CH417631A

CH417631A - Neue Wuchsstoffe und ihre Herstellung

Info

Publication number: CH417631A
Application number: CH7865259A
Authority: CH
Inventors: Gaeumann Ernst Dr Prof; Prelog Vladimir Dr Prof; Ernst Dr Vischer
Original assignee: Ciba Geigy
Priority date: 1959-09-25
Filing date: 1959-09-25
Publication date: 1966-07-31

Description

Neue Wuchsstoffe und ihre Herstellung
Aus Materialien biologischen Ursprungs, insbe- sondere Pflanzenmaterial, tierischen Organen und Mikroorganismen, sind bereits eine grosse Zahl biologisch und physiologisch aktiver Stoffe isoliert worden. Über das weitverbreitete Vorhandensein einer bestimmten ; Gruppe von Wuchsstoffen war jedoch nichts bekannt.

Es wurde nun gefunden, Idass man aus Mikroor- ganismen und deren Extrakten Wuchs, stoffe in reiner bzw. angereicherter Form erhalten kann,, die im fol- genlden Antisideromycinle genanX werden.

Die Antisideromycine sinld stickstoff-unld eisenhaltige organische Verbindungenl, deren Säurehydro- lysate ninhydrinpositive Substanzen enthalben. Sie besitzen eine rote Farbe uinid sind leicht löslich in Säuren und stark polaren Lösungsmitteln, wie Was ; ser, Dimethylformamid, Glykol, Äthylenglykolmonomethyläther, sowie in nielderen aliphatisohen Alkoholen, wie Methanol. Auch in höheren aliphatischen Alkoholen sowie in armomlatischen Alkoholen und Phenolen besitzen sie eine beschränkte Löslichkeit, z. B. in Butanol, Ben ylalkoh, ol, Phenol.

Ein charakteristischer Vertreter dieser Gruppe ist das Antisideromycin Al (auch Fenioxamin B ge nannt), das im Patent Nr. 413 853 beschriehen ist. Es wird als Hauptprodukt z. B. von Streptomyceten pro duziert. Danebe, n findet man drei weitere Stoffe, die als Antisideromycin A2 und A3 umd B bezeichnet werden.

In, der fol genden Tabelle sind Idie papierchroma- tographischen Charakteristika der Antisideromycine A2, A3 untd B sowic-des bekannten vom Brandpilz XJstilago sphaerogena produzierten Ferrichroms (Bact. Rev. 21, 101 1957) angefiihrt :
Tabelle 1 Präparat Rf-Werte in Lösungsmittelsystem
1 2 3 4 5 6 Anti, sideromycin A2 0, 61 0,59 0, 57 0, 23 0, 81 0, 28 Antisideromycin A3--0, 70 0, 34-- Antisideromycin B 0, l---0, 60 F michrom 0, 47 0, 28 0, 37 0, 05 0, 76 0, 10 -0, 50- 0, 30- Die Ziffern in der Tabelle bedeuten folgende Lösungsmittelsysteme :

1. = n-Propanol-Eisessig-Waslser (7 : 1 : 2 Volum- teile) 2. = n-Propanol-Amrnoniak-Wasser (7 : 1 : 2 Volumteile)
3. = wassergesättigtes sek. Butanol + 2 /o Trichloressigsäure
4. = n-Butanol-Pyridtin-Wass, er (6 : 4 : 3 Volumteile)
5. = Äthanol-Wasser (1 : 1 Volumteile) + 5 Olo Ferrichlorid
6. = wassergesättigtes n-Butanol + 2 /o p-Toluol sulfosäure.

Bei der Hochspannungs-Elektrophorese auf Papier in 1/3-n. Essigsäure wandern Antisideromycin A2 und A3 innert 4 Stunden Laufzeit (1000 Volt) 8, 4 cm bzw. 12 cm weit.

Bei der Hydrolyse mit Säuren erhält man Produkte, die zum Teil mit Ninhydrin eine positive Farbreaktion geben.

Dia freien Basen der Antisideromycine sind leicht in iiblicher Weise aus ihren Salzen zugänglich, aus dem Sulfat z. B. durch Umsetzung in wässrigem ausgearbeitete Test von Bonifas [V. Bonifas, Experientia 8, 234 (1952)] sinngemäss angewendet werden kans.

Die bereits genannten Substanzen Ferrichrom, Terregens Factor und Coprogen gleichen in ihrem Vitamincharaktar fiir Arthrobacter terregems und Athrobacter flavescens den Antisideromycinen.

