CH404860A - Procédé de préparation de dérivés de la céphalosporine C - Google Patents

Description

  Procédé de     préparation    de dérivés de la     céphalosporine    C    La présente invention a pour objet un procédé  de préparation de dérivés de la céphalosporine C.  



  Dans le brevet britannique No 810196, on décrit  un antibiotique résistant à la     pénicillinase,    la     c6pha-          losporine    C, que l'on isole des produits de fermenta  tion d'une espèce de     céphalosporium.     



  La céphalosporine C est relativement stable en  présence des acides, ne subissant pas de perte d'ac  tivité décelable par séjour dans de l'acide chlorhy  drique 0,1 N à température ordinaire pendant 4 h.  L'acide chlorhydrique concentré chaud agissant pen  dant une durée de l'ordre de 18 h dégrade la molé  cule de la céphalosporine C et détruit en même  temps son activité.  



  Dans le Symposium de la Fondation     Ciba    sur les  aminoacides et les peptides à l'activité     antimétaboli-          que,    1958,     pp.    205-223, on indique que le traite  ment de la céphalosporine C par l'acide chlorhydri  que 0,1 N à     20,)    C fournit au moins deux composés  acides et trois composés neutres, qui sont tous posi  tifs à la     ninhydrine.    Les composés neutres se sépa  rent facilement sur des chromatogrammes sur papier  traités avec une solution     butanol-acide    acétique-eau  (4 : 1 : 4).

   L'un d'eux     (Rr,,    0,15) présente une activité  antibactérienne et a été dénommé céphalosporine     C,     La préparation et les propriétés de la céphalosporine       C,.    sont décrites plus en détail dans l'exposé du bre  vet britannique No 912360.  



  On a maintenant     découvert    qu'en soumettant la  céphalosporine C à une hydrolyse acide ménagée, on  peut former un produit ayant un caractère totale-    ment distinct des produits de dégradation qui résul  tent du traitement acide décrit ci-dessus.     Ainsi,    en  traitant la céphalosporine C conformément à l'inven  tion, on scinde la molécule de la céphalosporine C  en deux fragments, à savoir un noyau cyclique et  une chaîne latérale qui est l'acide     .a-amino        adipique.     



  Le noyau de la céphalosporine C est de formule  
EMI0001.0021     
    On a également découvert qu'un type de struc  ture     noyau-chaîne    latérale similaire se retrouve dans  des produits de transformation de la céphalosporine  C qui étaient connus     jusqu'ici    sous les noms de       cé-          phalosporine        C.      et   céphalosporines CA  .

   Le  noyau de la céphalosporine     C,    est de formule  
EMI0001.0028     
      et les noyaux des céphalosporines<B>ÇA</B> sont de for  mule  
EMI0002.0001     
    dans laquelle R représente le radical d'une base     hété-          rocyclique        tertiaire    faible reliée au groupe     CH.,    par  son atome d'azote tertiaire, par exemple de la     pyri-          dine,    de la     collidine    ou de la quinoléine.

   Les céphalo  sporines C     #l,    représentées ci-dessus sous la forme de       zwitterion,peuvent    être préparées comme décrit dans  l'exposé du brevet britannique     Nû,    912541. Comme  dans la céphalosporine C, la chaîne latérale de la  céphalosporine     C,    et des céphalosporines     C_'    est le  radical acyle de l'acide a-amino-adipique,         HOOC    -     CH(NH.,)    -     (CH,),,    - CO -.    Le noyau de la céphalosporine C est également  appelé acide     7-amino-céphalosporanique.     



  Il a été constaté que la propriété de résistance à  la     pénicillinase    dont jouissent la céphalosporine C, la  céphalosporine     C,.    et les     céphalosporines    CA dépend  principalement de la structure du noyau et que la  préparation de ces noyaux par mise en     aeuvre    de  l'invention ouvre la voie à la préparation de compo  sés analogues à ces     céphalosporines,    notamment par  adjonction d'autres chaînes latérales à ces noyaux  par acylation sur le groupe     7-amino.    Les nouvelles  céphalosporines ainsi obtenues présentent une activité       similaire,    mais modifiée et parfois     augmentée,

      en  comparaison avec l'activité de la céphalosporine C  elle-même.  



  Conformément à l'invention, on obtient ces  noyaux en soumettant de la céphalosporine C, de la  céphalosporine     C,    ou une céphalosporine     CA,    ou un  dérivé de ces céphalosporines dans lequel le groupe       amino    de la chaîne latérale     a-amino-adipyle    est pro  tégé, à une hydrolyse en présence d'un agent     hydroly-          tique    acide pendant une durée qui, en fonction de la  température et des autres conditions de la réaction,  est telle que la     chaîne    latérale     a-amino-adipyle,    pro  tégée ou non protégée, soit enlevée et que la struc  ture soit conservée.  



