Molekülsieb zum selektiven Abtrennen von Molekülen aus Lös-iangsmitteln
Die Erfindung bezieht sich auf ein Molekülsieb zum selektiven Abtrennen von Molekülen aus Lösungsmitteln, welches Sieb mindestens teilweise durch im Lösungsmittel gequollene Gelkörner gebildet wird.
Ferner bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung des Molekülsiebs zur Gewinnung von nicht therapeutischen Zwecken dienenden Substanzen.
Es ist bekannt, Stoffe verschiedener Molekülgrösse mittels einer Schicht aus natürlichen oder in Wasser gequollenen Stärkekörnern aus wässrigen Lösungen zu trennen. Dieses Verfahren weist jedoch mehrere beträchtliche Nachteile auf, und zwar in erster Linie deshalb, weil Stärke bis zu einem gewissen Grade in Wasser löslich ist, weil sie unbeständig ist und weil sie dem Durchfluss durch damit gefüllte Säulen einen grossen Widerstand entgegensetzt. Daher sind die getrennten Präparate immer durch Stärke verunreinigt, und die Schicht aus Stärkekörnern degeliert rasch und wird zu einer schmierigen Masse. Aus diesen Gründen hat dieses Verfahren nur geringe praktische Bedeutung. Mit der Erfindung werden diese Nachteile überwunden und ein Molekülsieb geschaffen, das ein wirksames und befriedigendes selektives Abtrennen von Molekülen ermöglicht.
Das erfindungsgemässe Molekülsieb ist dadurch gekennzeichnet, dass die Gelkörner mindestens teilweise aus vernetzten Polymerisaten bestehen, welche aus aliphatische Hydroxylgruppen enthaltenden Stoffen und bifunktionellen Stoffen der allgemeinen For insel Y-X-Z erhältlich sind, worin Y und Z je ein Halogenatom oder eine Epoxygruppe und X eine aliphatische Gruppe mit 3 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeutet, wobei die vernetzten Polymerisate ein dreidimensionales makroskopisches Netzwerk von Molekülresten aufweisen, die durch kovalente Bindungen in Form von Ätherbrücken der Formel -O-X-O- mit cinander vernetzt sind, wobei diese vernetzten Polymerisate nicht ionisch und im Lösungsmittel unlöslich, jedoch darin quellbar und gegenüber den abzutrennenden Molekülen inert sind,
und wobei ferner der Gehalt an Hydroxylgruppen mindestens 12% des Gewichtes des Gels beträgt.
Erfindungsgemäss wird das Molekülsieb so verwendet, dass eine wässrige Lösung der zu trennenden Moleküle von unterschiedlicher Grösse oben auf eine aus gequollenen Gelkörnern bestehende Schicht, die sich in einer in ein wässriges Medium getauchten Säule befindet, gebracht wird, dass Flüssigkeit aus der Säule abgezogen wird, um die Lösung mit der Gelkörnerschicht in Berührung zu bringen, wobei die in der Lösung befindlichen Moleküle von unterschiedlicher Grösse auf Grund ihrer je nach ihren Molekülgrössen verschiedenen Fähigkeit, die Gelkörner zu durchdringen, zwischen den Gelkörnern und der umgebenden Lösung verteilt werden, wonach eine wässrige Eluierungsflüssigkeit in die Schicht eingeführt wird, um das Lösungsmittel aus der Schicht zu verdrängen, und dass aufeinanderfolgende Fraktionen des verdrängten,
aus der Schicht herausfliessenden Lösungsmittels aufgefangen werden und man eine Fraktion, die einen grösseren Teil der Moleküle mit grösserer Molekülgrösse aufweist, und anschliessend eine Fraktion gewinnt, die einen grösseren Teil der Moleküle mit kleinerer Molekülgrösse enthält.
Mit den Bezeichnungen wässrige Lösung , wässriges Medium und wässrige Flüssigkeit ist hierbei gemeint, dass das Wasser den Hauptbestandteil des Lösungsmittels ausmacht; es kann aber natürlich auch eine bestimmte Menge eines wasserlöslichen organischen Lösungsmittels, wie Alkohole und Ketone, z. B. niedere aliphatische Alkohole und Ketone, enthalten. Auch braucht das wässrige Medium bzw.
die wässrige Flüssigkeit nicht nur aus dem wasser haltigen Lösungsmittel zu bestehen, sondern sie kann auch eine bestimmte Menge gelöster Stoffe, z. B.
