CH382917A

CH382917A - Procédé pour la production d'un virus-vaccin contre la maladie des chiens

Info

Publication number: CH382917A
Application number: CH197360A
Authority: CH
Inventors: Jack Cabasso Victor
Original assignee: American Cyanamid Co
Priority date: 1959-02-24
Filing date: 1960-02-22
Publication date: 1964-10-15
Also published as: US2965544A; BE587925A; BR6017143D0

Description

Procédé pour la production d'un virus-vaccin contre la maladie des chiens
La présente invention se rapporte à un procédé pour la production d'un virus-vaccin amélioré contre la maladie des chiens ( canine distemper ). On utilisera dans ce mémoire l'abréviation M. C. pour désigner cette maladie.

Le virus-vaccin anti-M. C. est ordinairement préparé en développant une souche avirulente apte à se propager dans les embryons de poussins, en inoculant cette souche à des embryons de poussins vivants, en incubant les embryons pendant un certain nombre de jours et en récoltant le tissu infecté. Le vaccin anti-M. C. standard est efficace immunologiquement mais présente le désavantage d'tre contaminé par le tissu embryonnaire qui, quelquefois, peut provoquer des réactions secondaires indésirables chez l'hôte.

Jusqu'à présent, on en était réduit à tolérer ces réactions secondaires afin d'obtenir l'immunité voulue.

Le but de la présente invention est de rendre possible la propagation du virus M. C., adapté aux embryons de poussins, dans des cultures de tissu ne contenant qu'une quantité minimum de tissu embryonnaire de poussin. La solution de ce problème n'est toutefois pas aisée. Les essais effectués en vue de propager le virus M. C. modifié dans des tissus de chiens ou de furets ont échoué et, antérieurement à la présente invention, aucun virus-vaccin propagé dans des tissus n'a pas pu tre préparé.

La présente invention a pour objet un procédé pour la production d'un virus-vaccin amélioré contre la maladie des chiens, ce procédé étant caractérisé en ce qu'on fait subir au virus de la maladie des chiens des passages dans des embryons de poussins vivants, en un nombre suffisant à produitre l'avirulence, on inocule une culture de tissu embryonnaire de poussin avec le virus avirulent, on incube la culture et on récolte le vaccin formé.

Le virus récolté à partir des embryons infectés se propage dans la culture de tissu embryonnaire de poussin, et les vaccins récoltés à partir des virus ainsi cultivés sont pratiquement exempts des désavantages propres au virus-vaccin anti-M. C. standard obtenu par culture dans des embryons vivants. Apparemment la culture de tissu embryonnaire de poussin ne provoque pas de réactions secondaires indésirables chez l'hôte lorsque ces vaccins sont utilisés pour immuniser les chiens. On ignore lesquels des constituants présents dans l'oeuf embryonné provoquent lesdites réactions secondaires et manquent dans le vaccin préparé suivant la présente invention. Par conséquent, on n'entend limiter l'invention à aucune théorie relative à l'origine des désultats améliorés obtenus.

Il arrive fréquemment qu'un vaccin, ou plutôt le constituant virus du vaccin, perd son pouvoir antigène lorsqu'il est cultivé en série dans des tissus hétérologues. Le virus-vaccin obtenu suivant la présente invention présente l'important avantage que cette perte de pouvoir antigénique ne se produit pas, mme après 42 passages du virus dans les cultures de tissu embryonnaire de poussin. Le vaccin résultant est antigénique à la dose de virus CEDÏO remarquablement faible de 0,15 par 0,2 cc (la dose efficace CED50, déterminée par la méthode décrite à l'exemple 2, est exprimée logarithmiquement). Le virus peut tre récolté sous forme de vaccin après le premier passage dans la culture de tissu.

Il est toutefois préférable de récolter le virus après un nombre de passages plus élevé étant donné que le titre augmente quelque peu en fonction des passages successifs.

