CH410872A

CH410872A - Ionenaustauscher

Info

Publication number: CH410872A
Application number: CH1453960A
Authority: CH
Inventors: Kennay Anslow Winston
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 1959-12-28
Filing date: 1960-12-28
Publication date: 1966-04-15

Description

Ionenaustauscher
Die Erfindung betrifft einen Ionenaustauscher, ein Verfahren zur Herstellung eines solchen und die Verwendung dieses Ionenaustauschers.

Man hat schon durch Modifikation von gepulverter a-Cellulose Produkte hergestellt, die Anionenoder Kationenaustauscher sind (Sobers und Peterson, JA. C. 5. [1954], 76, 1711-1712, ibid. [1956], 78[4], 751-755, Sobers et al., J. A. C. S [1956], 78[4j, 756-763). Ein solches Produkt mit anionenaustauschenden Eigenschaften wird erhalten, wenn man stark alkalisches a-Cellulosepulver mit 2-Chlor N,N-diäthyl-äthylamin behandelt. Dieses Produkt, im weiteren DEAE-Cellulose benannt, hat als ionenaustauschendes Adsorptionsmittel für Proteine und proteinartige Stoffe, z.

B. für Enzyme, Verwendung gefunden, da es verhältnismässig grosse Mengen an Proteinen adsorbiert, die unter milden Bedingungen wieder eluiert werden können. Die a-Cellulose erschien diesen Forschern besonders vielversprechend, da sie hydrophil ist und eine grosse Oberfläche besitzt, welch letztere Eigenschaft für die Bestimmung der Adsorptionskapazität der daraus gewonnenen DEAE-Cellulose wichtig ist.

Der andere Faktor, der die Adsorptionskapazität der DEAE-Cellulose be einflusst, ist die Zahl der in die Cellulose einführbaren aktiven Gruppen; Versuche haben aber gezeigt, dass, je mehr MäthylaminoäthyTgruppen darin vorhanden sind, die Cellulose desto gelatinöser und wasserlöslicher wird, so dass eine obere Grenze für die in der Praxis einführbaren lonenaustauscher- gruppen vorliegt, bevor noch eine vollständige Di äthylamifloäthyiierung erreicht wird.

Bei der fabrikatorischen Durchführung von Ionen austauschverfahren ist es im alllgemeinen vorzuziehen, den Prozess kontinuierlich anstatt chargenweise zu gestalten; es ist also auch im Falle der Verwendung von DEAE-Cellulose ein Material zu verwenden, das für einen Säulenbetrieb brauchbar ist. Die betriebsmässig verwendbaren lonenaustauschstoffe sollten also folgende Eigenschaften in hohem Masse aufweisen:
1. Poröse Struktur, damit der zu behandelnden Flüssigkeit möglichst viel aktive Gruppen zur Verfügung stehen;
2. eine so weit offene Struktur, dass ein rascher Fluss der Flüssigkeit durch die Säule möglich ist;
3. möglichst gleichmässige Teilchengrösse, damit sich beim Packen der Säule das Material nicht durch unterschiedliche Sedimentation entmischt.

Die gleichmässige Teilchengrösse verhindert auch die Bildung von Kanälen und ermöglicht einen gleichmässigen Fluss im ganzen Querschnitt der Säule;
4. die einzelnen Teilchen des Materials sollen voneinander getrennt sein, so dass sie nicht zusammenballen und man die Säule rückwaschen und flul- dieren kann, z. B. um fremde Stoffe zu entfernen ;
5. die Teilchen des Materials sollen gegenüber wässrigen Salziösungen und schwach alkalischen und sauren Reagenzien beständig sein, so dass sie im Laufe der Adsorptïon, Elution und Regenerierung ihre Gestalt beibehalten, nicht zusammenballen oder zusammenfallen und damit den Fluss nicht behindern.

Die nach bekannten Methoden hergestellte DEAE- Cellulose besitzt die erste dieser Eigenschaften ; da sie aber ein feines, schwach gelatinöses Pulver bildet, neigt sie zur Klumpenbildung, kann nicht leicht rückgewaschen werden und behindert die Bewegung der Flüssigkeit. Ausserdem wird sie nach eigen Regenerierungen zu gelatinös, um weiter benutzt werden zu können.