Hingegen ist die oben geschilderte, für die Antiside romycine typische, wachsbumsfördernde Wirkung auf Baoillus subtils, Micrococcus pyogenes, Saccharomyces cerevisiae, Ustilago sphaerogena und Chlamy domonias eugametos für die drei Substanzen Ferrichrom, Terregens Factor und Coprogen nicht be kannt. Zud ! em fehlt diesen Substanzen, die starke und typisch, e Antisi, deromycinlwirkung.

Wie in Tabe31e 1 gezeigt worden ist, unterscheidet sich das Ferrichrom weitssr Volz den Antisideromyci- nen durch sefin papierchromatographisches Verhal- ten. Anderseits unterschenden sich Coprogen unld der Terregens Factor durch ihren Eisengehalt. Ersteres enthält 6, 61 /o Journ [Amer. Chem. Soc. 74, 1362 (1952)] und letzterer nur Spuren Eisen [Can. Jours.

Biochem. an, d Physiol. 32, 400 (1954)]. Im Gegensatz dazu wurde fiir Antisideromycin Al 4, 5 bis 5, 5 /o Eisen gefunden.

Die Herstellung des Gemisches der Anísidero- mycine A2, A3 und B kann nach an sich bekannten Methoden unter Beriieksichtigung der oben gegebenen physikalischen Daten und insbesondere mit Hilfe des zur Verfolgung der Isolierung geeigneten biologi eschez Testes erfolgen. Das erfindun, gsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, sdass man einen Antisideromycin erzeugenden Mikroorganismen- stamm züchtet, bis das Kulturmedium eine wesentliche Antisideromycinwirkung aufweist, unld aus dem Kulturfiltrat das Gemisch der Antisideromycine A2, A3 und B isoliert.

Als Ausgangsstoffe für die Gewinnung der Anti side, romycinid werden Kulturen von Mikroarganis- mfen, vor allem von Vertretern der Gattung Streptomyces, von Bakterien, z. B. von B. subtilis, oder von Hefen, z. B. von Saccharomyces cerevisiae, verwen- dot.

Eine besonders bdvorzugte Quelle sind, Kulturen vonz Streptomyceben, die anhand der von Ettlinger et al. [Arch. Mikrobiol. 3, 326 (1958)] vorgeschlagenen Merkmale der folgenden Arten zugeordnet werden : Streptomyces griseoflavus (Krainsky) Waksman et Henrici, Streptomyces laven, dulae (Waksman et Curtis) Waksman et Henfici, Streptomyces galilaeus Ett luger et al., Streptomyces pilosus Ettlinger et al., Streptomyces polychromogenus Hagemann, Pinasse et Teillon, Streptomyces viridochromogenes (Krainsky) Waksman et Henrici, Streptomyces aureofaciens Duggar,

Streptomyces divaceus (Waksman) Waksman et Henrici, Streptomyces griseus (Krainsky) Waksman et Henrici, Streptomyces glau cescens Gause et al.

Zur Gewinnung grösserer Mengen von Antisideromycin werden vorteilhaft Kulturen der genannten Me, clium mit Bariumhydroxyd, Neutralisierung des überschüssigen Baryts mit Kohlendioxyd sowie Abtrennung des Bariumcarbonat- und -sulfatnieder schlages und Isolierung der freiexl Base mitbels Ge- friertrocknung. Eivfacher erfolgt die Herstellung aus den Salzen unter Verwendung eines basischen Anionenaustauschers.

Die Salze der Antisideromycine können sich von den bekannben anorganischen und organischen Salzen ableiten, beispielsweise von der Salzsäure, den Schwefelsäuren unld Phosphorsäuren, der Essig-, Propion-, Valerian-, Palmitin- oder Ölsäure, der Bernsteinsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Mandel- säure, Glutaminsäure oder Pantothensäure. Sie stellen neutrale oder saure Salze, diar. Ihre Herstellung kann durch Einwirkung der entsprechenden Säuren auf die fraie Base oder durch, doppelbe Umsetzung vong Salzen, beispielsweise von Antisideromycin-Sulfat mit pantothensaurem Calcium erfolgen.

Die Antisideromycine besitzen wachstumsfördernde Eigenschaften für eine grosse Zahl von Organismen. So besitzen sie einen solchen Effekt auf Bacillus subtils, Micrococcus pyogenes var. aureus, Saccharomyces cerevisiae, Ustilago sphaerogena und Chlamydomonas eugametos.

