CH407124A

CH407124A - Verfahren zur Herstellung von Cycloserin

Info

Publication number: CH407124A
Application number: CH1236161A
Authority: CH
Inventors: L Harned Roger
Original assignee: Commercial Solvents Corp
Priority date: 1960-10-25
Filing date: 1961-10-25
Publication date: 1966-02-15
Also published as: US3090730A; BE609580A; GB929043A; SE310633B

Description

Verfahren zur Herstellung von Cycloserin
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Cycloserin durch Biosynthese unter Verwendung einer chemisch definierten Stickstoffquelle.

Cycloserin ist ein Agenz von grosser antibak- terieller Wirkungsbreite, wirksam sowohl gegen gramnegative als auch gram-positive Bakterien, d. h. gegen Mycobakterien wie Mycobacterium ranae und besonders aktiv in der Behandlung der Tuberkulose und von Entzündungen der menschlichen Harnwege. Das Antibiotikum wird durch Fermentation erhalten, wobei man cycloserinerzeugende Stämme von Mikro- organismen der Gattung Streptomyces, wie Streptomyces orchidaceus, Streptomyces virginiae, oder Streptomyces laventulae.

Das Antibiotikum ist eine amphotere Substanz, die sowohl schwach saure als auch schwach basische Gruppen enthält ; es ist sehr wasserlöslich, aber unlöslich in den meisten organischen Lösungsmitteln, wie Glykolen, Isopropanol, Methanol, Athanol, Azeton, Hexan, Benzol, Chloroform, Ather, Petroläther, Dioxan, 1-Butanol, Äthylacetat und Athylendichlorid. Das Antibiotikum schmilzt bei etwa 150 unter Zersetzung.

Es hat folgende Strukturformel :
EMI1.1

Bisher hat man Cycloserin erfolgreich hergestellt, indem man einen cycloserinerzeugenden Mikroorganismus in wässrigem Fermentationsmedium aus einem Stickstofflieferanten, einem Kohlenhydrat und Kalziumkarbonat einsetzt. Als Stickstofflieferanten dienten z. B. Alfalfamehl, Aminosäurekuchen, Milchpulver, Molkennährstoffe, getrocknete Weizenschlempe und Kasein. Die besten Cycloserinausbeuten konnten bei Anwendung von Produkten aus Sojabohnen erzielt werden, z. B. mit Sojaölkuchen oder trocknen mehlartigen Sojabohnenprodukten. Jedoch haben diese Sojaprodukte keine definierte Zusammensetzung, und es ist daher schwierig, bei ihrer Verwendung reproduzierbare Ausbeuten an Antibiotika zu erhalten.

Solche Ansätze enthalten auch zahlreiche Verunreinigungen, deren Entfernung kostspielig und zeitraubend ist. So ist die Nährbrühe dunkel gefärbt und enthält eine grosse Menge nichtassimilierbaren Sojabohnenmaterials. Solche Verunreinigungen wurden bisher durch einen langwierigen Prozess entfernt, indem man den pH-Wert des Mediums auf etwa 3 bis 6 adjustiert, dann filtriert, aus dem Filtrat das Cycloserin an ein Ionenaustauschharz absorbiert, es dann vom Austauscher eluiert, das Eluat mit Kohle entfärbt, die Kohle entfernt, den pH-Wert auf etwa 6,8 einstellt und das Cycloserin als wasserunlösliches kristallines Salz mit einem Metallion wie Silber, Kupfer oder Zink ausfällt. Das freie Cycloserin wurde dann nach bekannten Methoden isoliert. Dabei gehen gewöhnlich uber 25 % der Cycloserinausbeute, besonders beim Ionenaustausch, verloren.

Das erfindungsgemässe Verfahren erlaubt nun die Herstellung von Cycloserin in verbesserter reproduzierbarer Ausbeute, indem man im Fermentationsmedium einen synthetischen, chemisch definierten Stickstofflieferanten, wie Harnstoff, Ammoniak oder Ammoniumsalze, benutzt. Das Antibiotikum lässt sich aus diesem Medium leicht und mit geringsten Verlusten isolieren.

