CH395431A - Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums - Google Patents

Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums

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CH395431A
CH395431A CH7688259A CH7688259A CH395431A CH 395431 A CH395431 A CH 395431A CH 7688259 A CH7688259 A CH 7688259A CH 7688259 A CH7688259 A CH 7688259A CH 395431 A CH395431 A CH 395431A
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rifamycin
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agar
mycelium
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CH7688259A
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Sensi Piero
Margalith Pinhas
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Lepetit Spa
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/188—Heterocyclic compound containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen atoms and oxygen atoms as the only ring heteroatoms
    • C12P17/189—Heterocyclic compound containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen atoms and oxygen atoms as the only ring heteroatoms containing the rifamycin nucleus

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Description


      Verfahren    zur Herstellung     eines    neuen     Antibiotikums       Die vorliegende     Erfindung    betrifft ein Verfahren  zur Herstellung eines neuen Antibiotikums, welches  im folgenden als     Rifamycin    bezeichnet werden soll,  sowie der Komponenten A, B, C, D und E des       Rifamycins.     



  Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch  gekennzeichnet, dass man einen Stamm eines       Rifamycin    produzierenden Mikroorganismus, z. B.       Streptomyces        mediterranei    oder eines natürlich vor  kommenden oder künstlich erzeugten Mutanten oder  Varianten davon, in einem Medium züchtet, welches       assimilierbare    Kohlehydrate, Stickstoffverbindungen  und organische Salze enthält. Aus dem Kulturmedium  kann man hierauf das     Rifamycin    bzw. seine Kom  ponenten gewinnen.  



  Der Stamm     Streptomyces        mediterranei    wurde aus  einer bei St.     Raphael    (Frankreich) erhobenen Boden  probe isoliert. Er hat die im folgenden     beschriebenen     Eigenschaften, welche auf schrägen Kulturen bei 28   während einer Versuchsdauer von bis zu 20 Tagen  auf verschiedenen Kulturmedien beobachtet worden  sind. Die Farbbestimmungen wurden nach     Maerz        and     Pauls     Dictionary    of     Colour;        Mc        Graw        Hill   <B>1950</B>       gemacht.     



  Hafermehl     Agar:     Gutes Wachstum mit glatter Oberfläche. Vegeta  tives     Mycel    glasig bis gelblich, Rückseite rosa.  Weissliches oder     irdisches        Mycel    mit     Rosafär-          bung.    Spuren eines gelblichen löslichen Pigmentes.       Hefeextrakt-Glucose-Agar:     Reichliches     Wachstum,    gelblich bis rosa mit  rauher Oberfläche. Dürftiges oberirdisches     Mycel.     Keine     Pigmentation    der Medien.         Emerson-Glucoseagar:     Reichliches Wachstum, gelblich bis hellorange  mit rauher Oberfläche.

   Oberirdisches     Mycel     wird rötlich     (2/B/8).    Bernsteinfarbiges lösliches  Pigment.  



       Hafermehl-Mischagar:     (enthält 20g Filtrat von gekochten Haferflocken,  5 g enzymatisches     Caseinhydrolysat,    3 g Fleisch  extrakt, 10 g     Saccharose,    40 g     Agar    in 1 Liter  Wasser.     pH    auf 6,9     korrigiert.)     Gutes Wachstum, glatt, gelblich mit leichter  oranger Tönung. Bernsteinfarbiges Pigment.       Benett-Agar:     Gutes Wachstum, gelblich bis orangegelb, Ober  irdisches     Mycel    wird rosa. Helles bernstein  farbiges Pigment.  



       Penassay-Agar        ( Difcoy>):     Schlechtes Wachstum.       Hefeextrakt-Melasseagar:     (enthält 7,5g Glycerin, 7,5g Melasse, 5 g Hefe  extrakt, 4 g     NaC1,    30 g     Agaragar,    1 Liter     dest.     Wasser.     pH    korrigiert auf 6,0.)  Reichliches rauhes Wachstum, farblos bis gelb  lich.

   Weissliches oberirdisches     Mycel.    Dunkles  bernsteinfarbiges lösliches     Pigment        (12/H/10).          Csapek-Dox        Saccharoseagar:     Schlechtes Wachstum, dünn und farblos bis  schwach     melonenfarbig        (11/A/8).    Spuren eines       rötlichweissen    oberirdischen     Mycels.    Kein lös  liches Pigment.           Kartoffelagar:     Schlechtes Wachstum, dünn und farblos. Spuren  eines weisslichen oberirdischen     Mycels.    Kein  lösliches Pigment.  



  Kartoffelbrei:  Schlechte Entwicklung, glasig, Farbe des Breis       nicht    verändert.  



       Glucose-Asparagin-Agar:     Gutes Wachstum mit glatter Oberfläche. Dünnes  vegetatives     Mycel,    orange bis rosa     (10/B/12),     gelbliche Rückseite. Kein oberirdisches     Mycel.     Wenig hellgelbes lösliches Piment.       Glycerin-Asparagin-Agar:     Wie     Glucose-Asparagin-Agar.          Nähragar:     Mässiges Wachstum mit glatter Oberfläche, hell  rosa bis orange     (2/B/10)        mit    gelblich oranger  Rückseite. Oberirdisches     Mycel        rötlichweiss.    Kein  lösliches Pigment.  



       Pridham-Agar:          Mässiges    Wachstum, glatt, farblos mit hummer  roten     (2/G/11)    Flecken. Oberirdisches     Mycel     rosa. Keine     Pigmentation    des Mediums.       Stärke-Agar:     Schlechtes Wachstum, farblos bis hellorange  rosa. Stärkehydrolyse zweifelhaft. Wenig weisses  oberirdisches     Mycel.     



       Dextrose-Trypton-Agar:     Reichliches Wachstum,     orangerosa    mit gold  gelber bis     orangerosa    Rückseite.     Oberirdisches          Mycel    rosa. Hellgoldgelbes     (9/J/6)    lösliches  Pigment.  



       Hickey    und     Tresners        Cobalt-Agar:     Mässiges Wachstum, glasig bis     hellrosaorange.     Wenig oberirdisches     Mycel.    Wenig gelbliches  lösliches Pigment.  