Andere Organismen, z. B. Vertreter Ider Gattung Arthrobacter, wie Arthrobacter terregens und Arth robacter flavescens, entwickeln sich überhaupt nur in Anwesenheit von Antisideromycin. In diesen Fällen besitzen die Antisideromycine also einen lihnlichen Vitamincharaktor, wie es far die Wirksubstanzen Ferrichrom, Terregens Factor und Coprogen gezeigt worden zist. [Bact. Rev. 21, 101 (1957)].

Eine weitere biologische Eigenschaft der Antisideromycine besteht darin, dass sie im Stande sind, die Wirkung von Antibiotika, die der Gruppelder Sidero- mycine angehören, gagenüber grampositiven Erre- gern kompetitiv aufzuheben. Zu den Sideromycinten gehören u. a. die eisenhaltigen Antibiotika Grisein, Albomycin, Ferrimycin, das Antibiotikum 1787 H. Thrum, Naturwiss. 44, 561 (1957) und die Substanzen L. A. 5352 und L. A. 5937 [P. Sensi und M. T. Timbal, Antibiotics & Chemotherapy 9, 160 (1959)]. Anscheinend besteht ein Antagonismus zwischen den Antisideromycinen einerseits und den.

Sideromycinen anderseits, der sowohl in vitro als auch in vivo nachgewiesen werden kann. Von dieser Wirkung ist im übrigen auch der Name Antisi- deromycine abgeleitet.

Die geschilderte antagonsistische Wirkung beschränkt sich ausschliesslich auf die Sideromycin Antibiotika und konnte bei anderen Antibiotika, wie Neomycin, Viomycin, Streptomycin, Streptothricin, Penicillin, Brythromycin oder Novobiocin, nicht beobachtet werden.

Die Aufhebung der antibiotischen, Wirkung der Sideromycine in vitro eignet sich gut für eine qualitative Erkennung un, d quantitative Bestimmung der Antisideromycine, indem der an und für sich zur Bestimmung von synergistisch wirkender Substanzen Mikroorganismen verwendet. Besonders bewährt haben sich in dieser Beziehung die oben erwähnten Streptomyces-Stämme"die sich leicht in grösserem Massstab züchten lassen.

Die vorliegende Erfindung ist daher nichet auf die Verwendung der Vertreter der genannten Arten beschränkt, sondern betrifft auch die Verwendung vonl Antisiderornycin-bildenden Stämmen anderer Arten und insbeson, dere von Vari- anten aller dietser Organismen, wie sie z. B. durch Selektionierung oder Mutatlon, inisbesondere von Ultraviolett-oder Röntgenstrahlen oder von Stickstoffsenfölen gewonnen werden.

Zur Gewinaungider Antisideromycine in grosse- rem MAssstab wird z. B. ein die Eigenschaften der oben angeführten streptomyceten aufweisencder Stamm, z. B. in wässriger, KohlenNhydrate, stickstoilE- haltige Verbindungen sowie anorganische Salze enthaltender Nährlösung aerob gezüchtet, bis diese eine wesentliche Antisideromycinwirkung zeigt, und die Antisideromycine hierauf isoliert. Man kann atber auch Bakte. rien, wie B. subtils, züchten und aus den betreffenden Kulturen die Antisideromycine in reine-r bzw. angereicherter Form isolieren.

Für die Züchtung der genaneten Pilze oder B, akberien kommlen als assi milierbare Kohlenhydrate z. B. Glukose, Saccharose, Laktose, Mannit, Stärke sowie Glycerin in Frage. Als stickstoffhaltige Nährstoffe und gegebenenfalls wachs tumsfördernde Stoffe seien genannt : Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie, defen Abbauprodukte, wie Pepton o, dcr Trypton, ferner Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekörnern, wie Mais und Weizen, von Destillationsrückständen der Alkoholherstellung, von Hefe, Samen, insbesondere der Raps- und Soyapflanze, der Baumwollpflanze usw., aber auch Ammoniumsalze und Nitrate.

Von anderen anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate von Alkalien, Erdalkalien, Magnesium, Eisen, Zink und Mangan enthalten.