Salze, enthalten, um in der Flüssigkeit eine geeignete Ionenkonzentration herzustellen und aufrechtzuerhalten, oder Puffersubstanzen, um einen geeigneten pH Wert zu erzielen. Beispiele der erstgenannten Art von Substanzen sind Natriumchlorid und Ammoniumsulfat, und Beispiele der zweitgenannten Art sind wasserlösliche Acetate, Phosphate, Chlorate, Essigsäure, Chloressigsäuren, Salzsäure und Pyridin.
Die Fähigkeit der beschriebenen Gelprodukte in einem wässrigen Medium zu quellen, beruht auf der Gegenwart von Hydroxyl-Gruppen und Sitherbrük- ken. Diese Quellfähigkeit lässt sich durch die in Gramm angegebene Menge Wasser ausdrücken, die durch ein Gramm des trockenen Gels absorbiert wird, was auch als Wasserwiedergewinn bekannt ist. Der Wasserwiedergewinn der erfindungsgemässen Molekülsiebe liegt in der Regel bei etwa 1-50 Gramm je Gramm des trockenen Gelproduktes, im allgemeinen etwa 1,0 bis 20 g/g des trockenen Gelproduktes. Gelprodukte der beschriebenen Art können durch Polymerisation unelektrischer, organischer Hydroxylgruppen enthaltender Stoffe mit bifunktionellen organischen Stoffen, die Halogenatome und/oder Epoxy Gruppen enthalten, hergestellt werden.
Beispiele von für diese Umsetzung geeigneten, Hydroxylgruppen enthaltenden Stoffen sind: Polysaccharide, z. B. Dextran, Stärke, Dextrin, Cellulose, Polyglukose oder Hydroxylgruppen enthaltende Derivate dieser Stoffe, wie Äthyloxyäthyl-Cellulose oder durch eine teilweise Depolymerisation derselben erhaltende Produkte sowie deren Fraktionen, ferner Polyvinylalkohol, Zukkeralkohole, z. B. Sorbitol und Kohlehydrate, z. B.
Rohrzucker.
Beispiele von für diese Umsetzung geeigneten bifunktionellen Verbindungen sind: Epichlorhydrin, Dichlorhydrin, Diepoxybutan, Bisepoxypropyläther, Athylenglykol-bis-epoxypropyläther und 1, 4-Butan- diol-bis-epoxypropyläther.
Die Mischpolymerisation dieser organischen Hydroxylgruppen enthaltender Stoffe und der bifunktionellen Substanzen geht leicht vor sich, wenn man die Komponenten in wässriger Lösung in Gegenwart eines alkalisch reagierenden Stoffes als Katalysator umsetzt.
Beispielsweise erhält man ein äusserst brauchbares Gelprodukt dadurch, dass man Dextran mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 5000 bis
100000 mit Epichlorhydrin zu einem ein dreidimen sionales makroskopisches Netzwerk aufweisenden Mischpolymerisat umsetzt, das aus Ketten von hauptsächlich alpha-1,6-glycosidisch gebundenen Glukose resten besteht, die über Atherbrücken der Art O-CH2 CH(OH) CH2-O- miteinander verbunden sind. Dieses Gel hat einen Gehalt an Hydroxylgrup pen von mindestens 15 to des Gewichtes des trockenen
Gels und einen Wasserwiedergewinn von etwa 1 bis
50 g/g des trockenen Gelproduktes.
Ein weiteres Beispiel ist ein Gel, das durch Umsetzung von handelsüblichem weissem Dextrin mit Epichlorhydrin gewonnen wird. Dabei erhält man ein aus einem dreidimensionalen makroskopischen Netzwerk bestehendes Mischpolymerisat, das aus Ketten von hauptsächlich alpha-1,4-glycosidisch gebundenen Glukoseresten besteht, die über Atherbrücken -O-CH2 CH(OH) CHffO- miteinander verbunden sind. Dieses Gel weist einen Gehalt an Hydroxylgruppen von mindestens 152 des Gewichtes des trockenen Gels und einen verhältnismässig niedrigen Wasserwiedergewinn von im wesentlichen 1 bis 20 g/g des trockenen Gelproduktes auf.
Auf ähnliche Weise kann weiter ein Gelprodukt der gleichen Grundstruktur aus Kartoffelstärke und Epichlorhydrin hergestellt werden. Dieses Gel hat einen höheren Wasserwiedergewinn, d. h. 10 bis 50 g/g des trockenen Gelproduktes.