       Tyrosin        Agar:     Schlechtes Wachstum.       Calciummaleat        Agar:     Gutes Wachstum, farblos. Oberirdisches     Mycel     weisslich mit     Rosatönung.    Kein lösliches Pigment.  Teilweise Verdauung von     Calciummaleat.          Dorsets        Albuminagar:     Gutes Wachstum, rosa. Kein oberirdisches     Mycel     und keine     Pigmentation    des Mediums.  



  Gelatine:  Keine     Pigmentation.    Langsame und unvollstän  dige Verflüssigung.  



  Nitrate:  Oberflächenwachstum mit rosafarbigem ober-    irdischem     Mycel.    Keine Reduktion zu Nitrit.  Extrakt wird gelblich.  



       Lackmusmilch:     Keine     Peptisation    oder Koagulation.  Leicht     alkalische    Reaktion.       Cellulose:     Kein Wachstum auf     Filterpapierscheiben,    die auf       kohlehydratfreies    mineralisches     Agar    gebracht  werden.  



  Temperatur:  Optimum 28 ; bei 37  findet noch Wachstum  statt, doch sind die Eigenschaften weniger aus  geprägt.  



  Morphologie der Kolonien:  Auf     Benett-Agar    bildet dieser Stamm kleine  Kolonien (Durchmesser gewöhnlich nicht mehr  als 2 mm) mit gut abgegrenztem Umfang und  dichter, aber rauher Oberfläche, bedeckt mit weiss  lichem oberirdischem     Mycel.    Eine grosse Zahl  von auf     Agar    gezogenen Kolonien bilden kein  oberirdisches sondern nur ein orangerotes vege  tatives     Mycel    aus, welches bis zu erheblicher  Dicke wächst, bis die Kolonien ein felsartiges  Aussehen haben.  



       Sporenbildung:          ME/83    bildet auf den obengenannten Kultur  medien gewöhnlich keine Sporen. Falls     Sporu-          lation    erfolgt, erscheinen die Sporen in langen,  etwas verdrehten Ketten; Spiralen sind selten.  Die Sporen sind     ellipsoidartig    bis länglich  (0,8-1,0 X     3,0-5,0,        u).     



  Test für die Verwendung von     Kohlenstoffquellen:     Kulturen auf mineralischem     Agar    mit verschie  denen Quellen gemäss     Pridham    und Gottlieb er  gaben kein Wachstum auf:       Raffinose,    Acetat,     Citrat,        Glycin.     



  Alle andern ausprobierten     Kohlenstoffquellen    erga  ben mässiges bis gutes Wachstum:       Xylose,        Arabinose,    Glucose,     Rhamnose,     Fructose,     Mannose,        Galactose,        Lactose,          Saccharose,        Maltose,    Glycerin,     Mannit,        Inosit,          Succinat    und     Salicin.     



       Streptomyces        mediterranei    kann wie folgt charak  terisiert werden:  1. Er gehört nicht zur     chromogenen    Gruppe der       Streptomycetes.     



  2. Auf den meisten Medien ergibt das vegetative  Wachstum eine gelbliche bis leicht     rosaorange,     jedoch nie eine intensive orange bis rote Farbe.  



  3. Das oberirdische     Mycel    ist rötlich weiss, hat  jedoch nie eine orange oder     lavendelartige    Fär  bung. Auf den meisten Medien ist die     Sporulation     schwach.      4. Acetat,     Citrat,        Raffinose    und     Glycin    werden  nicht als     Kohlenstoffquellen    verwendet.  



  Ein Stamm von     Streptomyces        mediterranei    ist bei  der     American    Type     Culture        Collection    unter Num  mer 13 685 hinterlegt worden. Varianten oder Mu  tanten eines     Rifamycin    produzierenden Mikroorga  nismus können durch Behandlung von     Sporensuspen-          sionen    mit     mutagenen    Substanzen, wie z. B.     UV-          Strahlen    und Senfgas, erzeugt werden.  



  Zur Herstellung von     Rifamycin    kann so vorge  gangen werden, dass man     Streptomyces        mediterranei     oder, wie gesagt, irgendeinen anderen     Rifamycin    pro  duzierenden Mikroorganismus, bei     Temperaturen     von 25-37 , vorzugsweise bei 28 , in belüfteten  Kulturen in einem     wässrigen    Kulturmedium züchtet.

    Als     assimilierbare,    gut brauchbare Stickstoffquellen  kommen beispielsweise     Aminosäuren        einzeln    oder  gemischt,     Peptide    und Proteine und ihre     Hydrolysate     wie etwa     Peptone,    Fleischextrakt, Hefeextrakt, Soja  bohnenmehl,     Getreidebreiextrakt,    Fischmehl und       -extrakt,        wässrige    Auszüge von Samenkörnern und       Destillationsrückstände    in Betracht.

   Als Kohlenstoff  quelle können beispielsweise die folgenden Substan  zen verwendet werden: Glucose,     Xylose,        Lactose,          Saccharose,        Maltose,    Glycerin,     Mannit,        Inosit,          Succinatstärke    und     Dextrine.    Die Gärung kann wäh  rend 24-120 Stunden durchgeführt werden. Das ge  wöhnlich auf 7-8 eingestellte     Anfangs-pH    sinkt im  Verlauf der Gärung auf 5-7.     Normalerweise    werden  die besten Resultate bei einer Gärdauer von 48 bis  72 Stunden erhalten. Nach dieser Zeit wird eine aus  gezeichnete Ausbeute an Antibiotikum erhalten.  



  Nach Beendigung der Gärung kann     Rifamycin     wie folgt isoliert werden:  Das     Gärmedium    wird beim     End-pH    von 5-7  oder nachdem man das     pH    auf 7,5-8,5 eingestellt  hat, bei 26-28  oder einer tieferen Temperatur fil  triert. Das Filtrat wird sofort angesäuert, um die  beste Stabilisierung der antibiotischen     Substanzen    zu  erreichen. Die aktiven Substanzen werden mit in  Wasser unlösbaren Lösungsmitteln wie     Butanol,     Äthyl-,     Propyl-,        Butyl-    oder     Amylacetat    oder Chloro  form extrahiert.

   Das     Verhältnis    zwischen dem Volu  men des Gärmediums und dem Volumen des Lö  sungsmittels wird je nach dem     Lösungsmittel    ver  schieden gewählt, es kann 2: 1 bis 10: 1 betragen.  



