CH397572A - Verfahren zur Gewinnung von Fermenten - Google Patents

Description

  Verfahren     zur        Gewinnung    von Fermenten    Die     Erfindung    betrifft ein Verfahren zur Gewin  nung von     Fermentsystemen    in fester, trockener und  stabiler     Form    durch     Ausfällung    des     Fermentsystems     aus dessen wässriger Lösung beim     Mischen    mit einem  flüssigen     Fällungsmittel,    in welchem ein Salz einer  natürlich vorkommenden organischen Säure aufge  schlämmt ist, und durch anschliessende Trocknung  des abgetrennten Niederschlages.  



  Verfahren zur Ausfällung von     Fermentsystemen     aus deren     wässrigen    Lösungen sind bekannt. Eines  dieser Verfahren verwendet Alkohol als     Fällun@gs-          mittel,    ein anderes lösliche Salze, wie Ammonium  sulfat oder     dergleichen,    ein drittes ein     inertes    Ver  dünnungsmittel, z.

   B. ein     Cellulosederivat.    Diese  bisher     bekannten    Verfahren haben den Nachteil, dass  der erhaltene Niederschlag oft unlöslich ist oder eine  zähe klebrige     Masse    bildet, die sehr schwer zu filtrie  ren ist und, wenn getrocknet, sich in     Klumpen        zu-          sammenballt,    wodurch ein Pulverisieren mit entspre  chendem Verlust an     Fermentwirkung    notwendig wird.  



  Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren,  das keinen der Nachteile der bisher bekannten Ver  fahren aufweist. Das aus dem hier beschriebenen  Verfahren hervorgehende Produkt ist eine trockene,  stabile,     feste    Mischung eines     Fermentsystems    und  eines geniessbaren Salzes einer natürlich vorkommen  den organischen Säure. Die gleichzeitig ausgefällte  Kombination aus Säuresalz und Ferment kann leicht  filtriert werden und formt dabei einen mürben Filter  kuchen, der gut getrocknet und zu Pulver zerrieben  werden kann, ohne die charakteristische Einbusse an       Fermentwirkung    der anderen Verfahren zu erleiden.  



  Das erfindungsgemässe Verfahren zur Gewinnung  eines     Fermentsystems    aus dessen     wässrigem    Extrakt  ist dadurch     gekennzeichnet,    dass der     wässrige    Extrakt  mit einer     Aufschlämmung    eines Salzes einer natür-         lich    vorkommenden, organischen Säure in einer       niedrigmolekularen    mit einer sauerstoffhaltigen  Gruppe substituierten,     aliphatischen    Flüssigkeit zu  sammengebracht wird und die Suspension so lange  gerührt wird,

   bis die     Ausfällung    des     Fermentsystems     im wesentlichen beendet ist und nachfolgend die  gemeinsam     ausgefällte    Kombination     Fermentsystem-          Säuresalz    isoliert wird.    <I>Beispiel</I>  Der     wässrige    Extrakt eines     Fermentsystems    wird  folgendermassen erhalten:  Ein     Gärungsmedium,    welches ein     Kohlenhydrat-          und    eine Stickstoffquelle, sowie die benötigten Spuren  elemente enthält, wurde in einem Gärgefäss auf ein  Volumen von 10 000 Liter gebracht. Das Medium  enthielt 7,3 % Glukose.

   Es wurde     pasteurisiert,    abge  kühlt und mit     Aspergillus        niger        geimpft.    Der     Gär-          prozess    verlief unter Schütteln während etwa 13 Stun  den bei einer Temperatur von<B>31'C</B> und bei Auf  rechterhaltung einer Durchlüftung von 2000     1/min.     



  Nach Abschluss     ,des    Gärprozesses wurden die       Mycelien    von der Gärbrühe     abfiltriert,    gewaschen,  zermahlen und mit 750 Liter Wasser     extrahiert.     