Weiterhin kann ein geeignetes Gelprodukt durch Umsetzung von Sorbitol mit Epichlorhydrin hergestellt werden. Dabei erhält man ein Mischpolymerisat aus einem dreidimenionalen makroskopischen Netzwerk aus Sorbitolresten, die über Ätherbrücken -O-CH CH(OH) CH2-O- miteinander verbunden sind und einen Gehalt an Hydroxylgruppen von etwa 15 S des Gewichtes des trockenen Gels und einen Wasserwiedergewinn von etwa 1 bis 30 g/g aufweisen. Dieses Mischpolymerisat eignet sich besonders für Fälle, in denen das Gel mit einer Flüssigkeit von verhältnismässig hoher Acidität, z. B. bei Verwendung von Salzsäure als Puffersubstanz, in Berührung kommt.
Die vorgenannten Gelprodukte werden bis zu einer Teilchengrösse von 0,01 bis 2,0 mm, z. B. von etwa 0,05 bis 0,5 mm, vorzugsweise so klein gemahlen, dass sie ein Sieb mit einer Maschenweite von 56 bis 6560 Maschen je cm2 passieren.
Die Trennfähigkeit der Molekülsiebe hängt einerseits von der Molekülgrösse der zu trennenden Stoffe und anderseits von der Porengrösse oder Maschenweite des dreidimensionalen Netzwerkes des Gelproduktes ab. Die in der wässrigen Lösung befindlichen Stoffe, deren Molekülgrösse zu gross sind, um ein Eindringen in die Gelkörner zu gestatten, verbleiben in der Lösung und passieren die Schicht ausserhalb der Gelkörner. Sie werden in der ersten Fraktion oder den ersten Fraktionen aufgefangen, während die Stoffe, deren Molekülgrösse klein genug sind, um ein Eindringen in die Gelkörner zu gestatten, zeitweilig von den Körnern aufgenommen werden, so dass eine Trennung von den grösseren Molekülen möglich wird und sie in den nachfolgenden Fraktionen aufgefangen werden können.
Die Gelkörnerschicht findet vorzugsweise als Säule Anwendung.
Die Apparatur besteht zweckmässig aus einem zylindrischen Rohr, das unten durch eine poröse Scheibe oder Platte, z. B. eine Sinterglasplatte, die als Halt für die Gelschicht dient, abgeschlossen ist und oben mit Zuleitungsvorrichtungen für die zu behandelnde Lösung der Stoffe verschiedener Molekulargrösse und für die Flüssigkeit zur Verdrängung dieser Lösung durch die Säule hindurch (Eluierungsflüssigkeit) versehen ist. Die Gelteilchen, deren Grösse und Wasserwiedergewinn im Hinblick auf die vorzunehmende Trennung gewählt werden, sollen in der Säule so dicht wie möglich und in solcher Menge gepackt werden, dass sie den grössten Teil des gesamten Packvolumens einnehmen. Der Rest des Packvolumens ist der sog. Leerraum, d. h. der gesamte zwischen den Gelkörnern befindliche Raum. Das kann z.
B. folgendermassen erreicht werden: Man lässt die berechnete Menge an Gel mit enger Korngrössenverteilung so lange im Wasser quellen, bis ein Gleichgewicht erreicht ist. Dann wird gerührt, bis eine gleichmässige Suspension erreicht ist. Diese Suspension wird in das Rohr geschüttet, das bereits teilweise mit Wasser gefüllt worden ist. Während des Packens lässt man das Wasser mit gleichmässiger Geschwindigkeit aus der Säule herausfliessen. Dabei kann man beobachten, dass die Packschicht mit scharf abgegrenztem oberem Spiegel nach oben wächst, oberhalb dessen sich die Gelkörner durch Konvektion in ständiger Bewegung befinden.
Ist die Säule gepackt, so sollte dafür Sorge getragen werden, dass der obere Spiegel der Schicht so gleichmässig wie möglich ist. Dann lässt man das Wasser so lange durch die Schicht fliessen, bis der obere Spiegel derselben praktisch in der Schicht verschwindet. Darauf wird der Zufluss abgestellt und die zu trennende wässrige Lösung wird sorgfältig als eine Schicht von oben auf die Gelschicht geschüttet, worauf das Durchfliessen durch die Schicht wieder beginnt. Von diesem Zeitpunkt an wird die aus der Säule ausfliessende Flüssigkeit als Ausfluss bezeichnet, bis sie praktisch in der Schicht verschwindet. Daraufhin wird die Eluierungsflüssigkeit, die im allgemeinen aus Wasser oder evtl. auch aus Puffersubstanzen enthaltendem Wasser besteht, als eine Schicht von oben auf die Gelschicht geschüttet, wonach der Durchfluss durch die Schicht beginnen kann.