  Ein Teil des antibiotischen Substanzgemisches  ist in saurem Medium unlöslich und kann daraus  direkt, etwa durch Filtration gewonnen werden. Auf  alle Fälle muss hierbei aber das Filtrat mit orga  nischen     Lösungsmitteln    extrahiert werden, um soviel  wie möglich der antibiotisch aktiven Substanzen zu  gewinnen. Der in Wasser unlösliche Teil kann im  gleichen Lösungsmittel gelöst werden und     mit    dem  organischen Extrakt aus der Extraktion des Filtrates  vereinigt werden. Nach der Extraktion     enthält    das       wässrige    Medium immer noch antibiotisch aktive       Substanzen,    welche jedoch mit üblichen organischen  Lösungsmitteln nicht extrahiert werden können.

   Diese  Substanzen können jedoch in leicht saurem     Milieu       durch Tierkohle     adsorbiert    und daraus durch wasser  lösliche Alkohole, wie Methanol oder Äthanol,     eluiert     werden.  



  Das     Mycel    hält     einige        mikrobiologisch        aktive     Substanzen zurück. Diese können daraus durch die       genannten    Lösungsmittel oder durch mehrmaliges  Waschen mit Wasser extrahiert werden.    Sobald die meisten der antibiotisch aktiven Sub  stanzen im organischen Lösungsmittel gelöst sind,  wird dieses hierbei     unterhalb    30  im Stickstoffstrom  im Vakuum auf ein kleines Volumen eingedampft.

    Nach Zugabe von     Petroläther    oder einem andern  Kohlenwasserstoffgemisch     fällt    eine braune Substanz  aus, welche eine hohe Aktivität gegen     Mycobakterien     und     grampositive    Bakterien aufweist. Dieses Rohpro  dukt ist ein hell bis dunkelbraunes amorphes Pulver,  welches manchmal eine grünliche     Nüance    besitzt. Es  ist ein Gemisch von Substanzen mit antibiotischer  Wirkung.

   Eine     Chromatographie    auf     Whatman-Nr.1-          Papier.    (Lösungsmittel Wasser mit 3 % Ammonium  chlorid und 1 % Ascorbinsäure, Entwicklung auf  einer mit     Sarcina        lutea    geimpften     Agarplatte)    ergibt  mindestens fünf Flecken, welche     mit    den Buchstaben       A-E    bezeichnet worden sind, und zwar gemäss der  Zunahme des     Rf-Wertes    vom     Startpunkt    aus. Die  Flecken C und D sind     normalerweise    grösser als die  übrigen. Das Vorhandensein weiterer Fraktionen ist  nicht ausgeschlossen.  



  Anstatt die antibiotische Mischung aus dem orga  nischen Extrakt auszufällen, kann man diesen auch  mit Pufferlösungen zunächst bei     pH    7,0-7,5 und  dann bei     pH    10,0-10,5 extrahieren. Die Wahl geeig  neter     pH-Bereiche    erlaubt es, eine angenäherte Tren  nung der verschiedenen Fraktionen des rohen Pulvers  zu erreichen. Bei     pH    7,0-7,5 wird sodann das       Rifamycin    B, welches stark sauren     Charakter    hat,  selektiv extrahiert. Die andern Fraktionen werden bei  höheren     pH-Werten    extrahiert.

   Da diese Komponen  ten in neutraler und alkalischer Lösung wenig stabil  sind, ist es nötig, Pufferlösungen     mit    0,5 bis 3 %  Ascorbinsäure oder andern in ähnlicher Weise stabi  lisierend wirkenden Substanzen zu verwenden. Das  Volumenverhältnis zwischen organischer Lösung und  alkalischer     Pufferlösung    schwankt in breiten Gren  zen, je nach den verwendeten     organischen    Lösungs  mitteln und dem     pH-Wert    der Pufferlösung.

   Aus       einer        Äthylacetatlösung,    welche 1 % aktive Substanz  enthält, werden bei     pH    7,0-7,5 in drei     Portionen     mit je     1/1o    des Volumens der Pufferlösung die Frak  tion B und bei     pH    10,0-10,5 mit drei Portionen     mit     je     1/5    des Volumens der Pufferlösung, welche 1  Ascorbinsäure enthält, die restlichen Fraktionen in  die     wässrige    Phase gebracht.  



  Aus der     wässrigen    Phase können die     Antibiotica     in     halbreiner    Form gewonnen werden, indem man  die     wässrige    Phase ansäuert und die     Substanzen    mit  einem Lösungsmittel, wie z. B.     Äthylacetat    oder       Chloroform,    extrahiert, die erhaltene Lösung ein  dampft und die Substanzen     mit        Petroläther    ausfällt.

        Man kann     die        Antibiotica    auch aus der     wässrigen    Lö  sung durch     Ansäuern        ausfällen    und     abfiltrieren.     



  Die Reinigung der rohen     Mischung    kann durch       Chromatographie    an verschiedenen     Adsorbentien    er  folgen, z. B. an      Florisils>,    welches mit     methanolischer     Salzsäure vorbehandelt worden ist. Die rohe Mi  schung wird hierzu in einem Lösungsmittel, z. B.       Äthylacetat,    gelöst und auf eine Kolonne von      Floro-          sil     gegeben. Die     Elution    erfolgt mit dem gleichen  Lösungsmittel oder mit Lösungsmitteln oder     -ge-          mischen    mit zunehmender Polarität.

   Die     Eluate    mit  den höchsten mikrobiologischen     Werten    sind die  jenigen, welche     Rifamycin    C     und    D enthalten.  



  Nachfolgend wird ein zweckmässiges Vorgehen  zur     Isolierung    der fünf Hauptkomponenten der rohen       Antibioticamischung    beschrieben, und es werden  einige ihrer chemischen und physikalischen Daten  angeführt, die ihre     Identifikation    erlauben.  



       Rifamycin   <I>A.</I> Es besitzt einen     Rf-Wert    von 0,00  bis 0,10 bei der oben beschriebenen     Papierchromato-          graphie.        Rifamycin    A kann aus der rohen Mischung  durch     Gegenstromverteilung        im        Zweiphasensystem     Methanol + 0,01n Salzsäure - Benzol     +        Petroläther     (10:5:15:5) gewonnen werden. Nach 160 Über  tragungen kann     Rifamycin    A direkt aus den leichten  Phasen der Gefässe 150-160 gewonnen werden.