  Der     wässrige    Extrakt wurde auf     Fermentaktivität     geprüft und ergab folgende Resultate:         Glukoseoxydase-Einheiten    55     Einheiten/ml          Katalase-Einheiten    110     Einheiten/ml          pH    der Lösung 6,4 bis 6,6    Eine     Glukoseoxydase-Einheit    ist diejenige Menge       Glukoseoxydase,    die für eine Sauerstoffaufnahme  von 10     Micromilliliter    pro Einheit benötigt wird,  wenn das Ferment unter normalen Bedingungen auf  Glukose als Substrat einwirkt.

   Eine     Katalase-Einheit         ist diejenige Menge     Katalase,    welche unter normalen  Bedingungen 300 mg Wasserstoffperoxyd zersetzt.  



  Eine     Aufschlämmung    von     Natriumglukonat    in  Äthanol     wurde    hergestellt, indem eisgekühlter,  85     %iger    Alkohol schnell gerührt und die gewünschte  Menge Salz langsam zugegeben wurde. Der     ferment-          haltige,        wässrige    Extrakt wurde unter der Oberfläche  der Aufschlämmung unter konstantem Rühren in  dieselbe eingeführt, das Rühren während weiterer  15 Minuten fortgesetzt und das Gemisch dann ruhen  gelassen,     damit    sich der Niederschlag setzen konnte.

    Hierauf wurde das     Alkohol-Wassergemisch    dekan  tiert und der Rückstand filtriert,     mit    kaltem Äthanol  gewaschen und getrocknet, was eine stabile Fest  substanz ergab mit folgenden     Analyseresultaten:          Glukoseoxydase-Einheiten    3200 g       Katalase-Einheiten    2000 g        "        Glukoseoxydasegewinnung    94,0       Katalasegewinnung    50,5<B>5-3</B>  In dem beschriebenen Verfahren ergab die  Variierung des für die Ausfällung des Ferment  systems aus dem     wässrigen    Extrakt     verwendeten     Alkoholvolumens folgende Resultate:

    
EMI0002.0020     
  
    <I>Tabelle <SEP> 1</I>
<tb>  Wirkung <SEP> des <SEP> Alkoholvolumens <SEP> auf <SEP> Fermentausfällung
<tb>  Alkoholvolumen <SEP> Glukoseoxydasegewinnung
<tb>  0,5 <SEP> 0,0
<tb>  1,0 <SEP> 7,3
<tb>  1,5 <SEP> 58,5
<tb>  2,0 <SEP> 94,0
<tb>  2,5 <SEP> _ <SEP> 94,0
<tb>  3,0 <SEP> 95,0
<tb>  3,5 <SEP> 94,0
<tb>  4,0 <SEP> 94,0
<tb>  3,0 <SEP> g <SEP> Natriumglukonat <SEP> in <SEP> Alkohol <SEP> aufgeschlämmt
<tb>  1,0 <SEP> Volumen <SEP> wässrigen <SEP> Extraktes <SEP> des <SEP> Ferments <SEP> bei <SEP> pH <SEP> 6,8.       Ein Vergleich der erhaltenen Resultate von Ta  belle 1 zeigt, dass die Menge Alkohol pro Volumen  Extrakt von 1,5 bis ungefähr 4,5 Volumen variiert  werden kann, dass aber optimale Resultate bei Ver  wendung von 2,0 bis 4,0 Volumen Alkohol pro  Volumen     wässrigem    Extrakt erzielt werden.

   Es kön  nen auch höhere Alkoholvolumen verwendet werden,  doch ergibt dies keine grössere     Fermentausbeute    und  die Wirksamkeit des Produktes, nach Gewicht be  rechnet,     ist    wegen     Ausfällung    von nichtenzymatischen       Inertsubstanzen    vermindert.  



  Verschiedene     Fällungsmittel    wurden nach dem  beschriebenen Verfahren auf ihre     Fähigkeit,    die Aus  fällung des breiigen Salzes der organischen Säure  und des Fermentes zu bewirken, untersucht. Die  Resultate sind in nachstehender Tabelle 2 enthalten.