Die Züchtun, g erfolgt im allgemeinen aerob, also heispielsweise in ruherder Oberflächenkultur oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttelflaschen oder den b-kannten Fermentern,. Als Tem-peratur eignet sich eine solche zwischen 18 und 40 . Eine wesentliche Antisideromycinwirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach 1¸ bis 5 Tagen.

Man trennt vorzugsweise das Mycel vom Kulturfiltrat ab, wonach die Hauptmenge, der Antisideromy- cime im Kulturfiltrat gefunden wird. Es bleiben aber trotzdem namhafte Mengen davon am Mycel adsorbiert. Es ist daher vorteilhaft, letzteres gut auszuwaschen. Dazu eignen sich Wasser und wässrige organ, i- sche Lösungsmittel, wie Alkohole, z. B. wässriges Methanol.

In ah. nlicher Weise kans man auch Bakterien, z. B. B. subtils, züchten und das Kulturfiltr. at als Quelle fiir die Isolierung von Antisideromycin verwenden.

Für die Isolierung der Antisideromycine aus den genannten Materialien, insbesondere den Kulturfiltraten von Pilz- oder Bakterienzüchtungen, kann man nach an sich bekannten Methoden vorgehen und z. B. eine der nachfolgend angegebenen Arbeitsweisen oder Kombinationen davon verwenden.

1) Man kann Adsorptionsmittel verwendet, z. B.

Aktivkohlen, wie aNorita, aktivierte Erden, wie Frankonit , Fullereie oder Floridin , oder Haradsorber, wie Asmit . Die Elution der Adsorbate erfolgt zweckmässig mit Gemischen von mit Wasser mischbaren orgnaischen Lösungsmitteln mit Wassex, z. B. mit Wasser-Meth, anol-, Wasser-Pyridin-, ver dünnte Essigsäure-Methanol-oder Wasser-Methanol Eisessig-Butanol-Gemischen. Als besonders orteil- haft fiir die Elution eines Frankonit - oder Norit adsorbates hat sich das Gemisch von Wasser (4 Volumenteile) und Pyridin (1 Volumteil) erwiesen.

2) Eine zweite Methode zur Abtrennun, g der An tisideromycine besteht IdLarin, dass man, six an Katio nenaustauschern aldisorbiert, wobei besonders Saure- gruppen enthaltende Harze, wie Amberlite IRC-50 (vgl. US-Patent 2 340 111) geeignet sind.. Letzteres kann sowohl in der Säureform als auch in der Natriumform verwendet werden, doch hat sich auch ein Gemisch dieselr beideID Formen bewährt. Die Elution geschieht zweckmässig mit verdünnten Säuren, z. B. mit methanolischer Salzsäure.

3) Weiter könnenf die Antisi, dieromycine einer wässrigen Lösung mittels organischen Lösungsmitteln entzogen werden. Für diese Extraktionsverfahren haben sich höhere organische Alkohole, z. B. Benzylalkohol oder Isopropylalkohol, besonders bewährt.

Zweckmässigerweise wird dabei dier wässrigen Phase ein anorganlsches Salz, z. B. Ammoniumlsulfat oder Natriumchlorid, zugesetzt. Aus den erhaltenen orga nischlen ExtrakteD können die Antisideromycine entweder durch Abdampfen des Lösungsmittels oder durch Ausfällung mitbels eines geeigneten organi- schen Lösungsmittels, z. B. Sither, Petroläther oder Athylacetat, in angereichlerter Form erhalten werden.

4) Eine Anreicherung der Antisilderomycine wird auch dadurch erreicht, dass man konzentrierte, wäss ; riga oder alkoholisch-wässrige Lösungen des Salzes mit einem Oberschuss an organischen, mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln, wie Aceton, Dioxan, etc., versetzt, wobei die Salze in fester Form ausgefällt werden.

5) Eine weitere Methode der AnreicherungSder Antisideromycine besteht darin, dass man wässrige Lösungen desselben mit Lösungen von Phenol in Chloroform extrahiert, wobei sowohl das pH der wässrigen Lösuntg als auch der Phenolgehalt der Chloroformlösung variiert werden. So befinden sich die Antisideromycine z.

B. bei cirer Verteilung zwi schen, einer Lösung, die auf 100 cm3 chloroform 100 g Phenol enthält, und einer wässrigen Phase von pH 1 bis 6 fia, st ausschliesslich in derorganischen Phase, während sie bei der Verwendung einer Lösung, die auf 100 cm3 Chloroform nur 33 g Phenol enthält, der wdssrigen Phase lediglich bei einem pH zwischen 4 unl 6 annähernd vollständig entzogen werden.