  Les noyaux peuvent ensuite être isolés sous forme  libre ou sous forme de leurs sels d'addition d'acides,  par un ajustage approprié du pH de la solution. Par  exemple, si l'on ajuste le pH de la solution à environ  4,5, on peut isoler les noyaux libres. Il est entendu  que le terme   acide   comprend les matières     échan-          geuses    d'ions acides.  



  Le groupe     2,4-dinitro-phényle    est un groupe pro  tecteur particulièrement approprié. Un autre groupe  utilisable est le groupe 2-nitro-4-carbométhoxy-phé-         nyle.    Le dérivé     2,4-dinitro-phénylé    de la céphalospo  rine C peut être préparé par réaction de la céphalo  sporine C avec du     1-fluoro-2,4-dinitro-benzène,    et le  dérivé     2-nitro-4-carbométhoxy-phénylé    peut être pré  paré par réaction de la céphalosporine C avec du     1-          fluoro-2-nitro-4-carbométhoxy-benzène.     



  L'hydrolyse de la céphalosporine C, de la cépha  losporine     C,    ou de leurs dérivés à chaîne latérale  protégée, ou d'une céphalosporine     C.@,    peut être réa  lisée au moyen d'un acide minéral dilué, par exem  ple d'acide chlorhydrique 0,1 N à N. Comme autres  acides appropriés, on peut mentionner les acides     sul-          foniques    et les résines de polystyrène sulfonées.

   Pour  mettre en     oeuvre    le procédé, on peut laisser reposer  la solution traitée par un acide, contenant de la cé  phalosporine C, de la céphalosporine     C,.    ou une cé  phalosporine CA ou le dérivé à chaîne latérale pro  tégée, pendant un temps tel que le noyau soit séparé  de la chaîne latérale, ce temps dépendant de la sévé  rité des conditions mais étant normalement de l'ordre  de quelques jours. En général, aux températures com  prises entre -     10#,    C et     -I-        50,,    C, les durées employées  sont de 30 jours à 12 heures respectivement, par  exemple de 3 jours avec de l'acide chlorhydrique  0,1 N à     20o    C.

   Ensuite, on peut séparer le noyau  des produits de réaction, par exemple par électro  phorèse, par chromatographie ou échange d'ions.  Dans une méthode, on traite le produit de réaction  par une résine     échangeuse    d'anions fortement basi  que, on élue la résine au moyen d'un solvant et on  recueille les fractions contenant le noyau. La résine  est de préférence sous la forme d'acétate et le sol  vant peut être de l'acide acétique.

   Si l'on utilise ces  techniques, on peut généralement identifier le noyau  séparé sur un chromatogramme sur papier par la ca  ractéristique d'absence d'activité antibiotique propre  ment dite aux concentrations utilisées (par exemple  lorsqu'on place le papier     d'électrophorése    au contact  de plaques ensemencées de staphylocoque doré (sou  che d'Oxford), mais d'activité après     phénylacétyla-          tion    au moyen de chlorure de     phénylacétyle.    Pour  cette     phénylacétylation,    on peut tout d'abord sou  mettre le papier à une pulvérisation de     pyridine    M  dans de l'acétone à 50 0/0,

   puis à une pulvérisation       de        chlorure        de        phénylacétyle        (1,25        %        v/v)        dans        de     l'acétone. Le dérivé     phénylacétylé    peut être séparé  par chromatographie et électrophorèse.  



  Pour produire le noyau de la céphalosporine     C,,    ,  on peut préparer la céphalosporine     C,.    in situ à par  tir de céphalosporine C.     Ainsi,    en traitant de la cé  phalosporine C par un acide, on la transforme en  céphalosporine     C,.    et en continuant le traitement  acide, on obtient le noyau de la céphalosporine     C,     Il s'est avéré que l'acide chlorhydrique 0,5 N à N  pendant moins de 1 jour sont les conditions préférées  pour la production de céphalosporine C,. et que les  conditions préférées pour la production de son noyau  consistent en le traitement de la céphalosporine C  par de l'acide chlorhydrique 0,5 N à N pendant 2  à 4 jours.

        Le noyau de la céphalosporine C, obtenu con  formément à l'invention par hydrolyse acide de la  céphalosporine C ou d'un dérivé à chaîne latérale  protégée de la céphalosporine C, peut être utilisé  pour la production de noyaux de céphalosporines       Ç@    , par traitement du noyau de la céphalosporine C  par une base hétérocyclique tertiaire faible.  



  Lorsqu'on met en     couvre    l'invention en partant  d'un dérivé à chaîne latérale protégée, il convient  d'utiliser de l'acide chlorhydrique dilué, spéciale  ment en concentration comprise entre 0,1 et 0,3N,  en présence d'un solvant organique miscible à l'eau  tel que     l'acétonitrile.    Avantageusement, on effectue  la réaction à l'obscurité et sous une atmosphère       inerte,    par exemple sous azote.  