   Nach  dem Eindampfen und Ausfällen in     Petroläther    erhält  man     Rifamycin    A in Form eines dunkelbraunen  amorphen Pulvers.     Rifarnycin    A ist     unlöslich    in Was  ser, löslich in     wässrigen        Alkalien.    In     Äthylacetat    ge  löst zeigt es im sichtbaren Gebiet ein Absorptions  maximum bei 460 mg.

   Nach Schütteln der     Athyl-          acetatlösung    mit einer sauren     wässrigen    Lösung von  <I>1</I>     2ö        Stannochlorid    ist das Maximum nach<I>422</I>     my     verschoben. Derselbe Effekt kann auch durch Schüt  teln mit einer einprozentigen     wässrigen        Ascorbin-          säurelösung    erreicht werden. Das Maximum von  460     my    kann wieder erreicht werden, wenn man die       ÄthyIacetatlösung    mit einer 0,1 ö     igen    Lösung von       Kaliumferricyanid    schüttelt.

   Vermutlich hat     Rifamycin     A eine     Chinonstruktur,    welche reversibel reduzierbar  und     oxydierbar    ist.  



       Rifamycin        B.    Es besitzt einen     Rf-Wert    von 0,20  bis 0,30 bei der oben beschriebenen     Papierchromato-          graphie.        Rifamycin    B ist stark sauer. Es kann isoliert  werden, indem man die rohe Mischung in einem  Lösungsmittel wie z. B.     Äthylacetat    oder Chloroform  auflöst, und die Substanz bei     pH    6,5-7,5 mit     wäss-          rigem        Phosphatpuffer    extrahiert.

   Aus der     wässrigen     Phase kann     Rifamycin    B entweder durch Ansäuern  oder durch     erneutes    Extrahieren der     angesäuerten          wässrigen    Phase mit     Äthylacetat    gewonnen werden.  Beim Eindampfen der     Äthylacetatlösung    fällt die       Fraktion    B in halbreinem Zustand aus. Durch Um  kristallisieren aus     Äthylacetat    oder     Benzol        erhält    man  das reine Produkt.  



       Rifamycin    B bildet gelbe glänzende     Kristalle.    Es  wird dunkel bei 165  und     schmilzt    unterhalb 300   noch nicht. Seine gesättigte     wässrige    Lösung hat ein       pH    von 3,6. Es ist sehr wenig löslich in Wasser und    verdünnten Mineralsäuren, jedoch löslich in     Bicar-          bonatlösungen    unter Entwicklung von Kohlensäure.

    In     konzentrierter    Schwefelsäure löst es sich unter       Rotfärbung.    Es ist schlecht löslich in Methanol,  wenig in Äthanol,     Chloroform,        Äthylacetat    und  Aceton, sehr schlecht in Benzol und praktisch un  löslich in     Petroläther,        Tetrachlorkohlenstoff,        Athyl-          äther    und     Kohlenwasserstoffen.    Es entfärbt Kalium  permanganat,     reduziert        Fehlingsche    Lösung und       Tollensreagenz,    absorbiert Brom und wird mit Was  serstoff katalytisch reduziert.

   Bei der Behandlung  mit Nitrit in alkalischem Milieu erfolgt eine Rot  färbung. Es     reagiert    nicht     mit        Ninhydrin,    jedoch er  folgt die Reaktion nach einer     kräftigen    sauren Hydro  lyse. Es ist     nicht        diazotierbar    und     reagiert    nicht mit  aromatischen     Diazokörpern.    Es ergibt keine     Molish-          reaktion    und     reduziert        Triphenyltetrazolium    nicht.  Es     reagiert    jedoch mit     Ferrichlorid    unter Rotfärbung.  



       Die    Elementaranalyse ergab die folgenden Haupt  werte: C 61,75     %;    H 6,72     %;    N 1,88     ö;    O 29,22     7o.     Daraus kann die allgemeine Formel     C."H47_,53NO14     abgeleitet werden.     Rifamycin    B ist optisch aktiv:  [a]     589=    - 11  , c = 1, Methanol, photoelektrisches       Polarimeter.     



  Eine     potentiometrische        Titration    in Wasser zeigt  zwei saure Gruppen:     pK,    etwa 2,8     (Aquivalentge-          wicht    780),     pK2    etwa 6,7     (Äquivalentgewicht    765).

    Das     Molekulargewicht    wurde in     Cyclohexanol    nach  Rast mit etwa 750     ermittelt.    Das     UV-    und sichtbare  Spektrum in Wasser zeigt eine Schulter bei 220 bis  230     my    (Ei     @m        =    513), und zwei Maxima bei 305     mci     (E     i    % = 246) und 430     m     (E     i        5m    = 202).

   In     Äthyl-          acetat    liegt das Maximum im Sichtbaren bei 415     mu.     Das     UV-    und das sichtbare Spektrum von     Rifamycin     B in     Phosphatpuffer    vom     pH    7,3 zeigt Maxima bei  223     my    (E     i        @m    555), 304     my    (E     i        %R#    275) und bei  425     my    (E     i        %l    220).  



  Das     IR-Spektrum    von     Rifamycin    B weist Ab  sorptionsmaxima bei den folgenden Werten (in     cm-')     auf: 3465, 3330, 1742, 1730 (Schulter), 1705 (Schul  ter), 1673, 1602, 1575, 1550, 1445, 1342, 1300,  1267, 1240 (Schulter), 1205, 1180, 1165, 1102,  1073, 1048, 1020, 975, 948, 915, 905, 850, 795,  760, 730, 680.  



  Da     Rifamycin    B sauer reagiert, bildet es sowohl       mit    anorganischen wie     mit    organischen Basen Salze.  Es wurden das Mono- und     Dinatriumsalz    dargestellt,  von denen das erste wenig und das zweite gut in  Wasser löslich ist. Die Lösungen zeigen ein     pH    von  5,0 bzw. etwa 7,0. Diese Lösungen sind sehr stabil.  



  Mit den folgenden organischen Basen sind Salze       gebildet    worden:       Dibenzylamin,    Chinin,       1-(p-Chlor        benzyl)-2-pyrrolidylmethyl-          benzoimidazol,          Dibenzyläthylendiamin,          2-Methyl-6-amino-heptan     und andern. Alle diese Salze sind in Wasser wenig  löslich und versprechen, für therapeutische Zwecke       nützlich    zu sein.

