Verfahren zur Herstellung von penicillinspaltenden Enzympräparaten Es ist vorgeschlagen worden, 6-Aminopenicillan- säure herzustellen, indem man Suspensionen oder Extrakte von solchen penicillinspaltenden Bakterien, welche bevorzugt die Amidbindung in der 6-Stellung des Penicillinmoleküls angreifen, auf Penicilline ein wirken lässt.
Für die Eignung der benötigten Bakterienmasse zur Penicillinspaltung ist es keineswegs gleichgültig, unter welchen Bedingungen die Organismen kulti viert worden sind. Beimpft man eine Nährlösung von pH 7,0, welche neben den zur Züchtung von Mikro organismen erforderlichen Ionen als N-Quelle Am moniumionen, Caseinhydrolysat oder Fleischpepton und als Energie und C-Quelle Glukose, Lactose oder Saccharose enthält, mit einem geeigneten Bakterien stamm, so erhält man nach der Kultivierung unter Belüftung bei ca.
301> C wohl eine recht hohe Aus beute an Bakterienzellmaterial, doch ist das Penicil- linspaltungsvermögen dieser Zellen gering. Eine ge wisse Steigerung der gewünschten enzymatischen Ak tivität erhält man bei Verwendung von Glycerin oder Salzen organischer Säuren, wie z. B. Milchsäure oder Bersteinsäure als Energie- und C-Quelle.
Es wurde nun gefunden, dass man die penicillin- spaltende Aktivität von Bakterien steigern kann, wenn man sie - bevor man sie auf Penicillin einwir ken lässt - nach an sich üblichen Methoden unter Belüftung in solchen Nährlösungen züchtet, die höchstens unbedeutende Mengen von vergärbaren Kohlenhydraten enthalten und denen Phenylessig- säure oder deren Derivate in Mengen von 0;002 bis 2 % zugesetzt sind, wobei gegebenenfalls während des Wachstums Kohlendioxyd eingeleitet wird.
Es lässt sich Bakterienzellmasse von gutem Peni- cillinspaltungsvermögen gewinnen, wenn man als hauptsächliche Energie- und Stickstoffquelle Amino- säuregemische in Form von Eiweisshydrolysaten oder Peptidgemische in Form von Peptonen oder noch höher molekulare Proteine zur Herstellung der Nähr lösung verwendet.
Es ist zweckmässig, solchen Nähr lösungen neben den üblichen anorganischen Ionen, wie S04--, P0;4---, Mg+ +, K+, Na+, Cl- noch ein Vitamin- und Wuchsstoffgemisch, wie z. B. Hefe wasser, in geringen Mengen zuzusetzen.
Durch Zusatz von Phenylessigs:äure, ihren Salzen und Derivaten zur Nährlösung kann man die ge wünschte enzymatische Aktivität der Bakterien stei gern. Ferner kann man das Penicillinspaltungsvermö- gen der Bakterienmasse dadurch weiter erhöhen, dass in solche Kulturen während des Wachstums der Bakterien ausser Luft noch Kohlendioxyd eingeleitet wird.
Es wird vorzugsweise als Hauptnährboden bestandteil Maisquellwasser verwendet. Dieses ent hält gut geeignete Energie- und Stickstoffquellen, Vi tamine und Wuchsstoffe und ferner die obengenann ten anorganischen Ionen. Dieser Grundnährlösung werden erfindungsgemäss Phenylessigsäure, Phenyl- acetamid, Phenacetursäure, PhenacetylLzlutaminsäure oder andere Derivate der Phenylessigsäure zugesetzt. Das Kohlendioxyd kann entweder der zur Sauer stoffversorgung der Kulturen verwendeten Luft bei gemischt werden oder aber von der Belüftung ge trennt in die wachsenden Kulturen eingeleitet werden.
Die Temperatur der Kulturen kann 20-45 C betra gen. Zweckmässig lässt man die Kulturen 12-20 Stunden bei 30-35 C wachsen.
Nach dieser Zeit werden die Bakterienzellen zweckmässig abgetrennt und gewaschen. Man kann sie dann auf Penicilline einwirken lassen. Da das gewünschte penicillinspaltende Enzym fest an die Zellwand der Bakterien und nicht an cytoplasma- tische Bestandteile der Zellen gebunden ist, kann man das Enzymmaterial nach beendeter Einwirkung aus den Penicillinspaltungsansätzen durch Abzentri- fugieren zurückgewinnen und für weitere Ansätze wieder verwenden.