  Au cours du traitement de la céphalosporine C  par un acide, de concentration comprise dans les li  mites indiquées, au moins deux réactions entrent en  jeu. Ces réactions sont    (1) l'hydrolyse de la céphalosporine C qui scinde la  liaison reliant le noyau à la chaîne latérale et  (2) la réaction de l'acide avec la molécule de la cé  phalosporine C produisant de la céphalosporine       C'.     



  De plus, dès que de la céphalosporine     C,    est pré  sente dans le mélange réactionnel, une troisième réac  tion commence, à savoir l'hydrolyse de la céphalo  sporine     C.    qui scinde la liaison reliant le noyau de la  céphalosporine C. à la chaîne latérale. En outre, il se  forme une certaine quantité de noyau de la céphalo  sporine     C,,    par réaction de l'acide avec le noyau de la  céphalosporine C.

   Les conditions qui conviennent le  mieux pour l'obtention du produit désiré peuvent  être déterminées expérimentalement, et on a cons  taté que, lorsqu'on part de céphalosporine C, le trai  tement par de l'acide chlorhydrique 0,1 N à     20o    C  pendant environ 3 jours convient pour la produc  tion du noyau de la céphalosporine C et que le trai  tement par de l'acide chlorhydrique 0,5 à 1 N à       20     C pendant environ 3 jours convient pour la pro  duction du noyau de la céphalosporine     C,     Le noyau de la céphalosporine C forme des sels,  par exemple des sels de sodium, de potassium et  d'ammonium, par traitement avec un équivalent  d'une base.

   Les noyaux de la céphalosporine C, de la  céphalosporine     C.    et des céphalosporines     C.1    forment  également des sels d'addition d'acide sur le groupe       amino    primaire, par exemple d'acides minéraux et  d'autres acides forts, par exemple des chlorhydrates.  



  Le noyau de la céphalosporine C, que l'on a appelé  acide     7-aminocéphalosporanique,    possède une struc  ture stérique semblable à celle de la partie corres  pondante de la     céphalosporine    C obtenue par fer  mentation du     céphalosporium.    Il peut également être  identifié par les propriétés suivantes, après     phényl-          acétylation     1) La fraction de la préparation formée du noyau  de la céphalosporine C migre légèrement plus    vite que la céphalosporine C vers l'anode, lors  de l'électrophorèse au pH 7 (avec de l'acétate  de     collidine    aqueux comme solvant).  



  2) La fraction formée du noyau de la céphalospo  rine C migre à une vitesse égale à     environ    la  moitié de celle de la céphalosporine C vers  l'anode au pH 4,5 (avec de l'acétate de     pyridine     aqueux comme solvant).  



  3) La fraction formée du noyau de la céphalospo  rine C reste au voisinage du point d'origine dans  l'électrophorèse au pH 4,0 (dans de l'acétate de       pyridine    aqueux), ne manifestant qu'une migra  tion relativement faible vers l'anode. Dans ces  conditions, la céphalosporine C migre encore vers  l'anode presque aussi rapidement qu'au pH 7.

      4) Après électrophorèse dans l'acide acétique à  10 %,     élution    du papier et hydrolyse dans l'acide  chlorhydrique N à 1050 pendant 16 h, elle four  nit un peu de glycine (50     #tg    donnant une tache  d'intensité semblable à celle de la tache de gly  cine obtenue par hydrolyse de 50     [g    de     cépha-          Iosporine    C) mais pas d'acide     a-amino-adipique.     Elle ne contient donc pas la chaîne latérale de  la molécule de la céphalosporine C.  



  5) La fraction formée du noyau de la céphalospo  rine C présente une valeur Ru semblable à celle  de la     N-phénylacétylcéphalosporine    C (0,08-0,15)  dans le     butanol-éthanol-eau    (4 : 1 : 5 en volume).  



  6) Après chromatographie dans le     butanol-éthanol-          eau,    ou après électrophorèse, et après avoir pul  vérisé sur le papier une solution de gélatine à  0,1 %, contenant de la     pénicillinase    (concentra  tion d'enzyme égale à 10 fois celle nécessaire  pour inactiver une tache de 50     [.g    de     benzylpéni-          cilline),    elle donne une tache d'activité apparem  ment non diminuée lorsqu'on pulvérise sur le pa  pier du chlorure de     phénylacétyle    et de la     py-          ridine.     



  7) Lorsqu'on en dépose une goutte sur du papier,  on pulvérise de l'acétate de     pyridine    au pH 7  (concentration 2 M de la     pyridine)    sur la tache,  on suspend à l'état humide sur la vapeur d'une  solution d'acétate de     pyridine    2 M à     37o    pendant  16 h, on sèche, on soumet à l'électrophorèse au  pH 7 et on     phénylacétyle,    une tache active (due  au dérivé     phénylacétylé    du noyau de la céphalo  sporine<B>C.1</B>     (pyridine)    apparaît dans la position  neutre, ainsi qu'une tache dans une position légè  rement plus proche de l'anode que celle occupée  par la céphalosporine C.  