Versteht man unter dem Verteilungskoeffizienten der Antisideromycine das Verhältnis von, Konzentration in der organischen Phase zur Konzen°ration in dFer wässrigen, so geht aus, den obigen Angaben hervor, dass der Verteilungskoeffizient mit steigendem Phenolgehalt der organischen Phase zunimmt und mit sinken, deml pH Ider wässrigen Phase abnimmt. Da es somit möglich ist, jeden beliebigen Verteilungskoeffi zientenl der Antisideromycine in diesam. System einzustellen, kann man, durch Kombinatiorn von wenigen Verteilungsoperationen einen Grossteil inaktiver Verunreinigurllgen abtrennen.

6) Eine andere Anreicherungsmethode für die Antisideromycine stellt die Chromatographie dar, wie Adsorptionschromatographie an verschiedenen, Materialien, z. B. an Norit , Aluminiumoxyd, Magnesiumsilikaten, Silicagel , Calciumsulfat, so- wie Verteilungschromatographie mit Cellulose, Stärke, Silicagel , Celite und dergl. als Rager- substanzen, oder aber Chromatographie an Ionenaustauscherharzen, z. B. an Dowex 50 , Amberlite IRC-50 undSdergl.

7) Weiter können die Antisideromycine durch Gegenstromverteilung nach Craig zwischen, zwei n ! icht mischbaren Lbsungsmittelphasen angereich-ert werden,. Folgende Lösungsmittelsysteme haben sich dabei besonders bewährt : a) Benzylalkohol - 20 %ige wässrige Lösung von Ammoniumsulfat. b) n-Butanol (100 Volumteile)-Benzylalkohol (200 Volumteile)-1-n. Salzsaure (6 Volumteile)- Wasser (300 Volumteile) - wässrige, bei 19 gesättigte Natriumchloridlösung (60 Volumteile).

8) Schliesslich evgnet sich die praparative Elektrophorese an einler Säule mit Trägermaterial gut zur Reinigung, Anreicherung und Auftennung von AntiF sideromycin-'raparaten.Duesewirvorzugsvvei.se als Hochspannungselektrophorese bei 500-4000 Volt durchgefuhrt. Eine weitere Verbesserung besteht darin, dass man dieses Verfahren nach dem sogenannten Gegenstromprinzip durchführt.

Dabei werden die als Kationen vorliegenden Antisilderomycine auf der Trägersäule örtlich festgehalten, indem man die du. rch das elektrische Feld hervorgerufene Bewegung mittels einer in entgegengesetzter Richtung verlau fenden Strömung, des Elektrolyts genau kompensiert.

Dadurch wird erreicht, dass Stoffe mit anderer elektrischer Beweglichkeit die Trägersäule an den beiden Eiektrodenenden verlassen°.

Das so erhaltene Gemisch der Antisidleromycine kan, nl zur Herstellung Ider einzelnen Komponenten, Antisideromycin A2, A3 und B1 verwendet werden, indem man das Gemisch in die Komponenten zerlegt ; dies kann vor allem durch Papierchromatographie erfolgen.

Die Antisideromtycirlie können als Wuchsstoffe fur verschiedene Organismen verwen, det werden, und zwar entweder aUein oder inr Form von speziellen Präparaten.

In dlea nachfolgenden Beispielen sind bdie Temperaturen in Celsiusgradieni angegeben
Beispiel 1
Die Züchtung, des Strelptomyces pailosus, Stamm A 21748, (Institut für spezielle Botanik, Eidgenöfssische Technische Hochschule, Zürich) wird nach dem Submersverfahren durchgeführt. Man verwendet eine Nahrlosumg, die pro Liter Leitungswaslser 20 g Soyamehl und 20 g Maunit enthält. Die Nährlösung wird in den Impfkolben oder in den Fermentern 20-30 Minuten bei 1 atii sterilisiert. Die sterilisierte Nährlö- sung zeigt ein, pH von 7, 2-7, 6.

Die Beimpfung erfolgt mit bis zu 20% einer teilweise sporulierenden vegetativeni Kulturldes, genannten Organismus. Man inkubiert unter gutem Schütteln oder Rühren bei 24-30 , wobei die Kulturen in Fermentern mit ca. 2 volumen Luft je Volumen Lösung pro Minute belüf- tet werden. Nach 72-144 Stuniden Bebrdtung hat die Kultwrlosun : g den hochsten, Gehalt an Antisideromy- cin erreicht.