<I>Beispiel 1</I> <I>Vergleichsbeispiel</I> 160 Liter 2-Vol. % ige Maisquellwasserlösung werden mit KOH auf pH 7,0 eingestellt und 30 Mi nuten auf 12011 C erhitzt. Nach Abkühlung wird die Lösung durch Zentrifugieren geklärt und nach Zu satz von 0,5 % Glukose 40 Minuten bei 110o C im Fernenter sterilisiert. Diese Nährlösung wird nach Abkühlung mit 400 ccm einer 18stündigen Schüttel kultur von E.coli ATCC <B>11105</B> beimpft.
Der Ansatz wird dann mit 150 Liter Luft/Min. bei 150 Umdre hungen des Rührwerkes pro Minute belüftet und 17 Stunden bei 31() C kultiviert.
Die Bakterienzellen werden aus der Kulturlösung abzentrifugiert, in 16 Liter '/15 m Phosphatpuffer- lösung von pH 6,0 gewaschen und nach dem Abzen- trifugieren in 16 Liter<B>75</B> m Phosphatpufferlösung von pH 7,0 resuspendiert. In dieser Suspension wird trok- kenes Penicillin G bis zu einer Konzentration von 5000 i. E./ccm gelöst und 0,4 % Toluol zugegeben.
Der Ansatz wird 12 Stunden bei 37,1 C gehalten und enthält nach dieser Zeit noch 4200 i. E. Penicillin G pro Suspension. Das Filtrat einer Probe dieser Sus pension wird nach bekannten Methoden mit Phenyl- acetylchlorid umgesetzt und lässt sich so bis auf 4850 i. E. Penicillin G/ccm reaktivieren.
<I>Beispiel 2</I> <I>Vergleichsbeispiel</I> 160 Liter sterile, wie in Beispiel 1 hergestellte Maisquellwasserlösung, jedoch ohne Zusatz von Glu- kose, werden mit 400 ccm einer 18stündigen Schüt telkultur von E. coli ATCC 11105 beimpft. Der An satz wird mit 150 Liter Luft/Min. bei 150 Umdre hungen des Rührwerkes pro Minute belüftet und 17 Stunden bei 31o C kultiviert.
Die Bakterienzellen werden aus der Kulturlösung abzentrifugiert, in 16 Liter 'h5 m Phosphatpuffer- lösung von pH 6,0 gewaschen und nach Abzentrifu- gieren in 16 Liter '/5 m Phosphatpufferlösung von pH 7,0 resuspendiert. In dieser Suspension wird trockenes Penicillin G bis zu einer Konzentration von 5000 i.
E./ccm gelöst und 0,4 % Toluol zugegeben. Der Ansatz wird 5 Stunden bei 370 C gehalten und enthält nach dieser Zeit noch 600 i.E. Penicillin G pro ccm Suspension. Das Filtrat einer Probe dieser Suspension wird nach bekannten Methoden mit Phe- nylacetylehlorid umgesetzt und lässt sich so bis auf 4650 i.E. Penicillin G/ccm reaktivieren.
Bei den Beispielen 1 und 2 wurde dem Kultur medium keine Phenylessigsäure zugesetzt. Dement sprechend waren die Ausbeuten schlecht. Aus den nun folgenden Beispielen geht hervor, welch hohe Ausbeuten dann erreicht werden, wenn in Gegen- wart von Phenylessigsäure oder deren Derivaten ge arbeitet wird. <I>Beispiel 3</I> 160 Liter sterile, wie in Beispiel 2 hergestellte Maisquellwasserlösung, jedoch mit Zusatz von 0,2 % Kaliumphenylacetat, werden mit 400 ccm einer 18- stündigen Schüttelkultur von E. coli ATCC 11105 beimpft.
Der Ansatz wird mit 150 Liter Luft/Min. bei 150 Umdrehungen des Rührwerkes pro Minute belüftet und 17 Stunden bei<B>310</B> C kultiviert.
Die Bakterienzellen werden aus der Kulturlösung abzentrifugiert, in 16 Liter '/n m Phosphatpuffer- lösung von pH 6,0 gewaschen und nach Abzentri- fugieren in 16 Liter \/i; m Phosphatpufferlösung von pH 7,0 resuspendiert. In dieser Suspension wird trok- kenes Penicillin G bis zu einer Konzentration von 10000 i.E./ccm gelöst und 0,4 % Toluol zugegeben.