  8) Après électrophorèse sur papier, le noyau donne  une couleur brun jaunâtre avec la     ninhydrine,    qui  vire par la suite au gris bleu (il a été publié que  l'acide     6-aminopénicillanique    ne donne pas une  couleur     normale    avec la     ninhydrine).    Après élec  trophorèse ou chromatographie sur papier, il peut  être facilement décelé (comme la     céphalosporine         C), sous forme d'une tache absorbante sombre,  en plaçant le papier devant une source de lu  mière ultraviolette.  



  Le noyau de la céphalosporine     C,.,    qui est la     lac-          tone    de l'acide     désacétyl-7-aminocéphalosporanique,     a également une structure stérique semblable à celle  de la partie correspondante de la céphalosporine C  obtenue par fermentation de     céphalosporium.     Elle peut être encore identifiée par les propriétés sui  vantes, après     phénylacétylation.     



  1) Par électrophorèse sur papier dans un tampon  d'acétate de     pyridine    (pH 4,5), le noyau de la  céphalosporine     C,.    se déplace vers la cathode ap  proximativement sur la même distance que le  noyau de la céphalosporine C se déplace vers  l'anode.  



  2) Par électrophorèse sur papier avec un tampon  d'acide acétique à 10<B>()/a,</B> le noyau de la céphalo  sporine     C,.    migre vers l'anode deux fois et demie  plus vite que le noyau de la céphalosporine C.  



  3) Par chromatographie dans le     butanol-éthanol-eau     (4: 1 : 5 en volume), la valeur     R,,.    du noyau de  la céphalosporine     C,.    est de 0,33, alors que     celle     de la céphalosporine C est de 0,08-0,15 et celle  du noyau de la céphalosporine CA est de 0,08.

    Les noyaux des céphalosporines     C.,,    ont égale  ment une structure stérique semblable à celle de la  partie correspondante de la céphalosporine C obtenue  par fermentation du     céphalosporium.    La céphalospo  rine     C.,        (pyridine)    peut être encore identifiée par les  propriétés suivantes:  1) Par électrophorèse sur papier au pH 4,0 dans un  tampon d'acétate de     pyridine,    le noyau de cépha  losporine     C1    se déplace vers la cathode sur une  distance semblable à la distance sur laquelle la  céphalosporine C se déplace vers l'anode.

   Lors  que l'électrophorèse est effectuée dans de l'acide  acétique à 10<B>%</B>, le noyau de la céphalosporine       C_L        (pyridine)    se déplace environ deux fois plus  vite vers la cathode que la céphalosporine     C,t          (pyridine).     



  2) Le noyau de la céphalosporine     C_@        (pyridine)     n'est pas détruit par l'action de la     pénicillinase     dans des conditions dans lesquelles 50      g    de  pénicilline G sont complètement détruits.  



  3) Le noyau de la céphalosporine     C.,        (pyridine)    se  distingue du noyau de la céphalosporine     C,    sur  les chromatogrammes sur papier traités au     n-bu-          tanol-éthanol-eau    (4: 1 :5 en volume).  



  Les composés définis plus haut, c'est-à-dire les  noyaux des céphalosporines C,     C,    et CA sont spécia  lement     importants,    car ils sont des produits intermé  diaires à     partir    desquels d'autres dérivés de la cépha  losporine C doués d'activité biologique peuvent être  préparés.  



  Les exemples suivants illustrent l'invention.    Exemple 1  <I>Préparation de l'acide</I>     7-aminocéphalosporanique     <I>(a) Préparation dit dérivé du</I>     1-flitoro-2,4-dinitro-          benzène        (FDNB)   <I>et de la céphalosporine C.</I>  



  On a dissous 31,7 g du sel de sodium de la cé  phalosporine C (pureté 85-90<B>%</B>) dans 635 ml d'eau  contenant 25,5 g de bicarbonate de sodium anhydre.  En agitant la solution, on a ajouté 25,5 ml de     FDNB     dissous dans 635 ml d'alcool éthylique. On a agité  ce mélange à l'obscurité à température ordinaire pen  dant encore     21/=    h. On a ensuite ajusté le pH de la  solution à 5 avec de l'acide chlorhydrique concentré  et on a chassé l'alcool par distillation sous vide. Du       FDNB    en excès a été chassé en même temps.  



  Après avoir porté ce mélange au pH 7 avec du  bicarbonate de sodium, on l'a extrait avec 3     X        1/z     vol. d'éther pour éliminer l'excès de     FDNB    et laisser  une solution aqueuse limpide. On a alors amené le  pH à 2,5 avec de l'acide chlorhydrique concentré. II  s'est formé un précipité collant, qui s'est dissous par  extraction avec 3     X        1/:a    vol. d'acétate d'éthyle. On  a réuni les extraits dans l'acétate d'éthyle, on les a  lavés à l'eau, séchés sur du sulfate de sodium anhy  dre et évaporés à sec, ce qui a laissé 40,3 g d'un  solide jaune.  



  Un dosage biologique par comparaison avec un  échantillon pur du dérivé     dinitrophénylé    de la cé  phalosporine C a montré que ce produit est d'une  pureté d'environ 88 %.  