    
EMI0002.0028     
  
    <I>Tabelle <SEP> 2</I>
<tb>  Wirkung <SEP> verschiedener <SEP> Fällungsmittel <SEP> auf
<tb>  Fermentausfällung
<tb>  Verwendetes
<tb>  Fällungsmittel <SEP> @  <SEP> Volumen <SEP> Fermentgewinnung
<tb>  Äthanol <SEP> 1,0 <SEP> 7,3
<tb>  1,5 <SEP> 94,0
<tb>  2,0 <SEP> 94,0
<tb>  2,5 <SEP> 94,0
<tb>  3,0 <SEP> 95,0
<tb>  Isopropanol <SEP> 1,0 <SEP> 73,1
<tb>  1,5 <SEP> 87,4
<tb>  2,0 <SEP> 85,7
<tb>  2,5 <SEP> 75,6
<tb>  3,0 <SEP> 57,1
<tb>  Methanol <SEP> 1,0 <SEP> 10,9
<tb>  1,5 <SEP> .

   <SEP> 27,3
<tb>  2,0 <SEP> 49,5
<tb>  2,5 <SEP> 32,7
<tb>  3,0 <SEP> 6,4
<tb>  Aceton <SEP> 1,0 <SEP> 15,0
<tb>  1,5 <SEP> 37,5
<tb>  2,0 <SEP> 68,0
<tb>  2,5 <SEP> 45,0
<tb>  3,0 <SEP> 8,8
<tb>  -@\ <SEP> 3,0g <SEP> Natriumglukonat <SEP> im <SEP> Fällungsmittel <SEP> aufgeschlämmt
<tb>  1,0 <SEP> Volumen <SEP> wässriger <SEP> Extrakt <SEP> des <SEP> Ferments <SEP> bei <SEP> pH <SEP> 6,8.       Eine Prüfung der Resultate von Tabelle 2 ergibt,  dass Äthanol das bevorzugte     Fällungsmittel    ist; doch  können     Isopropanol,    Methanol und Aceton verwen  det werden unter der Voraussetzung, dass das Ver  hältnis Wasserextrakt- :     Fällungsmittelvolumen    sorg  fältig kontrolliert wird.  



  Anstelle von     Natriumglukonat    wurden auch  andere     Salze    bei Anwendung des beschriebenen Ver  fahrens mit folgenden Resultaten verwendet:  
EMI0002.0034     
  
    <I>Tabelle <SEP> 3</I>
<tb>  Wirkung <SEP> des <SEP> gleichzeitig <SEP> ausgefällten <SEP> Salzes
<tb>  auf <SEP> die <SEP> Fermentausfällung
<tb>  Salz <SEP> % <SEP> Fermentgewinnung
<tb>  Natriumglukonat <SEP> 95,0
<tb>  Kaliumglukonat <SEP> 90,0
<tb>  Natriumcitrat <SEP> 86,0
<tb>  Natriumsuccinät <SEP> 90,0
<tb>  Natriumacetat <SEP> 90,0
<tb>  @  <SEP> 3,0 <SEP> g <SEP> Salz <SEP> per <SEP> Volumen <SEP> Äthanol <SEP> per <SEP> 1(3 <SEP> Volumen <SEP> des
<tb>  wässrigen <SEP> Extraktes.

           Anstelle des vorstehend angeführten     Natrium-          glukonats    kann das Säuresalz auch aus der Gruppe  der Natrium-, Kalium- und     A.mmoniumsalze    von  monobasischen oder polybasischen,     aliphatischen          Carbonsäuren    mit 3 bis 6     Kohlenstoffatomen    gewählt  werden.

   Beispielsweise können im oben beschriebenen  Verfahren die Natrium-, Kalium- oder     Ammonium-          salze    folgender Säuren gewählt werden:     Glukonsäure,          Äpfelsäure,    Zitronensäure,     Milchsäure,    Weinsäure,  Bernsteinsäure, Zuckersäure,     Galacturonsäure,    Ascor  binsäure,     Isoascorbinsäure    und verwandte Säuren.  



