CH418524A - Reagens zur Durchführung serologischer Testverfahren - Google Patents

Description

  
 



  Reagens   zur    Durchführung serologischer Testverfahren
Die Injektion von weiblichem, menschlichem Urin in Testtiere zum Nachweis der Schwangerschaft ist bekannt. Die Friedmansche Modifikation von Aschheim-Zondeck verwendet Kaninchen als Testtiere.



  Während das weibliche Ei kontinuierlich   heranreift    und sich die Graafschen Follikel in den Ovarien der Kaninchen vergrössern, erfolgt bis nach der Kopulation keine weitere Ovulation. So ist es möglich, an sorgfältig gehaltenen weiblichen Kaninchen den Effekt von injiziertem weiblichem Urin in den Ovarien zu studieren. Im Friedman-Test wird einem Kaninchen der zu untersuchende Urin injiziert. Das Tier wird nach 3648 Stunden getötet und dessen Ovarien untersucht. Die Zeit, welche zur Vervollständigung des Friedman-Testes notwendig ist (üblicherweise mehr als 48 Stunden) stellt einen ernsthaften Nachteil der Methode zum Nachweis der Schwangerschaft dar. Der Friedman-Test ist übrigens kostspielig, da grössere Kaninchenbestände gehalten werden müssen.

   Die Resultate dieses Testes sind auch nur zuverlässig, wenn das Kaninchen längere Zeit nicht kopuliert wurde, nicht schwanger ist und nicht für andere Teste in den vorhergehenden 6 Wochen bis 2 Monaten verwendet wurde.



   Die vorliegende Erfindung betrifft nun   ein    neues Reagens, sowie ein serologisches Testverfahren zur Feststellung der Schwangerschaft, welches es dem Kliniker ermöglicht, ohne die üblichen Testtiere auszukommen.



   Im Hinblick auf die augenscheinlichen Nachteile, welche die bis jetzt üblichen Tierteste aufweisen, ist es nicht überraschend, dass viele Versuche zur Entwicklung eines serologischen Testes unternommen wurden. Es ist bekannt, dass bei der Schwangerschaft Choriongonadotrophin im Urin vorhanden ist; die Antigen-Eigenschaften desselben sind durch Leatham und andere zur Durchführung eines Testes vorgeschlagen worden.   Schuyler    verwendet Kaninchen Choriongonadotrophin-Antiserum in einem serologischen Test zum Nachweis der Schwangerschaft und teilt mit, dass es notwendig sei, das Serum vor Gebrauch zu absorbieren. Der durch   Schuyler    entwickelte Test ist weniger zuverlässig als der Salmon Test.

   Es wurden auch Versuche gemacht, um die Zuverlässigkeit des serologischen Testes durch Reinigung des menschlichen Choriongonadotrophins zu verbessern; dabei sollen interferierende Antigene, die im Harn nicht schwangerer Frauen vorhanden sein können, entfernt werden. Es wurde aber gefunden, dass der Reinigungsgrad sehr schwierig zu kontrollieren ist und dass der Reinigungsprozess, wenn er zu weit getrieben wird, die Antigen-Eigenschaften des menschlichen   Choriongonadotrophins    zerstört.



   Gegenstand vorliegender Erfindung ist ein Reagens zur Durchführung serologischer Testverfahren zum Schwangerschaftsnachweis, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es aus einer Suspension fein verteilter fester Partikeln mit Durchmessern im Bereich von 0,81 Mikron, die mit menschlichem Choriongonadotrophin überzogen sind, in einer polaren Flüssigkeit besteht. Bei der Verwendung dieses Reagens zum Nachweis der Schwangerschaft wird eine Mischung von menschlichem weiblichem Urin und Schwangerschaftsantiserum bei ungefähr 370 C inkubiert, dann das Reagens zugefügt, das Ganze 2 Stunden lang bei 370 C inkubiert, zentrifugiert und die Trübung des Überstehenden mit einem Turbiditätsstand'ard verglichen.