Au cours des passages successifs dans les cultures de tissu embryonnaire de poussin, le pouvoir antigénique du virus reste pratiquement inchangé et le virus conserve sa virulence vis-à-vis des embryons de poussins vivants. Le titre en virus est de 100.0 à 104z5 par cm3 de la suspension de culture infectée. Ces titres sont du mme ordre de grandeur que ceux obtenus avec des virus cultivés dans des embryons de poussins vivants.

L'efficacité des vaccins obtenus par passage du virus dans des cultures de tissu a été déterminée par des méthodes de neutralisation de virus en utilisant le virus M. C. primitif, et par la méthode standard d'immunisation des furets. Les résultats de ces essais sont décrits en détail dans les exemples.

Le vaccin produit par le procédé suivant l'invention présente l'avantage de ne pas tre particulièrement labile et de se laisser sécher à partir de l'état congelé, en vue de son stockage, sans que son activité subisse une réduction. Les pertes de CED50/cmS se montent à 1,0-1,5 au plus, et on n'observe aucune réduction de l'activité immunologique étant donné que la valeur de CED,, se maintient bien au-dessus du minimum requis pour une immunisation efficace.

On peut ainsi réaliser l'amélioration du vaccin, laquelle se traduit par l'absence de réactions secondaires graves, sans qu'elle soit contrebalancée par d'autres inconvénients.

Le tissu de culture utilisé pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention peut tre obtenu à partir d'embryons de poussins de tout âge. L'obtention de ces cultures ne présente donc pas de difficultés particulières. On obtient d'excellents résultats en utilisant des cultures de tissus préparées à partir d'embryons de 9 jours, ces cultures ne constituant toutefois que des exemples illustratifs.

Exemple
On prépare des cultures de tissu embryonnaire total trypsinisé, à partir d'embryons de poussins de 9 jours, par la méthode standard de Dulbecco et
Vogt (J. Exp. Med., vol. 99, page 167). On utilise les cultures dans des flacons type Povitsky. Comme milieu de culture liquide, on utilise le milieu basal d'Earle contenant de la lactalbumine hydrolysée et de 15 à 20 O/o de sérum de veau normal. Immédiatement avant l'inoculation dans chaque passage, on ajoute 100 cc du milieu dit mélange synthétique
No 199 décrit dans Proc. Soc. Exp. Biol. and Med., vol. 73, page 1. Pour l'inoculation on utilise le virus
M. C. modifié obtenu après le 48e passage dans des embryons de poussins vivants. Comme matière à inoculer, on utilise 5 cc d'une suspension à 400/0 de membrane chorioallantoïque infectée.

On incube les flacons à 370C et les examine au microscope pendant 7 jours. On n'observe aucun effet cytopathogénique sérieux. Chaque passage est effectué en séparant des couches individuelles, en les introduisant dans le liquide, en refroidissant le liquide, en broyant le mélange et en inoculant avec 0,5 cc de suspension par flacon de culture de tissu. On effectue des transferts successifs. Après le 15 passage et dans 64 passages au total, les fractions recueillies sont inoculées sous forme de suspension non diluée et, en plus, titrées dans des embryons de poussins.

Les titres déterminés sont compris entre 1021 et 1059 et en majeure partie entre 10 : l et 1010. Ces titres sont du mme ordre de grandeur que ceux obtenus par passage du virus dans des embryons de poussins vivants.

On détermine les rendements des 19e et 20 passages après des temps d'incubation différents et constate que le maximum est atteint le quatrième jour.

Après récolte du produit obtenu par une incubation de 4 jours et broyage dans un mélangeur type
Waring, on sèche les suspensions dans le vide à partir de l'état congelé, en vue du stockage du vaccin.

L'identité du virus dans les vaccins obtenus est déterminée par l'essai de neutralisation en utilisant du sérum de chien immunisé contre la M. C. et du sérum de chien normal, à une dilution de 1: 8, les vaccins étant dilués au taux de 1:10. On détermine la CED, (1 en inoculant la membrane chorioallan- toique d'embryons de poussins avec des doses de 0,2 cc de chaque passage successif, dilué au taux de 1:10, et en faisant suivre une incubation de 7 jours à 35-36" C. On examine les membranes infectées quant à l'épaississement caractéristique et aux foyers opaques. On calcule la CED.-,0 selon la formule de
Reed et Muench, indiquée dans Am. J. Hyg., vol. 27, page 493.