Man unterbricht die Kultur, trennt dias Mycel sowie andere feste Bestandteile von der die Hauptmenge der Antisideromycin enthaltenden Lösung mittels Filtration, oder Zentrifugation ab, wobei gegebenenfalls der Kulturlösung vor der Filtration etwa 1 /o, eines Filterhilfsmittels, z. B. Hyflo Supercel , zugesletzt wird. Die Filterrückstände wäscht man mit Wasser oder wässrigem Methanol und vereinigt die Waschflüssigkeiten mit dem Kulturfiltrat. Das gewonnene Kulturfiltrat wird unter stetem Rühren mit 2 % Tonerde, z. B. Frankonit , versetzt.

Nach gründlicher Durchmischung filtriert man ab und widerholt mit dem erhaltenen Filtrat den Ab sorptionsvongang l-2mal. Die Filterrückstände werden vereinigt und mehrmals mit Wasser und wässrigem Methanol gewaschen Anschliessend werden die Filternückstände 2-3mal mit einem Pyridin-Wassergemisch (1 : 4) eluiert. Das Idurch Filtration geklärte Eluat wird am Vakuum eingeengt. Die erhaltenen Konzentrate können entweder direkt weiter verarbeitet werden (siehe Beispiel 3) odeur man kann daraus mittels Gefr, ielrtrocknung ein Gemisch von Antiside- romycinen, in roher Form isolieren ;.

Vrwendet man anstelle der oben angegebenen Nährlösung solche, die pro Liter Leitungswasser die folgenden Nährstoffe enthalten, so erhält man nach analoger Züchtung und Aufarbeitung KulturfiltDate von ähnlich hohen Gehalt an Antisideromycin. a) Saccharose 20 g
Natriumcitrat 0, 9 g
Ammoniumacetat 3 g se. k. Kaliumphosphat 3 g
Magnesiumsulfat 0, 8 g Kupfersulfat 0, 01 mg
Manganchlorid 0, 07 mg Forricitrat 20 mg b) Rohglukose 10 g Soyamlehl 10 g
Cornsteep liquor 20 g
Kochsalz 5 g
Natriumnitrat 1 g
Kalk 10 g c) Raps-Extraktionsschrot 20 g
Rohglukose 10 g sek. Kaliumlphosphat 0, 2 g
Kalk 10 g d) Flachsmehl 40 g
Rohglukose 10 g sek.

Kaliu, mphosphat 0, 2 g
Kalk 10 g
Anstelle des angegebemen Stammes dler Art Streptomyces pilosus können die folgenden Stämme verwentdet werdell (unter den angegebenen Stamm- Nummern werden die Stämme im Institut fur spezielle Botanik, Eidgenössische Technische Hochschule, Zürich, aufbewahrt.) Nach analoger Züch tung und Aufanbeitunlg eIhält man Kulturfiltrate von ähnlich hohem Ferrioxamingehalt.

Stamm Nr. : Streptomyces Art :
9578 S. griseoflavus (Krainsky) Waksman et Henrici 15311 S. griseoflavus 11686 S. pilosus Ettlinger et al.

23258 S. pilosus 23305 S. pilosus 17635 S. viridochromogenes (Krainsky)
Waksman et Henrici 18055 S. viridochromogenles
6445 S. olivaceus (Waksman) Waksman et
Henrici
7346 S. olivaceus
7437 S. olivaceus 22083 S. aureofaciens Duggar 22765 S. aureofaciens 18822 S. galilaeus Ettlingezr et al.

14677 S. lavendulae (Waksman et Curais)
Waksman et Henrici 21510 S. lavendulae 21837 S. polychronogenes Hagem, ann et al.

23217 S. polychromogenes 23310 S. polychromogenes 10112 S. griseus Waksman et Henrici 13495 S. griseus
7419 S. griseus
Beispiel 2
Der Stamm A 23 978 der Art Stremptomyces aureofaciens (Institut für spezielle Botanik, Eidgenössische Technische Hochschule, Zürich) wird submers gezüchtet auf einer Nährlösung, die pro Liter Leitungswasser 20 g Malzextrakt, 20 g Distillers solubles enthält. Die Züchtung und Aufarbeitung erfolgt gleich wie in Beispiel 1, wobei Kulturfiltrate erhalten werden mit ähnlich hohem Antisideromycingehalt.