  <I>(b) Hydrolyse acide du dérivé</I>     2,4-dinitrophényle   <I>(le</I>  <I>la céphalosporine C.</I>  



  Le dérivé     2,4-dinitrophényle    brut de la céphalo  sporine C provenant de la préparation ci-dessus con  tient une faible proportion d'une impureté basique  colorée, que l'on a éliminée en dissolvant le produit  solide dans de l'acétate d'éthyle et en lavant du     HCl     0,2 N. On a ensuite séché l'acétate d'éthyle et on l'a  chassé sous vide. 10,1 g de solide ont été réduits à  9,7 g par cette opération.  



  On a dissous 9,7 g du dérivé du     DNP    et de la  céphalosporine C dans un mélange de<B>100</B> ml     d'acé-          tonitrile,    65 ml d'eau et 34 ml d'acide chlorhydrique  1 N. On a ensuite laissé reposer cette solution à l'obs  curité, à température ordinaire et sous azote pendant  64 h. On a ensuite ajouté 200 ml d'eau à la solution  et on a extrait le tout avec 5     X    100 ml d'acétate  d'éthyle. On a amené le résidu aqueux (270 ml)  d'acide     7-aminocéphalosporanique    au pH 7,2 avec  une solution saturée de bicarbonate de sodium et on  a refroidi à     0o    C.  



  <I>(c) Isolement (le l'acide</I>     7-arriiriocéphalospor-anique     <I>11I</I>     (7-ACA).     



  Après l'hydrolyse et l'extraction à l'acétate  d'éthyle du stade (b) ci-dessus, il reste une solution  acide contenant principalement du     7-ACA    et de la       lactone    de     7-ACA.    On a ajusté cette solution au  pH 6,7 et on l'a fait passer dans une colonne de            Dowex-1     <B>(CI-).</B> La     lactone    de     7-ACA    traverse  la colonne et apparaît dans le filtrat sortant de la  résine. Après lavage à l'eau, le     7-ACA    peut être       élué    avec de l'acide chlorhydrique 0,05 N.

   Les frac  tions contenant le     7-ACA    donnent un précipité cris  tallin qui parait être la forme     zwitterion    de     cette    ma  tière, alors que la majeure partie du     7-ACA    reste  en solution comme chlorhydrate. Le spectre infra  rouge du solide est représenté à la     fig.    1 du dessin.  Les solutions du chlorhydrate peuvent être     phényl-          acétylées    pour fournir la     benzylcéphalosporine.     



  Exemple 2  <I>Préparation du noyau de la céphalosporine C</I>       n   <I>partir (le</I>     céphalosporine   <I>C</I>  On a dissous 2 g de sel de sodium de céphalo  sporine C dans 30 ml d'eau, on a amené le pH à  2,5 par addition de       Dowex    50     X    8       (H--),    on a  séparé la résine par filtration, on l'a lavée avec 10 ml  d'eau et on a ajouté 10,2 ml     d'HCl    1 N au filtrat  et aux eaux de lavage réunis. On a maintenu la so  lution à 20  C pendant 3 jours et on l'a fait passer  dans une colonne de       Dowex-1      (forme acétate)  de 2,1 cm de diamètre X 7 cm.

   On a recueilli le       percolat    en fractions. de 5 ml (1 à 12) et on a     élué     la colonne avec de l'eau jusqu'à ce qu'un total de  34 fractions ait été recueilli. On a ensuite com  mencé une     élution    avec de l'acide acétique 0,5 N et  on a recueilli encore 66 fractions. La densité optique  à 260     mI,    a été mesurée pour chaque fraction.  



  Les fractions 2-16 ont été réunies et concentrées  sous vide et 312 mg de céphalosporine     C,    se sont  séparés sous     forme    cristalline. Les fractions 36-45  contenaient la majeure partie du noyau de céphalo  sporine C, qui a fourni un dérivé     phénylacétylé    ac  tif. Ces fractions ont été réunies et séchées sous  congélation (40 mg). Par     phénylacétylation,    ce pro  duit a donné 250 unités d'activité sur     Staph.        aureus,     par mg du produit original.  



  Le nouveau composé a encore été purifié par  électrophorèse de la fraction appropriée provenant  de la colonne de       Dowex-1      (acétate). L'électro  phorèse a été effectuée dans une cellule     d'électropho-          irèse    sur papier à écoulement continu     Beckman/          spinco    Modèle     CP.    Le tampon utilisé a été préparé  en ajoutant de la     pyridine    à de l'acide acétique  0,05 N jusqu'à ce que le pH monte à 4,0. On a fait  fonctionner la cellule à courant constant (40     mA),     la tension étant de 880 V.