Bei dem erfindungsgemässen Verfahren zur Herstellung von Cycloserin bringt man unter aeroben Bedingungen einen cycloserin-produzierenden Mikro organismus der Gattung Streptomyces in einem wäss- rigen Medium, das ein Kohlenhydrat, einen Magnesium-, einen Kalium-, einen Phosphat-, Eisen-, Zink-, Mangan-sowie einen chemisch definierten Stickstofflieferanten enthält bei einer Temperatur von etwa 25-37 etwa 3-5 Tage lang zur Fermentation, wobei das Verhältnis von Kohlenhydrat zu verfügbarem Stickstoff bei etwa 10 bis 20 zu 1 gehalten wird. Vorzugsweise arbeitet man bei einem Verhält- nis des Kohlenhydrats zum Stickstoff wie 15W20 zu 1.

Als Stickstofflieferanten eignen sich im vorliegenden Verfahren u. a. Harnstoff, Ammoniak und die Ammoniumsalze von Mineralsäuren wie Ammoniumkarbonat und Ammoniumsulfat, vorzugsweise verwendet man Harnstoff.

Als Kohlenhydrate eignen sich u. a. Stärke, Glukose, Xylose, Maltose, Fruktose und Dextrane ; aber auch umsetzbare Fettstoffe wie Erdnussöl, Oli venöl, Baumwollsaatöl usw. können als Nahrung dienen. Vorzugsweise verwendet man jedoch Stärke.

Als Manganquelle dient vorzugsweise Mangansulfat, als Magnesiumquelle Magnesiumsulfat, als Kaliumquelle und Phosphatquelle K., JIP04, als Eisenquelle FeSO4 und als Zinkquelle ZnSO4.

Man verwendet gewöhnlich ein wässriges Nähr- medium, das etwa 3 bis 8 % Kohlenhydrate, etwa 0,05% Magnesiumsulfat, etwa 0,05 % K2HP04, etwa 0,002% FeSO., etwa 0,002 % ZnSO4, etwa 0,001% MnSOa und etwa 0,1-0,5% zugänglichen Stickstoff enthält, wobei das Verhältnis von Kohlenhydrat zu Stickstoff bei etwa 10-20 zu 1 lie,-, Oft ist es notwendig, dem Fermentationsmedium einen Entschäu- mer zuzusetzen, z. B. Specköl, Mineralöl usw. Unter günstigen Bedingungen erhält man bei dem erfindungsgemässen Verfahren 2000-3000 Mikrogramm isolierbares Cycloserin pro Milliliter, auch im Fabri kationsmassstab.

Die cycloserinbildenden Organismen der Gattung Streptomyces sind aerobe Organismen. Dem Medium muss daher unter Rühren Luft zugeführt werden.

Das Cycloserin lässt sich leicht reinigen und isolieren. Mit Vorteil filtriert man zunächst aus dem Fermentationsmedium das Mycel ab. Zum Filtrat fügt man ein Entfärbungsmittel, z. B. Aktivkohle, dann eine Säure, z. B. Salpeter-oder Schwefelsäure bis zu einem pH-Wert von etwa 3,0 und ein Metallion-z. B.

Silber in Form von Silbernitrat. Das Gemisch wird gerührt, bis es entfärbt ist und die Chloride restlos ausgefallen sind. Das Filtrat ist dann farblos und chlorfrei. Man fällt daraus das wasserunlösliche Metallsalz des Cycloserins, indem man den pH-Wert auf etwa 6,5 bringt. Mit Vorteil verwendet man hierzu Natriumhydroxyd. Man kann dieses Metallsalz dann in Wasser anschlämmen und durch Zugabe von Salzsäure o. ä. das Metallion ausfällen und das Cycloserin in wässrige Lösung bringen. Das freie Cycloserin wird dann aus der wässrigen Lösung durch Gefriertrocknung im Vakuum isoliert und bildet eine amorphe Fällung von sehr hoher Reinheit. Es lässt sich aber auch aus Wasser durch Zugabe eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels umkristallisieren.

Beispiel I
Streptomyces orchidaceus wurde in einem wässrigen Saatkulturmedium folgender Zusammensetzung 24 Stunden bei 30 gezüchtet :
Cerelose 1 %
Gelatine 0,5 % NaNO3 0,3 %
MgS04. 0, 05 %
K2HP04 0, 05 %
34000 1 des nachstehenden Mediums wurden in eine Fermentieranlage gebracht, die 15 Minuten bei 121 sterilisiert wurde :

Stärke 5 % Mus04. 7H20 0, 05 % K2HPO4 0, 05 %
FeSO. 7H30 0, 002%
ZnS04 0, 002 %
MnS04 0,001 % Specköl 0,4 %
Dann werden dem sterilisierten Medium 0,48 % steriler Harnstoff zugesetzt und mit 3100 1 der genannten Saatkultur beimpft. Darauf wurde das Medium 86 Stunden bei 30 bebrütet, wobei mit 21,6 m Luft pro Minute belüftet wurde. Nach der 86stündigen Fermentation enthielt das Medium 2,600 Mikrogramm Cycloserin pro ml.