Les valeurs CED, > ainsi obtenues sont celles indiquées dans la partie générale de ce mémoire.

On détermine l'efficacité des vaccins obtenus suivant l'exemple 1 en inoculant à des furets, par voie intrapéritonéale, 1,0 cc de suspension fraîche non diluée, et à d'autres furets, des doses de 1 cc de vaccin obtenu par reconstitution des vaccins séchés, au volume étalon, avec de l'eau distillée stérile. On effectue, en outre, des dilutions 1:10, 1:100 et 1:1000.

On infecte les furets d'essai et les furets témoins normaux qui n'ont pas reçu de vaccin, avec une souche standard de virus M. C. virulent. Les résultats de ces essais sont résumés dans le tableau qui suit. Les vaccins utilisés sont prélevés à des niveaux de passage différents.

Tableau I
Immunisation de furets par des virus M. C. obtenus par passage dans des cultures de tissu
Effets de l'infection :
Nombre Inoculum CED Nombre des animaux de Dilution 5n succombant à l'infection I
passages (1 cc) inJectée nombre total des animaux
infectes
Furets Furets
immunisés témoins
22 non dilué 2,9 0/2 2/2
34 non dilué 3,4 0/2
42 non dilué 5,2 l/2(1)(2
10-i 4,2 0/3
10-- 3,2 2 O/2'2 2/2
10- 2,2 0/3
10-4 1,2
10-Ï 0,2 0/3 1.

Un furet a péri à la suite d'une pneumonie,
10 jours après l'infection, sans apparition des
symptômes de la maladie des chiens.

2. Les furets qui ont péri à la suite de complica
tions intercurrentes avant l'infection et sans avoir
montré de symptômes de la maladie des chiens,
ne sont pas énumérés dans le tableau.

Le tableau montre qu'une immunité totale est obtenue dans tous les cas, mme à une dilution de 1:1000 et avec une dose CET", de 0,2 seulement.

Les vaccins reconstitués, dont trois proviennent de 3 niveaux de passage différents et l'un est utilisé, d'une part, à l'état non dilué et, d'autre part, à 3 dilutions différentes, sont utilisés de la mme manière que les vaccins frais. Les résultats de ces essais sont résumés dans le tableau II.

Tableau II
Immunisation de furets par des vaccins anti-M. C.
obtenus dans des cultures de tissu expérimentales
Effets de l'infection
Nombre Inoculum CED Nombre des animaux
de Dilution tO succombant à l'infection/
passages (1 cc) mlectée nombre total des animaux
infectés
Furets Furets
immunisés témoins
33 non dilué 2,7 0/3 2/2
33 non dilué 2,2 0/3 2/2
34 non dilué 3,2 1/6(1 4/4
10-1 2,2 0/3
10-" 1,2 0/3
10-3 0,2 0/3 1. Un furet a péri à la suite de complications inter
currentes sans avoir montré de symptômes de la
maladie des chiens.

Le tableau II montre que, comme dans le cas du vaccin frais, on obtient une immunisation efficace uniforme. Dans aucun cas n'observe-t-on des réactions secondaires telles qu'elles se produisent quelquefois quand on utilise des vaccins anti-M. C. obtenus par des passages en série dans des embryons de poussins vivants.

Claims

REVENDICATION Procédé pour la production d'un virus-vaccin contre la maladie des chiens, caractérisé en ce qu'on fait subir au virus de la maladie des chiens des passages dans des embryons de poussins vivants, en un nombre suffisant pour produire l'avirulence, on inocule une culture de tissu embryonnaire de poussin avec le virus avirulent, on incube la culture et on receuille le vaccin formé.

SOUS-REVENDICATIONS 1. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce qu'on fait passer le virus avirulent successivement dans plusieurs cultures de tissu embryonnaire de poussin.

2. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce que le vaccin récolté est séché à l'état congelé.