   Die Verwendung des erfindungsgemässen Reagens beruht auf der Hemmung eines Schwangerschafts Antiserums, welches zweckmässig mit Puffern verdünnt, durch das Hormon im Urin einer schwangeren Patientin nach einer entsprechenden Incubation beeinflusst wird. Nach Incubation wird die Urin-Anti  serum-Mischung der Suspension von festen, kleinen Partikeln, welche mit menschlichem Choriongonado  trophin    überzogen sind, zugefügt, Wenn diese Mischung bei 370 C während etwa 2 Stunden incubiert wird, tritt Agglutination der festen Partikeln ein, wenn keine Hemmung des Antikörpers erfolgt; diese Partikel können dann durch leichte Zentrifugation sedimentiert werden. Die Untersuchung der überstehenden Lösung zeigt dann die Anwesenheit oder die Abwesenheit von Choriongonadotrophin im Urin der Patientin an.

   Wenn die überstehende Lösung trüb ist, ist   dWr    Test positiv, im gegenteiligen Fall ist er negativ. Diese Methode gibt ausgezeichnete   Uber-    einstimmung mit dem   Kröten- bzw.    Froschtest.



   Das zum Test verwendete Antiserum wird durch Injektion von menschlichem Choriongonadotrophin (ungefähr 1700-2200 int. Einh./mg) in Kaninchen gewonnen. Eine spezielle Reinigung des im Handel erhältlichen Choriongonadotrophins ist nicht   nötiig.   



  Nach ungefähr 5 Wochen wird das Kaninchen getötet und das Serum jedes Tieres gegen menschliches Choriongonadotrophin getestet. Die Antisera, welche eine positive Reaktion mit einer niedrigen Konzentration des Antigens ergeben, werden vereinigt und standardisiert.



   Die Beschaffenheit der Suspension der mit menschlichem Choriongonadotrophin überzogenen Partikeln ist für die zuverlässige Durchführung des restes massgebend; die Grösse und die Form der Partikel sind verantwortlich für den Anteil von Choriongonadotrophin, welches an der Oberfläche absorbiert wird sowie für die Sedimentation der Partikeln bei Anwesenheit von Antiserum. Es ist besonders wichtig für die Zuverlässigkeit der Testmethode, dass die festen Partikeln eine einheitliche Grösse und Form haben.



   Solche Suspensionen können erhalten werden durch Polymerisation von Styrol unter kontrollierten Bedingungen; sie wurden als befriedigend zur Herstellung des erfindungsgemässen Reagens befunden.



   Besonders bevorzugt sind Polystyrol-Suspensionen, die durch Dow Chemical Company, Midland, Michigan, unter den Nummern LS-066 A und LS-449 E hergestellt werden. Die Polystyrolteilchen dieser Fabrikation sind ungefähr kugelförmig und weisen einen durchschnittlichen Durchmesser von ungefähr 0,8140 Mikron und ungefähr 0,8020 Mikron auf. Sie dürften ein durchschnittliches Molekulargewicht, das über 200 000 liegt, besitzen; Partikeln, die einen wesentlich grösseren Durchmesser als 0,81 Mikron aufweisen, werden in der Zentrifuge zu leicht niedergeschlagen und geben deshalb falsche negative Reaktionen. Partikeln mit wesentlich kleinerem Durchmesser als etwa 0,80 Mikron benötigen wegen ihrer telativ grösseren Oberfläche mehr Choriongonadotrophin.

   Trotzdem zusätzliches Choriongonadotrophin gegeben wird, werden viele dieser zu kleinen Partikeln nicht an das Antigen gekuppelt, bleiben in Suspension und geben falsche positive Teste.



