lösung wurde dann mit dem mit Aceton ,getrockneten Pulver präparat von Aerobacter aerogenes ATCC 12409 behandelt.

Es wurde .in 67Q/oiger Ausbeute das L Lysin erhalten, ,das heisst 67 % der anfänglich ver- wendeten Diaminopimelinsäure wurde in L=Lysin umgesetzt.

Die Identifikation des Lysins als das einzige Pro dukt der enzymatischen Decarboxylierung der Di@ amiinopimelinsäure wurde durch Papierchromatogra phie vorgenommen. Eine Probe des Reaktionsge misches wurde auf ein Filterpapier Ni. 1 von What- man aufgetüpfelt und unter Benützung <RTI

ID="0004.0050"> eines Ge misches von Methanol: Wasser: lOn Salzsäure: Pyri din im Verhältnis von80: 17,5:2,5: 10 als steigende Phase entwickelt. Ein Vergleich der Ausgangslösung mit der Endlösung zeigte, dass sich nur Lysin gebil det hat.

Die Menge des gebildeten L-Lysins wurde enzymatisch durch Behandlung einer Probe mit L-Lysin decarboxylase (International Minerals and Chemical Corp., Chicago, Ill.)

und durch Messen des freigewordenen Kohlendioxyds bestimmt. Die Papier- chromatographie der geprüften Probe zeigte unter Benützung dergleichen Lösungsmittel, dass alles Lysin in das Cadaverm umgesetzt wurde.

Eine Probe von 3,6 .mg einer reinen D-Diamno- pimelinsäure in. 2;0 ml einer 1n Salzsäure wurde in ,einem Mikroca@riusrohr zugeschmolzen und bei 170 C während 48 Std. erhitzt.

Aus der Menge des ent wickelten Kohlendioxyds während der enzymatischen Behandlung - der racemisierten Probe konnte ge- schlossen werden, dass 2,

3 mg oder 64 % der D Di- amino#pimelinsäure racemisiert und in das L-Lysin umgesetzt wurden.

Die Racemisierung von D-Di-aminopi@melinsäure in alkalischer Lösung wurde durch Erhitzen von 5,3 mg der D-Diaminopimehnsäure in 2 ml von l.n Natriumhydroxyd bei 150 C während 20 Std. in einem geschlossenen Miikro-Cariu,srohr bewiesen.

Die Menge des durch die enzymatische Behandlung des Produktes entwickelten Kohlendioxyds zeigte an, dass 0,6 mg oder 15 /o in das LrLysin umgesetzt wurden.

Eine Probe von 7,3 mg von D-Diaminopünel:im- säure in 2,0 ml von 0,2n Natriumhydroxyd wurde in .einem Mikro-Cariusrohr versiegelt und während 48 Std. bei 170 C erhitzt.

Die Menge des Kohlen dioxyds, welche sich während des enzymatischen Be handlung der .racemisierten Probe entwickelte, zeigte, dass 1,5 mg oder 2119/9 der D-Diaminopünelinsäure in das L Lysin umgesetzt wurden.

Claims

PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch Monodecarboxyllerung von chemisch synthetisierter Dzammopünelinsäure, dadurch :

gekennzeichnet, dass man die, DL-Diaminopimelinsäure mit Monod,e- carboxylierungsenzympräpar aten in wässriger Lösung behandelt, das -entstandene L-Lysin und die unver brauchte D-Diaminopimelinsäurs voneinander trennt, die wiedergewonnene D-Diaminopimelinsäure in einer wässrigen,

sauren Lösung racemisiert, die racemisserte Diaminopimelinsäure mit Monodecarboxylierungs- enzympräparat, wie vorher, behandelt und zusätz- lich das entstandene L-Lysin aus dem Reaktions- gemisch gewinnt. UNTERANSPRÜCHE 1.

Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge- kennzeichnet, dass das Monodecarboxylierungsenzym durch den Organismus von Aerobacter aerogenes, Bac'dlus sphaericus, Sarcina lutea oder Sarcina urea erzeugt wird.

2. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge- kennzeichnet, dass das Mo:nodecarboxylierungsenzym durch einen Stamm von Escherichia coli, welcher zum Wachsen kein Lysin verbraucht, erzeugt wird.

3. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass die Monodecarboxylierung zum L-Lysin bei 20-45 und bei einem pH von 6,5 bis 8,5 vor sich geht. 4. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge- kennzeichnet, dass zur Umsetzung 0,1 bis 3 19/aige wässrige Lösungen von Diaminopimelinsäure verwen det werden.

5. Verfahren .nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass 5-20 Teile Enzympräparat pro 1000 Teile Lösung zur Umsetzung benützt werden. 6. Verfahren nach Unteranspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Enzym das durch den Orga nismus Aerobacter aerogenes .gebildete verwendet wird.

7. Verfahren :nach Patentanspruch., RTI ID="0004.0237" WI="13" HE="4" LX="1767" LY="1994"> dadurch ge- kennzeichnet, dass die Racemisierung der D-Diami:no- pimehnsäure in wässriger Lösung bei 125-230 C vor genommen wird. B.

Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge- kennzeichnet, dass die Racemisierung in einer 0,5 bis 10o/oigen wässrigen Lösung an gewonnener D-D.iaminopimelinsäure in einer 0,1 bis 10 normalen Säure vorgenommen wird.