             Rifamycin   <I>C und D.</I> Diese beiden Fraktionen  zeigen beinahe gleiche     Rf-Werte    bei der oben be  schriebenen     Papierchromatographie        (Rf    = 0,45 bis  0,55). Die Flecke sind auf dem     Chromatogramm     miteinander durch einen breiten Hals verbunden.       Rifamycin    C und D können auf der rohen Mischung  durch Gegenstromverteilung in einem Zweiphasen  system bestehend aus Methanol +     O,Oln    Salzsäure   Benzol +     Petroläther    (10: 5 :<B><I>15:</I></B> 5) gewonnen wer  den.

   Bei 85 Übertragungen wird die Hauptmenge an       Rifamycin    C zwischen den Gefässen 55-65 und die  Hauptmenge an     Rifamycin    D zwischen     den        Gefässen     35-45     angereichert.    Durch Extrahieren dieser Ge  fässe mit Benzol,     Äthylacetat,    Chloroform oder ähn  lichen Lösungsmitteln, Konzentrieren des Extraktes  und Ausfällen mit     Petroläther    oder andern Kohlen  wasserstoffmischungen kann man die beiden     Rifamy-          cine    C und D als amorphe Pulver von hoher Rein  heit erhalten.  



       Rifamycin    C und D erscheinen als dunkelbraune  Pulver mit grüner Nuance. Sie sind in den üblichen  organischen Lösungsmitteln löslich und in Wasser  praktisch unlöslich. Eine     wässrige    Lösung in einem  Puffer vom     pH    8,0-10,0 kann man herstellen, wenn  man Ascorbinsäure als Stabilisator zugibt. Die     UV-          und    sichtbaren Spektren der beiden     Rifamycine    C  und D sind ähnlich. Die     Maxima    bei 385-390     my     und bei 460     mlc    (in Methanol und     Äthylacetat)    sind  sehr charakteristisch.

   Das Maximum bei 460     mu    wird  nach 422     my    verschoben, wenn man die     Äthylacetat-          lösung    von     Rifamycin    C oder D mit einer 0,1     %igen          wässrigen        Stannochloridlösung    oder mit einer 1 %     igen          wässrigen        Ascorbinsäurelösung    schüttelt.

   Nach weite  rem Schütteln mit einer 0,1 %     igen        wässrigen    Lösung  von     Kaliumferricyanid    erscheint das     Maximum    von  460     my    wieder. Dies zeigt, dass     Rifamycin    C und D  reversibel oxydier- und reduzierbare Substanzen, wie  z. B. die     Chinone,    sind.  



  Eigenschaften von     Rifamycin    C: Elementar  analyse: C 61,51 %; H 6,73 %; N 4,21 %; O 27,55  (Differenz).     Rifamycin    C gibt eine positive Reaktion  mit     Fehling-    und     Tollensreagens,    mit     Ferrichlorid,          Jodoform    und     Permanganat.    Die     Ninhydrinreaktion     ist negativ, wird jedoch nach kräftig saurer Hydro  lyse positiv.

   Das sichtbare Spektrum in     Äthylacetat     zeigt     Maxima    bei 388 mg (E     I        %m78)    und bei 460     mu     
EMI0005.0059     
  
    Stamm <SEP> Rifamycin <SEP> <B>B</B> <SEP> Rifamycinkomplex
<tb>  Micrococcus <SEP> pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> ATCC <SEP> 6 <SEP> 538 <SEP> 0,025 <SEP> 0,01
<tb>  Micrococcus <SEP> pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> ATCC <SEP> 13 <SEP> 301 <SEP> 0,1 <SEP> 0,025
<tb>  Micrococcus <SEP> pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> ATCC <SEP> 9 <SEP> 144 <SEP> 0,025 <SEP> 0,01
<tb>  Micrococcus <SEP> pyogenes <SEP> var. <SEP> albus <SEP> ATCC <SEP> 12 <SEP> 228 <SEP> 0,025 <SEP> 0,01
<tb>  S. <SEP> pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> gray <SEP> Weinstein <SEP> 0,1 <SEP> 0,05
<tb>  S.

   <SEP> faecalis <SEP> ATCC <SEP> 10 <SEP> 541 <SEP> 0,5 <SEP> 0,05
<tb>  S. <SEP> homolyticus <SEP> C <SEP> 203 <SEP> 0,025 <SEP> 0,0025
<tb>  S. <SEP> mastitidis <SEP> ATCC <SEP> 7077 <SEP> 0,5 <SEP> 0,05       (E     i        %m    134).     Rifamycin    C ist unlöslich in Wasser,  Mineralsäuren und     Bicarbonaten,    löslich in Soda,  Methanol,     Äthylacetat,        Chloroform    und Aceton, un  löslich in     Äthyläther    und     Petroläther.     



  Eigenschaften von     Rifamycin    D: Elementar  analyse: C 62,17 %; H 6,58 %; N 3,53 %; O 27,72  (Differenz).     Rifamycin    D gibt eine positive Reak  tion mit     Tollens    und     Fehlingreagens,        Ferrichlorid,          Jodoform    und     Permanganat.    Die     Ninhydrinreaktion     ist vor und nach Hydrolyse negativ. Das sichtbare  Spektrum in     Äthylacetat    zeigt Maxima bei 388     mu     (E     i        @m    79) und bei 460 my (E     i        %m    115).

   Es ist un  löslich in Wasser, Mineralsäuren,     Bicarbonaten,          Äthyläther    und     Petroläther,    löslich in Soda, Methanol,       Äthylacetat,    Chloroform und Aceton.  



       Rifamycin   <I>E.</I> Diese Fraktion besitzt einen     Rf-          Wert    von etwa 0,7 bis 0,8 bei der oben beschrie  benen     Papierchromatographie.    Es kann aus der  rohen Mischung durch Gegenstromverteilung in  einem     Zweiphasensystem    bestehend aus  Methanol + 0,01n     Salzsäure    - Benzol +     Petroläther     <B>(10:5:15:5)</B> gewonnen werden. Nach 160 Über  tragungen hat sich die     Hauptmenge    des     Rifamycins    E  in den ersten 10 Gefässen angereichert.

   Durch  Extraktion der sauren     wässrigen    Phase     mit        Äthyl-          acetat,    Eindampfen des Extrakts und     Fällen    mit       Petroläther    kann man das     Rifamycin    E gewinnen.  Man erhält     ein    hellbraunes amorphes Pulver.