Die weitere Forschung zur Herstellung von Ionenaustauschmaterial vom DEAE-Typus aus verschieb denen Cellulosearten zeitigte das Ergebnis, dass man aus Balsaholz eine DEAE-Cellulose herstellen kann, die für den Säulenbetrieb zufriedenstellend ist und die oben angeführten wünschenswerten Eigenschaften für ein ideales lonenaustauschmaterial in hohem Masse aufweist.

Die Erfindung betrifft demnach einen Ionenaustauscher aus mit Di äthyl aminoäthylsubstituenten beladenem Balsaholz. Der erfindungsgemässe Ionenaustauscher wird im folgenden der Kürze halber als DEAE-Balsa bezeichnet.

Das erfindungsgemässe lonenaustauschmaterial kann in verschiedenen Formen, z. B. in Plattenform, vorliegen, aber die Teilchenform wird vorgezogen.

Bei der Herstellung von DEAE-Balsa wird das Balsaholz zweckmässig vor Einführung der Ionenaustauschgruppen erst in Teilchen zerkleinert, wie sie in der lonenaustauschersäule verwendet werden können. Die Teilchengrösse des Balsaholzes ist zweckmässig kleiner als 10 B. S. Mesh und liegt vorzugsweise zwischen 16 und 60 B. S. Mesh.

Zur Herstellung eines Ionenaustauschers gemäss der Erfindung geht man am besten so vor, dass man Balsaholz mit einem Alkalimetallhydroxyd, zweckmässig mit Natronlauge, behandelt und das derart erhaltene Produkt mit einem N,N-Diäthyl-halogen- äthylamin, zweckmässig mit Diäthylchloräthylamin, umsetzt.

Das Balsaholz besitzt im allgemeinen eine lose Struktur, die leicht mit Diäthylaminoäthylgruppen substituiert wird und von den Molekülen der zu absorbierenden Stoffe leicht durchdrungen werden kann.

Das DEAE-Balsa stellt also der zu behandelnden Flüssigkeit eine grosse Anzahl aktiver Gruppen zur Verfügung. Es wurde z. B. gefunden, dass das erfindungsgemässe lonenaustauschmaterial eine Austauschkapazität von 0,3 bis 1,5 Moläquival./g Trokkengewicht, oft von 0,6 bis 1,5 MoDäquival./g Trokkengewicht, aufweisen kann. Es sei aber bemerkt, dass man erfindungsgemässes lonenaustauschmaterial mit einer Austauschkapazität von viel mehr als 2 Mol- äquival./g herstellt, dieses Material, ähnlich wie die bekannte DEAE-Cellulose , zur Gelierung neigt oder wasserlöslich wird.

Bei Verwendung der richtigen Teilchengrösse kann ein guter Fluss durch die Säule aufrechterhalten werden, im allgemeinen besser, als bisher mit DEAE Cellulose erreicht werden konnte.

Das DEAE-Balsa zeigt eine gute Widerstandsfähigkeit, insbesondere gegen Laugen. Es kann ohne wesentliche Änderung seiner Eigenschaften oft regeneriert werden und, obwohl dabei eine kleine Volumenänderung auftritt, bleibt die Flussgeschwindig- keit weitgehend konstant.

Der erfindungsgemässe Ionenaustauscher kann zur Adsorption vieler Stoffe verwendet werden, z. B. in allen Fällen, wo bisher DEAE-Cellulose verwendet wurde, also zur Trennung, Reinigung und Konzentration von Proteinen usw. Es wurde gefunden, dass er besonderes zur Reinigung undloder Konzentration von a-Amylase aus Pilzen, von Poliomyelitis-Viren, zur Reinigung und/oder Konzentration von Säuren, die aus Vitamin B1 durch Hydrolyse gewonnen werden (durch Adsorption) und von Vitamin B12 (durch Adsorption der Verunreinigungen, während das Vitamin unverändert durch die Säule geht) brauchbar ist. DEAE-Balsa ist auch zur Entfernung. von Verunreinigungen aus den Ostreo grycin-Faktoren A und B geeignet.