   L'échantillon, dans un  tampon de 20 ml, a été fourni au rideau pendant  24 h et 32 fractions ont été recueillies, les fractions  étant numérotées de la cathode (1) à l'anode (32).  Le volume de chaque fraction était d'environ 12 ml.  A la fin de l'expérience, on a pulvérisé de la     ninhy-          drine    sur le rideau de papier. Ceci a révélé une forte  bande de matière de très faible mobilité qui a été  entraînée hors du rideau dans les fractions 13-15,  une bande de matière fortement acide qui avait  coulé dans la mèche d'anode, et une faible bande  d'un produit (correspondant à l'acide a-aminodipi-    que) qui avait migré vers l'anode et a été entraîné  hors du rideau dans la fraction 24.  



  Pour déterminer la position du nouveau composé,  on a appliqué 10 touches de 10     [l    de chaque frac  tion sur du papier et on a pulvérisé sur le papier de  la     pyridine    1 M dans. de l'acétone à 50 %, puis du       chlorure        de        phénylacétyle    à 2     %        dans        de        l'acétone.     Après contact du papier avec des plaques ensemen  cées de     Staph.        aureus    et incubation des plaques,

   on  a trouvé une grande zone d'inhibition dans une po  sition correspondant à la fraction 22 et une plus  petite dans une position correspondant à la frac  tion 23.  



  Par séchage sous congélation de la fraction 22,  on a obtenu un résidu qui était trop petit pour pou  voir être pesé avec précision. En solution aqueuse,  le spectre d'absorption ultraviolet du produit a mon  tré un plateau à 260     m#t,    et son poids total (43     I,g)     a été estimé d'après l'extinction à cette longueur  d'onde, en admettant que le poids moléculaire de la  substance est égal à celui de l'acide     7-aminocéphalo-          sporanique,    et que son extinction moléculaire est  égale à celle de la     céphalosporine    C. On a     phényl-          acétylé    le produit dans de l'acétone aqueuse conte  nant un tampon au phosphate de pH 6,5.

   L'activité  du dérivé     phénylacétylé    contre     Staph.        aureus    a cor  respondu à 1450 unités par mg de produit original.  La céphalosporine C présente une activité de 8-10  unités par mg contre le même organisme.  



  Le groupe     amino    de l'acide     6-aminopénicillanique     (noyau de la pénicilline) a une basicité relativement  faible, le pH isoélectrique publié pour ce composé  étant de 4,3     (Batchelor,    Doyle,     Naylor    et     Rolinson,     1959).  



  Ceci est facile à comprendre, étant donné que le  groupe     amino    est en     (3    à la fois par rapport à un  groupe CON et à un groupe CH - S -. Pour des  raisons analogues, le groupe     amino    de l'acide 7  aminocéphalosporanique devrait être faiblement ba  sique et la substance devrait migrer vers l'anode au  pH 7.

   Les propriétés du nouveau dérivé de la cépha  losporine C (décrites aux pages 5 et 6) dénotent qu'il  est en fait l'acide     7-aminocéphalosporanique.       Exemple 3  <I>Préparation de</I>  <I>l'acide</I>     7-phénylacétamidocéphalosporanique       On a traité le sel de sodium de la céphalosporine  C avec de l'acide chlorhydrique dilué à température  ordinaire, en procédant comme décrit précédemment.

    On a neutralisé la solution résultante, contenant  l'acide     7-aminocéphalosporanique    et d'autres pro  duits de dégradation faiblement acide de la céphalo  sporine C, et on l'a tamponnée au pH 7,0 avec une  solution de bicarbonate de sodium sous atmosphère  de     C02.    On a ajouté lentement du chlorure d'acé  tyle (1,2     équiv.,    basé sur la quantité de céphalospo  rine C utilisée)

   dans de l'acétone à la solution neutre  préalablement refroidie à     0o    et mélangée avec suffi  samment d'acétone pour que la concentration finale           de        l'acétone        soit        de        50        %        après        l'addition        de        la     solution de chlorure de     phénylacétyle.    Au bout d'une  heure, on a amené le pH du mélange à 5,0 (électrode  de verre) et on a chassé l'acétone sous vide.

   On a  alors abaissé le pH à 2,0 et on a extrait à l'acétate  de butyle l'acide     7-phénylacétamidocéphalosporani-          que,    ensemble avec la     N-phénacétyl-céphalosporine     C. et la     N-phénylacétyl-céphalosporine    C. On a sé  paré l'acétate de butyle et on l'a extrait avec de  l'eau amenée au pH 5,0 à l'équilibre par addition  d'alcali. On a séché l'extrait aqueux sous congéla  tion.

   Par chromatographie sur papier de 150     ug    du  produit dans du     n-butanol-éthanol-eau    (4: 1 : 5 en  vol.) on a constaté qu'il contenait trois composants  actifs contre     Staph.        aureus    (voir     fig.    1).

   Le compo  sant actif principal est l'acide     7-phénylacétamidocé-          phalosporanique.    Les autres composants actifs sont  la     N-phénylacétyl-céphalosporine        C,,    et la     N-phényl-          acétyl-céphalosporine    C qui toutes deux n'ont été  extraites que     partiellement    par l'acétate de butyle.  