   Das       sichtphase    Spektrum in     Äthylacetat    weist ein Maxi  mum bei 400     my    auf, welches nach Schütteln der       Äthylacetatlösung    mit     verdünnten        wässrigen    Lösun  gen von     Kaliumferricyanid    oder     Stannochlorid    nicht  verschoben wird.  



  Wie oben erwähnt,     zeigen        Rifamycin        und    seine  Komponenten einen hohen Wirkungsgrad gegen  gram-positive Bakterien und     Mycobakterien.    Biolo  gische Versuche wurden getrennt mit     Rifamycin    B  und mit einer Mischung der     Rifamycine    A, C, D  und E, welche nachfolgend mit      Rifamycinkomplex      bezeichnet     wird,    ausgeführt.  



  Die folgende Tabelle gibt     Aufschluss    über die  antibakterielle Wirkung in     vitro    von     Rifamycin    B  und dem     Rifamycinkomplex    auf eine grosse Zahl  von gram-positiven und gram-negativen Mikroorga  nismen.

   Die angegebenen Werte sind die minimalen       Inhibitionskonzentrationen    in     gamma/cmg.       
EMI0006.0001     
  
    Stamm <SEP> Rifamycin <SEP> B <SEP> Rifamycinkomplex
<tb>  S. <SEP> bovis <SEP> ATCC <SEP> 9809 <SEP> 0,25 <SEP> 0,025
<tb>  Neisseria <SEP> catarrhalis <SEP> ATCC <SEP> 8176 <SEP> 0,5 <SEP> 0,05
<tb>  Neisseria <SEP> gonorrhoeae <SEP> ATCC <SEP> 9826 <SEP> 2 <SEP> 0,1
<tb>  Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> XXXVII <SEP> L <SEP> 0,05 <SEP> 0,01
<tb>  Sarcina <SEP> lutea <SEP> ATCC <SEP> 9341 <SEP> 0,5 <SEP> 0,025
<tb>  Sarcina <SEP> subflava <SEP> ATCC <SEP> 7468 <SEP> 0,5 <SEP> 0,025
<tb>  M. <SEP> flavus <SEP> ATCC <SEP> 10 <SEP> 240 <SEP> 0,25 <SEP> 0,01
<tb>  B. <SEP> subtilis <SEP> ATCC <SEP> 6633 <SEP> 2,5 <SEP> 0,25
<tb>  B. <SEP> cereus <SEP> ATCC <SEP> 10 <SEP> 876 <SEP> 5 <SEP> 0,25
<tb>  B.

   <SEP> anthracis <SEP> 1 <SEP> 0,05
<tb>  Clostridium <SEP> perfringens <SEP> ATCC <SEP> 3226 <SEP> 0,5 <SEP> 0,05
<tb>  Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> ATCC <SEP> 10 <SEP> 031 <SEP> >200 <SEP> 20
<tb>  Klebsiena <SEP> pneumoniae <SEP> capsulata <SEP> >200 <SEP> 100
<tb>  Escherichia <SEP> coli <SEP> McLeod <SEP> 10 <SEP> 536 <SEP> >200 <SEP> 50
<tb>  Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> Gottlieb <SEP> >200 <SEP> 75
<tb>  Pseudonomas <SEP> fluorescens <SEP> ATCC <SEP> 11251 <SEP> >200 <SEP> 25
<tb>  Proteus <SEP> vulgaris <SEP> X <SEP> 19H <SEP> ATCC <SEP> <B>881</B> <SEP> >200 <SEP> 50
<tb>  Proteus <SEP> morganii <SEP> ATCC <SEP> 9237 <SEP> >200 <SEP> 50
<tb>  Proteus <SEP> rettgeri <SEP> ATCC <SEP> 9919 <SEP> >200 <SEP> 50
<tb>  Shigella <SEP> sonnei <SEP> ATCC <SEP> 9290 <SEP> >200 <SEP> 75
<tb>  Shigella <SEP> dysenteriae <SEP> ATCC <SEP> 9583 <SEP> >200 <SEP> 20
<tb>  

  Salmonella <SEP> Typhi <SEP> >200 <SEP> 150
<tb>  Salmonella <SEP> paratyphi <SEP> ATCC <SEP> 9150 <SEP> >200 <SEP> 150
<tb>  Salmonella <SEP> schottmuelleri <SEP> ATCC <SEP> 9149 <SEP> >200 <SEP> <B><I>150</I></B>
<tb>  Brucella <SEP> abortus <SEP> 150 <SEP> 10
<tb>  Brucella <SEP> melitensis <SEP> ATCC <SEP> 4309 <SEP> 75 <SEP> 10
<tb>  Pasteurella <SEP> pestis <SEP> ATCC <SEP> 87 <SEP> NIH <SEP> 100 <SEP> 10
<tb>  Mycobacterium <SEP> ranae <SEP> 50 <SEP> 10
<tb>  Mycobacterium <SEP> phlei <SEP> ATCC <SEP> 10142 <SEP> 0,05 <SEP> 0,5
<tb>  Mycobacterium <SEP> minetti <SEP> 100 <SEP> 10
<tb>  Mycobacterium <SEP> app. <SEP> 607 <SEP> 100 <SEP> 10
<tb>  Mocardia <SEP> astercides <SEP> >200 <SEP> 50
<tb>  Mycobacterium <SEP> tuberculosis <SEP> var.

   <SEP> hominis <SEP> 0,05 <SEP> 2
<tb>  H <SEP> 37 <SEP> Rv <SEP> ATCC <SEP> 9360
<tb>  Candida <SEP> albicans <SEP> ATCC <SEP> 10 <SEP> 231 <SEP> >200 <SEP> >200
<tb>  Trichophyton <SEP> mentagrophytes <SEP> ATCC <SEP> 8757 <SEP> >200 <SEP> >200       Aus den obigen Zahlenwerten ist ersichtlich, dass       die        Rifamycine    besonders auf gram-positive Mikro  organismen wirken und eine gewisse Wirkung auf  Bazillen haben.    Die akute Toxizität von     Rifamycin    Bist geprüft  und als sehr niedrig befunden worden, besonders  wenn man berücksichtigt, dass es einen sehr hohen  Wirkungsgrad hat.

   Die folgende Tabelle gibt die  erhaltenen Resultate    
EMI0007.0001     
  
    Tier <SEP> Applikation
<tb>  Maus <SEP> intravenös
<tb>  intraperitoneal
<tb>  subcutan
<tb>  Ratte <SEP> intravenös
<tb>  intraperitoneal
<tb>  subcutan       Die akute Toxizität des     Rifamycinkomplexes    ist  nicht ganz so günstig, jedoch immer noch sehr niedrig  und gewährleistet einen weiten Sicherheitsbereich.  Die intravenöse Verabreichung an Mäuse ergab eine       LD;,o    von 262 mg/kg.