Der erste Ausfluss besteht aus Wasser, bis ein dem Leerraum praktisch entsprechendes Volumen verdrängt worden ist. Dann erscheinen in dem Ausfluss die grösseren Moleküle, die nicht in die Gelkörner eindringen können. Diese werden in einer oder mehreren Fraktionen aufgefangen. Anschliessend - z. B. nach einer Zwischenzeit, während der der Ausfluss aus Wasser besteht - erscheinen in dem Ausfluss die kleineren Moleküle, die zeitweilig physikalisch von den Gelkörnern aufgenommen worden sind. Diese werden in einer oder mehreren Fraktionen aufgefangen.
Schliesslich besteht der Ausfluss wiederum aus Wasser. Dann befindet sich die Schicht wieder in ihrem ursprünglichen Zustand, und die Trennung einer neuen Menge Lösung kann sofort beginnen.
Auf diese Weise kann man Fraktionen erhalten, die einen grösseren Teil der Stoffe mit grösseren Molekülgrössen enthalten, oder nur aus solchen bestehen, und andere Fraktionen, die einen grösseren Teil der Stoffe mit kleineren Molekulargrössen enthalten oder nur aus solchen bestehen.
Um eine wirksame Trennung zu erreichen, ist es wichtig, dass das Volumen der wässrigen Lösung der zu trennenden Stoffe, die auf die Gelschicht gebracht wird, nicht das Wasservolumen übersteigt, das durch die gequollenen Gelkörner absorbiert wird. Diese Wassermenge kann durch eine Formel a WW ausgedrückt werden, in der a das Gewicht der trockenen Gelkörner und WW den Wasserwiedergewinn bedeuten. Die Menge wässriger Lösung, die die zu trennenden Substanzen enthält, sollte also höchstens a WW, vorzugsweise kleiner sein.
Weiterhin ist es wichtig, dass die Fliessgeschwindigkeit der Lösung durch die Gelkörnerschicht nicht zu gross ist. Je nach den Arbeitsbedingungen kann die lineare Fliessgeschwindigkeit bis zu 10 cm/min, vorzugsweise jedoch nicht mehr als 7 cm/min betragen.
Bisher wurde nur ein diskontinuierlicher Betrieb des Apparates beschrieben, doch lässt das Verfahren in geeigneter Weise auch in kontinuierlichen Zyklusstufen durchführen, was z. B. in folgender Weise erfolgen kann:
Sobald noch eine volumenmässig dem Leerraum entsprechende Fraktion, die die kleineren Moleküle enthält, in der Säule ist, wird die wässrige Lösung der im nächsten Zyklus zu trennenden Stoffe von oben auf die Schicht aufgebracht.
Zum Beispiel wird eine Wassersäule kontinuierlich auf der Schicht gehalten und die wässrige Lösung mit den zu trennenden Stoffen in dem unteren Teil der Wassersäule direkt über dem oberen Spiegel der Gelkörnerschicht eingeführt, wo sie eine Schicht bildet, die auf Grund des grösseren spezifischen Gewichtes der wässrigen Lösung das Wasser nach oben verdrängt.
Es hat sich gezeigt, dass Gelkörnerschichten, wie die beschriebenen, auch nach jahrelangem Gebrauch keine Zeichen einer Degeneration aufweisen.
Wird das Verfahren in technischem Massstab durchgeführt, so kann es vorteilhaft sein, wenn in jedem Zyklus nur eine teilweise Trennung bewirkt wird und nur die Fraktionen herausgenommen werden, die einen reinen Stoff, d. h. nur einen der zu trennenden Stoffe enthält, während die anderen Fraktionen, die ein Gemisch der Stoffe enthalten, in die Säule zurückgeführt werden, um zusammen mit einer weiteren Menge der Lösung in einem späteren Zyklus wiedereingeführt zu werden.
Das erfindungsgemässe Molekülsieb kann zur Trennung von Stoffen mit sehr verschiedenen Molekülgrössen angewendet werden, wobei der Unterschied der Molekülgrösse einem Unterschied des Molekulargewichtes von mindestens 100 entspricht. Das für die Trennung verwendete Gel wird im Hinblick auf den im einzelnen angestrebten Zweck, d. h. der zu trennenden Stoffe, des verlangten Trennvermögens und der Fliessgeschwindigkeit durch die Gelkörnerschicht gewählt.