Beispiel 3
60 Liter Kultur werden in der in Beispiel 1 targe- stellteru Weise hergesbellt und aufgearbeitet. Das ge- wonnene Pyridin-Wasser-Eluat (ca. 6 Liter) wird im Vakuum auf 3 Liter eingeengt. In diesem Konzentrat werden 870 g Amlmonsulfat golöst. Die Lösung wird durch Filtration oder Zentrifugation, ggegebenenfalls unber Zugabe von 1 % Hyflo Supercel , geklärt.

Durch 3-4maliges Ausschutteln mit Benzylalkohol odier Isopropylalkohol werdlen die Antisideromycine in das organische L6sungsmittel iibergefiihrt. Die orgnischen Phasen werd-en vereiniigt und, mit Hilfe von Natriumsulfat getrocknet. Man gibt, einen, Ober- schu, ss von Ather oder Athylacetat zu un^S filtriert die ausgefällten Antisiderlomycine ab. Der. Zusatz von Filterhilfsmittel, z. B. Hyflo Supercel , vor der Ausfällung erleichtert die Gewinnung des Niederschlages.

Aus diesem können die Antisideromycine mit Methanol oder Wasser ausgewaschen werden. Diese Eluate werden eingedampft oder lyophilisiert und man erhält so ein, Prdparat von Antisideromycin in angereicher- ter Forum.

Beispiel 4
Einem gemäss Beispiel 1 oder 2 erhaltenen Kul turfiltrat werden pro Liter 20 g Kochsalz zugefügt.

Die klare Lösung wird 3mal mit 1/10 Volumen Chloroform-Phenol-Gemisch (1 Volumteil Chlorofarm, 1 Gewichtsteil Phenol) ausgezogen. Die organischen Phasen werden vereinigt, unter Zusatz von Hyflo Supercel filtriert und mit eanem tJberschuss an Ather versetzt. Durch mehrmaliges Ausschütteln mit wenig Wasser werden die Antisideromycine in d-ie wässrigen Anteile übergeführt. Die erhaltenen wäss- rigen Extrakte werden vereinligt und zur vollständi- gen Entfernung des Phenols 2mal mit Äther ausgeschüttelt.

Durch Gefriertrocknung, gewinnt m ! an ein orange bis braunrotes Präparat von Antisideromycinen, das durch Papierchromatographie zerlegt werden kann.

Beispiel 5
Ein gemäss Beispiel 3 erhaltenles Rohprodukt von Antisideromycin wird einer Gegenstromverteilung user 83 Stufen unterworfen, wobei das Lösungsmit- telsystem Benzylalkohol-20 /0ige wässrige Ammoni- umsulfatlösung verwendet wird. Der Inhalt der einW zelnen Vertealumgsgefasse wird hierauf kolorimetrisch (Absorption bei 425 mou,) und biologisch (Bonifas Test) untersucht. Dabei können zwei Maxima festgestellt werden, und zwar bei Stufe 32 und. bei Stufe 76.

Das erstere enthält Antisideromycin A1 und das zweite die Antisideromycine A2, A3 und-, B. Die Stu- fen 32-42 werden verein, igt und bis zur Sättigung mit Ammoniumsulfat versetzt. Dam wird de Benzylal- koholphase, die nun die genannte Antisideromycin Aktivität enthält, abgetrennt und mit dem gleichen Volumen Ather versetzt. Diesem Gemisch wird die Antisideromycin-Aktivität mit werig Wasser entzogen. Durch Gefriertrocknung der konzentrierX wässrigen Lösung erhält man Antisideromycin A1 in Form eines braunroten Pulvers, das in bezu, g auf das Ausgangsmaterial der Gegenstromverteilung ca. 10mal angereichert ist.

Zur Isolierung der Antisideromycine A2, A3 und B vereinigt man die StuMen 65-82 usnd behandolt sie in gleicher Weise. Das Gemisch von Antisideromycin A2, A3 unld B stellt ebenfalls ein braunrotes Pulver dar. Es kann durch Papierchromatographie zerlegt werden.