      Wirkung in     vivo    von     Rifamycinkomplex    und     Rifamycin    B bei     subcutaner    Verabreichung  während 7 Tagen  
EMI0007.0008     
  
    Tagesdosis <SEP> Verabreichungen <SEP> Überlebende <SEP> nach
<tb>  Infektion <SEP> Antibiotikum <SEP> mg/kg <SEP> pro <SEP> Tag <SEP> 12 <SEP> Tagen
<tb>  Streptococcus <SEP> haemolyticus <SEP> 6203 <SEP> Rifamycinkomplex <SEP> 100 <SEP> 2 <SEP> 20/20 <SEP> 100
<tb>  75 <SEP> 2 <SEP> 20/20 <SEP> 100
<tb>  50 <SEP> 2 <SEP> 20/20 <SEP> 100
<tb>  30 <SEP> 2 <SEP> 19/20 <SEP> 95
<tb>  20 <SEP> 2 <SEP> 13/20 <SEP> 65
<tb>  10 <SEP> 2 <SEP> 4/20 <SEP> 20
<tb>  Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> Weinstein <SEP> Rifamycinkomplex <SEP> 100 <SEP> 2 <SEP> 20/20 <SEP> 100
<tb>  75 <SEP> 2 <SEP> 20/20 <SEP> 100
<tb>  30 <SEP> 2 

  <SEP> 19/20 <SEP> 95
<tb>  20 <SEP> 2 <SEP> 9/20 <SEP> 45
<tb>  10 <SEP> 2 <SEP> 2/20 <SEP> <B>10%</B>
<tb>  Streptococcus <SEP> Haemolyticus <SEP> B <SEP> 203 <SEP> Rifamycin <SEP> B <SEP> 400 <SEP> 4 <SEP> 20/20 <SEP> 100
<tb>  300 <SEP> 4 <SEP> 20/20 <SEP> 100
<tb>  300 <SEP> 4 <SEP> 16/20 <SEP> 80
<tb>  200 <SEP> 4 <SEP> 6/20 <SEP> 80
<tb>  400 <SEP> 2 <SEP> 20/20 <SEP> 100
<tb>  300 <SEP> 2 <SEP> 19/20 <SEP> 95
<tb>  300 <SEP> 2 <SEP> 13/20 <SEP> 65
<tb>  200 <SEP> 2 <SEP> 4/20 <SEP> 20
<tb>  Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> Rifamycin <SEP> B <SEP> 350 <SEP> 4 <SEP> 10/20 <SEP> 50
<tb>  XXXVII <SEP> L
<tb>  350 <SEP> 2 <SEP> 4/20 <SEP> 20
<tb>  Dibenzyläthylendiamin- <SEP> 350 <SEP> 2 <SEP> 20/20 <SEP> 100
<tb>  Salz <SEP> von <SEP> Rifamycin <SEP> B       Es ergibt sich aus den obigen Zahlenwerten,

   dass  der     Rifamycinkomplex    bei Mäusen eine sehr starke  Wirkung gegen     Streptococcus-    und     Staphylococcus-          infektionen    und allgemein gegen gram-positive Bak  terien ausübt. Eine 100%ige therapeutische Dosis  von 50 mg/kg erscheint als sehr niedrig für ein Anti-    Die Wirkung von     Rifamycin    B und     Rifamycin-          komplex    wurde in     vivo    mit sehr befriedigenden  Resultaten an Mäusen untersucht, welchen stark       pathogene    gram-positive     Microorganismen        injiziert     worden waren.  



  Alle Injektionen waren     intraperitoneale    Injek  tionen von 10-100     Letaldosen    von 15-20 Stunden  alten Kulturen der     pathogenen        Mikroorganismen.     Während die Kontrolltiere in jedem Fall 2-3 Tage  nach der Injektion starben, wurde die Zahl der       schliesslich    überlebenden Tiere jeweils 12 Tage nach  Beginn der Experimente     ermittelt.     



  Einige der erhaltenen Resultate sind in der fol  genden Tabelle zusammengestellt.         bioticum,    welches eine intravenöse     LD.o    von 250 bis  300 mg/kg aufweist.  



       Rifamycin    B, obwohl etwas weniger aktiv, weist  einen noch bessern therapeutischen Koeffizienten auf  infolge seiner extrem niedrigen Toxizität. Bei Men  schen werden gute     Antibiotica-Blutspiegel        mit    täg-           lichen        intramuskulären    Verabreichungen von 500 bis  1000 mg erreicht.  



  Die     Rifamycine    haben eine sehr gute Wirkung  bei Patienten gezeigt, welche unter verschiedenen  Abszessen,     Mastitis,    eitriger     Mittelohrentzündung     und dergleichen litten. Die verabreichte Tagesdosis       betrug    im allgemeinen 2 g, durch zwei intramuskuläre  Injektionen verabreicht. Ein rascher Fall der Tem  peratur mit einer Auflösung des Entzündungspro  zesses nach nicht mehr als 3-4 Tagen nach Beginn  der Behandlung wurde immer beobachtet. Auch die       Oberflächenbehandlung    von infizierten Wunden mit       wässrigen    Lösungen von     Rifamycin    war ebenfalls  erfolgreich.

   Eiterung und Sekretion im allgemeinen  hörten sofort auf und die Wundheilung erfolgte nach  her rasch.  



  Diese Resultate wurden oft erreicht, nachdem  vorher vergeblich andere     Antibiotica    angewendet  worden waren.  