Das vorliegende Verfahren eignet sich insbesondere zur Trennung von kolloidalen Stoffen und kristalloiden Stoffen, z. B. zur Abtrennung von Salzen, wie Natriumchlorid oder Ammoniumsulfat, aus Lösungen, die Kolloide, auch unbeständige Kolloide, z. B. Kolloide biologischen Ursprungs wie Proteine, z. B. Enzyme oder Viren, enthalten. Weitere Beispiele von Stoffen, die auf diese Art gereinigt, d. h. von Verunreinigungen mit verschiedenen Molekülgrössen getrennt werden können, sind anorganische Kolloide, kolloidale Pigmente und Farbstoffe sowie wässrige Dispersionen von Polymerisaten, die durch sog. Emulsionspolymerisation hergestellt worden sind.
Besonders geeignet ist das Verfahren zur Abscheidung von Stoffen mit Molekulargewichten von über 500, z. B. über 1000, da sich solche Stoffe oft nur sehr schwer nach anderen Verfahren abtrennen lassen.
Das Verfahren kann auch zur Fraktionierung einer Reihe von polymeren Homologen, d. h. zur Trennung von polymeren Homologen mit verschiedenen Molekulargewichten, z. B. zur Fraktionierung von wasserlöslichen Polymeren wie Dextran oder teilweise depolymerisiertem Dextran, Stärke und Dextrinen, Pektin, Polyäthylenglykolen oder Derivaten solcher Polymerisate angewendet werden.
Oft kann das Verfahren mit Vorteil auch auf die Behandlung von Proteinen oder Polypeptiden, z. B.
Plasma-Proteinen, Enzymen, wie Pepsin oder eines Bauchspeicheldrüsenenzyms, oder Hormonen, wie Insulin, oder Gemischen, die Polysaccharide, z. B. bakterielle Polysaccharide, wie Dextran und tierische Polysaccharide, z. B. Heparin, ferner Vitaminen, Antibiotica und Alkaloiden angewendet werden.
Wird das Verfahren auf die Trennung sehr komplizierter Gemische, z. B. von Lösungen, die aus biologischen Stoffen erhalten werden, angewendet, so kann man unter Umständen nur eine Gruppentrennung erreichen, wonach zur weiteren Trennung und Reinigung andere Verfahren angewendet werden müssen.
Um die anschliessende Reinigung des jeweiligen Stoffes oder der Stoffe zu erleichtern, kann es in manchen Fällen zweckmässig sein, das Ionmedium für Stoffe zu wechseln, die nicht in die Gelkörner einzudringen vermögen. So ist es beispielsweise möglich, den pH-Wert und die Ionenkonzentration für eine Proteinlösung, die für die Reinigung und Trennung solcher Stoffe von grosser Bedeutung ist, rasch zu wechseln. Dies kann dadurch erreicht werden, dass man die Proteinlösung durch eine Gelschicht führt, in der das wässrige Medium die für den Wechsel des pH-Wertes erforderlichen Puffersubstanzen enthält.
Beispiel 1
Ein Rohr mit einem Durchmesser von 3,5 cm und einer Höhe von 50 cm wurde mit 100 Gramm (Trokkengewicht) von im Wasser gequollenen Gelkörnern (die in trockenem Zustand eine solche Teilchengrösse aufweisen, dass sie ein Sieb mit einer Maschenweite zwischen 1650 und 1760 bis 6560 je cm2 passieren; Wasserwiedergewinn: 2,6 g/g des trockenen Gels WW 2,6) gefüllt. Die Gelkörner waren durch Umsetzung von Dextran mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht (M, v) von 40 000 40000 und Epichlor- hydrin hergestellt. Das Rohr wurde teilweise mit Wasser gefüllt, bevor die Gelkörner eingebracht wurden und zwar so, dass letztere mit Wasser bedeckt waren.
Während des Einfüllens der Körner liess man Wasser mit gleichmässiger Geschwindigkeit aus dem Rohr ausfliessen, bis der obere Wasserspiegel in der gepackten Gelschicht praktisch verschwand. Das Gesamtvolumen der gepackten Gelschicht betrug 390 cm3 und der Leerraum 130 cmS. Anschliessend wurden 5 cm3 einer wässrigen Lösung, die 10 Prozent eines Dextrans (Molekulargewicht = 75000) und 10% Glukose enthielt, auf die Schicht gebracht, wonach diese mit Wasser mit einer Geschwindigkeit von 84 cm5 pro Stunde eluiert wurde. Der Ausfluss wurde mittels eines Fraktionensammlers in Fraktionen von etwa 7 cm5 aufgefangen, die dann jede für sich analysiert wurden. Die ersten 130 cm3 des Ausflusses, die dem Leerraum entsprachen, enthielten Wasser.