Beispiel 6
100 g frische Bäckerhefe wird in einem Liter Methanol aufgeschgwemmt undl 30 Minuten kräftig gerührt. Die Aufschwemmung filtriert man und engt die methanolische Lösun'g am Vakuum auf 200 ml eiIr. Zu diesem Konzentrat werden 200 ml Wasser zugesetzt und die Lösung durch Filtration oder Zen- trifugation geklärt. Die geklärte Lösung wird 3mal mit einem Chloroform-Phenol-Gemisch (1 Volumteil Chloroform, 1 Gewichtsteil Phlenol) ausgezogen. Die vereinigten organischen Phasen versetzt man mit wenig Filterhilfsmittel ( Hyflo Supercel ) und gibt zu dieser Aufschwemmung unter stetem Rühren einen Überschuss an Äther zu.

Die ausgefallenen Antisideromycine werden zusammen mit dem Filterhilfsmittel abgetrenst, mit Äther gewaschen und getrocknet. Aus dem Filterhilfsmittel werden die Antisideromycine mit Methano1 eluiert. Die methanolische Lösung wird am Vakuum schonend eingedampft, wobei die Anti sideromycine m Form eines aktiven rotbraunen Har zes erhalten werden, aus dern sich mittels Papierchromatographie die einzelnen Faktoren abtrennen lassen.

Zu Präparaten mit ähnlich hohem Gehalt an Antisideromycin gelangt man, wenn man anstelle der Bäckerhefe einen käuflichen Hefeextrakt, abgepresste Brauereihefe oder frische Hefekulturen, wie beschrieben aufarbeitet.

Beispiel 7
Die Züchtung von Bacillus subtilis wird nach dem Submersverfahren durchgeführt. Man verwendet eme Nährlösung, Idie pro Liter Leitungswasser 10 g Roh- glukose, 5 g Pepton, 3 g Fleischextrakt, 5 g Kochsalz und 10 g Kalk enthält. Man inkubiert die Kulturen bei 33-37 unter Belüftung und unter stetem Schütteln oder Riihren. Nach 48-96 Stunden Bebrütung werden díe Kulturen unfiltriert mit 2 % Tonerde ( Frankonit ) versetzt, kräftig gerührt und anschliessend durch Filtration, oder Zentifugation geklärt.

Das Sedomlent wind mit Methlanol gewaschen und an- schliesseud mit einem Pyrid, in-Wassergemisch (1 : 4) eluiert. Das Eluat enthält die Hauptmenge der Antisideromycine, die gemäss den Angaben in Beispiel 3 isoliert wer, den.

PATENTANSPRUCHI
Verfahren zur Herstellung neuer Wuchsstoffe, der Antisideromycine, dadurch gekennzeichnet,, dass man einen Antisideromycin erzeugenden Mikroorganismenstamm züchtet, bis das Kulturmedium eine wesentliche Antisideromycinwirkung aufweist, und aus dem Kulturfiltrat das Gemisch der Antisideromy cine A2, A3 und B isoliert.

Claims

UNTERANSIPRUCHE 1. Verfahren mach Patentanspruch I, ldadurch ge- kennzeichnet, idlass man als Ausgangsmaterial Kultu ren von Streptomyceten verwendet.

2. Ve. rfahren nach Patentanspruch I, dadurch ge- kennzeichne, t, dass die Züchtung unter aeroben Ber dingungen während 36-120 Stunden bei einer Tem peratur zwischem 18 und 40 in einem wässrigen Medium durchgeführt wird, das, assimilier, bare Koh lenhydrate, stickstoffhaltige Verbindungen sowie an organische Salze enthält.

3. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch ge kennzeichmet,, dass das Gemisch der Antisideromycine aus der Kulturlösung Idurch Adsorption mittels Aktivkohle, aktivierten Eriden oder Harzadsorbem, isoliert wird.

4. Verfahren nach Patentanspruch I oder einem der Unteransprüche 1-3, Idadurch gekenneichnet, dass das Gemisch Idter Antisideromycine am einem schwach sauren, Carboxylgruppen enthaltenden Ionenaustauscher adsombiert und aus diesem mit einem s, auren Elutionsmittel eluiert wird, 5. Verfahren nach Patentanspruch I oder einem der Unteransprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, das, s das Gemisch tder Arstisideromycine mit Lösun, gen von Phenol in Chloroform extrahiert wird.

PATENTANSPRUCH II Verwendung des nach dem VerÇahren gemäss Patentanspruch I erhaltenen Gemisches der Antiside romycine A2, A3 und B zur Herstellung der einzele nen Komponenten, Idadurch gekennzeichnet, dass man das Gemisch in die Komponenten zerlegt.