  <I>Beispiel 1</I>  Eine Kultur von     Streptomyces        mediterranei    wird  während 6-8 Tagen auf     Bennetagar    bei 28  gezüch  tet. Der     Organismus    wird vom     Agar    durch Spülen  befreit und aseptisch in     Flaschen    von 500     cm3    ein  geimpft, welche 100     cm3    eines     Nährmediums    folgen  der Zusammensetzung aufweisen:

    
EMI0008.0020     
  
    Fleischextrakt <SEP> 5 <SEP> g
<tb>  Hefeextrakt <SEP> 5 <SEP> g
<tb>  Pepton <SEP> 5 <SEP> g
<tb>  Caseinhydrolysat <SEP> 3 <SEP> g
<tb>  Glucose <SEP> 20 <SEP> g
<tb>  NaCl <SEP> 1,5 <SEP> g
<tb>  Wasser <SEP> bis <SEP> zu <SEP> 1 <SEP> Liter       Das     pH    wird mit     NaOH    auf 7,3 eingestellt.  Die so geimpften Flaschen werden     während    48 Std.  



  bei 28  auf einer Maschine geschüttelt. Eine Nähr  flasche wird dann in ein     Vorgärgefäss    von 10 Litern  gegossen, welches 4 Liter des obigen     Nährmediums          enthält.    Die Gärung wird bei 28  unter Rühren mit  800     T/Min    und einer Belüftung von 1     v/v/m    durch  geführt. Nach einem Wachstum von 24 Stunden er  scheint das     Mycel    stark geteilt.

   Die     Zahl    der ge  packten Zellen beträgt     3-5%.    In der nächsten Stufe  wird     ein        Glasgärgefäss    von 20 Litern verwendet, wel  ches 10 Liter des folgenden     Gärmediums    enthält:

    
EMI0008.0035     
  
    Sojabohnenmehl <SEP> 5 <SEP> g
<tb>  (NH4)2804 <SEP> 7 <SEP> g
<tb>  MgS04 <SEP> * <SEP> 7H20 <SEP> 1 <SEP> g
<tb>  Glucose <SEP> 50 <SEP> g
<tb>  <B>KH2P04</B> <SEP> 3 <SEP> g
<tb>  CaCO3 <SEP> 9 <SEP> g
<tb>  CUS04 <SEP> - <SEP> 5H20 <SEP> 3,3 <SEP> mg
<tb>  FeS04 <SEP> 7 <SEP> H20 <SEP> 10 <SEP> mg
<tb>  ZnS04 <SEP> 7 <SEP> H20 <SEP> 50 <SEP> mg
<tb>  MnS04. <SEP> 41i20 <SEP> 4 <SEP> mg
<tb>  H20 <SEP> bis <SEP> zu <SEP> 1 <SEP> Liter       Das     pH    wird mit     NaOH    auf 7,0 eingestellt und  das Gemisch während 30 Minuten bei l20  sterili  siert.  



  Als Impfung werden<B>10%</B> des Inhaltes des Vor  gärgefässes verwendet.  



  Die Gärung wird unter Rühren mit 800     T/Min     und Belüften mit 0,8     v/v/m    durchgeführt, wobei man       Silicon    A als     Antischaummittel    benützt. Während  der Gärung zeigt die Brühe eine charakteristische  orangerote Farbe. Nach 48 Stunden     erhält    man ein  Volumen von 20-25 % an     gepackten    Zellen. Das     pH     der Brühe beträgt 5,6-5,4. Die höchste Menge an  antibiotisch wirksamen Substanzen wird nach 45 bis  50 Stunden erhalten (300-400     gamma/cm3    der anti  biotischen Mischung) und die Brühe wird dann auf  gearbeitet.  



  <I>Beispiel 2</I>  Eine Kultur von     Streptomyces        mediterranei    wird  in gleicher Weise wie im Beispiel 1 bereitet. Als  Nährmedium im     Vorgärgefäss    von 10 Litern Inhalt  verwendet man 4 Liter einer Mischung, welche fol  gende Substanzen enthält:

    
EMI0008.0049     
  
    Lactose <SEP> 10 <SEP> g
<tb>  Glucose <SEP> 10 <SEP> g
<tb>  (NH4)2S04 <SEP> 7 <SEP> g
<tb>  Sojabohnenmehl <SEP> 5 <SEP> g
<tb>  MgS04 <SEP> ' <SEP> 7H20 <SEP> 1 <SEP> g
<tb>  KH.PO4 <SEP> 1 <SEP> g
<tb>  ZnS04 <SEP> * <SEP> 7 <SEP> H20 <SEP> 20 <SEP> mg
<tb>  Cus04 <SEP> - <SEP> 5 <SEP> H20 <SEP> 5 <SEP> mg       Nach 24 Stunden Wachstum beträgt das Volumen  der gepackten Zellen<B>6-8%. 10%</B> der erhaltenen  Mischung werden in ein     Glasgärgefäss    von 20 Litern  Inhalt gebracht, welches 10 Liter     Gärmedium    von  folgender Zusammensetzung enthält:

    
EMI0008.0052     
  
    Getreideextrakt <SEP> 20 <SEP> g
<tb>  Sojabohnenmehl <SEP> 5 <SEP> g
<tb>  (NH4)2S04 <SEP> 6 <SEP> g
<tb>  MgS04. <SEP> 7H20 <SEP> 1 <SEP> g
<tb>  Glucose <SEP> 50 <SEP> g
<tb>  KH.P04 <SEP> 3 <SEP> g
<tb>  CaC03 <SEP> 9 <SEP> g
<tb>  ZnS04 <SEP> * <SEP> 7 <SEP> H20 <SEP> 2 <SEP> mg
<tb>  CuS04 <SEP> - <SEP> 5H20 <SEP> 5 <SEP> mg
<tb>  H20 <SEP> bis <SEP> zu <SEP> 1 <SEP> Liter       Vor dem Einbringen der Impfsubstanz wird  das     pH    mit     NaOH    auf 7,0 eingestellt und die  Mischung während 30 Minuten bei 120  sterilisiert.  Die Gärung erfolgt bei 28      während    60 Stunden.  Das     pH    der Gärbrühe beträgt am Schuss 5,6-5,8.

    Die erhaltene Menge an antibiotisch wirksamen Sub  stanzen beträgt 400     gamma/cm3.

Claims (1)

  1. PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung eines neuen Anti biotikums, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Stamm eines Rifamycin produzierenden Mikroorga nismus in einem assimilierbare Kohlenhydrate und Stickstoffverbindungen sowie anorganische Salze enthaltenden Nährmedium kultiviert. UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man einen Stamm von Strepto- myces mediterranei kultiviert. 2.
    Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man das erhaltene Antibiotikum in seine Komponenten A, B, C, D und E trennt. 3. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man das erhaltene Antibiotikum aus dem Gärmedium isoliert. 4. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man Varianten oder Mutanten von Streptomyces mediterranei kultiviert.
CH7688259A 1958-08-12 1959-08-12 Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums CH395431A (de)

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