  Die Menge des im erfindungsgemässen Verfahren  verwendeten Säuresalzes hängt von der     im    Endpro  dukt     gewünschten        Fermentwirksamkeit,    wie auch von  der Löslichkeit des Salzes im Niederschlag ab. Das  mit dem     Fermentsystem    gleichzeitig     ausgefällte    Salz  bildet mit diesem ein     Adsorbat,    und je grösser die  Menge des verwendeten Salzes ist, desto schwächer  ist die     Wirksamkeit    des Endproduktes. Es ist deshalb  wünschenswert, gleiche Gewichtsmengen von Ferment  und Salz zu verwenden, um ein     Produkt        mit    der  Mischung nach Gewicht von 1 : 1 zu erzeugen.

   Dieses  Gewichtsverhältnis kann nach oben bis 10: 1 und  höher verschoben werden, nach unten auch weniger  als 1 : 1, doch liegt das bevorzugte Verhältnis von  Salz zu Ferment innerhalb von 5 : 1 bis<B>1:</B> 1,5. Das  bevorzugte Salz ist     Natriumglukonat,    welches in der  bevorzugten Form des     Verfahrens    zur Anwendung  gelangt.  



  Als Medium für das Säuresalz sind     Alkoxy-,          Keto-    und     Oxyverbindungen    vorzuziehen, z. B.  Methanol, Äthanol,     Isopropanol,        Propanol,        Iso-          butanol,        Butanol,        Glycerol,        Propylenglykol,    Aceton,       Methyläthylketon,        Dioxan    und dergleichen. Auch  Mischungen können verwendet werden, z. B. gleiche  Volumen von Methanol und Äthanol, usw.

   Das       Fällungsmittel    wird vor der Zugabe des     wässrigen     Extraktes am besten auf eine Temperatur von 4,5  bis 7,0  C abgekühlt und diese Temperatur wird wäh  rend der ganzen Reaktionszeit beibehalten. Wird  Äthanol als     Fällungsmittel        gewählt,    so ist eine Rein  heit von     90-100%    erwünscht. Im bevorzugten Bei  spiel der Erfindung gelangt als     Fällungsmittel     95     %iger    Äthanol zur Anwendung.  



  Die im erfindungsgemässen Verfahren zu ver  wendende Menge des     Fällungsmittels    hängt zum Teil  vom     Fermentsystem    und zum Teil vom gewählten       Fällungsmittel    ab. Es ist aber wesentlich, dass wäh  rend der     Ausfällungsstufe    der Niederschlag genügend  entwässert wird, um ein gut koaguliertes, leicht zu       filtrierendes    Produkt zu erhalten. Es hat sich gezeigt,  dass 1,5 bis 4,5 Volumen     Fällungsmittel    pro Volumen  wässriger Extrakt gute Resultate ergeben. Es können  auch höhere Volumen Alkohol     verwendet    werden.

    Wird aber das Alkoholvolumen 4,5 pro Volumen  Extrakt überschritten, erzielt man keine     grössere    Aus  beute mehr, vermindert aber, durch Ausfällung von  nichtenzymatischen     Inertsubstanzen    die, nach Gewicht  berechnete,     Wirksamkeit    des     Endproduktes.       In der bevorzugten Ausführung des     erfindungs-          gemässen    Verfahrens werden 2,5 bis 4,0 Volumen  Äthanol pro Volumen     Fermentextrakt    verwendet.  



  Das beschriebene Verfahren kann für die Aus  fällung und Vorbereitung zahlreicher     Fermentsysteme     in trockener, stabiler Form zur Anwendung gelangen.       Fermentlösungen    oder     Aufschlämmungen,    die nach  dem Verfahren behandelt werden können, um     trok-          kene    feste, stabile Niederschläge zu erzeugen,     sind     z.