Der Ansatz wird 5 Stunden bei 30o C gehalten und enthält nach dieser Zeit noch 1500 i. E. Penicillin G pro ccm Suspension. Das Filtrat einer Probe dieser Suspension wird nach bekannten Methoden mit Phe- nylacetylchlorid umgesetzt und lässt sich dadurch bis auf 9500 i. E. Penicillin G/ccm reaktivieren.
<I>Beispiel 4</I> 160 Liter sterile, wie in Beispiel 2 hergestellte Maisquellwasserlösung, jedoch mit Zusatz von 0,2 % Kaliumphenylacetat, werden mit 400 ccm einer 18- stündigen Schüttelkultur von E.-coli ATCC beimpft.
Der Ansatz wird mit<B>150</B> Liter Luft/Minute bei 150 Umdrehungen des Rührwerkes pro Minute belüftet und 17 Stunden bei 31o C ohne überdruck kultiviert. Während der gesamten Wachstumszeit werden durch eine von der Luftleitung des Fernenters getrennte Leitung 5 Liter Kohlendioxyd pro Minute in die Kultur eingeleitet.
Die Bakterienzellen werden aus der Kulturlösung abzentrifugiert, in 16 Liter '/s5 m Phosphatpuffer- lösung von pH 6,0 gewaschen und nach erneuter Abtrennung in 16 Liter '/5 m Phosphatpufferlösung von pH 7,5, welche 100000 i. E. Penicillin G/ecm und 0,4 % Toluol enthält, resuspendiert. Der Ansatz wird 7 Stunden bei 30 C gehalten.
Während dieser Zeit wird das pH des Reaktionsgemisches, welches durch die enzymatisch aus dem Penicillinmolekül ab gespaltene Phenylessigs:äure in den sauren Bereich absinkt, durch wiederholte Zugaben von konzen trierter Na.CO;; Lösung zwischen 7,0 und 7,5 ge halten. Nach der 7stündigen Reaktion enthält der Ansatz noch 12 000 i.E. Penicillin G/ccm Suspen sion. Das Filtrat einer Probe dieser Suspension wird nach bekannten Methoden mit Phenylacetylchlorid umgesetzt und lässt sich dadurch bis auf 91000 i. E. Penicillin G/ccm reaktivieren.
Die in diesem Ansatz gebildete 6-Aminopenicil- lansäure kann als farbloses, kristallines Pulver in guter Ausbeute isoliert werden. <I>Beispiel 5</I> 160 Liter sterile, wie in Beispiel 2 hergestellte Maisquellwasser-Nährlösung, jedoch mit Zusatz von 0,2 % Kaliumphenylacetat werden mit 400 ccm einer 18stündigen Schüttelkultur von E.coli ATCC 9637 beimpft.
Der Ansatz wird mit 150 Liter Luft/Minute bei 150 Umdrehungen des Rührwerkes pro Minute belüftet und 17 Stunden bei 310 C ohne überdruck kultiviert. Während der gesamten Wachstumszeit werden durch eine von der Luftleitung des Fermen- ters getrennte Leitung 10 Liter Kohlendioxyd pro Minute in die Kultur eingeleitet.
Die Bakterienzellen werden aus der Kulturlösung abzentrifugiert, in 16 Liter '/,5 m Phosphatpuffer- lösung von pH 6,0 gewaschen und nach erneuter Ab trennung in 16 Liter '/5 m Phosphatpufferlösung von pH 7,5, welche 50000 i. E. Penicillin G/ccm und 0,4 % Toluol enthält, resuspendiert. Der Ansatz wird 3 Stunden bei 300 C gehalten.
Während dieser Zeit wird das pH des Reaktionsgemisches, welches durch die enzymatisch aus dem Penicillin-Molekül abgespaltene Phenylessigsäure in den sauren Bereich absinkt, durch wiederholte Zugabe von konzentrier ter Na.,C0,3-Lösung zwischen 7,0 und 7,5 gehalten. Nach der 3stündigen Reaktion enthält der Ansatz noch 4700 i. E. Penicillin G/ccm Suspension. Das Filtrat einer Probe dieser Suspension wird nach be kannten Methoden mit Phenylacetylchlorid umge setzt und lässt sich dadurch bis auf 46 500 i. E. Peni cillin G/ccm reaktivieren.
Die in diesem Ansatz gebildete 6-Aminopenicil- lansäure kann nun als farbloses, kristallines Pulver in guter Ausbeute isoliert werden.