  On a séparé l'acide     7-phénylacétamidocéphalo-          sporanique    des autres composants actifs du mélange  brut (17     unités/mg    contre     Staph.        aureus)    par chro  matographie sur une colonne de rouleau de papier       Grycksbo        (IKB-Produkter,    Suède) et par distribution  à contre-courant.  



       L'élution    de la colonne de papier a été effectuée  avec du     n-butanol    saturé d'eau. Dans une expérience  préliminaire, le sel de sodium de l'acide     7-phényl-          acétamidocéphalosporanique    a été obtenu de la co  lonne de papier sous forme d'une poudre présentant  une activité de 167 unités/mg. Ce produit est claire  ment impur.  



  Les distributions à contre-courant préliminaires  ont été effectuées dans deux systèmes solvants. Le  premier système consiste en volumes égaux     d'acé-          tate        de        butyle        et        d'acide        acétique    à 1     %        (solvant        I),     et le second en     n-butanol    et tampon de phosphate  de sodium 0,05 M au pH 6,0 (solvant II).

   Après huit  transferts dans le solvant I (10 ml de la couche su  périeure et 20 ml de la couche inférieure), la con  centration de l'acide     7-phénylacétamidocéphalospo-          ranique    a atteint un maximum entre les tubes 6 et 7,  alors que les autres composants actifs ont été trouvés  dans les tubes 0 et 1. La matière recueillie dans les  tubes 5, 6 et 7 a titré approximativement 50 unités  par mg. La chromatographie sur papier de cette  matière dans du     n-butanol-eau-éthanol    (4: 5 : 1 en  vol.) a montré que l'acide     7-phénylacétamidocéphalo-          sporanique    était la seule substance active présente.  



  Après huit     transferts    dans le solvant II (20 ml  de chaque couche), le     phénylacétamidocéphalospora-          nate    de sodium a montré un sommet entre les tubes  3 et 4, mais la majeure partie du restant de la ma  tière active est restée dans le tube 0.  



  L'acide     7-phénylacétamidocéphalosporanique    s'est  déplacé vers l'anode à presque la même vitesse que  la pénicilline G, en électrophorèse sur papier dans  un tampon d'acétate de     collidine    au pH 7. Par incu  bation avec de la     pyridine    aqueuse à     37 ,    l'acide 7-         phénylacétamidocéphalosporanique    a été partielle  ment converti en un dérivé actif du type de la cé  phalosporine C A     (pyridine).    Ce dérivé s'est     comporté     comme une substance neutre en électrophorèse au  pH 7,0.  



  Une quantité d'environ 10     ug    d'acide     7-phényl-          acétamidocéphalosporanique    n'a pas été     appréciable-          ment    inactivée par une solution de     pénicillinase    con  tenant 10 fois la quantité d'enzyme inactivant com  plètement 50     #tg    de pénicilline G dans des conditions  semblables.  



  Exemple 4  <I>Préparation du noyau de la</I>     céphalosporine        C=1          (pyridine)   <I>à partir de céphalosporine</I>     C.1        (pyridine)       On maintient de la céphalosporine     C_1        (pyridine)     dans de l'acide chlorhydrique 0,5 N ou 1 N à tempé  rature ordinaire pendant 3 jours ou plus.

   Lorsque  les produits de cette réaction sont analysés par élec  trophorèse sur papier dans un tampon d'acétate de       pyridine    (pH 4,0) suivie de mise en contact du papier  avec des plaques     d'agar    ensemencées de     Staph.        au-          reus,    une unique zone active due à la céphalosporine  C A     (pyridine)    non transformée est révélée, à la con  centration utilisée. La céphalosporine CA     (pyridine)     se     comporte    comme si elle n'avait pas de charge nette  au pH 4,0.

   Cependant, des bandes de papier dupli  quées sur lesquelles on a pulvérisé de la     pyridine    M       dans        de        l'acétone        aqueuse    à     50        %        et        du        chlorure        de          phénylacétyle    à     0,125        %        dans        de        l'acétone        sèche,

       révèlent une zone active additionnelle sur les plaques  ensemencées, due aux produits de la     phénylacétyla-          tion    du noyau de la céphalosporine     C,        (pyridine).    Le  noyau de céphalosporine CA se comporte     comme     une base au pH 4,0. Il migre vers la cathode sur une  distance un peu plus grande que la distance sur la  quelle la céphalosporine C elle-même migre vers  l'anode dans la même expérience. Il reste en     posï-          tion    neutre dans l'électrophorèse au pH 7.

   Ce com  portement est en accord avec les propriétés prévues  du noyau de la céphalosporine CA     (pyridine),    (voir  la position 9 de la définition du noyau de la céphalo  sporine C). On a formé un composé avec les mêmes  propriétés par incubation du noyau de la céphalo  sporine C avec de l'acétate de     pyridine    2 M au pH 7  pendant 16 h. Par     phénylacétylation,    ce composé a  fourni un dérivé     phénylacétylé    actif. Les propriétés  du noyau de la céphalosporine CA ont été étudiées  et elles se sont montrées coïncider avec les proprié  tés décrites plus haut     pour    ce noyau.