   B.     oxydative    Fermente, wie     Glukoseoxydase,        Kata-          lase,        proteolytische    Fermente, wie     Proteasen    und       Peptidasen,    einschliesslich Pepsin,     Trypsin,        Papain,          Ficin,        Bromelin    und dergleichen,     Kohlenhydratasen,     wie     pektolytische    Fermente,     Amylasen,        Invertasen     usw.,     Ureasen,        Lipasen,

          Phosphatasen,        Peroxydasen,          Sulfidasen,        Phenolasen        und    dergleichen, sowie Mi  schungen derselben. Zur Gewinnung durch das     erfin-          dungsgemässe    Verfahren sind speziell     Glukoseoxydase,          Katalase    und deren Mischungen geeignet.  



  Vorzugsweise wird der     wässrige    Extrakt des     Fer-          mentsystems    an einem unter der Oberfläche der Auf  schlämmung des Salzes der organischen Säure lie  genden Punkt in dieselbe eingeführt. Dieses Verfah  ren kann aber auch umgekehrt werden, indem der  Salzbrei in den     wässrigen    Extrakt des     Fermentsystems     eingeführt wird. Selbstverständlich ist bei     niedrigen,     das     Fermentsystem    schonenden Temperaturen zu ar  beiten.  



  Zur Isolierung wird gewöhnlich die     Wasser-          Alkoholschicht        abdekantiert    und der Rückstand     fil-          triert    oder zentrifugiert, um die Flüssigkeit abzu  trennen. Waschen der abgetrennten Festsubstanzen  mit zusätzlichem     Fällungsmittel    und Trocknen sichert  ein stabiles, trockenes, festes Produkt mit kaum ver  minderter     Wirksamkeit.    Falls es     gewünscht    wird,  kann die     Festsubstanz    durch Mahlen noch feiner ver  teilt werden.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH Verfahren zur Gewinnung eines Fermentsystems aus dessen wässrigem Extrakt, dadurch gekennzeich net, dass der wässrige Extrakt mit einer Aufschläm mung eines Salzes einer natürlich vorkommenden, organischen Säure in einer niedrigmolekularen, mit einer sauerstoffhaltigen Gruppe substituierten, alipha- tischen Flüssigkeit zusammengebracht wird und die Suspension so lange gerührt wird, bis die Ausfällung des Fermentsystems im wesentlichen beendet ist,

   und nachfolgend die gemeinsam ausgefällte Kombination Fermentsystem-Säuresalz isoliert wird. UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass der wässrige Extrakt mit der Auf- schlämmung eines Salzes der Glukonsäure, Zitronen säure, Bernsteinsäure oder Essigsäure in einer niedrig molekularen, mit einer sauerstoffhaltigen Gruppe substituierten 1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweisenden, aliphatischen Flüssigkeit zusammengebracht wird. 2.

   Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass der wässrige Extrakt mit einer Aufschlämmung von Natriumglukonat in einem niedrigmolekularen, aliphatischen Alkohol mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen zusammengebracht wird. 3.

   Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass der wässrige Extrakt mit einer Auf- schlämmung des Salzes der organischen Säure in Methanol, Äthanol, Isopropanol oder Aceton, vor zugsweise in Äthanol, zusammengebracht wird. 4. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass der wässrige Extrakt mit einer Auf schlämmung von Natriumglukonat in Äthanol zusam mengebracht wird. 5.

   Verfahren nach Patentanspruch zur Gewinnung von Glukoseoxydase aus deren wässrigem Extrakt mit einem pH von etwa 6,8, dadurch gekennzeich net, dass der wässrige Extrakt mit einer Aufschläm- mung von Natriumglukonat in Äthanol gemischt und so lange gerührt wird, bis die Ausfällung der Glukose- oxydase im wesentlichen beendet ist,

   dass man die gemeinsam ausgefällte Kombination Glukoseoxydase- Natriumglukonat abfiltriert und trocknet.