   Wie schon erwähat, ist die Menge des Choriongonadotrophins, welches auf den Polystyrolpartikeln absorbiert wird, abhängig von der Oberfläche und weil die Partikeln ungefähr kugelförmig sind, ist der Anteil von Choriongonadotrophin, welches absorbiert wird, der Oberfläche proportional, d. h. etwa proportional dem Kubus des Radius. Es kann berechnet werden, dass Polystyrolpartikeln, welche einen ungefähren Durchmesser von 0,264 Mikron haben, das   29,2fache    an Choriongonadotrophin absorbieren als ein gleiches Gewicht Polystyrolpartikeln,    welche e einen ungefähren Durchmesser von 0,81 Mi-    kron aufweisen. Diese Berechnung kann experimentell nachgeprüft werden. Es ist deshalb für den Fachmann klar, dass die Menge des Choriongonadotrophins dem Durchmesser der suspendierten Partikel angepasst werden muss.



   Herstellung des   Schwangerschafts-Antiserums   
Eine relativ konzentrierte Lösung von menschlichem Choriongonadotrophin wird hergestellt durch Auflösen von menschlichem Choriongonadotrophin, welches ungefähr 1700-2200 int. Einh./mg enthält, in   0, 15normaler    Kochsalzlösung, wobei man eine Konzentration von 100000 int. Einh./cm3 erhält.



  Diese Lösung wird mit einem gleichen Volumen Freundschen Adjuvans gemischt. Eine zweite und verdünntere Lösung wird hergestellt, die 10 000   int. Einh./cma    enthält. 1   cm3    der konzentrierten Lösung enthaltend 50000 int. Einh. Choriongonado  trophin/cm3    wird Kaninchen intramuskulär injiziert. Nach 3 Wochen erhalten diese Tiere eine intravenöse Injektion der verdünnteren Lösung mit 10 000 int. Einh. an 3 aufeinanderfolgenden Tagen.



  Alle Kaninchen werden 10-14 Tage nach der letzten Injektion durch   Herzpunktion    ausgeblutet und das Serum von jedem Kaninchen separat gesammelt.



  Jedes Serum wird 30 Minuten auf 560 C erwärmt und dann gegen Lösungen von menschlichem Choriongonadotrophin mit 250 und 100   int. Einh./cm3    getestet. Die   Antiseren,    welche gegen die 100 int.



  Einh. Prezipitation zeigen, werden vereinigt. Diesen vereinigten Antiseren wird Natriumäthylmercurithiosalicylat (Merthiolate) in einer Konzentration von   1 : 5000    zugefügt. 1 Volumen des so vorbereiteten Antiserums wird mit 15 Volumen einer Imidazol Lösung verdünnt.



   Die Imidazol-Lösung wird hergestellt durch Zusatz von 6   cm3      0,1n    Salzsäure zu 25   cm3    einer   0,2molaren    Imidazol-Lösung und Einstellung des Volumens auf 100   cm3    mit destilliertem Wasser. Zu dieser Imidazol-Lösung gibt man 0,7 g Natriumchlorid, 0,032 g Natriumsalicylat, 20   cm3    eines 30 % igen Rinderalbumins und Natriumäthylmercunthiosalicylat in einer Konzentration von   1 : 10    000.



  Das verdünnte Antiserum wird steril filtriert, z. B. durch D8 bis D10 Asbestschicht und ampulliert.  



   Beispiel I
Herstellung der Antigen-Suspension
1 Volumen eines Polystyrollatex (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, identifiziert als Bactolatex   0,81),    von einem ungefähren Partikeldurchmesser von 0,81 Mikron wird mit 9 Volumen eines Boratpuffers von pH 8,2 verdünnt. Der Boratpuffer wird hergestellt durch Mischen von 35 cm3 0,05molarer Natriumboratlösung mit 65   cm3    einer 0,2molaren Borsäurelösung unter Zusatz von 0,85 g Natriumchlorid. Die Konzentration der Polystyrolteile im Bactolatex beträgt 2 Volumenprozent und die Konzentration der Polystyrolteile im verdünnten Boratpuffer etwa 0,2 Volumenprozent. 1 Volumen des verdünnten Latex   (1 %    Polystyrolteile) wird weiter verdünnt mit einem gleichen Volumen der Borat  puffedösung,    welche 40 int.