Die zwischen 130 und 170 cm liegende Menge des Ausflusses enthielt Dextran und die zwischen 240 und 330 cm5 liegende Menge Glukose. Es wurde eine quantitative Ausbeute erzielt.
Beispiel 2
Auf einer Säule, die der im Beispiel 1 verwen deten entsprach, wurden 15 cm : 3 einer wässrigen Lö- sung gebracht, die 0,18 g Hämoglobin und 4,5 g Ammoniumsulfat enthielt. Anschliessend wurde mit Wasser mit einer Geschwindigkeit von 66 cm5 je Stunde eluiert. Die zwischen 130 und 230 cm:5 liegende Menge des Ausflusses enthielt Hämoglobin und die zwischen 230 und 340 cm3 liegende Menge Ammoniumsulfat. Es wurde eine quantitative Ausbeute erzielt.
Beispiel 3
Eine rohrförmige Säule mit einem Durchmesser von 7,2 cm und einer Höhe von 50 cm wurde wie in Beispiel 1 mit 300 g (Trockengewicht) von in Wasser gequollenen Gelkörnern (die in trockenem Zustand eine solche Teilchen grösse aufweisen, dass sie ein Sieb mit einer Maschenweite von 400 bis zwischen 1600 und 1760 je cm2 passieren. Wasserwie dergewinn: 4,9) gepackt. Die Körner waren durch Umsetzung von Dextran (Molekulargewicht = 40 000) mit Epichlorhydrin hergestellt worden. Das Gesamtvolumen der aus der Gelsubstanz gebildeten Schicht betrug 2000 cm3, der Leerraum 650 cm.
Auf die Schicht wurden 100 cm3 einer 10%gen wässrigen Lösung einer Dextran/Fraktion mit einem Molekulargewicht von 4000 gebracht, wonach mit Wasser mit einer Geschwindigkeit von 240 cm3 je Stunde eluiert wurde. Die ersten 650 cm5 des Ausflusses, die dem Leerraum entsprachen, wurden weggegossen, wonach mittels eines Fraktionensammlers 100 Fraktionen von je 17 cm3 aufgefangen wurden.
Durch Umsetzung mit Anthron wurde die in jeder einzelnen Fraktion enthaltene Menge an Kohlehydrat bestimmt. Die Fraktionen 8 bis einschliesslich 95 enthielten Kohlehydrat. Das Molekulargewicht M" (= durchschnittliche Motekulargewichtszahl z MÖ wurde für jede 5. Fraktion bestimmt, in der der Gehalt an Substanzen genügend hoch war. Hierfür wurden folgende Werte erhalten: 5000, 4600, 4300, 4300, 3100, 2900, 2200
1700, 1600, 1300, 950, 610, 400 und 180.
Beispiel 4
Eine rohrförmige Säule mit einem Durchmesser von 2 cm und einer Höhe von 40 cm wurde wie in Beispiel 1 mit 7 g (Trockengewicht) Gelkörnern (Wasserwiedergewinn 10,0) gepackt. Die Gelkörner liess man zuvor in als Puffersubstanz verwendetem 0,1 -molarem Natriumphosphat mit einem pH-Wert von 7 quellen. Die Gelsubstanz wurde durch Umsetzung von Äthyloxyäthylcellulose und Athylengly- kol-bis-epoxypropyläther hergestellt. Das Gesamtvolumen der Gelschicht betrug 105 cm3 und das des Leerraumes 38 cm3. Auf die Schicht wurden 5 cm3 einer wässrigen Lösung von 60 Milligramm Hämoglobin und 1,5 g Ammoniumsulfat in einer Phosphat Puffersubstanz gebracht, wonach mit einer Phosphat Puffersubstanz (0,1 Molar-pH-Wert = 7) eluiert wurde.
In dem Eluat erschienen Hämoglobin in Phosphat-Puffersubstanz zwischen 40 bis 55 cm8 und Ammoniumsulfat in Phosphat-Puffersubstanz zwischen 55 bis 105 cm3.