Beispiel 1 Hcfstell, ung von DEAE-Balsa
Man mischt 5 kg Balsa-Sägemehl (16 bis 60 Mesh) in einem horizontalen Mischer eine Stunde mit 26 Litern 5,75n Natronlauge. Dann gibt man 5 kg in 7,5 Litern Wasser gelöstes 2-Diäthyllamino-äthylchlo- rid zu und rührt 16 Stunden bei Zimmertemperatur.

Unter Kühlung gibt man 25 Liter 5n Salzsäure zu, filtriert den Schlamm und wäscht den Kuchen mit Wasser. Man erhält 5 kg DEAE-Balsa (Trockengewicht) mit einer Austauschkapazität von 1,38 Mol äquival./g (Trockengewicht).

Beispiel 2
1. Verwendung von DEAE-Balsa bei der
Herstellung von a-Amylase aus Pilzen
Man stellt aus gemäss Beispiel 1 erhaltenem DEAE-Balsa (nass gesiebt 16 bis 26 Mesh) ein Bett von 173 cm Höhe in einem Glaszylinder von 15,24 cm Durchmesser und einer Gesamthöhe von 305 cm (Bettvolumen etwa 31,2 Liter) her. Das Bett wird mit dem doppelten Bettvolumen von 0,045 Mol Natriumphosphat auf pH 6,5 bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 1,25 Bettvolumina pro Stunde gepuffert. Man speist in die Säule 8,5 Bettvolumina einer a-Amylasebrühe, erhalten aus einer Kultur von Aspergillus oryzae (Dextrinierfähigkeit 16,4 Ein- heiten/ml, d. h. Gesamtaktivität 4,320 Kiloeinheiten), die vorher auf pH 6,5 eingestellt worden ist, mit einer Geschwindigkeit von 1 Bettvolumen pro Stunde, gefolgt von 1 Bettvolumen Wasser.

Der Ausfluss zeigt eine Gesamtaktivität von 120 Kilo einheiten (Adsorptionsleistung 97,2%). Die adsorbierte a Amylase wird zurückgewonnen, indem man mit 1 Bettvolumen 1,6M Natriumacetatpuffer pH 4,7 und' dann mit stündlich 0,65 Bettvolumina Wasser wäscht.

1 Bettvolumen dieses Eluats enthält 3,615 Kiloeinheiten Dextrinierwirkung (86, 5 cd Ausbeute bei achtfacher Konzentration). Aus dem Eluat können weitere 420 Kiloeinheiten gewonnen werden, so dass man eine Ausbeute von 96 % erreicht.

2. Isolierung der durch Hydrolyse von Vitamin Bt2 erhaltenen Säuren
Man löst 19,4 g Vitamin B1 in 4 Litern 0,ln Salzsäure und lässt die Lösung erst 23 Stunden bei 370 C, dann 10 Stunden bei Zimmertemperatur stehen. Das gefärbte Material wird mit Phenol extrahiert, der Extrakt zweimal mit seinem eigenen Volumen Wasser gewaschen und dann das Phenol in Gegenwart von Wasser mit Äther extrahiert.

Man bereitet ein Bett aus DEAE-Balsa , hergestellt nach Beispiel 1 aus Bal'saholz-Sägemehl der Teilchengrösse 16 bis 40 Mesh, in einem Rohr von 11,4 cm Durchmesser mit einer Packungshöhe von 25,4 cm. Man gibt das Hydrolysat von Vitamin B12 und anschliessend Wasser mit einer Flussgeschwindigkeit von etwa 2 Litern pro Stunde auf die Säule.

Das unveränderte Vitamin Blr geht rasch durch, während die sauren Hydrolyseprodukte im DEAE- Balsa > adsorbiert werden.

Der 11,5 g Vitamin B12 in 3 Litern enthaltende Ausfluss wird mit 30 ml konzentrierter Salzsäure versetzt, 24 Stunden bei 370 und dann 10 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen, wobei man eine weitere Ausbeute an den erwünschten Säuren erhält. Die Lösung wird wie oben mit Phenol von der Mineralsäure befreit und durch dieselbe Säule geleitet, gefolgt von Wasser.