   Einh./mg menschliches Choriongonadotrophin enthält. Nach kräftigem Mischen wird die Mischung vor Gebrauch über Nacht bei   2-80    C stehengelassen.



   Beispiel II    Durchführung    des Testes
Der zu testende Urin soll der erste Morgenurin sein; er muss innerhalb von 12 Stunden untersucht werden. Der Urin wird in der Zentrifuge bei hoher Geschwindigkeit für 3 Minuten zentrifugiert und die klar überstehende Lösung dekantiert.



   Zu 0,25   cm3    des verdünnten Antiserums in einer 10 X 75 mm Teströhre werden 0,25 cm3 des zentrifugierten Urins gegeben. Die Teströhre wird vorerst gut geschüttelt und dann im Wasserbad für 1 Stunde auf 370 C erwärmt. Die Antigensuspension gemäss Beispiel I wird kräftig geschüttelt und   0,5      cm3    dieser Suspension werden in die Teströhre gefüllt.



  Der Inhalt der Teströhre wird wieder gut gemischt und in einem Wasserbad zwei Stunden auf 370 C erwärmt. Die Teströhre wird nun für zwei Minuten unter 1000 g zentrifugiert und die Klarheit des   Überstehenden    wird verglichen mit einem Turbiditätsstandard gegen einen schwarzen Hintergrund (der Trubiditätsstandard kann z. B. dem McFarland Ne  pheWomeFtler-Turbiditätsstand'ard    entsprechen; vergleiche Seite 583, Approved Laboratory Techniques, Kolmer,   Spaniding    and   Robinson,    5. Ausgabe). Wenn das Überstehende weniger trüb als der Standard ist, ist der   Schwangerschaftstest    negativ; wenn das   Über-    stehende trüber ist als der Standard, so ist der Schwangerschaftstest positiv.



   Es ist ein grosser Vorteil des Testverfahrens, dass nicht besonders hoch gereinigtes menschliches Choriongonadotrophin zu seiner Durchführung notwendig ist. Es wurde auch festgestellt, dass Phosphate und ähnliche Substanzen, die im Urin der Patientin vorhanden sein können, nur wenig oder gar keinen Einfluss auf den Test haben. Da das oben beschriebene Antiserum hoch verdünnt ist, sind auch nur sehr kleine Anteile von Antigen notwendig.   

Claims (1)

1. PATENTANSPRÜCHE I. Reagens zur Durchführung serologischer Testverfahren zum Schwangerschaftsnachweis, dadurch gekennzeichnet, dass es aus einer Suspension fein verteilter fester Partikeln mit Durchmesser im Bereich von 0,81 Mikron, die mit menschlichem Choriongonadotrophin überzogen sind, in einer polaren Flüssigkeit besteht.

   II. Verwendung des Reagens gemäss Patentanspruch I zum Nachweis der Schwangerschaft, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Mischung von menschlichem, weiblichem Urin und Schwangerschafts-Antiserum bei ungefähr 370 C incubiert, dann das Reagens zufügt, das Ganze für zwei Stunden bei 370 C incubiert, zentrifugiert und die Trübung des Überstehenden mit einem Turbiditätsstandard vergleicht.

   UNTERANSPRÜCHE 1. Reagens gemäss Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass der pH der Suspension ungefähr 7,9 bis 8,8 beträgt.

   2. Reagens gemäss Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass die Suspension etwa 0, 1 S feste Partikeln enthält.

   3. Reagens gemäss Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass die festen Partikeln aus Polystyrol bestehen.

   4. Reagens gemäss Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass die polare Flüssigkeit aus einem wässrigen Boratpuffer mit leinem ungefähren pH von 8,2 besteht.