      Exemple 5       Préparation   <I>du</I>     noyait   <I>de la céphalosporine C,.</I>  <I>à partir de</I>     céphalospotine        C,       On a maintenu 50 mg de céphalosporine C dans  1,33 ml de     HCl    0,5 N ou 1 N à     20o    C pendant 2 ou  3 jours. Dans ces conditions, l'acide     7-aminocéphalo-          sporanique,    qui était présent dans la solution chlor  hydrique normale après 24 h, a disparu après 3 jours.

    Après 4 jours, la zone active révélée par phénylacé-           tylation    du noyau de la céphalosporine     C,    était  encore proche de la valeur maximum, mais il ne res  tait que des traces de céphalosporine     C,    Le noyau  de la céphalosporine     C,,    paraît donc être le produit  final relativement stable en milieu acide d'une série  de dérivés actifs ou potentiellement actifs, formés  par traitement acide ménagé de la céphalosporine C.  



  Le noyau de la céphalosporine     C,.    a également  été formé par mise en contact de céphalosporine C  avec un poids égal de résine     échangeuse    d'ions       Do-          wex    50 X 8   (-H+) pendant 15-48 h à     20o    C.

   Des  bandes dupliquées provenant d'ionogrammes effec  tués dans un tampon d'acétate de     pyridine    de pH 4,5,  sur lesquelles on avait pulvérisé du chlorure de     phé-          nylacétyle    et que l'on avait mis en contact avec un  organisme d'épreuve, ou sur lesquelles on avait pul  vérisé de la     ninhydrine,    ont révélé que la position du  noyau de la céphalosporine     C,.    correspondait à une  zone jaune sur les bandes traitées à la     ninhydrine.     



  L'activité du noyau de céphalosporine     C,,    formé  à     partir    de 400     Etg    de céphalosporine     C,    par traite  ment avec du     HCl    1 N n'a pas été notablement affec  tée par l'action de la     pénicillinase    dans des condi  tions détruisant complètement 50     ug    de pénicilline G.

Claims (1)

1. REVENDICATION I Procédé de préparation des composés de for mule EMI0007.0023 dans laquelle Rl représente un groupe d'acide car boxylique ou un sel de sodium, de potassium ou d'ammonium dudit groupe, et R. représente le groupe CHjC00 ou un radical hétérocyclique tertiaire basi que faible relié au groupe CH.

   par son atome d'azote tertiaire, ou Rl et R, représentent ensemble le groupe lactone -C0-0- avec le groupe carbonyle en posi tion 4, caractérisé en ce qu'on soumet un composé de formule EMI0007.0033 dans laquelle A représente la chaîne latérale a-amino- adipyle de formule HOOC-CH(NH,)-(CH2)3-CO- ou une chaîne latérale correspondante dans laquelle le groupe amino est protégé,

   à une hydrolyse en pré sence d'un agent hydrolytique acide pendant une durée qui, en fonction de la température et des au tres conditions de la réaction, est telle que la chaîne latérale a-amino-adipyle ou la chaîne latérale a- amino-adipyle protégée soit enlevée et que la struc ture du noyau soit conservée. SOUS-REVENDICATIONS 1. Procédé selon la revendication I, caractérisé en ce que l'agent hydrolytique acide est un acide mi néral. 2. Procédé selon la sous-revendication 1, carac térisé en ce que l'acide minéral est de l'acide chlor hydrique dilué. 3.

   Procédé selon la revendication I, caractérisé en ce que la chaîne latérale est protégée par un groupe 2,4-dinitro-phényle. 4. Procédé selon la sous-revendication 2, carac térisé en ce qu'on utilise de l'acide chlorhydrique d'une concentration comprise entre 0,1 N et 0,3 N. 5. Procédé selon la revendication I, caractérisé en ce qu'on effectue la réaction en présence d'un solvant miscible à l'eau. 6. Procédé selon la sous-revendication 5, carac térisé en ce que ledit solvant est l'acétonitrile. 7.

   Procédé selon la revendication I, caractérisé en ce qu'on effectue l'hydrolyse au moyen d'acide chlorhydrique d'une concentration d'environ 0,1 N, à une température d'environ 20o C et pendant envi ron 3 jours. 8. Procédé selon la revendication I, caractérisé en ce qu'on isole le composé formé du mélange réac tionnel. 9. Procédé selon la revendication I, caractérisé en ce qu'on transforme le composé formé en un sel.

   REVENDICATION II Utilisation du composé préparé par le procédé selon la revendication I, dans la formule duquel R2 représente le groupe<B>CH.</B> C00, pour la préparation d'un composé correspondant dans la formule duquel R2 représente un radical hétérocyclique tertiaire ba sique faible relié au groupe CH2 par son atome d'azote tertiaire, par réaction avec une base hétéro- cyclique tertiaire faible.