Der Ausfluss enthält 6,75 g Vitamin Blz in 2,8 Litern. Man gibt 4,6 g Vitamin B, 2 und 28 ml konzentrierte Salzsäure zu und lässt die Lösung 40 Stunden bei 370 stehen. Sie wird wieder mit Phenol extrahiert und auf dieselbe Säule gegeben. Der wässrige Ausfluss enthält 6,1 g unverändertes Vitamin Bt2.

Nach Waschen mit etwa 10 Litern Wasser zur Entfernung der letzten Spuren von Vitamin B12 wird die gewünschte einbasische Säure (12,0 g) mit 10 Litern 0,01n Natriumchlorid eluiert. Dann eluiert man die entsprechende zweibasische Säure (5,5 g) mit 7 Litern 0,1 n Natriumchlorid.

3. Reinigung von rohem Vitamin B1 mit DEAE-Balsa
Es werden zwei Versuche mit DEAE-Balsa , das nach Beispiel 1 aus Balsa mit einer Teilchengrösse von 16 bis 40 Mesh bereitet worden ist, durchgeführt.

Das für die Versuche verwendete Vitamin-Bl2- Präparat ist eine rote Lösung, die 0,2 und 0,25 g Vitamin Bt2 und etwa sieben Gramm feste Stoffe pro Liter enthält. a) Beim ersten Versuch werden 10 Liter dieses Präparates in Phenol-Chloroform (2:1) extrahiert und in etwa 1500 ml Wasser durch Zugabe von Aceton-Äther (1:2) regeneriert, bis der ganze Farbe stoff beim Schütteln in die wässrige Schicht übergegangen ist.

Diese Lösung, die Spuren von Phenol und kleine Mengen Aceton und Äther enthält und zu 605S rein ist, was durch die kolorimetrische Untersuchung und Bestimmung des Feststoffgehalts festgestellt wird, wird durch eine 12,5 cm tiefe Schicht von DEAE-Balsa in einer chromatographischen Säule von 2,54 cm Durchmesser mit einer Geschwindigkeit von 500 ml pro Stunde geleitet. Der Ausfluss (72 %ige Reinheit) wird im Vakuum konzentriert, durch Kieselgur filtriert und aus Aceton kristallisiert. Die Kristalle werden in warmem Wasser gelöst und umkristallisiert. b) Beim zweiten Versuch werden weitere 10 Liter der wie oben teilweise gereinigten Lösung in einem Gemisch von 150 g Holzkohle und 30 g Kieselgur in einer chromatographischen Säule von 7,62 cm Durchmesser adsorbiert.

Nach Waschen mit Wasser lässt man 60 %iges wässriges Aceton durch die Holzkohle laufen und erhält ein 70% reines Eluat. Das Aceton wird mit Diäthyläther entfernt und die hauptsächlich wässrige Lösung, die das Vitamin Bt2 enthält, durch ein 10,16 cm tiefes Bett von DES Balsa > in einer chromatographischen Säule von 2,54 cm Durchmesser mit einer Geschwindigkeit von 500 ml pro Stunde geleitet. Der 76 % reine Ausfluss wird im Vakuum konzentriert und aus Aceton kristallisiert. Die Kristalle werden in warmem Wasser gelöst und vor dem Umkristallisieren durch Kieselgur filtriert.

Die bei diesen Versuchen gewonnenen Kristalle und eine Kontrollprobe von Vitamin B12 aus der normalen Produktion werden über Nacht bei 1050 im Vakuum getrocknet. Der Reinheitsgrad der trockenen Kristalle, an Lösungen gewogener Mengen kolorimetrisch bestimmt, beträgt 94 % für die Stoffe aus dem Versuch (a), 95% für diejenigen aus dem Versuch (b) und 92 % für die Kontrollprobe.