Beispiel 11
Nach Beispiel I arbeitet man mit einem Medium, das 7% Stärke und 0,62% Harnstoff enthält. Nach 72stündiger Fermentation waren 3,000 Mikrogramm Cycloserin pro ml gebildet.

Beispiel I11
Hier werden 0,48% Ammoniak verwendet und Resultate entsprechend Beispiel I erzielt.

Beispiel IV
Nach der Arbeitsweise von Beispiel I werden bei Verwendung von 0,48% Ammoniumkarbonat ähn- liche Resultate erzielt.

Beispiel V
260 1 einer Nährbrühe mit 2,256 Mikrogramm Cycloserin pro ml, also mit insgesamt 592 g, erhalten nach Beispiel I, wurden mit einem Filterhilfsmittel filtriert. Zum Filtrat wurde 1 Gew. % Aktivkohle gegeben, der pH-Wert mit Salpetersäure auf 3ç0 adjustiert und 1131 g AgNOs zugesetzt. Dann wurde das Gemisch 30 Minuten lang kräftig gerührt und dann abfiltriert. Der ph-Wert des Filtrates wurde mit wässriger Natronlauge auf 6, 8 adjustiert und da bei das Silbersalz des Cycloserins zur Fällung gebracht. Es wurde getrocknet und ergab eine Ausbeute von 1011 g, worin 442 g Cycloserin enthalten waren.

Es wurden also 74,5 % des Cycloserins aus dem Fermentationsmedium isoliert. Das Silbersalz wurde mit deionisiertem Wasser angeschlämmt und mit HC1 versetzt, um das Ag als Chlorid auszufällen und das Cycloserin freizusetzen. Silberreste wurden dann aus der wässrigen Cycloserinlösung mit Schwefelwasser- stoff als Ag2S entfernt. Die Lösung wurde dann in kaltes Isopropanol filtriert, wobei 369 g weisses kristallisiertes Cycloserin ausfiel ; das entspricht einer Ausbeute von 62 %.

Claims

PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von Cycloserin, dadurch gekennzeichnet, dass man einen cycloserinbildenden Mikroorganismus der Gattung Streptomyces in einem wässrigen Fermentationsmedium unter aeroben Bedingungen züchtet, welch'letzteres eine Kohlenhydratquelle, eine chemisch definierte Stickstoffquelle, eine Magnesium-, Kalium-, Phosphat-, Eisen-, Zink-und eine Manganquelle enthält, wobei das Verhältnis von Kohlenhydrat zu verfügbarem Stickstoff bei 10 zu 1 bis 20 zu 1 gehalten wird.

UNTERANSPRtJCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentation 3-5 Tage lang bei 25-37 durchgeführt wird.

2. Verfahren nach Patentanspruch und Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dal3 man als Mikroorganismus den Stamm Streptomyces orchidaceus, Streptomyces virginie oder Streptomyces laventulae verwendet.

3. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man als Magnesiumquelle MgSO4, als Kalium-un Phosphatquelle K2HPO4, als Eisenquelle FeS04, als Zinkquelle ZnS04 und als Manganquelle MnS04 verwendet.

4. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man dem wässrigen Fermentationsmedium Specköl zufügt.

5. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man als Kohlenhydratquelle Stärke, Glukose, Maltose oder Fruktose verwendet.

6. Verfahren nach Patentanspruch und Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als chemisch definierte Stickstoffquelle Harnstoff zufügt.

7. Verfahren nach Patentanspruch und Unteran sprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man dem wässrigen Fermentationsmedium 3-8 % Kohlenhydrate und 0,3-1,0 % Harnstoff zufügt.

8. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man dem Fermentationsmedium 3-8 % Stärke oder Cerelose, 0, 3-1, 0 % Harnstoff, etwa 0,05 % MgS04, 0,05 % K2HP04, 0,002 % FeS04, 0,002% ZnSO4,0,001% MnSO4 und 0, 4% Speeköl zufügt, wobei das Verhältnis von Kohlenhydrat zu verfügbarem Stickstoff bei 15 zu 1 bis 20 zu 1 gehalten wird und die Fermentation 1-5 Tage lang bei 25-37 durchgeführt wird, und das freie Cycloserin isoliert.

9. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man als Stickstoffquelle Harnstoff verwendet.