Beispiel 5
Eine Säule mit einem Durchmesser von 4 cm und einer Höhe von 26 cm wurde wie in Beispiel 1 mit 15 g (Trockengewicht) von im Wasser gequollenen Gelkörnern (Wasserwiedergewinn 16,0), die durch Umsetzung von Polyvinylalkohol und Epichlorhydrin hergestellt worden waren, gefüllt. Das Gesamtvolumen der Gelkörnerschicht betrug 330 cms und das des Leerraumes 120 cm3. Um festzustellen, wie weit es möglich ist, Dextran zu fraktionieren, d. h. polydisperse Dextranstoffe zu trennen, wurde die Verteilung von 4 Dextransubstanzen in vier getrennten Versuchen bestimmt.
Bei jedem dieser Versuche wurden 5 cm3 einer 10M, igen Lösung der jeweiligen im Wasser gelösten Substanz auf die Säule gebracht und jedesmal mit Wasser mit einer Geschwindigkeit von 20 cm5 je Stunde eluiert. Der Ausfluss aus der Säule wurde mittels eines Fraktionensammlers in Fraktionen aufgefangen. In den beiden ersten Versuchen, die mit einer Dextransubstanz mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 1 800000 bzw. 300000 durchgeführt wurden, erschien das Dextran in dem Ausfluss, nachdem die dem Leerraum entsprechende Menge Ausfluss abgezogen worden war.
In dem 3. Versuch, der unter Verwendung einer Dextransubstanz mit einem Molekulargewicht von 40000 erfolgte, war der Hauptteil des Dextrans in dem Ausfluss enthalten, der nach Abzug einer dem Leerraum entsprechenden Menge folgte, und ein kleinerer Teil erschien später. In dem 4. Versuch mit einer Dextransubstanz mit einem Molekulargewicht von 20000 erschien ein kleinerer Teil des Dextrans in dem Ausfluss, der nach Abzug einer dem Leerraum entsprechenden Menge Ausfluss folgte. Die Hauptmenge des Dextrans kam später. Wie aus diesen Versuchen hervorgeht, ermöglicht das vorliegende Verfahren eine Fraktionierung derartiger Dextransubstanzen in mindestens zwei Gruppen, wobei eine ein Molekulargewicht von mehr als 20000 bis 40000 und die andere ein Molekulargewicht von weniger als 20000 bis 40000 hat.
Beispiel 6
Eine Säule mit einem Durchmesser von 4 cm wurde mit 32 g (Trockengewicht) Gelkörnern (die eine solche Teilchengrösse besitzen, dass sie durch ein Sieb mit einer Maschenweite von zwischen 1600 und 1760 bis 6560 je cm2 passieren. Wasserwiedergewinn 6) gepackt. Diese Gelkörner waren durch Umsetzung von Stärke mit Glycerin-1,3-dichlorhydrin hergestellt worden. Die Gesamtmenge der Gelschicht betrug 314 cm3. In die Säule wurden 5 cm3 einer wässrigen Lösung eingebracht, die 200 mg menschliches Serum Albumin und 200 mg Natriumchlorid enthielt. Die Schicht wurde mit Wasser mit einer Geschwindigkeit von 120 cm3 je Stunde eluiert, und Fraktionen von 5,5 cm8 wurden aufgefangen.
Das Albumin erschien in dem Eluat zwischen 95 und 140 cm3 und das Salz zwischen 270 und 330 cm5.
Beispiel 7
Eine Säule mit einem Durchmesser von 3 cm wurde bis zu einer Höhe von 45 cm mit gequollenem pulverförmigem Gel (mit einer solchen Teilchengrösse, dass dieses ein Sieb mit einer Maschenweite von 6560 bis 22500 je cm2 passierte. Wasserwiedergewinn: 4,9) gefüllt. Dieses Gel wurde zuvor durch Umsetzung von Dextran (Molekulargewicht = 40000) mit Epichlorhydrin hergestellt. Die Schicht aus der Gelsubstanz wurde mit Phosphatpuffer (Ionenkonzentration = 0,03, pH-Wert = 7,03) gewaschen, bis ein Gleichgewicht erreicht wurde. Dann führte man 25 cm3 frisches menschliches Serum und anschliessend Phosphat-Puffer in die Schicht ein.
Der Ausfluss wurde in einem Fraktionensammler, in dem die Rohre alle 15 Minuten gewechselt wurden, so dass man eine Fliessgeschwindigkeit von 28 cm3 je Stunde erzielte, in Fraktionen von 7 cm9 aufgefangen. In jeder Fraktion wurde Protein (nach Folin-Lowry), Aminosäuren, Peptide und nukleotides Material ermittelt (die Peptide durch Ninhydrin und das nukleotide Material durch Ultraviolett-Absorption). Das Protein erhielt man in den Fraktionen 5 bis 12, die Peptide und die Aminosäuren in den Fraktionen 20 bis 40 und das nukleotide Material in den Fraktionen 42 bis 60.