4. Reinigung von Typ 1 Polio-Virus
3 g DEAE-Balsa , hergestellt nach Beispiel 1 aus Balsaholz mit einer Teilchengrösse von 16 bis 40 Mesh, werden in einem 0,02M Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert, so dass sich eine Säule von 21 X 110 mm ergibt. Die verwendete Virusflüssigkeit ist vom Typ 1, Titer 1011, Affennieren-Antigen (M. K.) = 1/512. Man leitet 5 ml Viruslösung durch die Säule mit einer Geschwindigkeit von 1,5 bis 2,0 ml pro Minute und entwickelt dann mit 0,02M Phosphatpuffer (pH 7,0). Die Restflüssigkeit (30 ml) wird verworfen und das Eluat in Portionen von 5 ml ge sammelt.

Die Resultate sind die folgenden: Vol. Titer % Aktivität M. K. % % M. K.

Ausgangsmaterial 5,0 mi 7,1 100 1/512 100
1. Eluat 6,5 ml 5,7 5 1/3 < 1
2. Eluat 5,0 ml 6,9 63 1/8 < 2
3. Eluat 5,5 ; mol 6,5 27,5 1/6 1
4. Eluat 5,1 ml 6,3 27,5 1/6 1
Total eluiert 123 < 5
Die vier Eluate enthalten die gesamte Eingangsaktivität und weniger als 5% des Affennieren-Proteinantigens.

6. Verwendung von DEAE-Balsa zur Reinigung von Ostreogrycin
Man löst 25 g Ostreogrycin, aus welchem der Faktor Z mit Cellulosephosphat entfernt wurde, in 200 ml 70% dem Methanol und leitet die Lösung durch eine 10,16 cm hohe Säule von DEAE-Balsa in einem Zylinder von 6,35 cm Durchmesser. Die Säule wird mit 70% igem Methanol gewaschen, bis der Ausfluss keine grüne Farbreaktion mehr mit FeCl3 zeigt, und gibt die Waschflüssigkeit zum Eluat. Die gesammelte methanolische Lösung wird unter vermindertem Druck auf etwa 200 ml eingeengt und die ausgeschiedene hellgelbe antibiotische Mischung abfiltriert.

Claims

PATENTANSPRÜCHE I. Ionenaustauscher aus mit Diäthylaminoäthyl Substituenten beladenem Balsaholz.

II. Verfahren zur Herstellung eines Ionenaustauschers nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man Balsaholz mit einem Alkalimetall- hydroxyd behandelt und das derart erhaltene Produkt mit einem N,N-Diäthyl-halogenäthylamin umsetzt.

III. Verwendung des Ionenaustauschers nach Patentanspruch I zur Trennung, Reinigung oder Konzentrierung von Proteinen, Viren, Vitamin-B1.-Säuren oder antibiotischen Stoffen.

UNTERANSPRÜCHE 1. Ionenaustauscher nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass dieser aus Teilchen besteht.

2. Ionenaustauscher nach Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Grösse der Teilchen kleiner ist als 10 B. S. Mesh und vorzugsweise zwischen 16 und 60 B. S. Mesh liegt.

3. Ionenaustauscher nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass dieser eine Austauschkapazität von 0,3 bis 1,5 Moläquival./g Trockengewicht, vorzugsweise von 0,6 bis 1,5 Moläquival./g Trockengewicht, besitzt.

4. Verfahren nach Patentanspruch II, dadurch gekennzeichnet, dass man Natronlauge verwendet.

5. Verfahren nach Patentanspruch II, dadurch gekennzeichnet, dass man N,N-Diäthyl-chloräthylamin verwendet.

6. Verwendung nach Patentanspruch III, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein a-Amylase ist.

7. Verwendung nach Patentanspruch III, dadurch gekennzeichnet, dass der Virus derjenige von Poliomyelitis ist.

8. Verwendung nach Patentanspruch III, dadurch gekennzeichnet, dass man den Ionenaustauscher mit einer Vitamin B12 enthaltenden Lösung oder Suspension in Berührung bringt, so dass es die Verunreinigungen adsorbiert.

9. Verwendung nach Patentanspruch III zur Reinigung einer Lösung oder Suspension der rohen Ostreogrycin-Faktoren A und/oder B.