Beispiel 8
Eine Schicht von einem Ausmass von 3 X 22 cm wurde mit gequollenen Gelkörnern (Wasserwiedergewinn 4,5), die durch Umsetzung von Dextran mit Epichlorhydrin hergestellt worden waren, gepackt.
Zwei Versuche wurden angestellt, um den Einfluss des Asoziationsgrades von Insulin auf dessen Adsorption in die Gelkörner und dessen Verdrängung und Eluierung aus den Körnern zu ermitteln: a) Die Schicht wurde in ein Gleichgewicht mit einer l-molaren Acetatpuffersubstanz (pH-Wert = 3,95) gebracht. Dann wurde 1 cm3 von 0,51 %igem Insulin in einer solchen Puffersubstanz in die Schicht eingeführt und diese mit der Puffersubstanz eluiert.
Das Insulin erschien in dem Ausfluss zwischen 55 und 65 cm3. b) Die Schicht wurde in ein Gleichgewicht mit 1 % Dichloressigsäure in Wasser gebracht. 1 cm3 einer 0,42% eigen Insulinlösung wurde in die Schicht eingeführt und diese mit der Dichloressigsäurelösung eluiert. In diesem Falle war das Insulin in dem Ausfluss zwischen 80 und 100 cm3 enthalten.
Beispiel 9
Eine Schicht mit einem Ausmass von 4 X 37 cm wurde mit Gelkörnern einer solchen Teilchengrösse, dass sie ein Sieb mit einer Maschenweite von zwischen 1600 und 1760 bis 6560 je cm2 passieren (Wasser wiedergewinn: 4,2) gefüllt. Diese Gelkörner waren durch Umsetzung von Dextran (Molekulargewicht = 20000) und Epichlorhydrin hergestellt worden. Die Schicht wurde mit 0,1 molaren Phosphat-Puffer (pH Wert = 7,0) gewaschen. Dann wurden 5 cm3 einer wässrigen Lösung, die 0,11 % der antibiotischen Substanz Polymyxin B enthielt auf die Schicht gebracht und anschliessend wurden 0,1 molarem Phosphatpuffer mit einer Geschwindigkeit von 101 cm3 je Stunde eingeführt.
Das Polymyxin war in dem Ausfluss zwischen 350 und 400 cm3 enthalten.
DBP zwischen 1600 und 1760 bis 6560 Maschen je cm2 passieren; Wasserwiedergewinn: 2,1) gepackt, die durch Umsetzung von Dextran mit 1 ,4-Butandiol-diepoxypropyläther hergestellt worden waren. Das Gesamtvolumen der Gelschicht betrug 247 cm3. Vor Versuchsbeginn wurde die Schicht mit einer 10% igen Lösung von Äthanol in Wasser gewaschen. In die Schicht wurden 3 cm3 einer Lösung von 30 Milligramm Dextran (Molekulargewicht 40000) und 30 mg Glukose in 10% im wässrigem Äthanol eingeführt. Dann wurde sie mit 10% igem wässrigem Äthanol mit einer Geschwindigkeit von 180 cm3 je Stunde eluiert und der Ausfluss in Fraktionen von 5,5 cm aufgefangen. In dem Ausfluss erschien das Dextran zwischen 103 und 120 cm3 und die Glukose zwischen 180 und 213 cm3.
Beispiel 15
Eine Säule mit einem Durchmesser von 3,5 cm wurde mit Gelkörnern (mit einer solchen Teilchengrösse, dass sie ein Sieb mit einer Weite von 400 bis zwischen 1600 und 1760 Maschen je cm2 passieren; Wasserwiedergewinn: 9,0) gepackt, die durch Umsetzung von Sorbitol mit Epichlorhydrin hergestellt worden waren. Das Schichtvolumen betrug 219 cm3.
In die Schicht wurden 5 cm3 einer Lösung eingeführt, die 200 mg menschliches Serum-Albumin und 100 Natriumchlorid enthielt. Anschliessend wurde die Schicht mit Wasser mit einer Geschwindigkeit von 100 cm3 je Stunde eluiert. In dem Ausfluss erschien das Albumin zwischen 75 und 110 cm3 und das Natriumchlorid zwischen 190 und 225 cm3.